CN101948802A - 免疫磁珠分选人关节软骨cd105+/cd166+间充质干细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种细胞分选方法，特别涉及免疫磁珠分选人关节软骨CD105+/CD166+间充质干细胞的方法，该方法为双标志免疫磁珠连续分选法，与目前常用的单标志分离-培养-单标志分离的免疫磁珠间断分选法相比，具有高效、省时、简便等优点，可以容易地获得高纯度的人关节软骨间充质干细胞，且细胞活性良好，能够满足后续细胞生物学特性研究和医学临床细胞移植治疗的需要；此外，本发明还明确了分选人关节软骨CD105+/CD166+间充质干细胞的适宜时机。
Description
技术领域
本发明涉及一种细胞分选方法，特别涉及免疫磁珠分选人关节软骨CD105+/CD166+间充质干细胞的方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)在维持组织损伤与修复的动态平衡中起着至关重要的作用。新近研究发现，正常人及原发性骨关节炎(osteoarthritis，OA)患者的关节软骨内均存在间充质干细胞。因此，建立适宜的分选方法并于适宜的分选时机从正常人及原发性骨关节炎患者的关节软骨细胞内高效、简便地分选出大量高纯度、高活性的间充质干细胞，对满足后续细胞生物学特性研究和医学临床细胞移植治疗的需要具有重要意义。
免疫磁性细胞分选技术已有20余年的历史，其中针对某一特异性干细胞表面标志物的阳性分选(positive isolation)较其阴性分选(negative isolation)能得到更高的目标细胞富集率。目前常用的免疫磁珠技术分选干细胞多为单阳性标志物分选或单阳性+单阴性标志物分选。由于组织中干细胞的数量很少，各种表面标志物的阳性率不一，双阳性分选相对比较困难。目前研究认为，人类成体间充质干细胞的表面标志物包括CD13、CD29、CD44、CD49、CD51、CD54、CD58、CD71、CD73、CD90、CD102、CD105、CD106、CDw119、CD120a、CD120b、CD123、CD124、CD126、CD127、CD140a和CD166，而某一组织中的成体间充质干细胞并非所有上述标志物均同时阳性。因此，通常选择其中一个或两个标志物进行成体间充质干细胞的筛选及其多向分化能力的检测，以确定其干细胞特性。CD105是TGF-βIII型受体，最早被称为SH-2，通过调节转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)与其受体的结合而参与细胞信号传导。CD166又称为白细胞活化黏附因子(activated leukocyte cell adhesion molecule，ALCAM)，是淋巴细胞抗原CD6的配基，主要在白细胞和胸腺上皮细胞上表达。CD105和CD166作为间充质干细胞的表面标志物之一于近年研究中得到广泛承认，并有研究认为CD105和CD166共表达可作为骨髓基质干细胞的表面标志物。Alsalameh等(Arthritis Rheum，2004，50：1522-1532)和刘军等(中国组织工程研究与临床康复，2008，12(47)：9239-9242)分别采用CD105和CD166共表达作为表面标志物进行关节软骨间充质干细胞分选及其多向诱导分化鉴定均获得成功。
但Alsalameh等和刘军等采用的分选方法均为目前常用的免疫磁珠间断分选法即单标志分离-培养-单标志分离法，该方法存在分选效能较低、所需时间较长、操作较为繁琐等缺点。此外，用免疫磁性细胞分选技术高效分选目标细胞应选择适宜的时机。但自2003年Barbero等首次发现正常人及原发性骨关节炎患者的关节软骨中含有能够多向分化的间充质干细胞以来，从最早利用细胞克隆技术到近来使用免疫磁珠技术、流式细胞术等分选关节软骨间充质干细胞，均未明确高效获取纯净、足量关节软骨间充质干细胞的适宜分选时机。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于建立一种免疫磁珠分选人关节软骨CD105+/CD166+间充质干细胞的方法，具有高效、省时、简便等优点，可以容易地获得高纯度的人关节软骨间充质干细胞，且细胞活性良好，能够满足后续细胞生物学特性研究和医学临床细胞移植治疗的需要。
为达到上述目的，本发明的免疫磁珠分选人关节软骨CD105+/CD166+间充质干细胞的方法，包括以下步骤：
①取正常人或原发性骨关节炎患者的关节软骨细胞悬液，加入荧光素标记CD166抗体，混匀后于温度2～6℃避光孵育35～55分钟，再于2～6℃离心，弃上清液，用磷酸盐缓冲液即PBS洗涤并重悬，获得CD166+细胞-一抗复合物悬液；
②向步骤①所得CD166+细胞-一抗复合物悬液中加入抗荧光素免疫磁珠，混匀后于2～6℃孵育20～40分钟，再于2～6℃离心，弃上清液，用PBS洗涤并重悬，获得CD166+细胞-一抗-二抗-磁珠复合物悬液；
③将LD分离柱置磁场中，用PBS洗柱后，加入步骤②所得CD166+细胞-一抗-二抗-磁珠复合物悬液，弃流出液，并用PBS洗柱；
④从磁场中取出经步骤③处理后的LD分离柱，用PBS冲洗，收集冲洗液，于2～6℃离心，弃上清液，用PBS洗涤并重悬，获得纯化的CD166+细胞-一抗-二抗-磁珠复合物悬液；
⑤向步骤④所得纯化的CD166+细胞-一抗-二抗-磁珠复合物悬液中加入分离试剂，于2～6℃孵育5～15分钟中止抗原抗体反应，使CD166+细胞与抗体和磁珠完全解离，再于2～6℃离心，弃上清液，用PBS洗涤并重悬后，加入终止试剂并充分混匀，使分离试剂丧失活性，获得CD166+细胞悬液；
⑥向步骤⑤所得CD166+细胞悬液中加入荧光素标记CD105抗体，于2～6℃避光孵育20～40分钟，再于2～6℃离心，弃上清液，用PBS洗涤并重悬，获得CD105+/CD166+细胞-一抗复合物悬液；
⑦将步骤⑥所得CD105+/CD166+细胞-一抗复合物悬液重复步骤②～⑤的操作并用MS分离柱替代LD分离柱，即得CD105+/CD166+间充质干细胞悬液。
进一步，所述关节软骨细胞为原代或第4代培养关节软骨细胞。
本发明的有益效果在于：本发明从分选周期、分选后的细胞活度、CD105+/CD166+细胞百分比及收获率四个方面，比较了本发明的免疫磁珠连续分选法与现有的免疫磁珠间断分选法从原发性骨关节炎患者第4代培养关节软骨细胞中分选CD166+/CD105+细胞的效能，结果发现：本发明的免疫磁珠连续分选法优于现有的免疫磁珠间断分选法，其具有高效、省时、简便等优点，可以容易地获得高纯度的关节软骨间充质干细胞，且细胞活性良好，能够满足后续细胞生物学特性研究和医学临床细胞移植治疗的需要。此外，本发明还观测了原发性骨关节炎患者关节软骨组织分离细胞及其原代和传代培养细胞中CD105+/CD166+细胞百分比的变化，结果发现：关节软骨组织分离细胞及其原代、第2代和第4代培养细胞中的CD105+/CD166+细胞百分比逐步明显提高，而第4代以后培养细胞中的CD105+/CD166+细胞百分比无显著变化，由此明确了分选关节软骨间充质干细胞的适宜时机。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：
图1为流式细胞术检测原代培养关节软骨细胞的体积分布(A)及CD105+/CD166+细胞百分比(B)；
图2为流式细胞术检测第4代培养关节软骨细胞的体积分布(A)及CD105+/CD 166+细胞百分比(B)；
图3为流式细胞术检测第4代培养关节软骨细胞分选后细胞的体积分布(A)及CD105+/CD166+细胞百分比(B)；
图4为倒置显微镜观察培养第4天的第4代培养关节软骨细胞(A)及其分选出的CD105+/CD166+细胞(B)。
具体实施方式
以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
优选实施例中采用的关节软骨标本为：中国人民解放军第三军医大学第一附属医院关节外科中心施行原发性骨关节炎人工全膝关节置换术中切除、Markin病理分级1～2级的全层关节软骨标本5例，患者年龄50～65岁，平均年龄61.0±6.3岁，其中男3例，女2例。标本获取得到医院伦理委员会批准，并经患者本人知情同意。
优选实施例中采用的主要试剂及材料为：透明质酸酶、胰蛋白酶(Sigma公司)，II型胶原酶(Gibco公司)，胎牛血清、DMEM/F12培养基(Hyclone公司)，小鼠抗人CD105抗体、小鼠抗人CD166抗体(Ancell公司)，CD105-PE抗体、CD166-FITC抗体(Serotec公司)，Dynabeads Pan Mouse IgG二抗磁珠(Invitrogen公司)，CD105MicroBeads、Anti-FITC-Multisort试剂盒[包括抗FITC磁珠(Anti-FITC MultiSort MicroBeads)、分离试剂(MultiSort Release Reagent)和终止试剂(MultiSort Stop Reagent)]、LD分离柱、MS分离柱(Militenyi公司)。
优选实施例中采用的主要仪器为：miniMACS分选架(Militenyi公司)，CKX31型倒置显微镜(OLYMPUS公司)，YJ-1450净化工作台(苏州净化设备公司)，二氧化碳培养箱(Thermo公司)，低温离心机(Beckman公司)，EPICS AL TRA II型流式细胞仪(Beckman公司)。
优选实施例中采用SPSS10.0统计软件处理数据，计量资料以均值±标准差
表示，计数资料以百分比表示，组间比较采用t检验，检验水准α为双侧0.05，以P＜0.05为有统计学差异。
一、人关节软骨CD105+/CD166+间充质干细胞适宜分选时机的确定
按照文献方法(周强等.三步酶消化法高效分离兔原代关节软骨细胞及体外培养观察.中华外科杂志，2005，43(8)：522-526)分离原发性骨关节炎患者的关节软骨细胞并进行体外培养。主要方法如下：取关节软骨标本，切剪成约1mm3碎块，依次用浓度为1g/L的胰蛋白酶溶液、1g/L的透明质酸酶溶液、2g/L的II型胶原酶溶液于37℃摇床中消化1小时、1小时、3小时，最后用300目滤网过滤，洗涤，得关节软骨组织分离细胞；所得关节软骨组织分离细胞经计数后，按3×104/cm2接种于DMEM/F12培养基(含有体积分数为10％的胎牛血清、浓度为100IU/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素)中，置温度为37℃、CO2气体体积分数为5％的培养箱内孵育，接种72小时后首次换液，培养细胞至80％融合时(第5天)，以质量分数为0.25％的胰蛋白酶溶液消化，收集培养细胞，得原代培养关节软骨细胞；所得原代培养关节软骨细胞经计数后，按照上述原代细胞培养方法以细胞比为1∶2连续传代培养至第6代，得传代培养关节软骨细胞。
分别取上述关节软骨组织分离细胞及其原代和传代培养细胞各5×105个，用PBS洗涤2次后加入PBS 100μl重悬，再加入CD105-PE抗体和CD166-FITC抗体(1μg/106个细胞，稀释度为1∶50)，4℃冰箱避光孵育30分钟，用PBS洗涤2次后，用质量分数为4％的多聚甲醛溶液固定15分钟，再于流式细胞仪上检测不同培养阶段关节软骨细胞中CD105+/CD166+细胞的百分比。
结果见表1和图1～3。
表1不同培养阶段关节软骨细胞中CD105+/CD166+细胞的百分比
注：各组间细胞活度比较P＞0.05；除第6代培养细胞外，各组间CD105+/CD166+细胞百分比比较P＜0.05～0.01；*表示与第4代培养细胞比较P＞0.05。
由表1可知，关节软骨组织分离细胞及其原代培养细胞中的CD105+/CD166+细胞百分比较低，分别为(1.13±0.68)％和(5.16±3.59)％，传代培养细胞中的CD105+/CD166+细胞百分比明显增高，其中第4代培养细胞达到(17.81±3.80)％，但进一步传代培养，CD105+/CD166+细胞百分比无显著变化，提示原发性骨关节炎患者的关节软骨间充质干细胞在体外培养时随着不断增殖进行着分化/去分化的过程。因此，应用免疫磁珠技术分选关节软骨间充质干细胞时，需要根据研究目的选择适宜的时机。如果研究重点是关节软骨组织中的间充质干细胞，适宜取原代培养细胞进行分选；如果研究重点是关节软骨间充质干细胞的诱导分化能力，适宜取第4代培养细胞进行分选。
二、免疫磁珠连续分选法与免疫磁珠间断分选法分选人关节软骨CD105+/CD166+间充质干细胞的效能比较
1、本发明的免疫磁珠连续分选法
采用Anti-FITC-Multisort试剂盒，包括以下步骤：
①取原发性骨关节炎患者的第4代培养关节软骨细胞悬液1ml(含1×107个细胞)，置1.5ml塑料离心管中，按稀释度为1∶50加入CD166-FITC抗体，混匀后置4℃冰箱中避光孵育45分钟，再于4℃、300g离心5分钟，弃上清液，用PBS洗涤2次后，加入PBS 80μl重悬，获得CD166+细胞-一抗复合物悬液；
②向步骤①所得CD166+细胞-一抗复合物悬液中加入抗FITC磁珠(Anti-FITC MultiSort MicroBeads)10μl，混匀后置4℃冰箱中孵育30分钟，再于4℃、300g离心5分钟，弃上清液，用PBS洗涤2次后，加入PBS 500μl重悬，获得CD166+细胞-一抗-二抗-磁珠复合物悬液；
③将LD分离柱置miniMACS分选架磁场中，用PBS洗柱后，加入步骤②所得CD166+细胞-一抗-二抗-磁珠复合物悬液，弃流出液(含CD166-细胞)，用PBS洗柱2次；
④从磁场中取出经步骤③处理后的LD分离柱，用PBS反复冲洗，收集冲洗液，于4℃、300g离心5分钟，弃上清液，用PBS洗涤2次后，加入PBS重悬，获得纯化的CD166+细胞-一抗-二抗-磁珠复合物悬液；
⑤按20μl/ml的比例向步骤④所得纯化的CD166+细胞-一抗-二抗-磁珠复合物悬液中加入分离试剂(其作用是中止抗原抗体反应，使CD166+细胞与抗体和磁珠完全解离)，混匀后置4℃冰箱中孵育10分钟，再于4℃、300g离心5分钟，弃上清液，用PBS洗涤2次后，加入PBS 50μl重悬，再加入终止试剂(其作用是使分离试剂丧失活性)30μl并充分混匀，获得CD166+细胞悬液；
⑥向步骤⑤所得CD166+细胞悬液中加入CD105MicroBeads(10μl/106个细胞，细胞体积90μl)，置4℃冰箱中避光孵育30分钟，再于4℃、300g离心5分钟，弃上清液，用PBS洗涤2次后，加入PBS 80μl重悬，获得CD105+/CD166+细胞-一抗复合物悬液；
⑦将步骤⑥所得CD105+/CD166+细胞-一抗复合物悬液重复步骤②～⑤的操作并用MS分离柱替代LD分离柱，即得CD105+/CD166+细胞。
2、现有的免疫磁珠间断分选法
参照文献方法(Alsalameh S et al.Identification of mesenchymal stem cells in normal and osteoarthritis human articular cartilage.Arthritis Rheum，2004，50：1522-1532)进行，包括以下步骤：
①取Dynabeads Pan Mouse IgG二抗磁珠25μl，置10ml塑料离心管中，加入PBS 1ml稀释后，置miniMACS分选架磁场中2分钟，用PBS洗涤2次后移出磁场，加入小鼠抗人CD105抗体0.4μg，混匀后置4℃冰箱中孵育30分钟，再将其置miniMACS分选架磁场中，用PBS 2ml洗涤后移出磁场，获得磁珠-CD105抗体复合物悬液；
②向步骤①所得磁珠-CD105抗体复合物悬液中加入原发性骨关节炎患者的第4代培养关节软骨细胞悬液1ml(含1×107个细胞)，混匀后置4℃冰箱中孵育30分钟(每5分钟轻微震荡1次)，再加入PBS 2ml，混匀后置miniMACS分选架磁场中2分钟，用PBS洗涤2次后移出磁场，获得磁珠-CD105抗体-CD105+细胞复合物悬液；
③将步骤②所得磁珠-CD105抗体-CD105+细胞复合物悬液按照前述关节软骨细胞培养方法孵育5天后，以质量分数为0.25％的胰蛋白酶溶液消化，收集与磁珠-CD105抗体完全解离的CD105+细胞，计数并制备其细胞悬液；
④将步骤③所得CD105+细胞悬液用小鼠抗人CD166抗体按上述步骤①～③所述方法进行分选，即得CD105+/CD166+细胞。
3、检测指标
a、分选周期：记录两种分选方法获取CD105+/CD166+细胞所需操作时间；
b、分选后的细胞活度：常规台盼蓝溶液染色法计算两种分选方法所获细胞总数及台盼蓝拒染率(重复3次)；
c、CD105+/CD166+细胞百分比：将两种分选方法所得CD105+/CD166+细胞按照前述关节软骨细胞培养方法孵育3天后，以质量分数为0.25％的胰蛋白酶溶液消化，收集细胞，按照前述方法进行CD105+/CD166+细胞百分比检测；
d、CD105+/CD166+细胞收获率：按如下公式计算：CD105+/CD166+细胞收获率＝(分选后细胞总数×分选后CD105+/CD166+细胞百分比)/(分选前细胞总数×分选前CD105+/CD166+细胞百分比)。
4、结果
结果见表2和图4。
表2两种免疫磁珠分选法分选关节软骨CD105+/CD166+细胞的效能比较
注：*表示组间比较P＜0.05；**表示组间比较P＜0.01；※表示组间比较P＞0.05。
由表2可知，两种免疫磁珠分选方法在CD166+/CD105+细胞百分比和分选周期上均存在统计学差异(P＜0.05)；而在CD166+/CD105+细胞收获率和分选后细胞活度上均不存在统计学差异(P＞0.05)；提示本发明的免疫磁珠连续分选法法优于现有的免疫磁珠间断分选法。与单标志分离-培养-单标志分离的免疫磁珠间断分选法相比，本发明的双标志免疫磁珠连续分选法采用直接免疫磁珠方法，避免了非特异性的结合，抗原抗体结合的精度更高，从而使分选出的间充质干细胞纯度更高；同时，本发明方法节省了等待磁珠分离的细胞培养时间，避免了培养过程中的细胞表型变化，大大缩短了分选周期。此外，研究还发现，采用两种免疫磁珠分选方法分选出的关节软骨间充质干细胞在贴壁时间及生长速度上没有明显差异，提示持续低温操作对分选细胞的活性基本没有影响。因此，采用本发明的免疫磁珠连续分选法可以高效、省时、简便地获得高纯度的关节软骨间充质干细胞，且细胞活性良好，能够保证后续细胞生物学特性研究和医学临床细胞移植治疗的需要。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
Claims (2)
1.免疫磁珠分选人关节软骨CD105+/CD166+间充质干细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：
①取正常人或原发性骨关节炎患者的关节软骨细胞悬液，加入荧光素标记CD166抗体，混匀后于温度2～6℃避光孵育35～55分钟，再于2～6℃离心，弃上清液，用磷酸盐缓冲液即PBS洗涤并重悬，获得CD166+细胞-一抗复合物悬液；
②向步骤①所得CD166+细胞-一抗复合物悬液中加入抗荧光素免疫磁珠，混匀后于2～6℃孵育20～40分钟，再于2～6℃离心，弃上清液，用PBS洗涤并重悬，获得CD166+细胞-一抗-二抗-磁珠复合物悬液；
③将LD分离柱置磁场中，用PBS洗柱后，加入步骤②所得CD166+细胞-一抗-二抗-磁珠复合物悬液，弃流出液，并用PBS洗柱；
④从磁场中取出经步骤③处理后的LD分离柱，用PBS冲洗，收集冲洗液，于2～6℃离心，弃上清液，用PBS洗涤并重悬，获得纯化的CD166+细胞-一抗-二抗-磁珠复合物悬液；
⑤向步骤④所得纯化的CD166+细胞-一抗-二抗-磁珠复合物悬液中加入分离试剂，于2～6℃孵育5～15分钟中止抗原抗体反应，使CD166+细胞与抗体和磁珠完全解离，再于2～6℃离心，弃上清液，用PBS洗涤并重悬后，加入终止试剂并充分混匀，使分离试剂丧失活性，获得CD166+细胞悬液；
⑥向步骤⑤所得CD166+细胞悬液中加入荧光素标记CD105抗体，于2～6℃避光孵育20～40分钟，再于2～6℃离心，弃上清液，用PBS洗涤并重悬，获得CD 105+/CD166+细胞-一抗复合物悬液；
⑦将步骤⑥所得CD105+/CD166+细胞-一抗复合物悬液重复步骤②～⑤的操作并用MS分离柱替代LD分离柱，即得CD105+/CD166+间充质干细胞悬液。
2.根据权利要求1所述免疫磁珠分选人关节软骨CD105+/CD166+间充质干细胞的方法，其特征在于：所述关节软骨细胞为原代或第4代培养关节软骨细胞。
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| CN103266050A (zh) * | 2013-06-04 | 2013-08-28 | 上海市东方医院 | 用于分选的微流控芯片及其用途 |
| CN103266050B (zh) * | 2013-06-04 | 2016-06-29 | 上海市东方医院 | 用于分选的微流控芯片及其用途 |
| CN111133006A (zh) * | 2017-07-14 | 2020-05-08 | 西托姆克斯治疗公司 | 抗cd166抗体及其用途 |
| CN110314173A (zh) * | 2019-07-17 | 2019-10-11 | 中国医科大学附属第一医院 | 一种用于治疗骨关节炎的细胞制剂及其制备方法 |
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