CN101935700A

CN101935700A - 鉴定绵羊早期胚胎性别的牙釉蛋白基因引物及其应用

Info

Publication number: CN101935700A
Application number: CN 201010227051
Authority: CN
Inventors: 王争光; 俞颂东; 陈阿琴; 王莉; 应璐祺; 白惠琴
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2010-07-15
Filing date: 2010-07-15
Publication date: 2011-01-05

Abstract

本发明属家畜繁殖技术领域，公开了一种可用于鉴定绵羊早期胚胎性别牙釉蛋白基因引物序列，该引物序列为：上游引物：5’-CAGCCAAACCTCCCTCTGC-3’，下游引物：5’-CCCGCTTGGTCTTGTCTGTTGC-3’，以及用鉴定绵羊早期胚胎性别的常规PCR方法。本发明的牙釉蛋白基因引物序列和检测绵羊胚胎性别的方法，提高了反应的灵敏度，缩短了性别鉴定所需的时间，不容易产生污染，而且适合在胚胎移植现场操作，便于在生产实际中推广应用。

Description

鉴定绵羊早期胚胎性别的牙釉蛋白基因引物及其应用

技术领域

本发明涉及一对可用于鉴定绵羊早期胚胎性别的牙釉蛋白基因引物及其应用，以及利用该引物鉴定绵羊早期胚胎性别的PCR方法。

背景技术

在胚胎生物技术领域中，对家畜性别的控制是多年来人们梦寐以求的愿望。对绵羊早期胚胎尤其是附植前胚胎进行性别鉴定后再进行移植，在生产中具有重要的科学研究价值和商业价值。因为有效控制后代性别，不仅意味着经济效益的增加，对促进优良绵羊基因的推广、加速品种改良有重要的意义。动物的某些生产性状是受性别限制（泌乳等）或性别影响的（产毛等），通过性别控制，达到理想的性别比例，可以获得更多的所需性状及更大的经济效益。家畜胚胎的早期性别鉴定技术，是实现家畜性别控制的一种重要方法。通过移植已知性别的胚胎，控制家畜后代的性别，能加快优良母畜的繁殖速度，促进高效畜牧业的发展。通过性别控制还可以排除畜群中有害基因和基因型，防止性连锁疾病。

目前，能够实现性别控制的手段主要有两种：一是X***和Y***的分离，即通过X、Y***微弱的生物学差异，分离出含两种染色体的***，用于人工授精或体外受精。流式细胞分离仪分离***的准确率达到90%，但目前分离速度太慢，***价格昂贵，且分离后***不耐冷冻，后代有一定的畸形率，因而应用受到限制。二是早期胚胎的性别鉴定。绵羊早期胚胎的性别鉴定已有十几年的发展历史，从早期的免疫学方法到胚胎细胞的染色体核型分析和现在的分子生物学方法，该项技术取得了巨大的进展，但最具有推广和实用价值的绵羊早期胚胎性别鉴定技术是聚合酶链式反应（PCR）技术。

虽然PCR技术在牛、羊早期胚胎性别鉴定中已取得了突破性的进展，使胚胎的性别鉴定进入了一个崭新的发展阶段。但在国内，该法尚未大面积应用于生产实践，仍停留在实验室研究阶段。胚胎性别鉴定程序仍很复杂，使养殖户和胚胎操作者一筹莫展。同时，在操作过程中会偶尔损坏或丢失胚胎。因此，建立一种能大规模的应用于生产的简便、省时、实用、经济的早期胚胎性别鉴定技术显得尤为必要。

发明内容

本发明的目的是提供一种可用于鉴定早期羊胚胎性别的绵羊牙釉蛋白基因特异性引物序列，并提供使用该引物鉴定绵羊早期胚胎性别的PCR方法。该发明具有简单、快速、准确，灵敏的特点，完全适合在野巧外操作，可在生产现场应用。

本发明采用的技术方案是：

一种牙釉蛋白基因引物，序列如下：

上游引物：5'-CAGCCAAACCTCCCTCTGC-3'

下游引物：5 '-CCCGCTTGGTCTTGTCTGTTGC-3'。

编码牙釉蛋白（AMEL）的基因位于哺乳动物的X和Y染色体上，其等位基因外显子具有相同的基因序列，但其内含子序列不同。因此，由X 和Y染色体决定性别的哺乳动物，雌性（XX）个体具有两种相同的AMEL基因，而雄性（XY）则具有两种不同的AMEL基因。Y染色体上的AMEL基因在第1内含子有一小段的缺失，可用特异性引物同步扩增X- Y染色体AMEL基因序列，使之产生不同的DNA片段，从而可以判断性别。

本发明还涉及所述的牙釉蛋白基因引物在制备鉴定绵羊早期胚胎性别的试剂盒中的应用。所述试剂盒主要包括牙釉蛋白基因引物和PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶。

本发明还涉及一种鉴定绵羊早期胚胎性别的PCR方法，所述方法包括：取绵羊胚胎细胞（4～6个细胞样品）作为模板，以所述牙釉蛋白基因引物作为扩增引物，配制PCR反应体系进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现262bp和202bp两条条带，则待测羊胚胎为雄性胚胎；若电泳结果只出现一条262bp的条带，则待测羊胚胎为雌性胚胎。

本发明可直接取胚胎细胞进行PCR扩增，而不需要提取细胞DNA，操作更加简便。由于只需要1对引物就可以同时解决性控引物和内标引物的问题，这样就不存在性控引物和内标引物扩增效率不同的问题，同时由于只需使用1对引物，既能降低实验成本，又能减少引物太多导致交叉产生引物二聚体等不良影响，有利于在生产中推广应用。应用本发明绵羊牙釉蛋白基因特异性引物序列，共对25枚绵羊胚胎进行了性别鉴定，结果显示出生的羔羊性别与胚胎鉴定的结果完全一致。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一对绵羊牙釉蛋白基因特异性引物序列，用该特异性引物建立了绵羊胚胎性别鉴定的PCR检测方法，具有简单、快速、准确，灵敏的特点，可在生产现场推广应用。

附图说明

图1为应用牙釉蛋白基因特异性引物对绵羊胚胎样品进行PCR扩增的产物电泳分析图。其中，1泳道为阴性对照；2~9泳道为待测绵羊胚胎样品；10泳道为100bp梯度的DNA分子量标准。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：特异性引物的合成

本发明根据Genbank所提供的AMEL基因序列，设计合成的特异性引物如下所示:

引物1: 5'-CAGCCAAACCTCCCTCTGC-3'

引物2: 5'-CCCGCTTGGTCTTGTCTGTTGC-3'

委托生物技术公司按上述提供的引物序列在基因合成仪上人工合成了上述两种寡核苷酸短片段，用于PCR反应。

实施例2: 通过绵羊基因组DNA进行性别鉴定，检测引物的特异性

先分别采集雄性和雌性绵羊耳尖部耳皮肤组织，用试剂盒提取基因组DNA，溶于灭菌超纯水中，用于PCR扩增。

使用本发明设计合成的引物进行性别鉴定的具体实验过程如下:

以提取的DNA为模板，用本发明设计合成的引物进行PCR扩增，反应体系为: 模板DNA 50～100 ng，10×PCR buffer（sigma公司）2μL，上、下游引物（20μmol/L）各为0.5μL，dNTP（10mM） 0.5μL，MgCl₂（2.5mM） 1.2μL，Taq酶（5U/μL）0.5μL，去离子水补足至20μL。PCR扩增条件为94℃预变性3min，94℃变性35 s，61℃退火50 s、72℃延伸35 s，共30个循环，再72℃延伸7min。扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳分离，用凝胶成像***观察结果。

实验结果表明用本发明的AMEL基因特异性引物序列对绵羊进行性别鉴定时，雄性绵羊样品可以扩增出262bp和202bp的片段，而母羊只产生262bp的扩增片断，用超纯水作对照则没有任何扩增条带。共检测了15份雄性绵羊和15份母羊耳部DNA样品，检测结果和实际完全符合，说明本发明设计合成的AMEL基因特异性引物序列可用于绵羊性别鉴定。

实施例3: 绵羊胚胎性别鉴定PCR法

微量绵羊胚胎细胞的提取：用胚胎分割仪，从桑堪胚或囊胚切取4～6个细胞，然后把胚胎细胞样品放入200μL离心管中，加入8μL灭菌超纯水备用。PCR性别鉴定：PCR反应体系及扩增条件与实施例2相同。部分胚胎的性别鉴定结果如图1所示：3，5，7，9泳道拥有源自X染色体的262bp的扩增片段和源自Y染色体的202bp的扩增片段，所以性别鉴定为雄性胚胎；而2，4，6，8泳道只产生源自X染色体的262bp扩增片断，所以性别鉴定为雌性胚胎。共检测了25枚胚胎的性别，性别鉴定胚胎移植后羔羊的性别和检测结果完全一致。

Claims

1.一种牙釉蛋白基因引物，序列如下：

上游引物：5'-CAGCCAAACCTCCCTCTGC-3'

下游引物：5 '-CCCGCTTGGTCTTGTCTGTTGC-3'。

2.如权利要求1所述的牙釉蛋白基因引物在制备鉴定绵羊早期胚胎性别的试剂盒中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述试剂盒主要包括牙釉蛋白基因引物和PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶。

4.一种鉴定绵羊早期胚胎性别的PCR方法，所述方法包括：取绵羊胚胎细胞作为模板，以所述牙釉蛋白基因引物作为扩增引物，配制PCR反应体系进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现262bp和202bp两条条带，则待测羊胚胎为雄性胚胎；若电泳结果只出现一条262bp的条带，则待测羊胚胎为雌性胚胎。