CN101946734A

CN101946734A - 一种鲍鱼育苗方法

Info

Publication number: CN101946734A
Application number: CN2010102707644A
Authority: CN
Inventors: 蔡俊鹏; 李娜
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2010-08-31
Filing date: 2010-08-31
Publication date: 2011-01-19
Anticipated expiration: 2030-08-31
Also published as: CN101946734B

Abstract

本发明提供一种鲍鱼育苗方法。该方法是在育苗过程中，每过5～40天将养殖水体更换一次，并同时向养殖水体中添加由光合细菌和芽孢杆菌组成的复合菌液，使水体中复合菌液终浓度达到10²～10⁸cfu/ml。本发明的方法能提高鲍苗的免疫力，使鲍苗成活率显著提高，同时能促进鲍鱼快速生长，降低生产成本，提高经济效益，从而克服了目前流水养殖模式对能源和资源的巨大耗费、全封闭养殖中鲍苗生长率不高、采用配合饲料和抗生素饲养所造成的养殖水域污染，抗生素在鲍鱼中残留等问题。

Description

一种鲍鱼育苗方法

技术领域

本发明涉及海水贝类养殖技术领域，具体涉及鲍鱼育苗方法，特别涉及一种利用光合细菌(Photosynthetic bacteria，PSB)和芽孢杆菌(Bacillus)提高育苗过程中鲍鱼幼苗成活率的方法。

背景技术

鲍鱼是传统的名贵食材，肉质鲜美，营养丰富，素称“海味之冠”，是海产八珍之一，也是四大海味之首。近年来，随着人们生活水平的提高，市场对鲍鱼的需求量在增加，鲍鱼育苗也成为了水产养殖领域中倍受人们关注的环节。但是目前在鲍鱼的育苗过程中存在着很多问题，如水体中致病菌、有害物质的大量富集导致幼苗壳长及体重增长缓慢，各种病害的增加也使得幼苗成活率低，育苗成本增加，从而给养殖户带来了消极的影响。

流水养殖是较普遍的生产模式，但这种养殖模式对饲料及药品的耗费都较大，需要消耗大量的海水及能源，而且一旦出现灾害性天气(如雨季-造成低密度海水、风暴等)或海况恶化(赤潮等)，则即使有足够的设备也难以保证正常供水，甚至连续几天无法抽水，影响了育苗车间的正常运转。

全封闭式养殖虽然耗水少，且不易污染海洋环境，但不利于废物的排出，在一定程度上限制了鲍苗生长率的提高。同时，投资大，运行成本高，不易被广大养殖户所接受。

各种新型配合饲料的研制和抗生素的使用也是目前水产养殖业较为常用的养殖模式，但是抗生素的使用会在鲍鱼中有残留，而配合饲料却见效慢、生产效率低、容易污染养殖水域，这些都直接影响了育苗的经济效益。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种能提高鲍鱼幼苗免疫力与成活率的育苗方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种鲍鱼育苗方法，包含以下步骤：

(1)制备复合菌液：分别将光合细菌和芽孢杆菌活化，培养至对数生长期，离心，取沉淀，然后用磷酸盐缓冲溶液悬浮沉淀，分别得到光合细菌溶液和芽孢杆菌溶液，将二者混合，得到复合菌液；

(2)选池培藻：对育苗池进行消毒处理，加装遮光装置和曝气装置，在布卵前开始培藻；

(3)布卵与育苗：往育苗池中布卵，育苗过程中每过5～40天换一次水，并往养殖水体中添加营养盐和步骤(1)制备得到的复合菌液；

(4)采收：经过培育，剥离稚孢，得到鲍鱼苗。

步骤(1)中所述光合细菌为红假单胞菌(Rhodopseudomonas sp.，保藏编号为CGMCC1.2193，购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心)或沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris，保藏编号为CGMCC1.2349，购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心)中的至少一种；所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis(Ehrenberg)Cohn，保藏编号为GIM1.136，购买于广东省微生物研究所)；

步骤(1)中所述光合细菌活化的方法为将光合细菌按体积百分比0.1％接种到RCVBN液体培养基中，于30℃、光照强度为3000lx下光照厌氧培养48h，得到活化的光合细菌菌液；所述芽孢杆菌活化的方法为将芽孢杆菌按体积百分比0.1％接种到营养肉汤培养基中，于37℃、250rpm摇床培养18h，得到活化的芽孢杆菌菌液；

步骤(1)中所述光合细菌培养的方法为将活化的光合细菌菌液按体积百分比10％接种到RCVBN培养基中，光照厌氧发酵培养48～96h，期间搅拌，然后5000～8000rpm离心5～15min后取沉淀，用磷酸盐缓冲溶液悬浮沉淀获得处于对数生长期的浓度为10⁸～10¹²cfu/ml的光合细菌菌液；所述芽孢杆菌培养的方法为将活化的芽孢杆菌菌液按体积百分比10％接种到营养肉汤培养基中，置于37℃、250rpm摇床培养24h，然后5000～8000rpm离心5～15min后取沉淀，用磷酸盐缓冲溶液悬浮沉淀获得处于对数生长期的浓度为10⁸～10¹²cfu/ml的芽孢杆菌菌液；

步骤(1)中所述复合菌液是由等菌液浓度等体积的光合细菌溶液与芽孢杆菌溶液混合得到；

步骤(2)中所述对育苗池的消毒处理是指将育苗池彻底洗刷干净后，采用质量百分比为10％的高锰酸钾溶液消毒；

步骤(2)中所述加装遮光装置是在育苗池上方盖一层遮光率为60％的黑色遮阳网，使光照率为3500～5000lux；所述加装曝气装置是在育苗池池两边等距离对称放置输气管各4条；

步骤(2)所述培藻是在布卵前40～45天开始培藻；

步骤(2)所述培藻的条件和方法为：育苗池水温控制在15～20℃，均匀投放藻种到附着基上，将附着基均匀排放在养殖池中培养，曝气，培藻过程中不断地将附着基上的老化藻搓洗掉，直至布卵前10天最后一次搓洗，搓洗后培养十天再布卵，所述附着基为黄色聚乙烯波纹板。

步骤(3)中所述布卵是布鲍鱼卵，布卵密度为每立方米水体中布卵10000～30000粒；

步骤(3)中所述营养盐是指硅藻营养元素(N∶P∶Si∶Fe＝5∶1∶1∶1)，育苗过程中营养盐每2～4天添加一次，每次投放量为3～5g/m³养殖水体；

步骤(3)中所述育苗条件是光照控制在2200～3000lux，水温控制在20～25℃；

步骤(3)中所述添加复合菌液是每次换水后都加入步骤(1)制备得到的复合菌液，使水体中混合菌液终浓度达到10²～10⁸cfu/ml；

步骤(4)中所述的培育，其培育时间为35～45天。

光合细菌(Photosynthetic bacteria，PSB)细胞含有62％蛋白质，丰富的VB1、VB2、VB3和能促进动物生长的生物素，而且无毒、易消化，是优良的饲料添加剂，有利于增强鲍鱼的免疫功能和抗病力；此外，光合细菌能净化氨氮、亚硝基氨及降解有机物，能将养殖水域的水质保持在一个清洁的水平。芽孢杆菌(Bacillus)是常用的益生菌之一，可以抑制病原微生物的生长。光合细菌与芽孢杆菌的协同使用能够提高水产动物的生长率和成活率，还能够达到改善水质，减少病害的目的。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

1、本发明复合菌液的制备方法简单，工序少，可有效降低成本。

2、本发明复合菌液可提高鲍鱼的免疫力，使鲍苗成活率显著提高，同时能促进鲍鱼快速生长，降低生产成本，提高经济效益。

3、本发明的鲍鱼育苗方法能避免滥用抗生素所带来的副作用，以及使用配合饲料所带来的海水污染问题。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例

本发明的具体实施地点为山东省某育苗场，实施时间85天，试验地海域的具体水源水质符合中华人民共和国国家标准渔业水质标准(GB11607-89)要求，海水经过砂滤、沉淀处理后进入养殖池，符合农业部《无公害食品海水养殖用水水质》(NY5052-2001)要求。鲍鱼的养殖池建在养殖大棚内，育苗池的规格为2.5×2×0.75m³。

育苗依照以下步骤进行：

(1)制备复合菌液

取红假单胞菌(Rhodopseudomonas sp.)(购于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC1.2193)，按体积百分比0.1％接种到RCVBN液体培养基中，于30℃、光照强度为3000lx下光照厌氧培养48h，得到活化的红假单胞菌菌液；将活化的红假单胞菌菌液按体积百分比10％接种到RCVBN培养基中，光照厌氧发酵培养72h，期间加以搅拌，然后6500rpm离心10min后取沉淀，用磷酸盐缓冲溶液悬浮沉淀获得处于对数生长期的浓度为10⁸～10¹²cfu/ml的红假单胞菌菌液；

取枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis(Ehrenberg)Cohn)(购于广东省微生物研究所，保藏编号GIM1.136)，按体积百分比0.1％接种到营养肉汤培养基(蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化钠5g，pH 7.4±0.2，下同)中，于37℃、250rpm摇床培养18h，得到活化的枯草芽孢杆菌菌液；将活化的枯草芽孢杆菌菌液按体积百分比10％接种到营养肉汤培养基中，置于37℃、250rpm摇床培养24h，然后6500rpm离心10min后取沉淀，用磷酸盐缓冲溶液悬浮沉淀获得处于对数生长期的浓度为10⁸～10¹²cfu/ml的枯草芽孢杆菌菌液；

将等菌液浓度等体积的红假单胞菌溶液与枯草芽孢杆菌溶液混合，得到复合菌液。

(2)选池培藻

将育苗池彻底洗刷干净后，采用质量百分比为10％的高锰酸钾溶液消毒，再用水冲洗干净。在育苗池上方盖一层遮光率为60％的黑色遮阳网，使光照率为3500～5000lux，在育苗池两边等距离对称放置输气管各4条。

在布卵前45天开始培藻，水温控制在15～20℃，附着基为黄色聚乙烯波纹板，投放藻(藻种由山东烟台龙口黄山馆永和育苗场保存并提供)到波纹板上，将波纹板均匀排放在养殖池中培养，适度曝气，曝气量为10～100L/h/m³，培藻过程中不断地将附着基上的老化藻搓洗掉，直至布卵前10天最后一次搓洗，搓洗后培养十天再布卵。

(3)布卵与育苗

鲍苗为皱纹盘鲍，每池布卵5万粒。根据藻的生长状态，添加硅藻营养元素(购于厦门健成水产科技研究所)，2～4天添加一次，每次投放量为3～5g/m³养殖水体。育苗过程中，光照控制在2200～3000lux，水温控制在20～25℃，每过5～40天换一次水，每次换水后都加入步骤(1)制备得到的复合菌液，使水体中混合菌液终浓度达到10²～10⁸cfu/ml。

(4)采收

经过40天的培育，此时波纹板上的藻类已部分老化，少数板上的藻已被吃光，稚鲍体长已长至3.89-5.69mm，前期育苗结束，将稚鲍从波纹板上剥离。

试验结束时分别进行鲍鱼苗的生长指标，免疫力相关酶指标的检测。

育苗阶段采用随机区组试验设计，分为3个试验组(A～C)，每组2个重复。三个实验组的分配如下：

A组：采用流水育苗，匀速流水，日换水量为池水量的2倍，不添加菌液；

B组：不流水，不加菌液，定期换水；

C组：不流水，定期换水，且每次换水之后向育苗水体中加入不同浓度的复合菌液。

B组分为B1～B8组，其中：

B1组为不加菌液，5天换一次水；

B2组为不加菌液，10天换一次水；

B3组为不加菌液，15天换一次水；

B4组为不加菌液，20天换一次水；

B5组为不加菌液，25天换一次水；

B6组为不加菌液，30天换一次水；

B7组为不加菌液，35天换一次水；

B8组为不加菌液，40天换一次水。

C组也分为C1～C8组，C1再分为C1-1，C1-2，C1-3，C1-4组；C2则分为C2-1，C2-2，C2-3，C2-4组；C3分为C3-1，C3-2，C3-3，C3-4组...C8分为C8-1，C8-2，C8-3，C8-4组。

C1，C2，C3...C7，C8同B组的换水频率，分别指以5天，10天，15天...35天，40天换一次水。而C1分成的四组C1-1，C1-2，C1-3，C1-4分别指代以下的设置组：

C1-1：5天换水，加入10²cfu/ml的复合菌液；

C1-2：5天换水，加入10⁴cfu/ml的复合菌液；

C1-3：5天换水，加入10⁶cfu/ml的复合菌液；

C1-4：5天换水，加入10⁸cfu/ml的复合菌液。

同理：

C2-1：10天换水，加入10²cfu/ml的复合菌液；

C2-2：10天换水，加入10⁴cfu/ml的复合菌液；

C2-3：10天换水，加入10⁶cfu/ml的复合菌液；

C2-4：10天换水，加入10⁸cfu/ml的复合菌液。

.........

C8-1：40天换水，加入10²cfu/ml的复合菌液；

C8-2：40天换水，加入10⁴cfu/ml的复合菌液；

C8-3：40天换水，加入10⁶cfu/ml的复合菌液；

C8-4：40天换水，加入10⁸cfu/ml的复合菌液。

一、鲍鱼苗的生长指标检测

测定方法如下：

(1)平均壳长的测定：每组中随机抽取50粒鲍苗，采用精密度为1mm的游标卡尺度量测量壳长，取平均值。

(2)壳长平均日增长量：收苗平均壳长，取40天的平均值。

(3)鲍苗平均个体重量：随机抽取50粒鲍苗，称其总重后取平均值。

(4)收苗量：称取5g鲍苗，计算其粒数，将收集的鲍苗称其总重，后估算鲍苗的粒数。

(5)成活率：试验结束时鲍苗量占该阶段投苗量的百分率。

结果如下：

表一流水工业生产A组与对照组B组生长指标的检测

从表一可以看出，与工业流水生产的A组相比，B组的成活率、至少降低了6％，体重、壳长日增长量也至少降低了0.45mg、4.25μm，说明在不做任何处理的情况下，5天不换水就会影响鲍鱼的正常生长，且随着换水周期的延长，B组中各个生长指标值相继降低，当换水周期长达40天时，成活率、壳长日增长量、体重最低降至42.56％、97.25μm，7.32mg。

表二10²cfu/ml混合液、不同换水周期生产组指标检测

表三10⁴cfu/ml混合液、不同换水周期生产组指标检测

表四10⁶cfu/ml混合液、不同换水周期生产组指标检测

表五10⁸cfu/ml混合液、不同换水周期生产组指标检测

而C组中，在加入相同浓度的复合菌液的情况下，以5天，10天，15天，20天，25天，30天，35天，40天为换水周期的各个组的成活率、壳长、壳长增长率、壳长日增长量和体重都没有显著差异，且与A组相比有明显提高，说明在育苗水体中加入浓度为10²～10⁸cfu/ml的复合菌液，能达到提高成活率及各项生长指标的效果，使5～40天之内不换水对成活率、壳长增长率、壳长日增长量和体重影响不大，加入菌液的C组与工业流水生产的A组相比，可达到促进生长，节约成本，提高经济效益的目的。

在C组中，同一个换水周期下，加入的复合菌液的浓度越高，对鲍苗生长的促进作用越明显。且在每一个换水周期下，加入10⁸cfu/ml混合菌液组的成活率、壳长增长率、壳长日增长量和体重与只换水，不加菌的B组相比，差值都达到了最大。从表中数据可知五天换一次水，加入10⁸cfu/ml混合菌液的C1～4组其鲍苗的生长状态是最好的，但考虑到加入菌液后不同的换水周期对鲍苗的生长影响并不大，且40天换水与5天换水并没有明显差异，为节约成本，40天换一次水，加入10⁸cfu/ml复合菌液的育苗方法较为理想。

二、鲍鱼苗免疫力相关酶指标的检测

试验结束后每组取样20个鲍鱼苗，去壳，4个/管放于5管分别盛有1mLHank’s缓冲液(pH值7.8)的Eppendoff管中，贮于-80℃以备抗免疫指标的测定。测定时取出样品，使其在冰上融化。融化后进行匀浆，之后6000r/min、-4℃离心5min.取上清用于免疫指标的测定。

①酚氧化物酶的测定方法

酚氧化物酶的活性测定是通过测定样品与L-DOPA反应生成的多巴胺的吸光值来计算的。把100μl样品加入到1.5mL的Eppendorf管中，加入用PBS配制的0.5mg/mL的海藻酸钠溶液，在26～27℃下反应30min，然后加入50μl的用PBS配制的3mg/mL的L-DOPA，反应10min后，在490nm处读取吸光值。每个样品重复测定三次。对照液用相应的PBS代替海藻酸钠。

②溶菌酶活性的测定

溶菌酶活性的测定用琼脂平板法。用1％的琼脂浇灌平板，待其凝固后，把混旋于PBS的溶壁微球菌均匀的涂布到平板上，把直径为4mm的滤纸圈放到平板上，每个纸片上加入30μl的样品，每个样品重复三次。在37℃下孵育18h，测定抑菌圈的直径。

③SOD的测定

SOD酶活力单位定义为每mL反应液中SOD抑制率达50％时所对应的SOD量。

表六流水工业生产A组与对照组B组免疫力

表七10²cfu/mL混合液，不同换水周期生产组免疫力

表八10⁴cfu/mL混合液，不同换水周期生产组免疫力

表九10⁶cfu/mL混合液、不同换水周期生产组免疫力

表十10⁸cfu/mL混合液、不同换水周期生产组免疫力

由表六～表十所示，C组中，在加入相同浓度的复合菌液的情况下，以5天，10天，15天，20天，25天，30天，35天，40天为换水周期的各个组的溶菌酶活力、酚氧化酶(PO)活力、SOD活性都没有显著差异。

在同一个换水周期下，C组与只换水不加菌的B组相比，加入任何一个浓度的混合菌液都能使鲍苗的免疫力明显提高。C组与流水工业生产的A组相比，所加入的菌液浓度越高，免疫力的提高越明显，其中效果最好的为C1～4组。

综上所述，在鲍鱼育苗水体中添加浓度为10²～10⁸cfu/mL的复合菌液均能起到提高鲍苗免疫力的作用。且5～40天之间不换水，对溶菌酶活力、超氧化物歧化酶(SOD)活力、酚氧化酶活力的含量影响不大，其中改善效果最明显的为添加10⁸cfu/mL的复合菌液。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种鲍鱼育苗方法，其特征在于包含以下步骤：

(4)采收：经过培育，剥离稚孢，得到鲍鱼苗。

2.根据权利要求1所述的鲍鱼育苗方法，其特征在于：

步骤(1)中所述光合细菌为红假单胞菌Rhodopseudomonas sp.或沼泽红假单胞菌Rhodopseudomonas palustris中的至少一种；

步骤(1)中所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌Bacillus Subtilis(Ehrenberg)Cohn。

3.根据权利要求1所述的鲍鱼育苗方法，其特征在于：

步骤(1)中所述光合细菌活化的方法为将光合细菌按体积百分比0.1％接种到RCVBN液体培养基中，于30℃、光照强度为3000lx下光照厌氧培养48h，得到活化的光合细菌菌液；

步骤(1)中所述芽孢杆菌活化的方法为将芽孢杆菌按体积百分比0.1％接种到营养肉汤培养基中，于37℃、250rpm摇床培养18h，得到活化的芽孢杆菌菌液。

4.根据权利要求1所述的鲍鱼育苗方法，其特征在于：

步骤(1)中所述光合细菌培养的方法为将活化的光合细菌菌液按体积百分比10％接种到RCVBN培养基中，光照厌氧发酵培养48～96h，期间搅拌，然后5000～8000rpm离心5～15min后取沉淀，用磷酸盐缓冲溶液悬浮沉淀获得处于对数生长期的浓度为10⁸～10¹²cfu/ml的光合细菌菌液；

步骤(1)中所述芽孢杆菌培养的方法为将活化的芽孢杆菌菌液按体积百分比10％接种到营养肉汤培养基中，置于37℃、250rpm摇床培养24h，然后5000～8000rpm离心5～15min后取沉淀，用磷酸盐缓冲溶液悬浮沉淀获得处于对数生长期的浓度为10⁸～10¹²cfu/ml的芽孢杆菌菌液。

5.根据权利要求1所述的鲍鱼育苗方法，其特征在于：步骤(1)中所述复合菌液是由等菌液浓度等体积的光合细菌溶液与芽孢杆菌溶液混合得到。

6.根据权利要求1所述的鲍鱼育苗方法，其特征在于：

步骤(2)中所述加装遮光装置是在育苗池上方盖一层遮光率为60％的黑色遮阳网，使光照率为3500～5000lux；所述加装曝气装置是在育苗池池两边等距离对称放置输气管各4条。

7.根据权利要求1所述的鲍鱼育苗方法，其特征在于：

步骤(2)所述培藻是在布卵前40～45天开始培藻；

8.根据权利要求1所述的鲍鱼育苗方法，其特征在于：

步骤(3)中所述营养盐是指硅藻营养元素，育苗过程中营养盐每2～4天添加一次，每次投放量为3～5g/m³养殖水体。

9.根据权利要求1所述的鲍鱼育苗方法，其特征在于：

步骤(3)中所述添加复合菌液是每次换水后都加入步骤(1)制备得到的复合菌液，使水体中复合菌液终浓度达到10²～10⁸cfu/ml。

10.根据权利要求1所述的鲍鱼育苗方法，其特征在于：步骤(4)中所述的培育，其培育时间为35～45天。