CN101943663A - 自动辨别微粒的衍射图像测量分析***及方法 - Google Patents

Abstract

一种自动辨别微粒的衍射图像测量分析***及方法，***有由流动微粒组成的样品流，与样品流相交的相干激发光束，具有第一中心散射角度的相干散射光束的第一散射光接受物镜部分、第一分光及滤波部分、第一成像测量及数据输出部分、图像处理电路及计算机部分以及与图像处理电路及计算机部分相连的显示部分；方法是获得相应的可调波长及偏振衍射图像数据；存储数据；进行图像空间坐标变换；进行特征甄别并选取特征区域；选取衍射图像模式特征；确定所测量微粒在衍射图像特征参数矢量样本空间的位置；确定所测量微粒在衍射图像特征参数矢量样本空间的位置。本发明具有可根据微粒内部三维结构特征快速分析辨别大量微粒以及无需对微粒染色的优点。

Description

自动辨别微粒的衍射图像测量分析***及方法 

技术领域

本发明涉及一种衍射图像测量分析***及方法。特别是涉及一种测量由微粒相干散射光形成的波长及偏振可调的衍射图像信号，计算提取其与微粒内部三维结构特征高度相关的图像特征，可自动快速准确分析辩别微粒的自动辨别微粒的衍射图像测量分析***及方法。 

背景技术

在细胞生物学研究，生物技术研究，药物研发，环境污染监测，大气科学等许多领域内研究人员需要可快速准确分析辨别大量线性尺度为一微米至数百微米的单个微粒的方法及仪器***。很多情况下，包括以细胞为代表的生物微粒在内的微粒之功能或其对与外界的相互作用常常与其三维结构形态紧密关联。因此通过对比微粒三维结构形态的特征与差异是分析辨别微粒的最佳方法之一。例如光学显微镜是人类用于观察微粒结构形态最早也是目前最常用的仪器之一。但由于下述原因，使用光学显微镜分析辨别微粒的方法具有局限性，很难用于对包含大量微粒的微粒群落进行快速分析辨别。第一，常用的光学显微镜(如荧光显微镜，明视场或暗视场显微镜等)是基于非相干成像原理设计的，其图像是通过对微粒三维结构的二维投影而形成，利用这种图像所测的微粒结构特征为结构二维投影特征，无法真实反映微粒的三维结构形态与特征。第二，由于显微图像是对微粒三维结构的二维投影，据此图像分析辨别微粒通常需要非常复杂的图像分析方法，在分析具有复杂三维结构形态的细胞时更是如此，一般需要人工分析，因而基于光学显微镜的图像分析方法很难自动化，而且相关的光学显微镜操作与图像测量也需人工操作，费时，易产生误差且分析速度极低。第三，包括细胞在内的许多微粒在可见光及近红外光波长范围内不含特征吸收或可发荧光的分子，因此必须在染色后才能在光学显微镜下观察其结构形态，染色往往需要昂贵的试剂和复杂费时的工序，并有可能对所观察的生物微粒如细胞等产生干扰效应。近年来，光学显微镜技术取得了新进展，例如使用共聚焦技术，可获取多幅景深很短的二维图像，通过二维图像叠加重建微粒的三维结构形态。共聚焦光学显微镜技术只解决了上述第一个问题，但需要更长的时间，而其他问题依然未解决。 

在世纪六十年代以来对以细胞为代表的微粒在层流快速流动状态下进行光学测量的研究基础之上，流式细胞仪成为一种集流体力学，激光技术，光电测量以及数据处理研究成果之大成的可对大量单个细胞进行快速测量分析的仪器。流式细胞仪利用同心喷嘴和液体压强差在样品室内形成由样品流和鞘流组成的层流。环包在样品流外的鞘流通过压强差减小含有微粒的样品流直径，迫使微粒以单列方式流动通过激发光束，被激发光 束照射的微粒会产生与激发光波长相同的散射光，其强度随散射角度变化而变化。这种波长与激发光波长相等的散射光也称为弹性散射光，是由于微粒内部的被激发光束电磁场感应而形成的分子电偶极子产生的辐射。微粒内部的感应分子电偶极子浓度分布由其内部的光折射率分布表达，因此微粒内部三维结构可通过其光折射率三维分布表达。如微粒内部的光折射率三维分布不均匀或与其所悬浮的载体材料光折射率不同，散射光即存在，并且通常是微粒被光照的条件下所产生的各种光信号中最强的信号。被激发光束照射的微粒如含有荧光分子还会产生其波长大于激发光波长的荧光，荧光是由于微粒内部的荧光分子被激发后产生的辐射光。许多包括细胞在内的微粒不含或含有很少的荧光分子，所以这些微粒只有在染色后才可产生足够强度荧光信号。流式细胞仪通过测量染色后微粒产生的荧光以及散射光信号，可对微粒进行快速分析辨别，其处理速度可达每秒数千个微粒。与光学显微分析方法相比，在分析包含大量微粒的群落及统计分布有其独特的优势。自上世纪八十年代以来，流式细胞仪在细胞生物学研究，污染监测和其他领域领域内得到广泛应用。 

目前流式细胞仪产品可按其光学信号测量方式分为角度积分型与非相干图像型两种，绝大多数现有流式细胞仪为角度积分型。在这种流式细胞仪中，流动微粒在入射光束照射下产生的散射光信号和荧光信号由不同的单体光电传感器(如光电二极管，光电倍增管等)接受而产生相应的输出电信号。单体传感器为只输出1个电信号的传感器，其信号强度正比于散射光或荧光信号强度在传感器面积相对于光源所形成的立体角度内的积分值，简称为散射光或荧光信号。荧光信号与微粒内部包含的特定分子(如细胞中的可与荧光分子结合的某种蛋白质分子)存在与否以及数量有关，而角度积分后的散射光信号则只与微粒体积和内部光折射率均匀度即颗粒度有关，与光折射率分布不同，颗粒度为光折射率分布的角度积分值。将散射光和荧光信号结合，通过计算机进行数据分析，可对包含大量微粒的群落进行自动分析辨别，达到将群落中的微粒进行快速种类区分的目的。目前角度积分型流式细胞仪通常可测量2到10个荧光信号以及2个散射光信号。荧光信号不包含结构信息，虽然2个散射光信号(前向与侧向散射光信号)可提供体积和内部颗粒度的信息，但其结构信息含量极其有限，因而角度积分型流式细胞仪主要依靠荧光信号对微粒进行快速分析辨别。 

近年来图像测量技术开始在流式细胞仪得到应用，形成非相干图像型流式细胞仪。这种流式细胞仪基于传统的光学显微镜方法，利用如电荷耦合器件(CCD)相机等图像传感器测量非相干光信号在空间的角度分布，可输出荧光，明视场和暗视场等图像数据，但各种图像均为微粒三维结构的二维投影。与角度积分型流式细胞仪相比，非相干图像型流式细胞仪可对每个流动微粒测量并输出多幅图像，其包含的结构信息显然大为增加，因此可对微粒结构进行更细致的分析。但与传统的光学显微镜方法相同，利用非相干光信号成像的图像型流式细胞仪具有类似的局限性，如无法根据微粒三维结构位形态特征分析辨别微粒，需要对微粒染色才能获得荧光图像等。更为重要的是，由于二维投影图 像与三维结构之间的关系非常复杂，通常需要人工分析，因此很难实现通过计算机软件对包含大量微粒的群落进行自动图像数据分析，无法达到将群落中的微粒进行快速种类区分的目的。由于图像信号型流式细胞仪可以每秒测量几百至上千个微粒，其图像信号数据总量非常大，如无法实现自动图像信号分析，其应用受到极大的限制。 

如前所述，在激发光束照射下的微粒会产生散射光，其波长与激发光波长相同。如果激发光束为一具有高度相干性的光束，在波长相等的条件下散射光也具有高度相干性。含有荧光分子的微粒也会同时产生荧光，其波长与激发光束波长不同，不具有相干性。如使用具有高度相干性的激光束作为激发光束，微粒内部的感应分子电偶极子产生的具有高度相干性的散射光电磁场会在空间内形成由于相位差造成的光强度随角度变化的衍射分布，相干散射光的衍射分布及偏振态由激发光束波长与偏振态以及微粒内部的光折射率与其悬浮介质折射率差的三维分布决定，因此相干散射光强的衍射分布及偏振态与微粒内部三维结构形态高度相关，也与激发光束波长及偏振态有关。利用图像传感器测量相干散射光的衍射分布即为衍射图像。通过多幅衍射图像计算分析微粒三维结构特征，可获得微粒三维结构形态或相关之信息。这种方法的最早应用为可见光波长范围内的激光全息成像技术以及在X光波长范围内推算生物大分子三维结构的X射线衍射技术。一般情况下，推算微粒三维结构需要在不同激发光束入射角度下获得足够多幅(5至10幅或更多)衍射图像后再做复杂的三维结构重建计算。在细胞流式仪中由于微粒快速流动，很难同时得到足够多幅不同角度的衍射图像数据，即使能够获得足够多幅的图像，也不可能在数秒或更短时间内完成三维重建计算。此外微粒在层流液体内流动经过入射光束时，其附近会存在曲率半径极小的光学界面，包括鞘流与流体室材料如玻璃等的折射率不同造成的界面等。这些曲率半径极小的光学界面通常会引起成为图像噪音的散射光场，一般可大于或远大于微粒所产生的衍射光强分布，使得所测量到的衍射图像与微粒结构有关的信号对比度很小。获得高质量的与微粒结构有关的光学衍射图像需要减小或消除由于这些光学界面所产生的图像噪音，是一个很难解决的技术问题。此外如何利用所获得的衍射图像数据，得到与微粒三维结构特征高度相关的信息并据此快速分析包含大量微粒的群落并分类，也是一个尚未解决的难题。由于这些问题，尽管目前商用流式细胞仪大多使用激光束作为激发光束，但均无法通过测量与分析衍射图像的方式辨别微粒。在角度积分型流式细胞仪中，其所测得的散射光信号为角度积分，因此由于散射光相干性造成的随角度变化的衍射分布在经过角度积分后的信号中基本消失，所得到的结构特征只包括体积和内部颗粒度类的简单特征；而在非相干图像信号型流式细胞仪中，其荧光图像由于荧光波长相对于激发光束波长的变化为非相干图像，而明视场或暗视场图像则一般是在非相干白光照射条件下获得的，也属于非相干图像。 

最近在对包括细胞在内的微粒光散射的理论和实验多年研究基础之上，一种新型衍射图像型流式细胞仪方法已经公布，详细讨论可见参考文献(例如X.H.Hu，K.M.Jacobs，J.Q.Lu，“Flow cytometer apparatus for three dimensional diffraction imaging and related methods”，PCTApplication No.WO 2009/151610 by East CarolinaUniversity)。这种新型衍射图像型流式细胞仪提出了将层流置于主要由液体形成的流体室的设计概念，使用如电荷耦合器件相机等图像传感器纪录微粒所产生相干散射光的角度分布，可获得高对比度的衍射图像信号。实验结果表明这种新型衍射图像信号型流式细胞仪可根据微粒衍射图像信号分析辨别具有不同三维结构的微粒，详细讨论可见参考文献(例如K.M.Jacobs，L.V.Yang，J.Ding，A.E.Ekpenyong，R.Castel lone，J.Q.Lu，X.H.Hu，“Diffraction imaging of spheres and melanoma cells with a microscopeobjective”，Journal of Biophotonics，vol.2，pp.521-527(2009)；K.M.Jacobs，J.Q.Lu，X.H.Hu，“Development of a diffraction imaging flow cytometer”，OpticsLetters，vol.34，pp.2985-2987(2009))。通过基于经典电动力学理论的微粒光散射模型和大规模数值计算，现已证明由衍射图像型流式细胞仪所获得的微粒二维衍射图像与其三维结构高度相关，可以从中提取与微粒三维结构特征相关的许多特征，详细讨论可见参考文献(例如J.Q.Lu，P.Yang，X.H.Hu，“Simulations of Light scatteringfrom a biconcave red blood cell using the FDTD method”，Journal of BiomedicalOptics，vol.10，024022(2005)；R.S.Brock，X.H.Hu，D.A.Weidner，J.R.Mourant，J.Q.Lu，″Effect of detailed cell structure on light scattering distribution：FDTD study of a B-cell with 3D structure constructed from confocal images″，Journal of Quantitative Spectroscopy & Radiative Transfer，vol.102，pp.25-36(2006))。尽管上述研究提供了如何在流动状态下快速测量微粒二维衍射图像信号的***与方法以及通过基于经典电动力学理论的微粒光散射模型证明了二维衍射图像特征与微粒三维结构特征的高度相关性，但通过微粒光散射模型以及数值计算从衍射图像数据分布中提取单个微粒内部三维结构参数需要进行大量计算，即使在大型计算机上也常需要数小时或更长的时间才能获得单个微粒的三维结构的可靠参数数据，无法对大量微粒进行分析。如何同时测量多幅衍射图像，从中计算获得与微粒内部三维结构高度相关的图像模式特征，达到快速准确分析辨别微粒之目的，尚无有效的***设计和分析方法。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种能够测量多幅波长与偏振可调的衍射图像，并根据这些图像数据快速分析提取与微粒内部三维结构形态特征高度相关的图像模式特征，分析辨别包含大量微粒的群落并对之进行自动分类的自动辨别微粒的衍射图像测量分析***及方法。 

本发明所采用的技术方案是：一种自动辨别微粒的衍射图像测量分析***及方法，其中，自动辨别微粒的衍射图像测量分析***，包括有由流动微粒组成的样品流，还设置有与样品流相交的相干激发光束、测量被相干激发光束所激发的微粒射出的具有第一中心散射角度的相干散射光束的第一散射光接受物镜部分、第一分光及滤波部分、第一 成像测量及数据输出部分、图像处理电路及计算机部分以及与图像处理电路及计算机部分相连的显示部分；其中， 

所述的第一分光及滤波部分用于对所接收的微粒发射的散射光进行分光和滤波； 

所述的第一成像测量及数据输出部分用于对分光和滤波后的散射光进行成像测量及数据输出，从而获得由相干散射光束形成的衍射图像； 

所述的图像处理电路及计算机部分用于接收数据输出部分的输出信息，提取不同波长及偏振衍射图像数据特征并计算、分析和辨别。 

所述的显示部分是将计算、分析和辨别结果的统计数据进行显示。 

还设置有用于测量被相干激发光束所激发的微粒射出的具有第二中心散射角度的相干散射光束的第二散射光接受物镜部分；对所接收的散射光进行分光和滤波的第二分光及滤波部分；对分光和滤波后的散射光进行成像测量及输出背向散射光衍射图的第二成像测量及数据输出部分；所述的接收数据输出部分与所述的图像处理电路及计算机部分相连；其中，所述的第二散射光接受物镜部分、第二分光及滤波部分和第二成像测量及数据输出部分对应的与所述的第一散射光接受物镜部分、第一分光及滤波部分和接收数据输出部分结构完全相同。 

所测量的被相干激发光束所激发的微粒射出的相干散射光束的立体角度范围在0至π球面度。 

所述的第一散射光接受物镜部分是由多个透镜依次排列组成的显微物镜。 

所述的第一分光及滤波部分包括有分光片，接收从分光片透射出的散射光的且依次设置的第一窄带滤光片和第一偏振滤光片，以及接收从分光片反射出的散射光的且依次设置的第二窄带滤光片和第二偏振滤光片。 

所述的第一分光及滤波部分包括有分光片和接收从分光片所射出的不同方向散射光的第一窄带滤波片和第二窄带滤光片，以及位于第一窄带滤波片后面的第一偏振滤光片和位于第二窄带滤光片后面的第二偏振滤光片；或者所述的分光及滤波部分是由偏振窄带分光片组成，或是由分光片与棱镜或衍射光栅组成。 

所述的第一偏振滤光片和第二偏振滤光片的后面设置有光强衰减片。 

所述的第一成像测量及数据输出部分包括有分别对分光及滤波部分所射出的不同方向的散射光进行聚焦的第一聚焦透镜和第二聚焦透镜，位于第一聚焦透镜后面的第一图像传感器和位于第二聚焦透镜后面的第二图像传感器，以及连接在第一图像传感器的后面进行数据输出输入的第一数据输出输入端口和连接在第二图像传感器后面的第二数据输出输入端口； 

其中，所述的第一数据输出输入端口和第二数据输出输入端口结构完全相同，提供图像传感器工作所需的偏置电压以及图像传感器冷却电源的电源电压，提供图像传感器控制信号以及传感器输出模拟脉冲数据信号的时序信号，并提供传感器模拟脉冲数据信号数字化后输出的数据信号。 

所述的图像处理电路及计算机部分包括有分别向第一图像传感器和第二图像传感器提供偏置电压及电源电压的第一图像传感器电源和第二图像传感器电源，分别通过第一数据输出输入端口和第二数据输出输入端口接收图像信号的第一图像处理电路及计算机和第二图像处理电路及计算机， 

其中，所述的第一图像处理电路及计算机和第二图像处理电路及计算机，为两个结构完全相同的计算机，或为同一计算机；图像处理电路及计算机可对所接收的图像信号进行存储处理以及计算，提取不同波长及偏振衍射图像模式特征参数并输出显示参数数据。 

自动辨别微粒的衍射图像测量分析***的分析方法，包括有如下步骤： 

第一步骤：通过图像传感器以及相应光路测量在多波长激发光束照射下的微粒散射光空间分布，获得相应的可调波长及偏振衍射图像数据； 

第二步骤：将被测微粒群落内所有微粒在不同波长及偏振衍射图像数据以及种群分辨判据传输到计算机内的图像处理电路存储器中供下一步骤图像分析用； 

第三步骤：根据衍射图像的像素灰度值分布将像素灰度值位数由大于8位降阶为8位并根据其图像分布模式进行图像空间坐标变换； 

第四步骤：通过运用特征甄别方法对变换后的不同波长及偏振衍射图像进行特征甄别并选取特征区域； 

第五步骤：在特征区域内对特征甄别后的不同波长及偏振衍射图像选取衍射图像模式特征。 

第六步骤：根据不同波长及偏振衍射图像的模式特征参数组成衍射图像特征参数矢量并根据该矢量确定所测量微粒在衍射图像特征参数矢量样本空间的位置； 

第七步骤：确定被测微粒群落内的所有微粒在衍射图像特征参数矢量样本空间的位置后，根据微粒在特征参数矢量样本空间的位置分布以及输入的种群分辨判据将被测微粒群落自动分类成不同的种群并输出相应数据。 

第一步骤所述的可调波长及偏振衍射图像数据是：在测量衍射图数据时通过图像传感器前的光路元件选择多波长激发光束照射下的微粒射出的散射光的波长与偏振。 

第二步骤所述的种群分辨判据由微粒群落培训数据获得。 

第五步骤所述的衍射图像模式特征是基于像素灰度关联计算的衍射图像模式特征。

第五步骤所述的基于像素灰度关联计算是基于将输入图像数据分为多个数据流后分别计算的平行算法。 

本发明所述的自动辨别微粒的衍射图像测量分析***及方法，利用在相干激发光束照射下流动微粒所产生的相干散射光，测量其空间分布的波长与偏振可调的衍射图像数据，快速分析提取衍射图像模式特征参数，组成与微粒内部三维结构特征高度相关的特征参数矢量，据此对所测微粒群落内的微粒进行自动分类。本发明具有可根据微粒内部三维结构特征快速分析辨别大量微粒以及无需对微粒染色的优点，不影响所测微粒如细 胞等的内部生物化学过程且测量成本低。 

附图说明

图1是本发明自动辨别微粒的衍射图像测量分析***第一实施例的结构示意图； 

图2是本发明自动辨别微粒的衍射图像测量分析***第二实施例的结构示意图； 

图3是本发明自动辩别微粒的衍射图像测量分析方法的流程图； 

图4是本发明衍射图像素灰度关联计算软件的流程图； 

图5是本发明进行衍射图像素灰度关联计算过程中图像处理产生的效果图。 

其中： 

1：流动微粒                  2：样品流 

3：相干激发光束              4：相干散射光束 

5：显微物镜                  6：分光片 

7：第一窄带滤光片            8：第一偏振滤光片 

9：第一聚焦透镜              10：第一散射光 

11：第一图像传感器           12：第一数据输出输入端口 

13：第一图像传感器电源       14：第一图像处理电路及计算机 

15：第二窄带滤光片           16：第二偏振滤光片 

17：第二聚焦透镜             18：第二散射光 

19：第二图像传感器           20：第二数据输出输入端口 

21：第二图像传感器电源       22：第二图像处理电路及计算机 

23：第一中心散射角度         24：散射光束 

25：显微目镜                 26：分光片 

27：窄带滤光片               28：偏振滤光片 

29：聚焦透镜                 30：散射光 

31：图像传感器               32：数据输出输入端口 

35：窄带滤光片               36：偏振滤光片 

37：聚焦透镜                 38：散射光 

39：图像传感器               40：数据输出输入端口 

43：第二中心散射角度         A：第一散射光接受物镜部分 

B：第一分光及滤波部分        C：第一成像测量及数据输出部分 

D：图像处理电路及计算机部分  A′：散射光接受物镜部分 

B′：分光及滤波部分          C′：成像测量及数据输出部分 

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的自动辨别微粒的衍射图像测量分析***及方法做出详细说明。 

本发明所述的自动辨别微粒的衍射图像测量分析***及方法的一种实现方法，利用可调节成像***测量不同波长及偏振的衍射图像，然后通过计算机软件快速分析多幅衍射图像数据的像素灰度关联参数，提取图像模式统计参数矢量并根据这些参数矢量与种群分辨判据对包含大量微粒的群落进行快速种群分类。本发明还可通过计算机软件对衍射图像数据内所包含的图像模式对包括大量微粒的群落进行快速种群分类的方法实现。本发明所描述的方法还可以通过其他的光学***，方法和计算机软件实现。 

本发明的自动辨别微粒的衍射图像测量分析***及方法的方案之一，是使用显微镜物镜接受由多波长入射光所激发的微粒产生的在不同波长上各自相干的散射光，通过多个图像传感器与其他光学元件的组合，选择在不同波长、偏振以及角度范围条件下分别测量散射光空间角度分布，输出多幅不同波长及偏振方向的衍射图像数据，利用计算机软件分析不同波长及偏振衍射图像数据的各自与关联特征，进而可快速准确分析辨别大量微粒的方法。与传统的角度积分型与非相干图像型流式细胞仪相比，本发明所叙述的衍射图像型方法可通过与微粒内部三维结构形态特征高度相关的衍射图像特征对微粒进行快速准确的分析辨别。 

如图1所示，本发明的自动辨别微粒的衍射图像测量分析***，包括有由流动微粒1组成的样品流2，还设置有与样品流2相交的相干激发光束3、被相干激发光束3所激发的微粒射出的具有第一中心散射角度23的相干散射光束4的第一散射光接受物镜部分A、第一分光及滤波部分B、第一成像测量及数据输出部分C、图像处理电路及计算机部分D以及与图像处理电路及计算机部分D相连的显示部分； 

其中， 

从被激发的微粒所射出的被测相干散射光束4的立体角度范围可在0至π球面度； 

所述的第一散射光接受物镜部分A是由多个透镜依次排列组成的具有适当数值孔径及工作距离的显微物镜5构成。其设计制作需满足不同立体角度内通过衍射图像测量散射光分布的要求。 

所述的被测相干散射光束4的光强随光束传播方向与入射光束传播方向之间的角度也即散射角度变化而变化。被显微物镜5收集的被测相干散射光束4的立体角度范围由显微物镜5的数值孔径决定，在该角度范围内的光强随散射角度的变化即形成衍射图像，第一中心散射角度19可用来标志该角度范围的中心角度位置。被测相干散射光束4的立体角度范围可在0至π球面度，中心散射角度可在5至180度之间，其中，中心散射角度由第一中心散射角度23表示。根据其中心散射角度的范围，被测相干散射光束4可称为前向、侧向或背向散射光束。前向散射光束定义为其中心散射角度在5至90度之间，侧向散射光束为其中心散射角度在45至135度之间，背向散射光束为其中心散射角度在90至180度之间。 

所述的第一分光及滤波部分B用于对所被相干激发光束3所激发的微粒发射的散射光进行分光和滤波，所述的分光及滤波部分B包括有分光片6，接收分光片6透射散射光的且依次设置的第一窄带滤光片7和第一偏振滤光片8，以及接收分光片6反射散射光的且依次设置的第二窄带滤光片13和第二偏振滤光片14。所述的第一偏振滤光片8和第二偏振滤光片14的后面还可以设置有光强衰减片，可根据图像传感器光强数据自动调整进入传感器的光强，避免传感器过载饱和。 

分光与及滤波部分可根据不同光路设计获得，因此，所述的第一分分光及滤波部分B还可以是：包括有偏振分光片和接收从偏振分光片所射出的不同方向散射光的第一窄带滤波片7和第二窄带滤光片15，以及位于第一窄带滤波片7后面的第一偏振滤光片8和位于第二窄带滤光片15后面的第二偏振滤光片16；或者所述的分光及滤波部分B是由偏振窄带分光片组成，或是由分光片与棱镜或衍射光栅组成。 

一般窄带滤光片的光学波长带宽为0.5纳米到50纳米之间，带宽中心波长可调，只有波长位于带宽之内的光波才能在较小衰减的条件下通过。偏振滤光片只允许处于某种偏振状态的光波在较小衰减的条件下通过，例如水平线偏振状态或左旋偏振状态等等。由于第一滤光部分与第二滤光部分的带宽中心波长与偏振可分别独立调整，这样可按照不同的微粒分析要求获得不同波长与偏振的衍射图像后由第一数据输出输入端口12与第二数据输出输入端口20分别输出至图像处理电路。 

样品流2在鞘流压强作用下迫使微粒1成单列流动经过可包含多束激光的相干激发光束3，所产生的相干散射光束4在中心散射角度为第一中心散射角度23的立体角度内由显微物镜5收集，然后由分光片6分为透射光也即第一散射光10与反射光也即第二散射光18两部分，再经过各自的滤光部分和成像装置部分形成两幅衍射图像数据输出。 

所述的第一成像测量及数据输出部分C用于对分光和滤波后的散射光进行成像测量及数据输出，从而获得前向、侧向或背向等不同角度范围的散射光衍射图。所述的第一成像测量及数据输出部分C包括有分别对分光及滤波部分B所输出的不同方向的散射光进行聚焦的第一聚焦透镜9和第二聚焦透镜17，位于第一聚焦透镜9后面的第一图像传感器11和位于第二聚焦透镜17后面的第二图像传感器19，以及连接在第一图像传感器11后提供数据输出输入通道的第一数据输出输入端口12和连接在第二图像传感器19后的第二数据输出输入端口20；所述的第一数据输出输入端口12和第二数据输出输入端口20结构完全相同，作为信号通道提供图像传感器工作所需的偏置电压以及图像传感器冷却电源的电源电压，提供图像传感器控制信号并提供传感器输出模拟脉冲数据信号的时序信号，并提供传感器模拟脉冲数据信号数字化后输出的数据信号。其中图像传感器将散射光随空间角度分布转换为衍射图像数据并根据控制信号输出相应的模拟脉冲数据信号。数字化后的衍射图像素灰度值可选为8位到16位；一般情况下像素灰度值位数越高，图像信号测量的动态范围就越大，但需要存储的数据量也大。 

所述的图像处理电路及计算机部分D用于接收数据输出部分C的输出数据，计算与 提取不同波长及偏振衍射图像模式特征并辨别微粒。包括有分别向第一图像传感器11和第二图像传感器19提供偏置电压及电源电压的第一图像传感器电源13和第二图像传感器电源21，分别通过第一数据输出输入端口12和第二数据输出输入端口20接收图像信号的第一图像处理电路及计算机14和第二图像处理电路及计算机22， 

其中，所述的第一图像处理电路及计算机14和第二图像处理电路及计算机22结构完全相同，所述计算机部分为两个不同的计算机，也可为同一计算机；图像处理电路及计算机可对所接收的图像信号进行存储处理以及计算，提取不同波长及偏振衍射图像模式特征参数并输出显示参数数据。 

所述的第一图像处理电路及计算机14和第二图像处理电路及计算机22，有可通过图像信号传输线接收图像信号并对所接收的图像信号进行存储处理的图像处理电路，产生图像传感器控制信号及时序信号的电路，以及与图像处理电路相连对所接收的图像进行计算提取不同波长及偏振衍射图像模式特征参数并输出显示参数数据的计算机。所述的计算机显示部分是将分析、计算和辨别结果的统计数据进行显示。 

图像处理电路可将输入的图像信号存储于电路内部存储器或电子计算机的存储器内，图像处理电路也可包括可对存储的图像信号进行特定数学运算。 

本发明所述的第一图像传感器11和第二图像传感器19均可采用CCD相机，本实施例所使用的CCD相机的型号是：MegaPlus ES2093，厂家：Princeton Instruments。两个CCD相机分别通过第一数据输出端口12和第二数据输出端口20输出的信号可由插在计算机内的帧接收器插板接收并存储后再转入计算机内存储器。帧接收器的型号是：PIXCI E4，厂家：EPIX，Inc。 

如图2所示，本发明的自动辨别微粒的衍射图像测量分析***，在图1所示的基础上，还可以设置有用于测量被相干激发光束3所激发的微粒射出的具有第二中心散射角度43的相干散射光束24的第二散射光接受物镜部分A′；对所接收的相干散射光束24进行分光和滤波的第二分光及滤波部分B′；对分光和滤波后的散射光束进行成像测量及数据输出的第二成像测量及数据输出部分C′；所述的接收数据输出部分C′与所述的图像处理电路及计算机部分D相连；其中，所述的第二散射光接受物镜部分A′、第二分光及滤波部分B′和第二成像测量及数据输出部分C′对应的与所述的第一散射光接受物镜部分A、第一分光及滤波部分B和接收数据输出部分C结构完全相同。图2为本发明之一种实施方案，其中被相干激发光束3激发的微粒所产生的相干散射光束分不同散射角度范围由两个显微目镜收集，一般可以是前向、侧向或背向散射光束之间的任意两个。图2中所示的相干散射光束4的第一中心散射角度19在5至90度之间，为前向散射光束，相干散射光束24的第二中心散射角度43在90至180度之间，为背向散射光束，每束相干散射光束各自由分光片分为透射光与反射光两部分，再经过相应的滤光部分和成像装置部分形成四幅衍射图像数据输出。 

图2所示的分光片26将从显微物镜25接受的散射光分为透射散射光和反射散射光， 分别对应经过窄带滤光片27和窄带滤光片35、偏振滤光片28和偏振滤光片36以及聚焦透镜29和聚焦透镜37汇聚的透射散射光30和反射散射光38两部分，经过各自的图像传感器32和图像传感器40形成两幅衍射图像数据后再经各自的数据输出输入端口32和数据输出输入端口40输出至图像处理电路及计算机部分。 

计算机包括计算提取不同波长及偏振衍射图像模式特征的计算机软件部分，含以下步骤：重整变换，坐标变换，模式特征分析计算，提取图像模式特征参数。如像素灰度值位数大于8位，像素重整变换可根据衍射图像素灰度值的分布将像素灰度值位数降为8位，可减小图像信号文件所需的存储量并加快其后图像计算分析速度；坐标变换为根据衍射图像中的光强分布模式做适当像素空间位置变换，模式特征分析计算可根据不同图像分析算法如像素灰度关联等对坐标变换后的衍射图像进行计算分析，基于模式特征分析计算结果使用统计或其他数学方法获取图像模式特征参数数据。 

如图3所示，本发明的一种自动辨别微粒的衍射图像测量分析***的分析方法，即计算机软件部分具体包括有如下步骤： 

第一步骤：通过图像传感器以及相应光路测量在多波长激发光束照射下的微粒散射光空间分布，获得相应的可调波长及偏振衍射图像数据；所述的可调波长及偏振衍射图像数据是：在多波长激发光束照射下的微粒散射光由相应多波长散射光组成，每个波长的散射光的偏振态一般与入射光偏振态不同，其变化与微粒内部的三维结构形态有关，在测量衍射图数据时通过图像传感器前的光路元件选择所测衍射图像的波长与偏振。 

即，使用图像传感器以及相应光路测量在多波长激发光束照射下的微粒散射光空间分布，获得可调波长及偏振衍射图像数据；多波长激发光束可由二或更多束不同波长的激光束组成，每束激光在各自的波长上高度相干并处于某种偏振态，并激发微粒产生对应波长的散射光，在各自的波长上高度相干，其偏振态一般与相对应的激发光束之偏振态不同，其变化与微粒内部三维结构有关，通过窄带滤光片与偏振滤光片可在选择所测量散射光的波长与偏振态后获得相应的衍射图像。； 

第二步骤：将所测量的被测微粒群落内所有微粒在不同波长及偏振衍射图像数据以及种群分辨判据传输到计算机内的图像处理电路存储器中供下一步骤图像分析用； 

第二步骤所述的种群分辨判据由微粒群落培训数据获得。一种实现方法为：首先通过测量已知内部三维结构形态特征的微粒群落样品的可调波长及偏振衍射图像数据，获得其中每个微粒衍射图像特征参数矢量以及在特征参数矢量样本空间的分布，最后确定与微粒内部三维结构形态特征相关的种群分辨判据。另一种实现方法为：首先通过测量已知特征(如处于细胞循环不同阶段)的不同微粒种群样品的可调波长及偏振衍射图像数据，获得其中每个微粒衍射图像特征参数矢量以及在特征参数矢量样本空间的分布，最后确定与微粒内部三维结构形态特征相关的种群分辨判据。 

所述的衍射图像数据可以自第一图像传感器11和第二图像传感器19直接交替传输到计算机内的图像处理电路存储器，也可暂时储存在图像传感器内设置的存储器内，然 后分批交替传输到计算机内的图像处理电路存储器。 

第三步骤：根据衍射图像的像素灰度值的分布将像素灰度值位数由大于8位降阶为8位并根据其图像分布模式进行图像空间坐标变换；所述的衍射图像素灰度值位数根据不同厂家生产的图像传感器可有不同位数，如12位或16位等，像素灰度值位数越大，一般情况下计算精度越高，但图像运算所需要的存储器和计算量也越大，在将像素灰度值位数由大于8位通过数据正常化变为8位时，根据像素灰度值分布，将其最小值设为2°-1(＝0)，最大值设为2⁸-1(＝255)，其他像素灰度值则按相应比例变为0至255之间的整数值，通过这样的数据正常化完成的位数变换可在基本不影响图像计算精度的条件下，减小图像运算所需要的存储器和计算量；所述的图像空间坐标变换所指的是根据测量到的衍射图像分布模式，如径向发散型光斑分布等，进行直角坐标与极坐标变换，使得光斑分布变为主要沿横向或纵向分布。 

第四步骤：通过运用特征甄别方法(如小波变换，曲波变换，傅立叶变换)对变换后的不同波长及偏振衍射图像进行特征甄别并选取特征区域。同时对图像进行除噪声和图像增强。这一步骤的处理在增强了特征对比的同时，降低了下一步骤的计算复杂程度。 

第五步骤：在特征区域内对特征甄别后的不同波长及偏振衍射图像选取衍射图像模式特征。所述的衍射图像模式特征是基于像素灰度关联计算的衍射图像模式特征。所述的基于像素灰度关联计算方法是基于将输入图像数据分为多个数据流后分别计算的平行算法。 

统计特征选取方法可以是LAWS纹理能量滤波器，随机领域模型，灰度共生矩阵等方法之间的一种或不同组合。本节详述了如何通过基于灰度共生矩阵的像素灰度关联计算并获取图像模式特征参数的统计特征选取方法，灰度共生矩阵的计算可通过下例说明。 

设I(m，n)为一幅衍射图像，m和n分别为代表像素位置横向和纵向坐标的正整数：1≤m≤Ly，1≤n≤Lx，像素总数目为Ly×Lx，像素灰度值I的级别为N_g，也即1≤I≤N_g，则其灰度共生矩阵P的矩阵元定义为 

P(i，j；d，0°)＝#{(k，l)，(m，n)∈(L_y×L_x)|k＝m，|l-n|＝d；I(k，l)＝i，I(m，n)＝j}

P(i，j；d，45°)＝#{(k，l)，(m，n)∈(L_y×L_x)|k-m＝±d，l-n＝md；I(k，l)＝i，I(m，n)＝j}

P(i，j；d，90°)＝#{(k，l)，(m，n)∈(L_y×L_x)||k-m|＝d，l＝n；I(k，l)＝i，I(m，n)＝j}

P(i，j；d，135°)＝#{(k，l)，(m，n)∈(L_y×L_x)|k-m＝±d，l-n＝±d；I(k，l)＝i，I(m，n)＝j}

这里#表示满足集{…|…}中条件(由符号|后面的方程组代表)的像素对(其位置由|前面的像素位置坐标代表)的个数，d为代表像素位置差距的正整数，其后的角度值δ(＝0°，45°，90°，135°)为像素对的方向关系，i，j分别表示像素对内的像素灰度值并代表灰度共生矩阵元位置的横向和纵向坐标，为介于1和N_g之间的整数。 

根据上述定义所计算的灰度共生矩阵反映衍射图像数据中像素灰度分布模式，可通过对每对像素灰度值分布的方向、相邻间隔、变化幅度等因素的定量分析提取与微粒三 维结构形态高度相关的图像特征。它提供了可用于分析衍射图像的纹理模式和排列规则等基本模式信息的一种途径，并可用多幅二维灰度共生图像表示：每个灰度共生矩阵元由一个灰度共生图像像素代表，像素位置的横向和纵向坐标分别为i和j，像素灰度值为P；每幅灰度共生图像代表某种d与δ的组合；如衍射图像像素灰度值位数为8时，则对应的每幅灰度共生图像的像素总数为256x256。由此可见，灰度共生矩阵的矩阵元数或灰度共生图像的像素数与衍射图像的像素灰度值位数成指数关系，增加衍射图像像素灰度值位数会造成灰度共生图像的存储量与计算量极快地增加。通过对于灰度共生矩阵或灰度共生图像的统计分析，可以提取多个衍射图像模式特征参数(包括二阶距/与能量，对比度，相关性，自相关，惯性，平方和，总方差，总平均，总熵，差异性，熵，同质性，中值，协方差，方差差，熵差，最大值，最大相关系数等参数)，用于对微粒的分析辨别。 

第六步骤：根据不同波长及偏振衍射图像模式特征参数组成衍射图特征参数矢量并根据该矢量确定所测量微粒在特征参数矢量样本空间的位置； 

所述的衍射图像特征参数矢量可包含多个分量，如3至20个分量，每个分量值为自衍射图像计算获得的某一图像特征参数值，将自同一微粒测量到的不同波长及偏振衍射图像的所有特征参数值作为分量值组合而成的矢量即为代表该微粒的衍射图特征参数矢量；所述的特征参数矢量样本空间为一矢量空间，其维数等于衍射图像特征参数矢量的分量个数，每个所测微粒由其衍射图像特征参数矢量样本空间的位置代表，而位置则由该微粒的衍射图特征参数矢量的所有分量之决定，被测微粒群落在特征参数矢量样本空间由所有微粒的位置点集合代表。 

第七步骤：确定被测微粒群落内的所有微粒在衍射图像特征参数矢量样本空间的位置后，根据微粒在衍射图像特征参数矢量样本空间的位置分布以及输入的种群分辨判据将被测微粒群落自动分类成不同的种群并输出相应数据。 

种群分辨判据是通过如前所述方法得到的微粒群落培训数据获得。在衍射图像特征参数矢量样本空间中的数据分析与微粒分类一般基于线性和非线性分析结合的方法，可以通过例如神经网络与支持矢量机结合的混合方案来实现。支持矢量机属于普适线性分类器，它的优点在于同时最小化经验误差与最大化几何边缘区，因此也常被称为最大边缘分类器。在本方法中，我们采用了支持矢量机的延展方法。在支持矢量机的内核中，引入了非线性算法(包括多项式，双曲正切，基于径向基函数，高斯基于径向基函数等)，该方法既保持了非线性算法的准确性又提高了分类效率。 

图4是本发明所述的用于自动辨别微粒的衍射图像素灰度关联计算以及基于衍射图像特征参数矢量对微粒分类的流程示意图。首先根据衍射图像素灰度值的分布将像素灰度值位数由大于8位降为8位，然后进行由直角坐标至极坐标的坐标变换，对变换后的衍射图进行特征区甄别以及像素值的正常化，最后计算像素灰度共生矩阵并根据相应的灰度共生图像提取衍射图像模式特征参数。在完成所有被测微粒的衍射图像素灰度关联计算后，其图像模式特征参数作为衍射图像特征参数矢量输入支持矢量机在衍射图像特 征参数矢量样本空间中对被测微粒群落内的所有微粒进行自动分类。图4还显示可将输入的衍射图像数据分成N个数据流，利用平行算法提高图像分析计算的速度。 

图5为根据本发明进行衍射图像素灰度关联计算过程中图像处理产生的效果图。图中：a衍射图像；b变换坐标后的衍射图像；c特征甄别后的衍射图像特征区；d灰度共生图像。 

Claims (14)

1.一种自动辨别微粒的衍射图像测量分析***，包括有由流动微粒(1)组成的样品流(2)，其特征在于，还设置有与样品流(2)相交的相干激发光束(3)，测量被相干激发光束(3)所激发的微粒射出的具有第一中心散射角度(23)的相干散射光束(4)的第一散射光接受物镜部分(A)，第一分光及滤波部分(B)，第一成像测量及数据输出部分(C)，图像处理电路及计算机部分(D)以及与图像处理电路及计算机部分(D)相连的显示部分；其中，

所述的第一分光及滤波部分(B)用于对所接收的微粒发射的散射光进行分光和滤波；

所述的第一成像测量及数据输出部分(C)用于对分光和滤波后的散射光进行成像测量及数据输出，从而获得由相干散射光束(4)形成的衍射图像；

所述的图像处理电路及计算机部分(D)用于接收数据输出部分(C)的输出信息，提取不同波长及偏振衍射图像数据特征并计算、分析和辨别。

所述的显示部分是将计算、分析和辨别结果的统计数据进行显示。

2.根据权利要求1所述的自动辨别微粒的衍射图像测量分析***，其特征在于，还设置有用于测量被相干激发光束(3)所激发的微粒射出的具有第二中心散射角度(43)的相干散射光束(24)的第二散射光接受物镜部分(A′)；对所接收的散射光进行分光和滤波的第二分光及滤波部分(B′)；对分光和滤波后的散射光进行成像测量及输出散射光衍射图的第二成像测量及数据输出部分(C′)；所述的接收数据输出部分(C′)与所述的图像处理电路及计算机部分(D)相连；其中，所述的第二散射光接受物镜部分(A′)、第二分光及滤波部分(B′)和第二成像测量及数据输出部分(C′)与所述的第一散射光接受物镜部分(A)、第一分光及滤波部分(B)和接收数据输出部分(C)结构完全相同。

3.根据权利要求1所述的自动辨别微粒的衍射图像测量分析***，其特征在于，所测量的被相干激发光束(3)所激发的微粒射出的相干散射光束(4)的立体角度范围在0至π球面度。

4.根据权利要求1所述的自动辨别微粒的衍射图像测量分析***，其特征在于，所述的第一散射光接受物镜部分(A)是由多个透镜依次排列组成的显微物镜(5)。

5.根据权利要求1所述的自动辨别微粒的衍射图像测量分析***，其特征在于，所述的第一分光及滤波部分(B)包括有分光片(6)，接收从分光片(6)透射出的散射光的且依次设置的第一窄带滤光片(7)和第一偏振滤光片(8)，以及接收从分光片(6)反射出的散射光的且依次设置的第二窄带滤光片(13)和第二偏振滤光片(14)。

6.根据权利要求1所述的自动辨别微粒的衍射图像测量分析***，其特征在于，所述的第一分光及滤波部分(B)包括有分光片和接收从分光片所射出的不同方向散射光的第一窄带滤波片(7)和第二窄带滤光片(15)，以及位于第一窄带滤波片(7)后面的第一偏振滤光片(8)和位于第二窄带滤光片(15)后面的第二偏振滤光片(16)；或者 所述的分光及滤波部分(B)是由偏振窄带分光片组成，或是由分光片与棱镜或衍射光栅组成。

7.根据权利要求6所述的自动辨别微粒的衍射图像测量分析***，其特征在于，所述的第一偏振滤光片(8)和第二偏振滤光片(16)的后面设置有光强衰减片。

8.根据权利要求1所述的自动辨别微粒的衍射图像测量分析***，其特征在于，所述的第一成像测量及数据输出部分(C)包括有分别对分光及滤波部分(B)所射出的不同方向的散射光进行聚焦的第一聚焦透镜(9)和第二聚焦透镜(17)，位于第一聚焦透镜(9)后面的第一图像传感器(11)和位于第二聚焦透镜(17)后面的第二图像传感器(19)，以及连接在第一图像传感器(11)的后面进行数据输出输入的第一数据输出输入端口(12)和连接在第二图像传感器(19)后面的第二数据输出输入端口(20)；

其中，所述的第一数据输出输入端口(12)和第二数据输出输入端口(20)结构完全相同，提供图像传感器工作所需的偏置电压以及图像传感器冷却电源的电源电压，提供图像传感器控制信号以及传感器输出模拟脉冲数据信号的时序信号，并提供传感器模拟脉冲数据信号数字化后输出的数据信号。

9.根据权利要求1所述的自动辨别微粒的衍射图像测量分析***，其特征在于，所述的图像处理电路及计算机部分(D)包括有分别向第一图像传感器(11)和第二图像传感器(19)提供偏置电压及电源电压的第一图像传感器电源(13)和第二图像传感器电源(21)，分别通过第一数据输出输入端口(12)和第二数据输出输入端口(20)接收图像信号的第一图像处理电路及计算机(14)和第二图像处理电路及计算机(22)，

其中，所述的第一图像处理电路及计算机(14)和第二图像处理电路及计算机(22)，为两个结构完全相同的计算机，或为同一计算机；图像处理电路及计算机可对所接收的图像信号进行存储处理以及计算，提取不同波长及偏振衍射图像模式特征参数并输出显示参数数据。

10.一种权利要求1所述的自动辨别微粒的衍射图像测量分析***的分析方法，其特征在于，包括有如下步骤：

第一步骤：通过图像传感器以及相应光路测量在多波长激发光束照射下的微粒散射光空间分布，获得相应的可调波长及偏振衍射图像数据；

第二步骤：将被测微粒群落内所有微粒在不同波长及偏振衍射图像数据以及种群分辨判据传输到计算机内的图像处理电路存储器中供下一步骤图像分析用；

第三步骤：根据衍射图像的像素灰度值分布将像素灰度值位数由大于8位降阶为8位并根据其图像分布模式进行图像空间坐标变换；

第四步骤：通过运用特征甄别方法对变换后的不同波长及偏振衍射图像进行特征甄别并选取特征区域；

第五步骤：在特征区域内对特征甄别后的不同波长及偏振衍射图像选取衍射图像模式特征； 

第六步骤：根据不同波长及偏振衍射图像的模式特征参数组成衍射图像特征参数矢量并根据该矢量确定所测量微粒在衍射图像特征参数矢量样本空间的位置；

第七步骤：确定被测微粒群落内的所有微粒在衍射图像特征参数矢量样本空间的位置后，根据微粒在特征参数矢量样本空间的位置分布以及输入的种群分辨判据将被测微粒群落自动分类成不同的种群并输出相应数据。

11.根据权利要求10所述的自动辨别微粒的衍射图像测量分析***的分析方法，其特征在于，第一步骤所述的可调波长及偏振衍射图像数据是：在测量衍射图数据时通过图像传感器前的光路元件选择多波长激发光束照射下的微粒射出的散射光的波长与偏振。

12.根据权利要求10所述的自动辨别微粒的衍射图像测量分析***的分析方法，其特征在于，第二步骤所述的种群分辨判据由微粒群落培训数据获得。

13.根据权利要求10所述的自动辨别微粒的衍射图像测量分析***的分析方法，其特征在于，第五步骤所述的衍射图像模式特征是基于像素灰度关联计算的衍射图像模式特征。

14.根据权利要求13所述的自动辨别微粒的衍射图像测量分析***的分析方法，其特征在于，第五步骤所述的基于像素灰度关联计算是基于将输入图像数据分为多个数据流后分别计算的平行算法。 

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