CN101940616B - 一种防治糖尿病的风轮菜有效部位的制备方法与药物用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种防治糖尿病的风轮菜有效部位提取物的制备方法和应用。该有效部位提取物以风轮菜(Clinopodium chinense(Benth.)O.Kuntze)为原料,经粉碎、醇提取、减压回收后碍到浓缩物,浓缩物经石油醚、乙酸乙酯萃取,得到乙酸乙酯提取物,再经大孔树脂纯化而得到。该有效部位提取物主要由总黄酮和萜类组成,具有明显的降低链脲佐菌素糖尿病小鼠的血糖,降低血清胆固醇含量,保护胰岛细胞,抑制α-葡萄糖苷酶活性,和保护血管内皮细胞的作用。可见,风轮菜有效部位提取物具有良好的降血糖、降血脂、保护胰岛细胞和血管内皮细胞功能,可用于防治糖尿病、糖尿病引起的脂代谢紊乱及糖尿病性心脑血管方面并发症。
Description
一、技术领域
本发明涉及中药风轮菜有效部位提取物的制备方法,以及该有效部位提取物的降血糖、降血脂、保护胰岛细胞和血管内皮细胞功能,及其在防治糖尿病、糖尿病引起的脂代谢紊乱及糖尿病性心脑血管并发症方面的应用。
二、背景技术
糖尿病是由遗传和环境因素相互作用而引起的一组代谢异常综合症。据WHO估计1995~2025年,全球糖尿病发病率将增至3%~5%,预计达3亿患者,患者年龄则从65岁以上趋向45~54岁。糖尿病可分为胰岛素依赖型糖尿病(Insulin Dependent Diabetes Mellitus,IDDM又称1型)和非胰岛素依赖型糖尿病(Noinsulin Dependent Diabetes Mellitus,NIDDM又称2型)。糖尿病的主要危害在于它的血管并发症,包括大血管病变和微血管病变。糖尿病大血管并发症主要是指脑血管、心血管和下肢血管的病变。糖尿病患者并发心脑血管病的几率要远远高于非糖尿病患者。目前的研究认为糖尿病引起的大血管病变是糖尿病患者致死致残的主要原因。
目前治疗糖尿病的药物主要有磺脲类,双胍类、胰岛素、α-葡萄糖苷酶抑制剂、噻唑烷酮类等。这些药会引起一些副作用如低血糖,肝毒性,乳酸性酸中毒及腹泻。中药治疗糖尿病具有明显的优势,其治疗糖尿病是多环节、多途径、多靶点的综合协调作用,其药源丰富、价格低廉、毒副作用小,所以从中药筛选具有抗糖尿病药物的前景是十分广阔的。
风轮菜为唇形科风轮菜属植物风轮菜(Clinopodium chinense(Benth.)O.Kuntze)的全草,风轮菜微苦、涩,凉。归肝经。风轮菜为《中华人民共和国药典》收载中药断血流的原植物,具有清热解毒、止血活血的功效。风轮菜在福建民间用于治疗糖尿病。本实验室前期研究发现风轮菜具有降血糖作用,但尚未有针对风轮菜有效部位提取物的制备工艺、以及该有效部位提取物的降血糖、降血脂、保护胰岛细胞和血管内皮细胞功能,及其在防治糖尿病及糖尿病性心脑血管并发症方面的报道。
三、发明内容
本发明提供了一种从中药风轮菜中制备有效部位提取物的方法,以及该有效部位提取物的降血糖、降血脂、保护胰岛细胞和血管内皮细胞功能,及其在防治糖尿病及糖尿病性心脑血管并发症方面的应用。
1、风轮菜有效部位提取物的制备方法取干燥风轮菜,粉碎,乙醇或甲醇或丙醇及它们的含水物回流提取,或浸渍提取,提取液减压浓缩,将浓缩的提取物分散在水中,依次用石油醚、乙酸乙酯萃取3~4次,乙酸乙酯提取物用大孔树脂柱进行柱层析,水洗脱杂质后,
乙醇梯度洗脱,收集乙醇洗脱液,减压浓缩干燥,得提取物。分成步骤为:
(1)风轮菜全草干燥粉碎;
(2)乙醇或甲醇或丙醇及它们的含水物回流提取,或浸渍提取,提取液减压浓缩;
(3)将浓缩的提取物依次用石油醚、乙酸乙酯萃取3~4次;
(4)乙酸乙酯提取物用大孔树脂柱进行柱层析;
(5)水洗脱杂质后,乙醇梯度洗脱,收集乙醇洗脱液,减压浓缩干燥,得提取物。
上述制备方法的条件范围为:步骤(2)中乙醇或甲醇或丙醇的浓度为10~90%,提取方法为回流、浸渍;步骤(5)中乙醇梯度洗脱范围为20~80%。
2、风轮菜有效部位提取物主要由总黄酮和萜类组成,黄酮的主要成分为香蜂草苷、柚皮素、芹菜素、异樱花素、木犀草素、金合欢素等;熊果酸为萜类的主要成分。其中总黄酮含量的测定采用紫外分光光度法,以NaNO2-A1(NO3)3-NaOH显色测定总黄酮含量,以芦丁计,黄酮类化合物的总含量不低于50%。
本发明所述风轮菜有效部位提取物可与常规辅助剂和/或赋型剂混合,制备成各种剂型,用于预防或治疗。针剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、糖衣丸剂、溶液剂等都为可供选择的药物剂型。
胶囊剂、片剂、颗粒剂、糖衣丸剂等剂型可以含有一种或多种常用赋型剂-填料和增容剂:如淀粉,微晶纤维等;粘合剂:如羧甲基纤维素,聚乙烯吡咯烷酮等;致湿剂:如甘油;崩解剂:如碳酸钙等;吸收剂:如高岭土等;润滑剂:如滑石粉等。
药用赋型剂可以是固体、半固体、液体等各种形态的,配方辅助剂可以是各种类型的。
溶液剂可以含有一般的溶剂、增溶剂、乳化剂、防腐剂等,如水、乙醇、甘油、聚乙二醇、苯甲酸苄酯等。
胶囊剂、片剂、颗粒剂、糖衣丸剂、溶液剂等剂型可以用已知的常规方法制备,可以将风轮菜有效部位提取物与一种或多种赋型剂混合,制备剂型。
3、风轮菜有效部位提取物降血糖、降血脂和保护血管内皮细胞活性
3.1风轮菜有效部位提取物(CCE)对链脲佐菌素糖尿病小鼠血糖、胆固醇(TC)、血清胰岛素及胰岛组织的影响
随机取出小鼠10只作为正常组,其余小鼠禁食16-17h后,尾静脉注射链脲佐菌素160mg/kg,注射后72h后眼眶后静脉丛取血,分离血清,测定血糖,选空腹血糖>11mmol/L的小鼠40只,随机分为4组,分别按10ml/kg体重经口给予CCE 50、100mg/kg,二甲双胍(Metformin)200mg/kg以及等体积的0.2%CMC-Na,每日一次,连续12天给药。第6天末次给药后1.5h(禁食5h),小鼠眼眶后静脉丛取血,分离血清,以葡萄糖氧化酶法测定血糖。末次给药后1.5h(禁食5h),小鼠摘眼球取血,分离血清,以试剂盒方法测定血糖、TC、血清胰岛素。分离小鼠胰腺,将胰腺浸泡在10%***中固定、石蜡包埋,制片,HE染色,作组织病理学检查。
血糖实验结果如图1所示,与正常组比较,模型组链脲佐菌素糖尿病小鼠血糖极显著升高(P<0.01)。与模型组比较,CCE 100mg/kg和二甲双胍200mg/kg均可明显降低第6天糖尿病小鼠血糖(P<0.05);CCE 50mg/kg剂量组明显降低第12天糖尿病小鼠的血糖(P<0.05),CCE100mg/kg和二甲双胍200mg/kg剂量组均可极明显降低第12天糖尿病小鼠的血糖(P<0.01)。
TC实验结果如图2所示,与正常组相比,链脲佐菌素糖尿病小鼠的TC含量极明显升高(P<0.01)。与模型组相比,CCE 50mg/kg和二甲双胍200mg/kg剂量组均明显地降低糖尿病小鼠的血清TC含量(P<0.05),CCE 100mg/kg剂量组极明显地降低糖尿病小鼠的血清TC含量(P<0.01)。
胰岛素的实验结果如图3所示,与正常组相比,模型组链脲佐菌素糖尿病小鼠的血清胰岛素含量极明显降低(P<0.01)。与模型组相比,CCE100mg/kg剂量组和二甲双胍200mg/kg剂量组均明显地回升糖尿病小鼠低下的胰岛素含量(P<0.05)。
链脲佐菌素糖尿病小鼠胰腺的组织病理学改变主要为:内分泌部胰岛数量较正常减少,体积缩小,存留的胰岛组织结构较正常松散,其内细胞体积增大,胞界欠清,部分小鼠胰腺外分泌部腺泡细胞有空泡变。CCE 50、100mg/kg和二甲双胍200mg/kg能减轻胰岛的病变,具体表现药物应用后胰岛数量增多、胰岛体积增大,每个胰岛内细胞数量有明显改善,提示药物能改善链脲佐菌素所致的胰岛病变。
3.2风轮菜有效部位提取物(CCE)对α-葡萄糖苷酶的抑制作用
以4-硝基酚-α-D-呋喃葡萄糖苷(PNP-G)为底物测定α-葡萄糖苷酶的活性。将CCE(终浓度为10,30,60,90,120mg/L)或阿卡波糖(终浓度为100,300,600,900,1200,1500mg/L)40μl与α-葡萄糖苷酶(0.35mg/ml)30μl共同加500μl KH2PO4缓冲液(67mmol/L,pH:6.8)中,在37℃水浴中孵育10min后,加入底物PNP-G(0.01mol/L)30μl以启动反应。37℃反应10min后,加入0.1mol/L Na2CO3 1ml终止反应。于405nm波长下测定在酶作用下从PNP-G中释放的对硝基苯(PNP)的OD值。酶活力单位定义为:在37℃,pH 6.8的条件下,1min内水解PNP-G释放1μmol PNP所需的酶量,计算抑制率。酶抑制试验重复3次,每次3个复管。对α-葡萄糖苷酶的抑制率用以下公式计算:抑制率=(对照组OD值-药物组OD值)/对照组OD值×100%。
结果如表1所示:与对照组相比,CCE(30、60、90、120mg/L)、阿卡波糖(100、300、600、900、1200、1500mg/L)均对α-葡萄糖苷酶有极显著的抑制作用(P<0.01)。CCE、阿卡波糖抑制α-葡萄糖苷酶的IC50分别为62.3、666.6mg/L。
*P<0.05,**P<0.01vs对照组
3.3、风轮菜有效部位提取物(CCE)对高糖损伤的内皮细胞的保护作用
取对数生长期HUVEC消化成单细胞悬液接种于96孔细胞培养板(1×104 cell/well),培养24h后更换RPMI 1640培养基(含10%胎牛血清),将细胞分为6组,正常组为HUVEC的自然培养,模型组为CCE与33mmol/L葡萄糖共培养,其余组为CCE(1、3、10、30mg/L)与HUVEC及葡萄糖共培养,培养72h后,加入含0.5%MTT的培养基20μl,再培养4h后,弃培养液,加入150μl DMSO原液,振荡10min,待结晶完全溶解后,用酶联免疫仪于570nm波长处测定OD值。实验重复3次,每次3个复孔。
结果如图4所示,与正常组比较,模型组HUVEC细胞A570值极明显降低(P<0.01)。与模型组相比,CCE 3、10、30mg/L组的A570值明显高于模型组(P<0.01)。可见CCE 3、10、30mg/L明显提高高糖损伤的内皮细胞的存活率,对高糖所致的内皮细胞损伤具有保护作用。
本发明所述,风轮菜中有效部位提取物可用于制备预防和治疗糖尿病、糖尿病引起的脂代谢紊乱及糖尿病性心脑血管方面并发症。
四、附图说明
图1风轮菜有效部位提取物(CCE)对链脲佐菌素糖尿病小鼠血糖的影响
随机取出小鼠10只作为正常组,其余小鼠禁食16-17h后,尾静脉注射链脲佐菌素160mg/kg,注射后72h后,选空腹血糖>11mmol/L的小鼠,随机分为模型组、CCE 50、100mg/kg,二甲双胍200mg/kg,连续12天经口给药,每日一次。第6天和第12天,末次给药后1.5h(禁食5h)分别取血,测定空腹血糖,结果以表示。##P<0.01vs Normal;*P<0.05,**P<0.01vs Control(Student’s-t test).
图2风轮菜有效部位提取物(CCE)对链脲佐菌素糖尿病小鼠总胆固醇的影响
随机取出小鼠10只作为正常组,其余小鼠禁食16-17h后,尾静脉注射链脲佐菌素160mg/kg,注射后72h后,选空腹血糖>11mmol/L的小鼠,随机分为模型组、CCE 50、100mg/kg,二甲双胍200mg/kg,连续12天经口给药,每日一次。第12天,末次给药后1.5h(禁食5h)取血,测定血清总胆固醇,结果以表示。##P<0.01vs Normal;*P<0.05,**P<0.01vs Control(Student’s-t test).
图3风轮菜有效部位提取物(CCE)对链脲佐菌素糖尿病小鼠血清胰岛素含量的影响
随机取出小鼠10只作为正常组,其余小鼠禁食16-17h后,尾静脉注射链脲佐菌素160mg/kg,注射后72h后,选空腹血糖>11mmol/L的小鼠,随机分为模型组、CCE 50、100mg/kg,二甲双胍200mg/kg,连续12天经口给药,每日一次。第12天,末次给药后1.5h(禁食5h)取血,用放射免疫法测定血清胰岛素,结果以表示。##P<0.01vs Normal;*P<0.05vs Control(Student’s-t test).
图4CCE对高糖损伤的内皮细胞的保护作用
五、具体实施方式
下面结合实例对本发明进行详细描述。但是,本发明不局限于所给出的这些实例。
实施例1:风轮菜有效部位提取物的制备:
取10kg干燥风轮菜全草,粉碎成粗粉,加6倍体积的80%乙醇回流提取3次,合并提取液,减压浓缩,将浓缩液,依次用3倍量的石油醚、乙酸乙酯萃取4次,将乙酸乙酯提取物用大孔树脂柱进行柱层析,水洗脱杂质后,乙醇梯度洗脱(洗脱范围为20~80%),收集乙醇洗脱液,减压浓缩干燥,得风轮菜有效部位提取物,得率为1.5%。
实施例2:胶囊剂的制备
实施例1中的风轮菜有效部位提取物65g,微晶纤维素135g,研磨混合10-30分钟,至均匀。将混匀的药粉,灌装于1号胶囊中,随机抽样每粒装量控制在0.2g,含风轮菜有效部位提取物为65mg。
实施例3:片剂的制备
实施例1中的风轮菜有效部位提取物25g,微晶纤维素49g,研磨混合10-30分钟,至均匀止;加入硬脂酸镁1g,充分混合;混合物用单冲压片机压成直径6mm,重300mg的片剂,每片含风轮菜有效部位提取物为100mg。
实施例4:颗粒剂的制备
实施例1中的风轮菜有效部位提取物20g,加玉米淀粉180克,混匀后,加适量乙醇(60%)制成软材,过12目筛,经干燥后得颗粒剂,每1克颗粒剂含风轮菜有效部位提取物为100mg。
Claims (9)
1.一种防治糖尿病的风轮菜有效部位提取物的制备方法,其特征在于:取干燥风轮菜,粉碎,用乙醇及其含水物、甲醇及其含水物或丙醇及其含水物回流提取,或浸渍提取,提取液减压浓缩,将浓缩的提取物分散在水中,依次用石油醚、乙酸乙酯萃取3~4次,乙酸乙酯提取物用大孔树脂柱进行柱层析,水洗脱杂质后,乙醇梯度洗脱,收集乙醇洗脱液,减压浓缩干燥,得提取物。
2.根据权利要求1所述的风轮菜有效部位提取物的制备方法,其特征在于:乙醇梯度洗脱范围为20~80%。
3.根据权利要求1所述的风轮菜有效部位提取物的制备方法,其特征在于:该提取物主要由总黄酮和萜类组成,所述黄酮的主要成分为香蜂草苷、柚皮素、芹菜素、异樱花素、木犀草素和金合欢素;萜类的主要成分为熊果酸,采用紫外分光光度法,以NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色测定总黄酮含量,以芦丁计,黄酮类化合物的总含量不低于50%。
4.一种防治糖尿病的风轮菜有效部位提取物,由权利要求1-3中任一权利要求所述制备方法制得。
5.一种治疗糖尿病的药物组合物,其特征在于由权利要求4所述的提取物与一种或多种辅助剂和/或赋形剂混合。
6.根据权利要求5所述的药物组合物,其特征在于其被制备成各种剂型。
7.根据权利要求6所述的药物组合物,所述剂型为针剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、糖衣丸剂或溶液剂。
8.根据权利要求4所述的风轮菜有效部位提取物,其特征在于所述风轮菜有效部位提取物能显著降低糖尿病高血糖、降血脂,保护胰岛细胞,抑制α-葡萄糖苷酶活性,保护血管内皮细胞。
9.根据权利要求4所述的风轮菜有效部位提取物的用途,其特征在于其用于制备预防和治疗糖尿病、糖尿病引起的脂代谢紊乱或糖尿病性心脑血管方面并发症的药物。
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