CN101935630A - 一株马红球菌及其在石油微生物增产上的应用 - Google Patents
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Abstract
一株马红球菌及其在石油微生物增产上的应用。公开了一种利用马红球菌降解原油烃类物质及生产生物表面活性剂的方法，其特征在于，利用马红球菌对原油中烃类物质进行降解，原油降解率可以达到60％，固体石蜡降解率可以达到30％，其代谢产生的糖脂类生物表面活性剂，可使发酵液的表面张力降低到30mN/m以下。
Description
技术领域
本发明涉及原油烃类物质降解，具体地说是一株马红球菌及其在石油微生物增产上的应用，利用马红球菌的菌株降解原油中烃类物质生产糖脂类生物表面活性剂的方法。
背景技术
近年来，在石油的大规模开采、加工及运输过程中，全世界每年有近千万吨原油作为污染物进入环境，污染水体、土壤和大气。石油污染已经成为世界性主要公害之一。生物降解是自然界消除这类污染物的一个重要途径。据统计，迄今为止，已经发现能够降解石油的微生物有200多种，其中细菌有假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、棒杆菌属(Corynebacteium sp.)、微球菌属(Micrococcus sp.)、产碱杆菌属(Alcaligenes sp.)等。微生物产生表面活性剂是其代谢原油的机制之一。生物表面活性剂具有乳化原油、可生物降解的优点，在原油污染土壤的修复中具有很高的应用价值，所以高效产表面活性剂并且降解原油的菌株的筛选已经引起了国内外学者的广泛关注。
发明内容
本发明涉及一种利用马红球菌的菌株降解原油烃类物质生产糖脂类生物表面活性剂的方法，具体实施方案为：
一株马红球菌，为马红球菌BS001，分类命名：马红球菌Rhodococcus equi.，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No3885，保藏日期2010年06月01日，其对原油中烃类具有降解能力，且可代谢产生糖脂类生物表面活性剂。所用菌株为马红球菌，菌株来源为由采自大庆油田石油污染土壤样品中富集筛选所得。
1)种子液的制备：采用富集培养基对马红球菌进行富集培养，培养基配方为：蛋白胨5-15g/L，酵母粉2-8g/L，NaCl 2-8g/L，pH值6.0-8.0；培养温度为30-60℃；
2)发酵液的制备：将富集得到的马红球菌发酵液转接入原油培养基中进行培养，原油培养基配方为：NH4Cl 1-5g/L，K2HPO41-3g/L，KH2PO41-5g/L，CaCl20.1-1g/L，原油0.5-5g/L；培养温度为30-60℃，培养时间为3-10天，摇床转速为100-200rpm，接种量为3-10％；
3)烃降解效果的分析：利用气相色谱法对原油降解效果进行分析，所用气相色谱为，条件为：100℃恒温2min，以升温速率为4℃/min升温到300℃，然后再恒温20min，载气N2流速1-2mL/min，H2流速35mL/min，空气流400mL/min，尾吹气(N2)流速26mL/min。
4)生物表面活性剂的制备：将上述发酵液用氯仿和甲醇(2∶1～3.5∶1)作为萃取剂，按照发酵液∶萃取剂＝3∶1～4∶1的比例对发酵液进行萃取，连续萃取3次合并有机相，50℃条件下减压蒸干得到棕黄色粉末状物体，即为表面活性剂粗品。
将上述表面活性剂粗品采用傅立叶红外光谱仪和质谱进行分析，傅立叶红外光谱仪采用德国布鲁克光谱仪器公司生产TENSOR27傅立叶红外光谱仪。
液质联用采用：HP1100型液质联用仪，A相纯水，B相乙腈，A/B＝90/10，维持3分钟，达到33分钟时A/B达到10/90，达到63分钟时，A/B达到0/100，达到73分钟停止。C18色谱柱，检测波长254nm。质谱为电喷雾离子源，单四级杆质量分析器，运行参数是：干燥气流速(drying gas)8L/min，雾化室压力(nebulizer pressure)40psig，干燥气温度(drying gas temperature)350℃，毛细管电压(capillary voltage)3000v，源内CID电压70v，扫描范围190-1000atmu。特征离子：ES(-)：[M-H]-[M+Cl]。
附图说明
图1菌株BS001***进化树；
图2菌株BS001发酵液表面张力与其生长状态关系；
图3菌株BS001产生物表面活性剂红外光谱图；
图4表面活性剂高效液相图(其中黄色红色为鼠李糖脂标准品，绿色为菌株BS001产表面活性剂)；
图5菌株BS001原油石蜡降解效率与其生长状态关系；
图6菌株BS001处理前后原油全烃扫描图谱。
马红球菌BS001，分类命名：马红球菌Rhodococcus equi.，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No3885，保藏日期2010年06月01日，其对原油烃类物质具有降解能力，且可代谢产生糖脂类生物表面活性剂。
具体实施方式
实施例1：本发明从油田原油污染样品筛选到一种产糖脂类表面活性剂的菌种，通过实验室鉴定纯菌株和产糖脂表征。是通过以下方式实现的：
1.以LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L，pH值7.0-7.2)为富集培养基，对样品中马红球菌进行富集。以平板划线法进行多次的划线分离直至电镜扫描观察为纯菌株，16S rDNA测序分析委托Takara(大连)公司。利用NCBI基因序列数据库做BLAST序列对比分析，选取同源性较高的序列采用Mega4软件按照邻位连接法构建***进化树(如图1所示)。
菌株为马红球菌BS001，分类命名：马红球菌Rhodococcus equi.，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCCNo3885，保藏日期2010年06月01日，其对原油烃类具有降解能力，且可代谢产生糖脂类生物表面活性剂。
2.分别将菌株BS001置于不同温度、矿化度和pH值条件下进行培养，观察菌株生长最佳条件。经优化菌株BS001耐受pH范围为4.0～9.0，温度40～55℃，矿化度0.1％～8％；最佳生长条件为温度40℃，pH＝7.0，矿化度2％；表面张力最低为29.3mN/m。
3.菌株BS001的具体发酵过程：按培养基质量的3-10％接种，发酵培养基配方为：NH4Cl 1-5g/L，K2HPO4 1-3g/L，KH2PO4 1-5g/L，CaCl20.1-1g/L，原油0.5-5g/L。培养温度为30-60℃，培养时间为3-10天，摇床转速为100-200rpm，得发酵液。
发酵完成后测定发酵液的表面张力从61.0mN/m下降到30.1mN/m。取BS001发酵液8000rpm，离心20min除去菌体，氯仿和甲醇(2∶1～3.5∶1)作为萃取剂，按照发酵液：萃取剂＝3∶1～4∶1的比例对发酵液进行萃取，连续萃取3次合并有机相，50℃条件下减压蒸干得到棕黄色粉末状物体，即为表面活性剂粗品。通过红外光谱质谱分析，初步判定产生的生物表面活性剂为糖脂类化合物。
如图2-4所示：图2菌株BS001发酵液表面张力与其生长状态关系；图3菌株BS001产生物表面活性剂红外光谱图；图4表面活性剂高效液相图(其中黄色红色为鼠李糖脂标准品，绿色为菌株BS001产表面活性剂)；
通过红外及液质联用表征，确定筛选得到的红球菌所产菌株为鼠李糖脂类表面活性剂。发酵液表面张力最低能从73mN/m降低到29左右mN/m。
实施例2：将筛选得到能够降解原油和石蜡的菌株BS001，用正十二烷为特征碳源考察其对原油中烃类的降解率；用原油和石蜡为碳源考察其降解率和时间的关系。实验室是通过以下方案实现的：
1.配置以正十二烷为单独碳源的培养基，配方如下：正十二烷1％～3％；NH4NO32g/L；K2HPO4 1.5g/L；KH2PO43g/L；CaCl20.1g/L；MgSO40.1g/L，pH值调至6.0-8.0，121℃高压灭菌20min。
按培养基质量的1％～5％接种量接种实施例1中筛选得到菌株BS001种子液，具体组成为，蛋白胨5-15g/L，酵母粉2-8g/L，NaCl 2-8g/L，pH值6.0-8.0；发酵条件为：温度30～37℃，转速150～200rpm，时间：36～48h，摇床好氧发酵。发酵完成后用分光光度法测定正十二烷降解率为46.2％。
通过实验可以看出其对以正十二烷为代表的正构烷烃的降解率达到46.2％，表明其对正构烷烃有很好的降解率。
2.配置以原油或石蜡为单独碳源的培养基，配方如下：原油或石蜡1％～3％；NH4NO32g/L；K2HPO41.5g/L；KH2PO43g/L；CaCl20.1g/L；MgSO40.1g/L，pH值调至6.0-8.0，121℃高压灭菌20min。
按培养基质量的1％～5％接种量接种实施例1中筛选得到菌株BS001，发酵条件为：温度30～37℃，转速150～200rpm，时间：36～48h，摇床好氧发酵。发酵完成后用分光光度法测定降解率，用其发酵液OD600表征其菌体生长情况。
如图5所示，图5菌株BS001原油石蜡降解效率与其生长状态关系；
通过实验可以看出，菌株对原油降解率达到60％左右，对石蜡降解率达到37％，且原油降解集中在菌株生长对数期，石蜡降解集中在菌株稳定期。菌株对原油和石蜡降解均有一定的效果。
实施例3：筛选得到能够广泛降解原油中各正构烷烃的纯菌株。实验室是通过以下方案实现的：
配置以原油为单独碳源的培养基，配方如下：原油1％～3％；NH4NO32g/L；K2HPO41.5g/L；KH2PO43g/L；CaCl20.1g/L；MgSO40.1g/L，pH值调至6.0-8.0，121℃高压灭菌20min。
按培养基质量的1％～5％接种量接种实施例1中筛选得到菌株BS001种子液，具体组成为，蛋白胨5-15g/L，酵母粉2-8g/L，NaCl 2-8g/L，pH值6.0-8.0；发酵条件为：温度30～37℃，转速150～200rpm，时间：36～48h，摇床好氧发酵。发酵完成后用正己烷萃取降解后发酵液中的残余原油，根据《SY-T 5779-1995原油全烃气相色谱分析方法》中的方法用气相色谱对其做全烃组分的扫描，以正常原油为对照。
从气相色谱图(如图6所示)可以看出，从正庚烷到正二十四烷均有很好的降解效果，原油中的正庚烷到正十二烷降解率达到95％以上。可以看出其对原油各组分的正构烷烃均有很好的降解效果。
本发明中筛选到的马红球菌能够降解原油和石蜡且能产鼠李糖脂类的表面活性剂原油降解率可以达到60％，固体石蜡降解率可以达到30％，其代谢产生的糖脂类生物表面活性剂，可使发酵液的表面张力降低到30mN/m以下。该菌株在微生物采油领域中有很好的利用前景。
Claims (7)
1.一株马红球菌，所采用的菌种为马红球菌BS001，分类命名：马红球菌Rhodococcus equi.，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC 3885，保藏日期2010年06月01日。
2.一种权利要求1所述马红球菌在石油微生物增产上的应用，其特征在于：所述马红球菌BS001对原油中烃类物质具有降解能力，且可代谢产生糖脂类生物表面活性剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
所述马红球菌可采用的富集培养基组成为：蛋白胨5-15g/L，酵母粉2-8g/L，NaCl 2-8g/L，pH值6.0-8.0；培养温度为30-60℃。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
所述利用马红球菌降解原油烃类物质的方法为：采用原油培养基，培养温度为30-60℃，培养时间为3-10天，摇床转速为100-200rpm，接种量为3-10％。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
所述利用马红球菌生产生物表面活性剂的方法为：采用原油培养基，培养温度为40-55℃，培养时间为1-3天，摇床转速为100-200rpm，接种量为3-10％；
培养后体系中生物表面活性剂的分离采用有机溶剂萃取法。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
采用有机溶剂萃取法，具体操作步骤为：使用体积比2∶1～3.5∶1的氯仿和甲醇作为萃取剂，按照发酵液∶萃取剂＝3∶1～4∶1的体积比例对发酵液进行萃取，连续萃取2-3次，合并有机相，50℃条件下减压蒸干得到棕黄色粉末状物体，即为表面活性剂粗品。
7.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：
所述原油培养基组分为：NH4Cl 1-5g/L，K2HPO41-3g/L，KH2PO41-5g/L，CaCl20.1-1g/L，原油0.5-5g/L。
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