CN101933917A - 贯叶金丝桃素衍生物在制药中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了具有结构I₁的贯叶金丝桃素乙酯和/或具有结构I₂的贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐在制备***药物中的应用。本发明通过药理药效学实验证明，贯叶金丝桃素乙酯和贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐对体外培养的人肿瘤细胞具有特异性的抑制增值、诱导凋亡、影响细胞周期等作用，为临床肿瘤治疗提供了新的药物选择。

Description

贯叶金丝桃素衍生物在制药中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及两种贯叶金丝桃素衍生物，即贯叶金丝桃素乙酯和贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐在制药中的应用。

背景技术

恶性肿瘤是常见的且严重威胁人类生命和生活质量的主要疾病之一，2000年全球新发癌症病例约为1000万，死亡620万，现患病例2240万。20世纪后期近30年以来癌症病发率一直呈上升趋势，按目前趋势世界卫生组织(WHO)预测，至2020年随着全球人口达80亿，将有2000万新发癌症病例，其中死亡人数将达到1200万，癌症将成为新世纪人类的第一杀手。统计表明，我国常见人类生命健康的恶性肿瘤有：肺癌、胃癌、食管癌、肠癌、肝癌、***、乳腺癌、白血病、恶性淋巴瘤、鼻咽癌等十大肿瘤。化疗、放疗、手术治疗是当今***的主要手段，但毒副作用较大。能否找到既能杀伤肿瘤细胞，毒副作用又比较小的药物及治疗方法，在肿瘤治疗中显得尤其重要。目前恶性肿瘤的药物治疗以化学药品为主，但化学药品的开发费用昂贵，毒副作用大，多有不同程度的致突变性。因此，人们把目光转向天然抗肿瘤药物的研发上，试图从天然成分中寻找毒副作用小，作用独特的抗肿瘤药物。

贯叶连翘(Hypericum perforatum L.)是藤黄科金丝桃属植物，又名贯叶金丝桃、赶山鞭、千层楼、圣·约翰草(St.John’s wort)。由其提取物生产的制剂已在欧美诸国临床上广泛用于治疗中、轻度抑郁症。贯叶金丝桃素(hyperforin，HF)属于间苯三酚类物质，存在于贯叶连翘的花、果实、芽和叶中，其中花和嫩枝梢端提取物亲脂性成分中含量最高。在植物中含量为(0.8～7.2％)(郑清明等，不同产地贯叶连翘中贯叶金丝桃素含量分析比较.药学实践杂志.2002，01：29-31)。

最近的研究发现，贯叶金丝桃素除具有抗抑郁作用外，还具有抗肿瘤等药理活性。贯叶金丝桃素能够诱导，包括实体瘤和血液瘤例如慢性B淋巴细胞白血病，在内的多种肿瘤细胞凋亡。并且呈剂量依赖性的抑制多种人原和鼠原的肿瘤细胞增殖，IC50在3-20μM之间。并且贯叶金丝桃素抑制多种肿瘤细胞转移和侵袭以及抑制肿瘤血管生长(C Quiney，et al.Hyperforin，a new lead compound against the progression of cancer and leukemia？Leukemia.2006，20：1519-1525.)。贯叶金丝桃素已经成为了目前国际上研究的热点天然药物之一。研究表明，贯叶金丝桃素抑制了Wistar大鼠自身的MT-450乳腺癌细胞的生长，这种作用和紫杉醇(paclitaxel)等效，但大鼠无任何急性中毒征象(Hostanska K，et al.Hyperforin a constituent of St John′s wort(Hypericum perforatum L.)extract induces apoptosis by triggering activation of caspases and with hypericin synergistically exerts cytotoxicity towards human malignant cell lines.Eur J Pharm Biopharm.2003，56(1)：121-32.)。有报道表明，贯叶金丝桃素能够通过体外抑制血管内皮细胞的生长来抑制血管生成。它能够抑制MMP-2和尿激的分泌，加入贯叶金丝桃素后能显著抑制慢性B淋巴细胞中MMP-9的分泌，抑制细胞外基质的降解，而细胞外基质的降解是肿瘤血管生成的一直重要表现(Girieca Lorusso，et al.Mechanisms of Hyperforin as an anti-angiogenic angioprevention agent.EUROPEAN JOURNAL OF CANCER.2009，45：1474-1484)。由于贯叶金丝桃素具有显著的抗肿瘤活性、体内低毒性、副作用小、天然资源含量丰富的性质，其具有作为新的抗肿瘤药物的潜在开发价值。

近年来关于贯叶金丝桃素提取制备工艺出现了很多深入的研究。Bombardelli等(Bombardelli E，et al.Hyperforin derivatives，the use thereof and formulations containing them.WO：9964388，1999-12-16.)将贯叶连翘花枝机械干燥并压成立方体，240巴40℃用二氧化碳超临界萃取，再用甲醇和正己烷反复萃取，得到的提取物中含有70％的HF，但此工艺成本较高。Bombardelli等(Bombardelli E，et al.Hyperforin derivatives，the use thereof and formulations containing them.WO：03091193(A1)，2003-11-06.)用甲醇提取贯叶连翘花枝，正己烷萃取，正己烷层用碱醇溶液萃取至没有HF，碱醇层中和后用弱碱性离子交换树脂过滤，其可选择性保留HF，再用含磷酸的甲醇洗脱，甲醇洗脱液加水稀释后用正己烷萃取，浓缩干燥后得到HF的含量为90％。此法工序复杂，不适宜大规模生产。杨得坡等(杨得坡等，植物中贯叶金丝桃素类成分的提取纯化方法。C07C50/36，2004-11-24.)用加入复合稳定剂的醇或酮搅拌浸提药材，提取液浓缩并加水稀释，用石油醚萃取，石油醚层用碱醇溶液碱化后静置分层，碱醇层酸化后用石油醚萃取，所得提取物HF含量不低于65％。此法更适宜工业化生产。

但贯叶金丝桃素遇光、氧、热极易发生化学氧化降解(Poutaraud A，et al.Improved procedure for the quality control of Hypericum perforatum L.Phytochem Anal 2001，12(6)：355-62.)。从而使其药理活性大大降低。因此，还需要对其进行结构修饰与改造，使其能在常态下保持稳定的化学特性，并保留或增强原有的活性。近年来，关于贯叶金丝桃素衍生物的研究逐渐成为热点。Zanoli P.等人报道(Zanoli P.，et al.Pharmacological activity of hyperforin acetate in rats.Behav Pharmacol.2002，13(8)：645-651.)贯叶金丝桃素乙酯，化学性质十分稳定，且具有良好的抗抑郁效果。Chatterjee SS等人(Chatterjee SS，et al.Stable hyperfonn salts，method for producing same and their use in treatment of alzheimer’s disease.PCT WO 99/41220，1999-8-19.)合成了贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐用于治疗阿尔茨海默症。Melanie Rothley等人报道了(Melanie Rothley，et al.Hyperforin and aristoforin inhibit lymphatic endothelial cell proliferation in vitro and suppress tumor-induced lymphangiogenesis in vivo.Int.J.Cancer.2009，125：34-42.)贯叶金丝桃素稳定衍生物aristoforin在体外能够抑制淋巴内皮细胞增殖，并且体内抑制由于肿瘤引起的血管生成。

目前在抗肿瘤方面，还未见有关于贯叶金丝桃素乙酯和贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供了两种贯叶金丝桃素衍生物，即贯叶金丝桃素乙酯和贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐在制药中的新用途。

实现上述的目的技术方案如下：

具有结构I₁的贯叶金丝桃素乙酯和/或具有结构I₂的贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐在制备***的药物中的应用。

优选地，所述肿瘤为白血病，特别是，所述肿瘤为对多种抗肿瘤药物耐药的白血病。

优选地，所述肿瘤为肝癌、***、肺癌、乳腺癌或恶性黑色素瘤。

本发明的另一目的是，提供一种***的药物。

具体技术方案如下：

一种***的药物，其有效成份为具有结构I₁的贯叶金丝桃素乙酯和/或具有结构I₂的贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐。

本发明通过大量的药理药效学实验证明，贯叶金丝桃素乙酯和贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐对体外培养的人肿瘤细胞具有特异性的抑制增值、诱导凋亡、影响细胞周期等作用，提示可以用于肿瘤治疗。特别是贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐，对多种抗肿瘤药物耐药的白血病具有良好的治疗作用。

附图说明

图1、贯叶金丝桃素衍生物对各种肿瘤细胞株的增殖抑制作用的结果图；

图2、贯叶金丝桃素衍生物对正常细胞株的毒性作用的结果图；

图3、流式细胞术分析贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐不同浓度处理组K562细胞凋亡的影响(Annixin V-PI染色，vs空白对照，^*p＜0.05，^**p＜0.01)；

图4、流式细胞术分析贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐不同浓度处理组K562细胞各期分布；

图5、DAPI法检测K562细胞凋亡：(A)对照组；(B)加药组10μM贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐；

图6、细胞术分析贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐对K562/ADR细胞P-gp表达的影响；

图7、流式细胞术分析贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐不同浓度处理组HepG-2细胞凋亡的影响(Annixin V-PI染色，vs空白对照，^*p＜0.05，^**p＜0.01)；

图8、流式细胞术分析贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐不同浓度处理组HepG-2细胞各期分布结果图；

图9、DAPI法检测HepG-2细胞凋亡：(A)对照组；(B)加药组10μM贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐。

具体实施方式

本发明采用杨得坡等人(杨得坡等，植物中贯叶金丝桃素类成分的提取纯化方法。C07C50/36，2004-11-24.)的专利中所述的提取工艺。首先制备贯叶金丝桃素提取物，然后采用Verotta L等人(Verotta L，et al.Journal of Natural Products，2002，65(4)：433-438.)和Chatterjee SS等人(Chatterjee SS，et al.2002，US Patent No：6,444,662.)的文献中所述的合成工艺。合成了贯叶金丝桃素乙酯和贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐，并对其进行了纯化。通过，红外光谱IR、紫外光谱UV、¹H核磁共振波谱¹H-NMR、¹³C核磁共振波谱¹³C-NMR等方法鉴定。

具有结构I₁的贯叶金丝桃素乙酯和具有结构I₂的贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐的具体制备方法如下：

一、富含贯叶金丝桃素的提取物的制备方法

(1)取含贯叶连翘(Hypericum perforatum L.)地上部分，每次用药材干重4-10倍量含1-5％复合稳定剂的极性溶剂在室温并搅拌下浸提2-6小时，浸提2-3次；所说的极性溶剂为醇类(通常为甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇)、酮类(通常为丙酮)、酮水混合溶剂或酮醇水以任意比例的混合溶剂；所说的复合稳定剂为VC或VC的衍生物和VE或VE的衍生物与有机酸的混合体，混合比例为VC或VC的衍生物∶VE或VE的衍生物∶有机酸＝20～200∶20～200∶1(质量比)；所说的有机酸通常为柠檬酸、苯甲酸、酒石酸中任一种或它们以任意比例的组合；

(2)将上述所得提取液浓缩至含生药量0.1-1克/毫升后加水至含水量10-60％，用含0.5-5％稳定剂的非极性溶剂萃取1-3次，萃取溶剂总体积为生药量的8-16倍，取非极性溶剂相；所说的非极性溶剂是石油醚、***、烷烃类(通常为正戊烷、正己烷或正庚烷)或环烷烃类(通常为环戊烷或环己烷)，或它们的任意比混合溶剂；所说的稳定剂是VE或VE的衍生物。

(3)上述所得非极性溶剂相用40％-60％乙醇萃取(洗涤)除杂，以40％-60％乙醇相呈透明浅黄绿色为萃取终点；非极性溶剂相用pH≥8.5的含碱的40％-60％乙醇水溶液萃取，取碱醇相；所说的碱是指水可溶性碱(可以是KOH、NaOH、K2CO3、Na2CO3、KHCO3或NaHCO3)；

(4)将上述所得碱醇相调至pH＝0-4后，再用与步骤(2)相同的含0.5-5％稳定剂的非极性溶剂萃取1-3次，取非极性溶剂相，萃取溶剂总体积为生药量的5-10倍；

(5)在低于45℃下减压回收非极性溶剂，即得到贯叶金丝桃素的含量不低于65％的稳定的提取物。所得到的提取物为浅棕色粘状固体，有特殊气味。

二、贯叶金丝桃素乙酯的合成

把贯叶金丝桃素的提取物溶于吡啶溶液后向溶液中加入乙酸酐，避光搅拌反应，反应12-48小时后，至反应比较完全。反应混合物中加入冰水停止反应。

加入正己烷-***混合液萃取，合并有机相，依次用饱和NaHCO₃和饱和盐水洗涤。无水硫酸钠脱水过夜，过滤除去硫酸钠固体后滤液浓缩至干，得棕黄色固体。通过硅胶柱层析先用石油醚洗脱，然后用石油醚-乙酸乙酯洗脱，得到贯叶金丝桃素乙酯。保存于-20℃备用。

三、贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐的合成

把贯叶金丝桃素的提取物溶解正己烷/异丙醇99-70/1-30(v/v)的混合液中，滴入二环己胺，室温反应12-48小时后将反应液放入-4℃--80℃冰箱中析出大量白色结晶，过滤，用正己烷洗涤，室温真空干燥，得贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐。保存于-20℃备用。

本发明通过药理药效学实验证明，贯叶金丝桃素乙酯和贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐对体外培养的人肿瘤细胞具有特异性的抑制增值、诱导凋亡、影响细胞周期等作用，特别是贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐，对多种抗肿瘤药物耐药的白血病具有良好的治疗作用。提示可以用于肿瘤治疗。下面是本发明的药理药效学实验及结果。实验所用贯叶金丝桃素乙酯和贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐由实施例1、2和3的方法制备。

以下通过具体实施例对本发明做详细的阐述，但不用于限定本发明的保护范围。

实施例1、富含贯叶金丝桃素的提取物的制备

贯叶连翘药材粉碎，取药材粉末300g，每次用800毫升含1％复合稳定剂(稳定剂的组成为VC∶VE∶柠檬酸＝50∶100∶1)丙酮浸提，共提3次，每次1天，合并丙酮浸提液，回收丙酮至1000毫升后加入蒸馏水250毫升。再用1300毫升石油醚萃取，共萃取2次，合并石油醚相并加入维生素E至含量为1％。浓缩至600毫升后以50％乙醇500毫升萃取2次，弃去乙醇相。以800毫升1％NaOH的50％乙醇溶液碱化石油醚相，弃去石油醚相。用10％盐酸调节碱醇液至pH＝2，然后用含VE1％的石油醚萃取3次，每次用石油醚300毫升。合并石油醚相，低温减压浓缩得浅棕色提取物2.13g，贯叶金丝桃素含量71.6％。

实施例2、贯叶金丝桃素乙酯的合成

贯叶金丝桃素的提取物溶于吡啶溶液，彻底溶解后向溶液中加入乙酸酐，在室温下避光搅拌反应，干燥，反应24小时后，薄层色谱法显示反应比较完全，原料点几乎完全消失。反应混合物中加入冰水停止反应。

加入正己烷-***混合液(3∶1)萃取三次，合并有机相，依次用饱和NaHCO₃和饱和盐水洗涤。无水硫酸钠脱水过夜，过滤除去硫酸钠固体后滤液浓缩至干，得棕黄色固体。通过硅胶柱层析(100-200目)先用石油醚洗脱，然后用石油醚-乙酸乙酯(95∶5)洗脱，得到HF乙酸酯(淡黄色膏状物)保存于-20℃备用。

实施例3、贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐的合成

贯叶金丝桃素的提取物溶解在30ml正己烷/异丙醇98/2(v/v)的混合液中，滴入300ul二环己胺，室温反应18h后，将反应液放入-20℃冰箱中析出大量白色结晶，过滤，用正己烷洗涤，室温真空干燥，得HF-N，N二环己胺盐(白色粉末状物)保存于-20℃备用。

以下药理药效学实验所用细胞系K562细胞购自美国ATCC公司；K562/ADR细胞株由K562细胞株经Adriamycin诱导而成，由郑州大学医学研究中心王庆端教授赠送。其他瘤系细胞株为暨南大学生物医药研究开发基地保存细胞株。

实施例4、贯叶金丝桃素乙酯和贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐在人体外对肿瘤细胞特异性的增殖抑制作用

(1)甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测定药物对7种肿瘤细胞株的增殖抑制作用

在本实验中，以Adriamycin(注射用盐酸多柔比星ADR，为浙江海正药业股份有限公司产品(批号：080601B)。)为阳性对照，采用常规的甲基偶氮唑盐(MTT)比色法考察了药物对7种肿瘤细胞株的增殖抑制作用。

先将受试药物用DMSO溶解配置成50mM的母液，使用时最大终体积≤0.1％，储存在-20℃。使用时用完全培养基将其稀释成系列浓度，终浓度依次为1.5625、3.125、6.25、12.5、50、100μM；阳性对照药物浓度，如无特殊说明均为0.15625、0.3125、0.625、1.25、5、10μM。取对数生长期的人***细胞(Hela)、人恶性黑色素瘤细胞(A375)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人肺癌细胞(A549)和人肝癌细胞(HepG-2)用完全培养基调整细胞浓度为1×10⁵个/ml的单细胞悬液，人慢性髓细胞白血病细胞(K562)和人慢性髓细胞白血病细胞对ADR耐药株(K562/ADR)调整细胞浓度为2×10⁵个/ml的单细胞悬液，接种于96孔板，每孔100μL。加入不同浓度药物培养，分别设置实验组，阳性对照组、溶剂对照组和空白组，每组3个复孔。置37℃、5％CO₂培养箱内培养，倒置显微镜下观察细胞生长情况。连续培养48h。每孔加5mg/mL的MTT 20μL，继续培养4h后每孔加入200μL DMSO，室温避光放置30min后。在自动读数酶标仪上读取各孔在570nm波长处的吸光度(OD)值。计算各孔(OD)值的平均数，按公式下述计算细胞生长抑制率，并计算药物对细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)。

贯叶金丝桃素衍生物对不同肿瘤细胞株的抑制率曲线如图1所示，药物对细胞株的半数抑制浓度(IC₅₀)结果如表1所示：

表1贯叶金丝桃素衍生物对各肿瘤细胞株的IC₅₀值

由表1的结果可见，贯叶金丝桃素乙酯和贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐对人***细胞(Hela)、人恶性黑色素瘤细胞(A375)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人肺癌细胞(A549)和人肝癌细胞(HepG-2)和人慢性髓细胞白血病细胞(K562)都有明显的抑制增殖作用。对于人慢性髓细胞白血病细胞对ADR耐药株(K562/ADR)，其增殖抑制作用远远强于阳性对照药阿霉素。其中贯叶金丝桃素乙酯对癌细胞的IC₅₀值在20.98-64.14μM的范围内。而贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐的作用更加显著，IC₅₀值在3.24-14.90μM之内。

(2)贯叶金丝桃素衍生物对正常细胞非洲绿猴肾细胞Vero的体外毒性试验。

按实验(1)的方法，分别用1.5625、3.125、6.25、12.5、50、100μM的贯叶金丝桃素乙酯和贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐处理非洲绿猴肾细胞Vero48h后，采用甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测定非洲绿猴肾细胞Vero的生长状况，实验结果见图2。

图2结果显示，贯叶金丝桃素乙酯和贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐对正常细胞非洲绿猴肾细胞Vero的存活率影响远远不如对癌细胞敏感，说明药物体外毒性很低。因此，贯叶金丝桃素乙酯和贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐对癌细胞具有特异性的抑制作用。

实施例5、贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐在人体外对人慢性髓细胞白血病细胞(K562)的抗癌实验

(1)贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐在体外诱导人慢性髓细胞白血病细胞(K562)凋亡

按实验1.1的方法，分别配制好0、1、10、20μM的贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐，处理K562细胞48h后，采用流式细胞术FITC-Annexin V/PI荧光双染检测细胞凋亡。1000rpm/min离心5min，室温下PBS离心洗涤细胞两次。去上清，加100μl凋亡缓冲液，Annexin V和PI，混匀后避光孵育20min，以不加Annexin V及PI的为阴性对照，立即流式细胞仪检测。根据早期和晚期凋亡的检测数据，计算凋亡率AP，并进行分析比较。结果如图3所示。

图3的结果显示，贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐以剂量依赖的方式诱导细胞凋亡。药物处理的细胞凋亡率均高于对照组(2.7±0.4)％，加药48h后1μM组，10μM组，20μM组的凋亡率分别为(9.3±1.2)％、(20.6±1.2)％和(35.8±1.3)％。因此，贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐在体外对K562具有诱导凋亡作用，即其具有抗癌作用。

(2)贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐在体外影响人慢性髓细胞白血病细胞(K562)周期

按实验1.1的方法，分别配制好0、1、10、20μM的贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐，处理K562细胞48h后，采用流式细胞术PI单染检测药物对细胞周期的影响。1000rpm/min离心5min，室温下PBS离心洗涤两次，去上清，用300μL含10％胎牛血清的PBS重悬细胞，再逐滴加入70％的冷乙醇700μL，边加边轻轻振荡，以防止细胞团块形成，4℃固定过夜。离心去上清，PBS进行离心沉淀，去除固定液。加入适量PBS制成细胞悬液，加入RNase使其终浓度为50μg/mL，37℃水浴消化1h，再加入PI(终浓度为10μg/mL)染液混匀，置4℃避光30min，1h内上机。检测前用300目尼龙网筛过滤除去细胞团块，每份1×10⁵个细胞，488nm处显红色荧光。检测并进行细胞周期分析比较。结果如图4所示。

结果显示，加药处理后，细胞周期相比对照组细胞G₁期细胞比例(29.1±1.2)％变化明显，随药物浓度的增加G₁期细胞比例上升分别至(35.8±0.4)％(41.9±1.7)％(48.2±1.0)％，相对于空白对照组具有显著差异。

因此，贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐能将K562细胞阻滞在G₁期，从而抑制肿瘤细胞增殖

(3)DAPI法检测细胞凋亡

用多聚赖氨酸预处理共聚焦平板，使用前用无菌水洗2遍，干燥2h待用，共聚焦平板内加入100μL含有10μM贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐的K562细胞，细胞密度为2×10⁵个/mL，37℃，5％CO₂孵育48h，PBS洗3遍，每次5分钟。小心吸去皿中液体，用新配制的多聚甲醛溶液于4℃固定30min。用PBS轻轻漂洗2-3次，每次5min，以滤纸小心吸去皿中液体。滴加DAPI应用液100μL，室温作用15min，标记细胞核，PBS洗3次，每次5min。同时设置不加药对照组。4℃保温放置，避光备用。于共聚焦显微镜下观察。结果如图5所示。

DAPI检测结果表明：对照组K562细胞核没有明显的凋亡现象；经10μM的贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐孵育48h后，细胞则出现明显的凋亡现象，在共聚焦显微镜下可看到凋亡细胞核染色质断裂为大小不等的片段，有的形成单个的凋亡小体。见图5(A、B)。

形态学实验结果更加直观的说明，贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐对K562细胞具有诱导凋亡作用。

综合本试验例和试验例1的体外实验结果可见，贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐对于人慢性髓细胞白血病细胞具有抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、阻滞细胞于G₁期的作用。

实施例6、贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐在人体外对人慢性髓细胞白血病细胞对ADR耐药株(K562/ADR)的抗癌实验

在多药耐药肿瘤细胞中，通常情况下与耐药性密切相关的P-糖蛋白(P-gp)是高表达的。在本试验例中，采用流式细胞术检测细胞膜P-gp蛋白的表达，考察了药物对多药耐药细胞耐药性的逆转作用。

实验分为K562组、K562/ADR组、K562/ADR+10μM贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐组于培养箱中培养48h后，收集细胞离心后弃上清，4℃PBS洗3次，加PE标记的鼠抗人P-gp单克隆抗体，室温避光孵育30min，PBS洗2次，用PBS重悬后以流式细胞仪检测P-gp表达，每个样本细胞计数为10⁴个。结果如图6所示。

流式细胞术检测结果显示，非耐药性的K562细胞P-gp阳性表达率仅为(2.2±1.1)％，而耐药细胞K562/ADR的阳性表达率高达(99.87±1.4)％。以10μM处理48h后，K562/ADR细胞P-gp表达率下降至(72.2±2.6)％。贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐能够下调K562/ADR细胞表面P-gp的阳性表达。

综合本试验例和试验例1的体外实验结果可见，贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐对人慢性髓细胞白血病细胞对ADR耐药株(K562/ADR)具有抑制细胞增殖、下调细胞P-gp表达的作用。而通常情况下，对广谱抗肿瘤药物ADR耐药的癌细胞也对其他多种抗肿瘤药物耐药。提示贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐可以逆转多药耐药细胞的耐药性。

实施例7、贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐在人体外对人肝癌细胞HepG-2的抗癌实验

(1)贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐在体外诱导人肝癌细胞HepG-2凋亡

按实验1.1的方法，分别配制好0、1、5、40μM的贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐，处理HepG-2细胞48h后，采用流式细胞术FITC-Annexin V/PI荧光双染检测细胞凋亡。1000rpm/min离心5min，室温下PBS离心洗涤细胞两次。去上清，加100μl凋亡缓冲液，Annexin V和PI，混匀后避光孵育20min，以不加Annexin V及PI的为阴性对照，立即流式细胞仪检测。根据早期和晚期凋亡的检测数据，计算凋亡率AP，并进行分析比较。结果如图7所示。

图7的结果显示，贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐以剂量依赖的方式诱导细胞凋亡。药物处理的细胞凋亡率均高于对照组(3.5±0.6)％，加药48h后1μM组，5μM组，40μM组的凋亡率分别为(12.6±0.8)％、(31.6±1.0)％和(60.5±2.8)％。因此，贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐在体外对HepG-2具有诱导凋亡作用，即其具有抗癌作用。

(2)贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐在体外影响人肝癌细胞HepG-2周期

按实验1.1的方法，分别配制好0、1、5、40μM的贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐，处理HepG-2细胞48h后，采用流式细胞术PI单染检测药物对细胞周期的影响。1000rpm/min离心5min，室温下PBS离心洗涤两次，去上清，用300μL含10％胎牛血清的PBS重悬细胞，再逐滴加入70％的冷乙醇700μL，边加边轻轻振荡，以防止细胞团块形成，4℃固定过夜。离心去上清，PBS进行离心沉淀，去除固定液。加入适量PBS制成细胞悬液，加入RNase使其终浓度为50μg/mL，37℃水浴消化1h，再加入PI(终浓度为10μg/mL)染液混匀，置4℃避光30min，1h内上机。检测前用300目尼龙网筛过滤除去细胞团块，每份1×10⁵个细胞，488nm处显红色荧光。检测并进行细胞周期分析比较。结果如图8所示。

结果显示，对照组细胞G₂期细胞比例为(7.0±1.3)％。加药处理后，1μM组细胞周期变化不明显，随药物浓度的增加，5μM和40μM组细胞G₂期细胞比例上升分别至(11.2±1.4)％(19.0±1.6)％，相对于空白对照组具有显著差异。

因此，贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐能将HepG-2细胞阻滞在G₂期，从而抑制肿瘤细胞增殖

(3)DAPI法检测细胞凋亡

HepG2细胞以1×10⁵个/mL加入100μL接种于共聚焦皿中，细胞贴壁后加入100μL含有5μM DCHA-HF，37℃，5％CO₂，孵育48h。PBS洗3遍，每次5分钟。小心吸去皿中液体，用新配制的多聚甲醛溶液于4℃固定30min。用PBS轻轻漂洗2-3次，每次5min，以滤纸小心吸去皿中液体。滴加DAPI应用液100μL，室温作用15min，标记细胞核，PBS洗3次，每次5min。同时设置不加药对照组。4℃保温放置，避光备用。于共聚焦显微镜下观察。结果如图9所示。

DAPI检测结果表明：对照组HepG2细胞核没有明显的凋亡现象；经5μM的DCHA-HF孵育48h后，细胞则出现明显的凋亡现象，在共聚焦显微镜下可看到凋亡细胞核染色质断裂为大小不等的片段，有的形成单个的凋亡小体。见图9(A、B)。

形态学实验结果更加直观的说明，贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐对HepG2细胞具有诱导凋亡作用。

综合本试验例和试验例1的体外实验结果可见，贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐对人肝癌细胞HepG-2具有抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、阻滞细胞于G₂期的作用。

实施例8

本实施例所述的***的药物，其活性成份为贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐，具体组成如下：

贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐            20g

淀粉                                   9g

10％淀粉浆                             6g

干淀粉                                 4g

硬脂酸镁                               0.5g

维生素C                                50mg

制成片剂：取处方量的贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐与淀粉混合均匀，加适量10％淀粉浆制软材，过16目筛制粒，将湿颗粒于40～60℃尽快通风干燥，干粒通过16目筛整粒，整粒后加入润滑剂，崩解剂等辅料，混匀，计算片重后压片。

使用方法：一日三次，每次1g。

实施例9贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐薄膜包衣片剂

贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐片剂的组成和制法与实施例4相同。

片剂的薄膜包衣

组成：

羟丙甲纤维素(HPMC)                        6ml

聚乙二醇(PEG6000)                         4ml

滑石粉                                    2g

二氧化钛                                  2g

水                                        适量

95％乙醇                                  适量

制法：

包衣液的配制：取HPMC加热水使其分散溶解，另取PEG-6000加水，搅拌使其分解，将以上两溶液混合加入95％乙醇适量，加入滑石粉和二氧化钛，将上述混合液用胶体磨均质2次，即得包衣液。

包衣工艺：将素片倒入锅内，开动包衣锅，素片预热约5min后控制好包衣液流速，开始喷雾包衣(待素片平均增重约0.15g后)。包衣约2h，至素片全部包好，用2％二甲基硅油的乙醇溶液打光，即得成品

使用方法：一日三次，每次1g。

实施例10、贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐微丸

组成：

空白丸芯                                12g

贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐             2.7g

滑石粉                                  0.4g

微晶纤维素                              0.6g

维生素C                            30mg

10％PVP乙醇液                      适量

制法：

(1)在2.7克贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐(过100目)中，加入0.4克滑石粉、0.6克微晶纤维素、以及30mg的维生素C，混合均匀。

(2)将12克空白丸芯放于包衣锅内，转速调至40rpm，以10％PVP乙醇液为粘合剂，(1)为成丸材料，进行微丸的制备，过程中，送冷风干燥。

(4)所得微丸充分干燥后，筛出0.45-1.1mm(40-16目)大小的微丸用于包薄膜衣。使用方法：一日三次，每次1g。

实施例11、贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐薄膜包衣微丸

贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐微丸的处方和制法与实施例6相同。

微丸的薄膜包衣

处方：

5％IV号丙烯酸树脂                      5ml

2％羟丙基甲基纤维素                    1ml

滑石粉                                 0.1g

二氧化钛                               0.1g

硬脂酸镁                               0.05g

吐温-80                                0.1ml

制法：

(1)分别用95％的乙醇和80％的乙醇，浸泡IV号丙烯酸树脂和羟丙基甲基纤维素过夜，使其溶解。

(2)将上述两种溶液按处方量混合，依次加入过100目筛的滑石粉、二氧化钛、和硬脂酸镁。再加入吐温-80，在研磨内反复研磨后，转入喷瓶内备用。

(3)将微丸置于包衣锅中，包衣锅转速调为30rpm，向微丸喷涂包衣料，当微丸表面覆盖一层包衣料后，停止喷液，并慢慢把转速调高到40rpm，待其转动一小段时间后，送冷风将微丸吹干，其间用毛刷打散粘在一起的微丸。

(4)将包衣操作控制在避光，低温的条件下，间歇式喷涂包衣料，注意层层吹干，防止微丸互相粘连，喷一层，干燥一层，直到包衣液喷完为止。

(5)取出包衣后的微丸，置干燥器中干燥24小时以上，筛出40-16目的微丸。

(6)将最后所得微丸装入含遮光剂的胶囊壳中，制得成品。

使用方法：一日三次，每次1g。

实施例12、贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐硬胶囊

处方：

贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐                20g

维生素C                                    50mg

10％淀粉浆                                 适量

硬脂酸镁                                   0.05g

制法：取贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐以及维生素C分别粉碎过80目筛。加入由10％淀粉浆制成的糊，制成软材后，过14目尼龙筛制粒，于70℃干燥至水分3％以下，加入硬脂酸镁，混匀后的颗粒填充胶囊即得。

使用方法：一日三次，每次1g。

实施例13、贯叶金丝桃素乙酯软胶囊

贯叶金丝桃素乙酯           20ml

维生素E                    9ml

明胶                       8ml

甘油                       4ml

水                         9ml

精炼食用植物油            适量

取贯叶金丝桃素乙酯和维生素E加入精炼食用植物油，溶解，并调整浓度，作为药液待用；另取甘油以及水加热至70-80℃，加入明胶，搅拌溶化，保温1-2h，除去泡沫，过滤加入滴丸机滴制，冷却，最后在30-35℃烘干约2h，筛选，即得。

使用方法：一日三次，每次2g。

Claims (5)

1.具有结构I₁的贯叶金丝桃素乙酯和/或具有结构I₂的贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐在制备***的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为白血病。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为对多种抗肿瘤药物耐药的白血病。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肝癌、***、肺癌、乳腺癌或恶性黑色素瘤。

5.一种***的药物，其特征在于，其活性成份为权利要求1所述的贯叶金丝桃素乙酯和/或贯叶金丝桃素-N，N二环己胺盐。

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