CN101948536A - 猪传染性胃肠炎病毒、流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体及其制备方法。包括以下步骤：1)免疫用疫苗的制备；2)免疫；3)提取猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体，纯化后，冻干。本发明采用了特别免疫程序，猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体效价高。本发明方法制备的猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体具有效果明显、特异性高、治疗效果迅速、疗效确实、生产成本低等优点，具有良好的应用前景。

Description

猪传染性胃肠炎病毒、流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体及其制备方法 

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体及其制备方法。 

背景技术

猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻是目前证实的引起猪发生腹泻的重要的两个病毒性传染性病。这两种疾病主要对仔猪的影响较大，是引起仔猪死亡的主要病毒性腹泻病。这两种病常常混合感染，在流行病学、临床症状、病理解剖学变化上都非常相似，很难区别到底是哪一种病毒感染，而且发病急速，在发病后近几个小时就可波及全群，主要是造成哺乳期仔猪的大批死亡，给养猪生产造成巨大的损失。 

猪传染性胃肠炎(Porcine Transmissible Gastroenteritis，TGE)是由冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)的猪传染性胃肠炎病毒(Porcine Transmissible Gastroenteritis virus，TGEV)引起的以猪呕吐、腹泻、脱水为特征的传染病，对新生仔猪具有高度致死率，通常为100％。虽然不同年龄的猪对这种病毒均易感，但5周龄以上的猪感染后，死亡率很低。1945年Doyle在美国首次报道了这一疾病以后，世界上许多国家都相继报道了猪传染性胃肠炎。我国从1956年在广东省首次发生这种疾病后，全国大多数省份也有猪传染性胃肠炎的发生，给养猪业带来了严重危害。 

猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhae，PED)是冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)的猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhae virus，PEDV)引起的一种猪肠道传染病，以水泻、呕吐和脱水为特征。各种年龄的猪均易感，哺乳仔猪、架子猪或育肥猪的 发病率可达100％，尤其哺乳仔猪受害最为严重。猪流行性腹泻主要发生在冬季和早春天气较为寒冷的季节，但在夏季也可发生。上世纪70年代初期许多国家相继报道了猪流行性腹泻的发生，我国上世纪80年代开始陆续有发生猪流行性腹泻的报道。 

目前主要用疫苗免疫母猪来预防这两种疾病的发生。由于还没有针对病毒性疾病的特效药物，因此在临床治疗上主要采取对症治疗和用抗生素类药物预防并发症的发生，其治疗效果不理想。此外，由于这两种疾病发病急速，出现腹泻后，仔猪大多由于腹泻而脱水，很快就会衰竭而死亡。因此，在生产中急需一种针对猪传染性胃肠炎、流行性腹泻病毒性疾病均具有特异性、治疗效果好且疗效迅速的治疗制剂。 

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体及其制备方法。 

技术方案

本发明中，所述“PK15”为猪肾细胞，“Vero”为非洲绿猴肾细胞。 

所述“饱和甲醛水溶液”为市售40％甲醛水溶液。 

本发明一方面提供了一种猪传染性胃肠炎、流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体的制备方法。 

为实现本发明目的，本发明技术方案步骤如下： 

1)免疫用疫苗的制备： 

分别用猪肾传代细胞、非洲绿猴肾传代细胞培养猪传染性胃肠炎病毒及猪流行性腹泻病毒，分别浓缩后用作抗原，将两种抗原充分混合后灭活，加入免疫增强剂及白油佐剂，制备油包水型猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒二联灭活疫苗，做为免疫用疫苗； 

2)免疫： 

用步骤1)制备的免疫用疫苗对非免疫产蛋鸡进行多次免疫，免疫 次数≥2，优选地，本发明的免疫次数≥4，本发明实施例中免疫次数为4次。 

3)从步骤2)免疫产蛋鸡产出鸡蛋中收集蛋黄液，提取猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体，纯化后，冻干。 

优选地，本发明所述的传染性胃肠炎病毒抗原的制备包括以下步骤：将传染性胃肠炎病毒液接种在PK15单层细胞上，同时设立不接毒细胞对照，在37℃温度下CO₂培养箱中培养，至75％细胞出现细胞病变时收毒，中和试验测定毒价，浓缩后用作抗原。 

优选地，本发明所述的流行性腹泻病毒抗原的制备包括以下步骤：将流行性腹泻病毒液接种于Vero单层细胞上，同时设立不接毒细胞对照，在37℃温度下CO₂培养箱中培养，至75％细胞出现细胞病变时收毒，中和试验测定毒价，浓缩后用作抗原。 

优选地，本发明所述的步骤1)中猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒按体积比1∶0.8～1∶1.2混合，混合后两种病毒的毒价均≥1.0×10^6.0TCID₅₀/ml。 

优选地，本发明所述的步骤1)中将猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒抗原灭活后，分别加入终浓度为体积比0.01％～0.05％的脂多糖和终浓度为体积比0.2％～0.8％的酵母葡聚糖作为免疫增强剂，与所述病毒液的总体积的2倍量的白油佐剂乳化，制备油包水型猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒二联灭活疫苗作为免疫用疫苗。 

优选地，本发明所述的步骤2)中免疫程序为：在首免前10日，每日用体积比1％～5％的黄芪多糖供鸡饮用，提升鸡体整体免疫力，首免前7日每羽鸡皮下注射牛结核分枝杆菌多糖核酸0.1～0.5ml、弗氏完全佐剂100～300μg，进行免疫剌激。 

首免时胸部肌肉多点注射免疫用疫苗1～2ml；2周后进行二免，注射免疫用疫苗1～2ml及牛结核分枝杆菌多糖核酸0.1～0.5ml；再隔2周后进行三免，注射免疫用疫苗2～4ml及牛结核分枝杆菌多糖核酸0.2～0.8ml；再隔4～8周后进行四免，注射免疫用疫苗2～4ml。 

优选地，本发明所述的步骤3)中二免后1周开始每隔7天抽样测定高免鸡蛋蛋黄中抗猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒特异抗体效价；抗体效价均达到1∶128以上收集蛋黄，用于制备猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体。 

优选地，本发明所述的步骤3)中充分搅拌使蛋黄呈均匀膏状，加入等体积经灭菌并冷却的蒸馏水，搅拌混匀，灭活；在隔层反应罐中加入相当于原蛋黄6倍体积的pH值为4.2的灭菌蒸馏水，并降温至1～4℃，然后将灭活的蛋黄液加入，边加边搅拌，4～8℃静置4h；离心分离上清液并转入另一反应罐中，按体积比为总量的0.2％加入辛酸，搅拌均匀，室温放置2～4h；用滤布过滤后，再用K型多层板框过滤至澄清，按体积比为总量的0.1％加入饱和甲醛水溶液于上述滤液中，充分搅拌混匀，室温放置24h，期间振摇数次，过滤除菌，用截留分子量为1000KDa的超滤膜过滤除病毒，即可得到提纯的猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体。 

优选地，本发明所述的步骤3)中抗体效价检测步骤如下： 

将收集的蛋黄液用浓度为0.01mol/L pH为7.2的磷酸盐缓冲液倍比稀释后加入琼脂凝胶周围孔中，中间孔中加入步骤一中经离心浓缩纯化的猪传染性胃肠炎病毒(或流行性腹泻病毒)抗原，置湿盒中37℃温箱反应24h，以出现沉淀带的最高稀释度的蛋黄液为该蛋黄液的猪传染性胃肠炎病毒(或流行性腹泻病毒)的抗体效价。 

优选地，本发明所述的猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体为冻干二联蛋黄抗体。 

优选地，本发明所述的步骤3)中猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体冻干程序是：将提纯并经检验合格的蛋黄抗体液小量分装于西林瓶，于冻干机上冻干过夜，冻干过程中温度最低降至-38℃，维持3～4h至完全冻干，然后逐渐恢复至室温，取出贮存于4℃。 

本发明另一方面是提供了一种猪传染性胃肠炎病毒、流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体。 

本发明的又一方面为猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体在猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻疾病临床治疗及预防中的应用。 

技术效果

与现有技术相比，本发明的猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体及其制备方法，具有以下有益效果： 

本发明采用的免疫程序，保证了在首免后12～16周猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体都可达1∶512，两种的抗体效价同时获得较高的水平，从而实现对二种疾病——猪传染性胃肠炎和流行性腹泻同时起到治疗和预防的效果。其次，由于获得蛋黄二联抗体，与单独病毒的蛋黄抗体相比，还具有生产程序简单，生产成本降低的优点。 

本发明猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体进行动物试验，实验动物为1日龄未吃初乳的仔猪，试验组动物用猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒口服攻毒，然后口服饲喂本发明的猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体。另设攻毒未用抗体组、不攻毒未用抗体组、不攻毒用抗体组3组作为对照试验，结果表明：本发明猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体对猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒引起的仔猪腹泻具有明显的治疗作用，稀释成1∶32后饲喂攻毒的1日龄小猪，对小猪保护率100％。 

猪流行性腹泻病毒与猪传染性胃肠炎病毒同属冠状病毒科，二者致病的临床症状又极其相似，且一般呈混合感染，各个年龄的猪均可感染，最明显的特征就是水泻，发病率较高，仔猪死亡率较高。其作用机理一般都是吸附于小肠粘膜上，感染上皮细胞而使小肠吸收和代谢紊乱，造成腹泻的发生。因此，提高猪小肠局部免疫能力，抑制病原在小肠粘膜的吸附和增殖是治疗和预防传染性胃肠炎和流行性腹泻的关键。本发明猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒二 联蛋黄抗体通过口服直接被小肠吸收，提高了小肠的局部免疫力，抑制了病原对小肠粘膜的吸附和增殖。 

由上可以看出，与现有技术比较，用本发明方法提供了一种猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体的制备方法。本发明方法制备的猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体，用于预防和治疗猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻这两种疾病，攻毒对比实验结果表明：蛋黄抗体治疗组仔猪腹泻症状则明显减轻，一周左右逐渐恢复，未出现死亡情况。本发明所述猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体具有治疗效果迅速、疗效显著的优点。 

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。 

实施例1猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体的制备 

1.免疫用疫苗的制备： 

1.1传染性胃肠炎病毒增殖及抗原的制备 

将传染性胃肠炎病毒液接种3瓶PK15细胞，每瓶细胞接种1ml病毒液，瓶底面积25cm²，盖好瓶盖，横卧瓶管轻轻转动，使病毒液与整个细胞单层充分接触，在37℃温度下吸附40min，其间每隔10min晃动1次，无需吸弃病毒液，直接加含2％胎牛血清的DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle Medium)细胞维持培养液5ml，同时设立细胞对照，在37℃温度下CO₂培养箱中培养。24h后倒掉维持液 进行换液。逐日观察细胞病变，若72h后感染细胞病变不明显，则收获细胞悬液-20～20℃反复冻融3次后在4℃条件下3000rpm离心30min取上层清液继续在细胞上盲传，盲传至第二代出现细胞病变，至75％细胞出现细胞病变时收毒，-20～20℃反复冻融3次，然后在4℃条件下，3000rpm离心30min，除去细胞碎片，收集上层清液，浓缩后用作抗原。 

1.2流行性腹泻病毒增殖及抗原的制备 

将流行性腹泻病毒液接种于Vero细胞单层上，同时设立细胞对照，37℃CO₂培养箱中培养。逐日观察细胞病变，若72h后感染细胞病变不明显，则收获细胞悬液-20～20℃反复冻融3次后于4℃条件下3000rpm离心30min，取上层清液继续在细胞上盲传，盲传至第三代出现细胞病变，至75％细胞出现细胞病变时，表现为细胞融合和圆缩，部分细胞脱落，出现空斑化。此时收获细胞悬液，-20～20℃反复冻融3次后在4℃条件下，3000rpm离心30min，除去细胞碎片，收集上清液，浓缩后用作抗原。 

1.3疫苗的制备： 

猪传染性胃肠炎病毒抗原和流行性腹泻病毒抗原按体积比1∶1.03混合，混合后两种病毒抗原的毒价均为1.0×10^6.3TCID₅₀/ml。分别加入终浓度为体积比0.03％的脂多糖和终浓度为体积比0.5％的酵母葡聚糖作为免疫增强剂，与2倍量的白油佐剂乳化，制备油包水型猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒二联灭活疫苗作为免疫用疫苗。 

2.免疫非免疫产蛋鸡 

免疫程序为：在首免前10日，每日用体积比3％的黄芪多糖供鸡饮用，提升鸡体整体免疫力，首免前7日每羽鸡皮下注射“牛结核分枝杆菌多糖核酸”0.2ml、弗氏完全佐剂200μg，进行免疫剌激。 

首免时胸部肌肉多点注射免疫用疫苗1ml；2周后进行二免，注射 免疫用疫苗1ml及“牛结核分枝杆菌多糖核酸”0.2ml；再隔2周后进行三免，注射免疫用疫苗2ml及“牛结核分枝杆菌多糖核酸”0.4ml；再隔6周后进行四免，注射免疫用疫苗2ml。 

3.二联蛋黄抗体制备 

3.1蛋黄的收获及灭活： 

二免后1周开始收集经抽检合格的免疫鸡所产高免鸡蛋，将蛋壳消毒，采取手工或机械打蛋。充分除去蛋清(白)、胚盘和系带，收集蛋黄。充分搅拌使蛋黄呈均匀膏状，加入等体积经121℃30min灭菌并冷却的蒸馏水，搅拌混匀，62.5℃加热灭活30min。 

3.2抗体的酸化蒸馏水法提纯： 

先在隔层反应罐中加入相当于原蛋黄6倍体积的pH值为4.2的灭菌蒸馏水，并降温至4℃。然后，将灭活的蛋黄液加入，边加边搅拌，4℃静置4h。管式低温连续离心机14000rpm离心分离上清液并转入另一反应罐中。 

3.3抗体的辛酸法提纯： 

按体积比为总量的0.2％加入辛酸，搅拌均匀，室温放置4h。用滤布过滤后，再用K型多层板框过滤至澄清，再按体积比为总量的0.1％加入饱和甲醛溶液于上述滤液中，充分搅拌混匀，室温放置24h，期间振摇数次。 

3.4过滤除菌： 

用0.22μm微孔滤芯过滤除菌。用截留分子量为1000KDa的超滤膜过滤除病毒。 

4.提纯的蛋黄抗体冻干 

将提纯并经检验合格的蛋黄抗体液小量分装于西林瓶，于冻干机上冻干过夜，冻干过程中温度最低降至-38℃，维持4h至完全冻干，然后逐渐恢复至室温，取出贮存于4℃。 

实施例2猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体效价检测 

1.实验准备  猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒标准阳性血清，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供；抗原，由实施例1制备；琼脂糖、打孔器、16#针头、剪刀、镊子、酒精灯、记号笔、洁净平皿、水浴锅。 

2.猪传染性胃肠炎病毒(或流行性腹泻病毒)琼扩抗原的制备：用聚乙二醇(PEG-20000)干粉包埋透析袋进行抗原浓缩。 

透析袋的处理方法：0.5mol/L EDTA-2Na 1ml加10g碳酸氢钠，补蒸馏水至500ml，pH值调至8.0；透析袋放上述液体中煮沸10min；取出透析袋蒸馏水清洗干净，再放蒸馏水中煮沸10min；将40ml病毒液倒入处理后的透析袋中，扎紧袋口，放在干净铝盒中，用聚乙二醇(PEG-20000)干粉包埋透析袋，放4℃透析。观察透析袋中液体剩余3～4ml时取出，吸出浓缩的抗原即为制备的琼扩抗原。 

3.1％琼脂糖平板的准备 

取浓度为0.01mol/L，pH为7.2的磷酸盐缓冲液100ml，加1g琼脂糖，8.0g的NaCl，煮沸融化后滤去沉淀，加0.01％的硫柳汞防腐，冷却到50℃左右胶制琼脂板。在直径90mm的平皿中注加融化的琼脂糖16ml。琼脂糖厚度不少于2.8mm，4℃冷却后打孔。 

4.操作步骤 

4.1取琼脂糖平板用六角形七孔模具打孔，孔径5mm，孔距为3mm。琼脂用打孔器打孔后，在酒精灯外焰上过一下，对孔的底部进行封口，以防蛋黄液渗漏。 

4.2抗原标定 

中间孔加猪传染性胃肠炎病毒(或流行性腹泻病毒)标准阳性血 清，周围孔从最上方孔开始依次加入抗原原液、2倍稀释的抗原、4倍稀释的抗原、8倍稀释的抗原、16倍稀释的抗原、32倍稀释的抗原。每孔加液40μl，加样完毕后，将琼脂糖板放在铺有湿纱布的带盖容器中，并用支持物将琼脂糖平板放稳，置37℃温箱湿盒内反应24～72h，直至沉淀线产生。以出现沉淀线最明显的稀释度的抗原作为标准抗原。 

4.3抗体效价的测定 

将收获的待测定抗体效价的蛋黄液用0.01mol/L pH为7.2的磷酸盐缓冲液作倍比稀释，稀释度分别为1倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍及更高的稀释倍数。中间孔中加入标定的猪传染性胃肠炎病毒(或流行性腹泻病毒)抗原，周围孔中加入不同稀释度的抗体，其中1孔加入标准阳性血清，每孔加液40μl，加样完毕后，将琼脂糖板放在铺有湿纱布的带盖容器中，并用支持物将琼脂糖平板放稳，置37℃温箱湿盒内反应24～72h，直至沉淀线产生。以观察到沉淀线的抗体最大稀释倍数为检测样品的抗体效价。 

5.结果判定 

阳性血清与对应抗原孔中间形成一条清晰、致密的沉淀线时，才能进行判定。 

阳性：被检蛋黄液与抗原孔中间形成沉淀线，并与阳性血清沉淀线弯曲环连，判为阳性(+)。 

可疑：沉淀线不清晰或阳性对照沉淀线向被检血清孔微弯时，判为可疑(±)。可疑样品应予重检，重检结果相同时应判为阳性(+)。 

阴性：无沉淀线出现为阴性。沉淀线与阳性对照沉淀线交叉或不相连时，均属非特异性反应。判为阴性(-)。 

6.检测结果： 

二免后1周采集蛋黄液检测，以后每隔7天检测一次，一直到首 免后24周。结果显示，采用本发明的免疫程序，在首免后12～16周猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体效价都可达1∶512，首免后3～24周，猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体效价均≥1∶256。 

实施例3猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体治疗试验 

取1日龄未吃初乳仔猪16头，试验动物房温度控制在25～30℃，采用人工哺乳方法，每隔2h饲喂1次牛奶，饲喂观察1天后随机分为4个小组，分别为：攻毒治疗组(4头)、攻毒不治疗组(4头)、治疗不攻毒组(4头)和不治疗不攻毒组(4头)。攻毒所用病毒为超滤的猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒，经浓度为0.01mol/L pH为7.2的磷酸盐缓冲液10倍稀释后直接口服，攻毒剂量为最小发病量的5倍，每头仔猪攻毒剂量相同，观察仔猪攻毒后的腹泻情况。待仔猪刚开始出现腹泻症状时治疗组饲喂猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体，治疗所用蛋黄抗体为提纯级样品，琼脂扩散试验测定蛋黄抗体效价为1∶32。不治疗组饲喂等量生理盐水，逐日观察每头仔猪腹泻症状和猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体治疗效果，以粪便指数和死亡率2个指标判断治疗效果。粪便指数按照Sherman等(Sherman D M，Acres S D，Sadowski P L，et al.Protection of calves against fatal enteric colibacillosis by orally administered Escherichia coli K99-specipic monoclonal antibody[J].Infect Immun，1974，10：770-782.)制定的标准判定，即0分为正常，粪便固态成形；1分为轻度腹泻，粪便稀软成形；2分为中度腹泻，粪便呈黄色水样；3分为重度腹泻，粪便呈水样喷射。 

攻毒后12～24h所有仔猪均出现不同程度的黄色水泻，攻毒治疗组在口服猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体1天后腹泻症状减轻，2天后变为黄色稀粪，3天后粪便变粘稠，4～5天后变为成形的软粪；不攻毒治疗组与不攻毒不治疗组仔猪精神状态正常，无腹泻症状；攻毒不治疗组仔猪腹泻呈水样喷射，2～3天后因极度脱水死亡。结果见表1。 

表1仔猪攻毒治疗后不同天数死亡情况及粪便指数 

注：分母为存活仔猪数，分子为腹泻仔猪数；括号内为平均粪便指数 

试验结果表明：不攻毒的两组仔猪未出现腹泻症状；攻毒不治疗组仔猪在第一天就出现严重的腹泻症状，粪便呈水状喷射，仔猪迅速消瘦，仔猪3天全部死亡；攻毒治疗组仔猪在出现腹泻症状，用蛋黄抗体治疗后，该组仔猪腹泻症状则明显减轻，粪便由黄色水样腹泻变为黄色稀粪，后逐渐成形，一周左右恢复健康，未出现死亡情况。 

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 

Claims (11)

1.一种猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)免疫用疫苗的制备：

分别用猪肾传代细胞、非洲绿猴肾传代细胞培养猪传染性胃肠炎病毒及猪流行性腹泻病毒，分别浓缩后用作抗原，将两种抗原充分混合后灭活，加入免疫增强剂及白油佐剂，制备油包水型猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒二联灭活疫苗，做为免疫用疫苗；

2)免疫：

用步骤1)制备的免疫用疫苗对非免疫产蛋鸡进行免疫，免疫次数≥2；

3)从步骤2)免疫产蛋鸡产出鸡蛋中收集蛋黄液，提取猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体，纯化后，冻干。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中猪传染性胃肠炎病毒抗原的制备包括以下步骤：将传染性胃肠炎病毒液接种在PK15单层细胞上，同时设立不接毒细胞对照，在37℃温度下CO₂培养箱中培养，至75％细胞出现细胞病变时收毒，中和试验测定毒价，浓缩后用作抗原。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤1)中流行性腹泻病毒抗原的制备包括以下步骤：将流行性腹泻病毒液接种于Vero单层细胞上，同时设立不接毒细胞对照，在37℃温度下CO₂培养箱中培养，至75％细胞出现细胞病变时收毒，中和试验测定毒价，浓缩后用作抗原。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中猪传染性胃肠炎病毒抗原和流行性腹泻病毒抗原按体积比1∶0.8～1∶1.2混合，混合后两种病毒抗原的毒价均≥1.0×10^6.0TCID₅₀/ml。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中将猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒混合抗原灭活后，分别加入体积比0.01％～0.05％的脂多糖和体积比0.2％～0.8％的酵母葡聚糖作为免疫增强剂，与所述病毒液的总体积2倍量的白油佐剂乳化，制备油包水型猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒二联灭活疫苗作为免疫用疫苗。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中免疫程序为：在首免前10日，每日用体积比1％～5％的黄芪多糖供鸡饮用，提升鸡体整体免疫力，首免前7日每羽鸡皮下注射牛结核分枝杆菌多糖核酸0.1～0.5ml、弗氏完全佐剂100～300μg，进行免疫剌激；

首免时胸部肌肉多点注射免疫用疫苗1～2ml；2周后进行二免，注射免疫用疫苗1～2ml及牛结核分枝杆菌多糖核酸0.1～0.5ml；再隔2周后进行三免，注射免疫用疫苗2～4ml及牛结核分枝杆菌多糖核酸0.2～0.8ml；再隔4～8周后进行四免，注射免疫用疫苗2～4ml。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中二免后1周开始每隔7天抽样测定高免鸡蛋蛋黄中抗猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒特异抗体效价；抗体效价均达到1∶128以上收集蛋黄，用于制备猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中充分搅拌使蛋黄呈均匀膏状，加入等体积经灭菌并冷却的蒸馏水，搅拌混匀，灭活；在隔层反应罐中加入相当于原蛋黄6倍体积的pH值为4.2的灭菌蒸馏水，并降温至1～4℃，然后将灭活的蛋黄液加入，边加边搅拌，4～8℃静置4h；离心分离上清液并转入另一反应罐中，按体积比为总量的0.2％加入辛酸，搅拌均匀，室温放置2～4h；用滤布过滤后，再用K型多层板框过滤至澄清，按体积比为总量的0.1％加入饱和甲醛水溶液于上述滤液中，充分搅拌混匀，室温放置24h，期间振摇数次，过滤除菌，用截留分子量为1000KDa的超滤膜过滤除病毒，即可得到提纯的猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体。

9.一种由权利要求1～8任意一项方法制备的猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体。

10.根据权利要求9所述的猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体，其特征在于，所述二联蛋黄抗体为冻干二联蛋黄抗体。

11.如权利要求9所述的猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体在猪传染性胃肠炎和流行性腹泻疾病的临床治疗及预防中的应用。