CN101932708A

CN101932708A - 改进的基因沉默方法

Info

Publication number: CN101932708A
Application number: CN2008801021953A
Authority: CN
Inventors: M-B·王; P·沃特豪斯
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Current assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Priority date: 2007-08-14
Filing date: 2008-08-14
Publication date: 2010-12-29
Also published as: AU2008286701B2; ES2651911T3; US20110131668A1; EP2185706A4; CA2695455C; EP2185706B1; AU2008286701A1; US20150259682A1; US9885038B2; WO2009021288A1; EP2185706A1; CA2695455A1

Abstract

本发明提供了获得靶核酸的改进的基因沉默的方法和手段，其中提供了靶向相同核酸的至少两种抑制性RNA分子，但是所述RNA分子通过不同的加工途径被加工成短干扰RNA分子。还提供了获得靶核酸的改善的基因沉默的方法和手段，其中提供了靶向不同核酸的至少两种抑制性RNA分子，但是所述RNA分子通过不同的加工途径被加工成短干扰RNA分子。

Description

改进的基因沉默方法

技术领域

本发明涉及重组DNA技术领域，更特别地涉及通过提供抑制性RNA分子而修饰真核生物的核酸表达。本发明描述了通过向真核生物提供一种以上的抑制性RNA而修饰植物中的基因沉默的方法，其中通过不同的基因沉默途径处理所述的不同种类的抑制性RNA。本发明可以应用于不同的领域，包括农业、水产业或医疗领域。

背景技术

基因沉默是一种真核生物中常见的现象，其中通过一些不同的机制，从mRNA降解(转录后沉默)到抑制蛋白合成再到染色质重塑(转录沉默)，从而降低或甚至消除特定基因的表达。

已经快速采用基因沉默的现象而工程化不同靶分子的表达。最初，已知调节真核生物中基因表达的两种主要的方法，其在本领域中被称为“反义”下调或“正义”下调。

在过去十年中，已经证明使用编码RNA的嵌合构建体可以在定量和定性水平上极大地改进沉默效率，所述RNA能够通过在分别与靶序列互补和同源的反义和正义RNA核苷酸序列之间通过配对而形成双链RNA。这样的双链RNA(dsRNA)被称为发夹RNA(hpRNA)。

下列参考文献描述了这样的方法的用途：

Fire等人，1998(Nature 391，806-811)描述了通过在线虫(Caenorhabditiselegans)中实验引入双链RNA的特异性遗传干预。

WO 99/32619提供将RNA引入活细胞而抑制该细胞中靶基因的基因表达的方法。该方法可以在体外或在体内进行。RNA有带有双链结构的区域。抑制是序列特异性，因为RNA的双链区的核苷酸序列和或靶基因的一部分是相同的。

Waterhouse等人1998(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13959-13964)描述可以通过同时表达正义和反义RNA诱导植物中的病毒抗性和基因沉默。正义和反义RNA可以定位于自我互补的一个转录本中。

Hamilton等人1998(Plant J.15：737-746)描述了具有重复DNA的转基因，即其5’非翻译区的倒转拷贝，所述转基因造成番茄中ACC-氧化酶表达的高频率的转录后抑制。

WO 98/53083描述了用于增强生物中靶基因抑制的构建体和方法，其包括将载体中多核苷酸区所有或一部分的倒转重复序列***基因沉默载体。

WO 99/53050提供了通过引入编码针对靶核酸的正义和反义RNA分子的嵌合基因而减少真核细胞中特别是植物细胞中感兴趣的核酸的表型表达的方法和手段。这些分子能够在具有正义和反义核苷酸序列的区域之间通过碱基配对或通过自身引入RNA分子而形成双链RNA区。优选地，RNA分子同时包括正义和反义核苷酸序列。

WO 99/49029大体上涉及修饰基因表达的方法并涉及修饰转基因生物特别是转基因动物或植物的细胞、组织或器官中内源基因表达的合成基因。还提供了，当引入生物时，能够形成可以抑制、延迟或减少生物中内源基因或靶基因的表达的dsRNA的合成基因和遗传构建体。

WO 99/61631涉及使用基因的正义和反义RNA片段改变植物中靶基因表达的方法。正义和反义RNA片段能够配对和形成双链RNA分子，因此改变基因的表达。该发明还涉及使用这些方法获得的植物、其后代及其种子。

WO 00/01846提供了一种鉴定负责提供细胞中特定表型的DNA的方法，该方法包括a)在合适的载体中构建细胞的DNA的cDNA或基因组库，其方向为相对于启动子的方向，当合适的转录因子结合至启动子时，所述启动子能够启动cDNA或DNA转录至双链(ds)RNA；b)将库引入含有转录因子的一个或多个细胞中，和c)鉴定和分离含有库的细胞的特定表型并鉴定来自负责提供表型的库的DNA或cDNA片段。使用这个技术，还可以通过下列方法确定已知DNA序列的功能：a)鉴定细胞中DNA序列的同源物，b)从细胞中分离相关DNA同源物或其片段，c)将同源物或其片段克隆进入合适的载体，其方向为相对于合适的启动子的方向，当合适的转录因子结合至启动子时，所述启动子能够启动来自所述DNA同源物或片段的dsRNA的转录，d)将载体引入含有转录因子的步骤a)的细胞中。

WO 00/44914还描述了使用双链RNA在体内和体外，特别是在斑马鱼中弱化基因表达的组合物和方法。

WO 00/49035描述了使细胞中内源基因表达沉默的方法，该方法包括在细胞中过表达内源基因的核酸分子和反义分子，包括与内源基因的核酸分子互补的核酸分子，其中细胞中内源基因的核酸分子和反义分子的过表达使内源基因的表达沉默。

Smith等人，2000(Nature 407：319-320)以及WO 99/53050描述了含有dsRNA的内含子进一步增加沉默的效率。含有发夹RNA的内含子也被称为ihpRNA。

虽然基因沉默最初被认为是引入异常RNA分子的结果，如当引入转基因(转录至反义正义或双链RNA分子)时，但是最近明确的是这些现象不只是实验假象。真核生物中RNA介导的基因沉默似乎在各种生物过程中起重要作用，如发育的空间上和时间上的调节，异染色质形成和抗病毒防御。

所有真核生物具有产生小RNA的机制，小RNA然后用于在转录或转录后水平调节基因的表达。通过特异性核糖核酸酶(Dicer或Dicer样(DCL)蛋白)的作用，各种双链RNA分子底物被加工成小的21-24个核苷酸长的RNA分子。专用的dsRNA结合(DRB)蛋白与DCL蛋白结合而优化将其各种dsRNA底物加工成特异性大小的小RNA。这些小RNA作为引导分子被整合进入蛋白复合物(RNA-诱导的沉默复合物(RISC))，其进一步含有保守的Argonaute蛋白(AGO)家族的一个成员，其导致通过基因沉默获得的各种效应。植物如拟南芥具有广泛的内源RNA沉默途径，这归因于存在几个专门的DCL蛋白(拟南芥中有四个)和不同的AGO旁系同源物(拟南芥中有十个)。

通过与RNA或DNA的序列特异性相互作用而参与真核生物中基因表达抑制的小RNA通常分为两类：microRNA(miRNA)和小干扰RNA(siRNA)。这些类型的小RNA分子通过其前体的结构和通过其靶标而得以区分。miRNA从大得多的折回转录本的短的不完全配对的主干上被切下并调节那些与其具有非常有限的相似性的转录本的表达。siRNA起源于长的双链RNA(dsRNA)并通常指导与其完全互补的转录本的切割，包括其所衍生自的转录本(Yoshikawa等人，2005，Genes& Development，19：2164-2175)。

Dicer家族成员的数量在生物中差别很大。在人类和线虫(C.elegans)中只有一个Dicer。在果蝇(Drosophila)中，小干扰RNA指导的mRNA的切割既需要Dicer-1又需要Dicer-2，而Dicer-1而非Dicer-2对于microRNA指导的抑制是重要的(Lee等人，2004 Cell 75：843-854，Pham等人，2004 Cell 117：83-94)。

植物如拟南芥似乎具有至少四个Dicer样(DCL)蛋白并且已经在科学文献中建议这些DCL是功能上专门化的(Qi等人，2005 Molecular Cell，19，421-428)。

DCL1具有来自部分双链茎环前体RNA(该前体RNA从MIR基因转录)的miRNA(Kurihara和Watanabe，2004，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：12753-12758)。

DCL3具有内源性重复和基因间区域衍生的siRNA，其依赖于依赖RNA的RNA聚合酶2并参与涉及DNA和组蛋白甲基化的24nt siRNA的累积(Xie等人，2004，PLosBiology，2004，2，642-652)。

DCL2似乎在一些但不是所有的植物病毒的抗病毒沉默反应中起作用(Xie等人，2004，PLosBiology，2004，2，642-652)。

几个出版物已经归结了DCL4在产生反式作用siRNA(ta-siRNA)中的作用。ta-siRNA是三个已知基因家族(在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中被称为TAS1，TAS2和TAS3)所编码的内源性siRNA的特异性种类。ta-siRNA的生物发生途径包括miRNA指导的位点特异性的原始转录本的切割。该加工的转录本然后通过RDR6和SGS3的活性被转变成dsRNA。然后DCL4的活性催化将dsRNA转变为以21-nt增加的siRNA双链结构(Xie等人2005，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102，12984-12989；Yoshikawa等人，2005，Genes & Development，19：2164-2175；Gasciolli等人，2005 Current Biology，15，1494-1500)。

如Xie等人2005(前述)所显示的，还需要确定DCL4是否对于转基因和抗病毒沉默是必需的。

Dunoyer等人2005(Nature Genetics，37(12)pp1356 to 1360)描述了DCL4对于RNA干扰是必需的并且产生植物细胞-细胞沉默信号的21-核苷酸的小干扰RNA成分。

Dunoyer等人2007(Nature Genetics 39 pp 848-856)将拟南芥中不同途径总结如下：DCL1与DRB蛋白HYL1一起催化从不完全折回的前体转录本中miRNA的释放。通常，加载了miRNA的AGO1然后促进带有miRNA靶序列8的细胞转录本的切割。通过募集AGO4和/或AGO6，DCL3产生指导异染色质形成的与24-ntDNA重复相关的siRNA。与DRB4一起，DCL4产生21-nt反式作用siRNA(tasiRNA)，其需要AGO1或AGO7的功能以介导控制异胚体(Heteroblasty)和叶子极性的基因的转录后沉默。最后，DCL2产生指挥应激反应16的天然反义转录本siRNA。

未公开的PCT申请PCT/AU07/000583描述了并证明了在将长发夹RNA分子加工成最终实施基因沉默的干扰RNA成分的过程中DCL4的调节和参与。

虽然介导基因沉默的RNAi已经成为可接受的研究工具，以及开发特定性质的工具，但是偶然有报道提出在特定条件下，或几个世代的终身，特别是在植物细胞和植物中的基因沉默的长期稳定性的问题。例如Szittya等人2003(EMBOJournal 22，pp 633 to 640)报道低温通过控制siRNA产生而抑制RNA沉默介导的防御。Karmeda等人2004报道通过果蝇中表达的倒转重复的温度敏感的基因沉默(Biochem.Biophys.Res.Comm.315，599-602)。Niu等人2006(NatureBiotechnology 24，1420-1428)描述通过拟南芥植物上TYMV症状的病毒感染***在15℃比在24℃更严重并且含有指导下调病毒表达的microRNA的转基因植物显示出在15℃保持的稳定的amiRNA介导的特异性病毒抗性。

另外，一些RNAi的应用，特别是作为发展特性的工具，需要靶基因的强烈下调，优选甚至为了靶基因功能的所有实际方法和目的而几乎完全或完全下调靶基因。

使用不同的嵌合体基因或通过相同的siRNA分子产生途径加工的RNA分子，将RNAi应用于不同的靶基因可以导致这样途径的饱和。

因此，以下在不同具体实施方式中描述的实施例和权利要求是解决上述问题的基因沉默的方法和手段，其提供和使用至少两种抑制性RNA分子或编码针对相同靶核酸的这样的RNA分子的基因，其中抑制性RNA分子通过将RNAi加工成siRNA分子的两种或两种以上分开的途径而造成基因沉默，通常由不同的Dicer蛋白或Dicer样蛋白(可选与不同的dsRNA结合蛋白和/或Argonaute家族成员组合)介导并最终造成基因沉默。为了减少RNAi加工途径的饱和问题，描述了提供和使用至少两种抑制性RNA分子或编码针对不同靶核酸的这样的RNA分子的基因的方法和手段，其中抑制性RNA分子通过将RNAi加工成siRNA分子的两种或两种以上的单独途径造成基因沉默。

发明内容

在一个具体实施方式中，本发明提供了一种减少真核细胞或生物，如植物细胞或植物或动物细胞或非人类动物中的靶核酸的表达的方法，其包括引入能够减少存在于真核细胞中的一个靶核酸的表达的至少两种抑制性RNA分子的步骤，其中抑制性RNA分子通过不同的RNAi分子加工途径被加工成21至24个核苷酸长度的寡核苷酸，例如主要通过单独的Dicer蛋白或单独的Dicer样蛋白而切割成为21至24个核苷酸长度的寡核苷酸。

在另一个具体实施方式中，本发明提供了一种减少真核细胞或生物中第一和第二靶核酸的表达的方法，其包括引入至少两种抑制性RNA分子的组合的步骤，其中一种抑制性RNA分子能够减少真核细胞或生物中的第一靶核酸的表达，另一种抑制性RNA分子能够减少所述真核细胞或生物中的第二靶核酸的表达，其中主要通过细胞或生物中不同的RNAi分子加工途径将抑制性RNA分子加工成为21至24个核苷酸长度的寡核苷酸。

在本发明的一个具体实施方式中，一种抑制性RNA分子主要通过DCL1或具有相似功能或特异性的RNAse切割，另一个抑制性RNA分子主要通过DCL4或具有相似功能和特异性的RNAse切割。

在本发明的另一个具体实施方式中，一种抑制性RNA分子主要通过DCL3或具有相似功能和特异性的RNAse切割，另一种抑制性RNA分子主要通过DCL4或具有相似功能和特异性的RNAse切割。

还提供了其它的组合如：

a)一种抑制性RNA分子主要通过DCL1或具有相似功能和特异性的RNAse切割，另一种抑制性RNA分子主要通过DCL2或具有相似功能和特异性的RNAse切割；

b)一种抑制性RNA分子主要通过DCL1或具有相似功能和特异性的RNAse切割，另一种抑制性RNA分子主要通过DCL3或具有相似功能和特异性的RNAse切割；

c)一种抑制性RNA分子主要通过DCL2或具有相似功能和特异性的RNAse切割，另一种抑制性RNA分子主要通过DCL3或具有相似功能和特异性的RNAse切割；或

d)一种抑制性RNA分子主要通过DCL2或具有相似功能和特异性的RNAse切割，另一种抑制性RNA分子主要通过DCL4或具有相似功能和特异性的RNAse切割。

还在本发明的另一个具体实施方式中，提供了一种减少真核细胞或生物，如植物细胞或植物或动物细胞或非人类动物中的靶核酸的表达的方法，其包括引入能够减少存在于真核细胞中的一种靶核酸表达的至少两种抑制性RNA分子，其中一种抑制性RNA分子是能够减少靶核酸表达的miRNA分子，pre-microRNA分子或pri-mRNA分子，其中另一种RNA分子是双链RNA分子，其包括互补或实质上互补的第一和第二RNA区，第一RNA区包含至少19个连续的选自靶核酸的核苷酸序列的核苷酸，第二RNA区包含至少19个连续的选自靶核酸的核苷酸序列互补的核苷酸。在另一个具体实施方式中，所述第一抑制性RNA分子可以包含至少19个连续的来自靶核酸分子的启动子区的核苷酸，第二抑制性RNA分子可以包含至少19个连续的来自转录成RNA分子的靶核酸分子区的核苷酸。

还在本发明的另一个具体实施方式中，从引入真核细胞的抑制性RNA编码基因转录抑制性RNA分子。在本发明的特定具体实施方式中，可以在被RNA聚合酶II识别的启动子的控制下从抑制性RNA编码基因转录抑制性RNA分子，可以在被RNA聚合酶III识别的启动子控制下从抑制性RNA编码基因转录另一种抑制性RNA。

靶核酸可以是病毒核酸或基因或其转录区或其可以是转基因或其可以是内源性基因。

相对于那些通过任何抑制性RNA分子单独在真核生物中的获得的靶核酸表达的减少来说，通过本发明的方法获得的靶核酸的表达可以更加减少或更稳定或对外部因素更不敏感。

本发明的另一个目的是提供真核细胞，如植物或动物细胞，其包含能够减少存在于真核细胞中的一种靶核酸表达的至少两种抑制性RNA分子，其中抑制性RNA分子通过不同的RNAi分子加工途径被加工成21至24个核苷酸长度的寡核苷酸。本发明还提供实质上或完全由上述细胞组成的非人类真核生物。

还在另一个具体实施方式中，本发明提供物质的组合物，其包括能够减少存在于真核细胞的一种靶核酸的表达的至少两种抑制性RNA分子，其中抑制性RNA分子通过不同的RNAi分子加工途径被加工成21至24个核苷酸长度的寡核苷酸。

本发明还提供一种试剂盒，其包含能够减少存在于真核细胞的一种靶核酸的表达的至少两种抑制性RNA分子，其中抑制性RNA分子通过不同的RNAi分子加工途径被加工成21至24个核苷酸长度的寡核苷酸，所述试剂盒作为同时、分别或相继用于减少真核生物中靶核酸表达的组合制备物。

本发明还提供物质的组合物，其包含本文所述的至少两种抑制性RNA分子，及其作为药物的用途。

附图说明

图1.图板A：差别性处理源自CaMV35S(PolI II识别的)和AtU6-指导的(Pol III识别的)PDShp42转基因的短hpRNA：中间体RNA种类和siRNA的模式在35S和U6系之间均不同。泳道1-6：含有CaMV35S驱动的PDS hp42转基因的不同植物系中的小RNA种类的Northern分析；泳道7-12：含有AtU6驱动的PDS hp42转基因的不同植物系中的小RNA种类的Northern分析。

图板B：含有CaMV35S驱动的PDS hp42转基因(35S-X；每个板的顶部)，AtU6驱动的PDS hp42转基因(U6-XX；每个板的底部)的不同转基因系中的和同时含有两个转基因(35S-X x U6-XX；每个板的中部)的植物系中的PDS表达的沉默。

图2.Northern blot分析显示源自拟南芥中35S-GUShp93和U6-GUShp93转基因的hpRNA的差异性加工。图板A.siRNA的检测。注意35S和U6系间siRNA大小模式的总体差异性。图板B.siRNA的更好分离。在15％(左图板)或18％(右)聚丙烯酰胺凝胶中分离A中小RNA样品的亚群并以针对A探针相同的探针杂交。注意来自35S系的siRNA主要是21nt的大小，而来自U6系的siRNA是22和/或24nt的大小。图板C.拟南芥植物中35S-GUShp93和U6-GUShp93的中间体RNA的Northern blot分析。在5％的甲醛琼脂糖(NuSieve 3∶1)凝胶中分离总的小RNA，并以³²P标记的全长反义GUS RNA杂交(顶部图板)。图板D.C(#4，#6，#17和#21)中显示的四个总的小RNA样品不以RNaseI处理(-)或以RNaseI处理(+)，在5％的甲醛琼脂糖(NuSieve 3∶1)凝胶中分离并以³²P标记的对应于GUShp93 RNA的茎和环(即GUS ORF的nt.512-697)正义RNA杂交，其应该检测GUShp93的转录本的全长RNA和dsRNA茎而不是GUShp93的转录本的环片段。N-35S和N-U6是分别来自混合的35S-GUShp93和U6-GUShp93的植物的核RNA制备物。图板E.相同的四个样品不以RNaseI处理(-)或以RNaseI处理(+)，在5％的甲醛琼脂糖(NuSieve 3∶1)凝胶中分离，并以³²P标记的对应于GUShp93 RNA环(即GUSORF的nt.605-697)的反义RNA杂交。注意35S-GUShp93衍生的RNA中间体只与反义探针(C和E)杂交，但不与正义探针(D)杂交，这表明杂交带是环片段。

图3.含有35S-GUShp93嵌合基因或AtU6hp93嵌合基因或两者的不同转基因系中的GUS表达的分析。

图4.图板A：含有针对EIN2的启动子和转录区的hpRNA的转基因系(hp)；含有针对EIN2启动子的正义RNA的转基因系(s)或含有两类转基因的转基因系(hp x s)中的短RNA分子的Northern分析。

图板B：含有编码针对EIN2内源性基因的启动子的正义抑制性RNA的转基因的不同转基因系(s)中的EIN2沉默；含有编码针对EIN2内源性基因启动子区以及EIN2内源性基因的mRNA编码区的5’UTR的双链抑制性RNA的转基因的转基因系(hp)中的EIN2沉默；和含有这两个转基因的系(s x hp)中的EIN2沉默。在含有ACC的培养基中播种种子并在黑暗中培育。胚轴越长，EIN2基因的表达的沉默越强。

具体实施方式

本发明基于本发明人的这样的证明：相对于只提供了一种抑制性分子时在真核细胞中观察到的靶核酸表达的减少来说，当提供针对特定的靶核酸的至少两种抑制性RNA分子时，真核细胞，如植物细胞，表现出的更强烈的和更稳定的特定靶核酸的表达的减少，每个抑制性RNA分子通过不同的基因沉默途径发挥其最终效应。

特别证明了当提供编码在被RNA聚合酶II所识别的启动子控制下的hpRNA的嵌合基因和编码在被RNA聚合酶III所识别的启动子(特别是3类启动子)控制下的hpRNA的嵌合基因的组合时，通过编码植物细胞中双链RNA分子(特别是hpRNA)的嵌合基因而获得的基因沉默更为加强。相似地，可以通过提供两种单独的嵌合基因而观察到靶核酸表达的增强性减少，其中一种嵌合基因编码针对启动子区的抑制性RNA(称为共抑制或正义基因沉默构建体)，另一种嵌合基因编码还针对靶核酸的转录区的抑制性RNA(hpRNA)。另外从编码microRNA的嵌合基因和编码hpRNA的基因的组合预期得到表达的增强性减少。还预期这样的组合将在其他真核细胞如动物细胞中有效。

因此，本发明提供一种在真核细胞或生物中减少靶核酸表达的方法，其中将能够减少存在于真核细胞中的一种靶核酸的表达的至少两种抑制性RNA分子引入真核细胞中，并且其中通过不同的RNAi分子加工途径将抑制性RNA分子加工成21至24个核苷酸的寡核苷酸。这样的方法意外地造成靶核酸表达的增强性减少。另外，因为抑制性RNA分子通过不同的途径造成最终的基因沉默效应，该方法不倾向于受那些干扰加工途径中的一种而不干扰其它种的外部刺激的影响。

本文使用的“基因沉默效应”是指宿主细胞中，优选植物细胞中的“靶核酸的表达的减少”，其可以通过引入沉默RNA而实现。“靶核酸的表达”是指细胞中核酸的转录，可以通过转录本或加工产物例如mRNA或mRNA转录产物的产生或积累的降低的水平而观察或测定表达的减少。转录本可以不被加工或通过例如去除内含子而被加工，并且其可以被翻译或不被翻译；“表达”包括有该过程或无该过程的转录。表达的减少可以是转录减少的结果，包括通过染色质重塑的甲基化，或RNA分子的转录后修饰；包括通过RNA降解；或包括两者。基因沉默不必被解释为靶核酸或基因表达的消除。当存在沉默RNA时靶核酸表达的水平比不存在沉默RNA时低就足够了。表达水平可以减少至少约10％或至少约15％或至少约20％或至少约25％或至少约30％或至少约35％或至少约40％或至少约45％或至少约50％或至少约55％或至少约60％或至少约65％或至少约70％或至少约75％或至少约80％或至少约85％或至少约90％或至少约95％或至少约100％。如本文使用的，除非相反声明，短语“约”是指关于所考虑数值的任何合理的范围。在优选的具体实施方式中，术语“约”是指所指明数值的+/-1％。如本文使用的，“至更大的程度”是指相对于参考的至少10％的效应的增加。靶核酸可以包括内源性基因，转基因或病毒基因或通过病毒载体引入的基因。靶核酸可以进一步包括稳定引入宿主细胞基因组优选宿主细胞的核基因组的基因。

如本文使用的，“沉默RNA”或“沉默RNA分子”在本文还指“抑制性RNA”或“抑制性RNA分子”，表明当引入宿主细胞优选植物细胞时，特别通过转录和/或转录后沉默而减少靶基因的表达的任何RNA分子。这样的沉默RNA可以是例如所谓的“反义RNA”，其中RNA分子包含与靶核酸序列优选靶基因的编码序列的互补物具有至少95％序列同一性的至少20个连续核苷酸的序列。但是，反义RNA还可以针对靶基因的调节性序列，包括启动子序列和转录终止子和多腺苷酸化信号。沉默RNA进一步包括所谓的“正义RNA”，其中RNA分子包含与靶核酸序列具有至少95％序列同一性的至少20个连续核苷酸的序列。正义RNA还可以针对靶基因的调节性序列，包括启动子序列和转录终止子和多腺苷酸化信号。

提及的正义或反义RNA当然可以更长并为约30nt，约50nt，约100nt，约200nt，约300nt，约500nt，约1000nt，约2000nt或甚至约5000nt或长度更大，每个分别与靶核酸(或其互补物)的核苷酸序列具有约40％，50％，60％，70％，80％，90％或100％的总序列同一性。序列越长，总序列同一性的要求越低。但是，具有较小的总序列同一性的较长的正义或反义RNA分子应该至少包含与靶核酸或其互补物的序列具有至少95％序列同一性的20个连续核苷酸并且可以包含与靶核酸或其互补物的序列具有100％序列同一性的至少20个连续核苷酸。正义或反应RNA的长度可以在上面数字中的任何组合之间。在具体实施方式中，优选用于动物细胞特别是哺乳动物细胞的正义或反义RNA的长度在20至30个核苷酸之间。在具体实施方式中，正义或反应RNA的长度为21，22，23，24，25，26，27，28，或29个核苷酸。而沉默RNA包括正义和反义RNA，每个的长度可以独立地是上述的任何数字。在优选的具体实施方式中，正义和反义RNA的长度是相同的或差异达10％或20％，但不多于这个数值。

两种抑制性RNA分子可以靶向相同的区域，重叠区或优选靶核酸的非重叠区。如本文使用的，“重叠”意思是两个区域在至少两个相同的连续核苷酸重叠。在特别用于动物细胞如哺乳动物细胞的更优选的具体实施方式中，两种抑制性RNA分子中的一种是短发夹RNA，其可以是多腺苷酸化的但优选是非多腺苷酸化的，具有与靶基因的20-30个核苷酸的第一区的至少95％同一性的20-30个连续核苷酸的正义核苷酸序列，以及与靶基因第一区的互补物至少95％同一性的20-30个连续核苷酸的反义核苷酸序列，正义和反义序列通过3-20个核苷酸的间隔区共价结合；并且两种抑制性RNA分子中的第二种是miRNA分子，其具有与靶基因的20-30个或20-25个核苷酸的第二区的互补物有至少95％同一性的20-30个连续核苷酸优选为20-25个连续核苷酸的反义核苷酸序列，但不具有与靶基因的第二区有至少95％同一性的至少20个连续核苷酸的正义核苷酸序列。miRNA分子可以具有或不具有与靶基因的第二区为60-95％序列同一性的20-30个连续核苷酸的正义核苷酸序列。靶基因的第一和第二区优选是不同的，更优选是不重叠的。优选地，短发夹RNA是从具有RNA聚合酶III(RNA Pol III)启动子的嵌合基因表达而来的，并且miRNA分子是从具有RNA Pol II启动子的嵌合基因转录而来的，其作为随后在细胞中加工的前体RNA(pri-miRNA或pre-microRNA)。

其它沉默RNA可以是“非多腺苷酸化的RNA”，其包含与靶核酸序列的互补物具有至少95％序列同一性的至少20个连续核苷酸，如在WO 01/12824或US6423885中所描述的(两个文献都并入本文作为参考)。另外另一种沉默RNA是如在WO 03/076619或WO 2005/026356中所描述的(两个文献都并入本文作为参考)RNA分子，其包含与靶核酸或其互补物的序列具有至少95％序列同一性的至少20个连续核苷酸，并进一步包含如WO 03/076619或WO 2005/026356所述的大的双链区(包括含有来自马铃薯纺锤状块茎类病毒型的类病毒的核定位信号的或含有CUG三核苷酸重复的大的双链区)。沉默RNA还可以是和含有如本文定义的正义和反义链的双链RNA，其中正义和反义链能够相互碱基配对而形成双链RNA区(优选所述正义和反义RNA的至少20个连续核苷酸的是相互互补的)。正义和反义区还可以存在于一个RNA分子内，以便当正义和反义区形成双链RNA区时可以形成发夹RNA(hpRNA)。hpRNA在本领域是熟知的(参见例如WO 99/53050，并入本文作为参考)。可以将hpRNA分类为长hpRNA，其具有可以大部分互补但是不必完全互补的长的正义和反义区(通常在约200bp以上，在200-1000bp的范围内)。hpRNA还可以是相当小的，大小从约30至约42bp的范围，但是不比94bp长太多(参见WO 04/073390，并入本文作为参考)。沉默RNA分子还可以包括所谓的microRNA或合成的或人工的microRNA分子或其前体，如例如Schwab等人2006，Plant Cell 18(5)：1121-1133所描述的。

沉默RNA可以直接引入宿主细胞，或通过“基因沉默嵌合基因”的转录非直接地引入宿主细胞。基因沉默嵌合基因可以稳定地引入宿主细胞(如植物细胞)基因组，优选核基因组，或其可以瞬时地引入。

本文定义的所有的沉默RNA具有中间体的阶段，其中沉默RNA分子含有双链RNA区。本文使用的“双链RNA区”具有两条通过碱基配对而杂交的RNA链。这两条链可以是分离的链(未共价结合的)或可以是通过间隔或环区作为单一自我互补RNA的部分而共价结合的。在上下文中“碱基配对”包括G:U碱基配对以及标准Watson-Crick碱基配对。单链RNA通过例如依赖RNA的RNA聚合酶的作用而部分或完全转变成双链RNA，或者引入的或转录的抑制性RNA分子自身能够形成这样的双链RNA区。如果真核生物含有一个以上的dicer或dicer样蛋白(如例如在植物细胞中)，不同的Dicer或dicer样蛋白可以对双链RNA底物具有偏好并且产生的短干扰RNA的长度还可以不同，通过不同的Dicer或dicer样蛋白或通过Dicer或dicer样蛋白的不同活性的加工中的这种差异被称为“不同的RNAi分子加工途径”。通过与不同的专用双链RNA结合蛋白相结合以及通过将产生的小干扰RNA分子并入含有不同的Argonaute样蛋白的不同的RISC复合物，可以进一步延伸对于特定dsRNA底物的活性和特异性的这种差异。

如本文使用的，“Dicer蛋白”是具有核糖核酸酶活性的蛋白，其参与将双链RNA分子加工成短干扰RNA(siRNA)。核糖核酸酶活性是所谓的核糖核酸酶III的活性，其主要或优先切割双链RNA底物而不是单链RNA区，因此靶向RNA分子的双链部分。如本文使用的，术语“主要”是指至少51％直至100％并包括100％，或相对于另一种具有一种的更大的活性。术语Dicer包括Dicer样(DCL)蛋白。Dicer蛋白优选参与将双链RNA底物加工成约21-24个核苷酸长度的siRNA分子。如本文使用的“植物dicer”或植物“dicer样”蛋白是具有双链RNA底物上核糖核酸酶活性(核糖核酸酶III活性)的蛋白，其特征在于存在至少下列结构域：DExD或DExH结构域(DEAD/DEAH结构域)，螺旋酶-C结构域，优选可以是缺失的Duf283结构域，PAZ结构域，两个RNAse III结构域和至少一个和优选2个dsRB结构域。

螺旋酶C：在广泛的各种螺旋酶和螺旋酶相关蛋白中发现了定义这个蛋白集合的结构域。其可以不是自主折叠的单元，而是螺旋酶的整体部分(PF00271；IPR001650)。

PAZ结构域：这个结构域因蛋白Piwi Argonaut和Zwille而得名。还在来自拟南芥的CAF蛋白中发现了它。该结构域的功能未知，但是在Argonaute蛋白家族的许多成员的中间区中发现了它，其也在其C-末端区含有Piwi结构域。该家族的几个成员涉及通过与蛋白Dicer相关的RNA-介导的基因抑制机制的干细胞的发育和保持(PF02170；IPR003100)。

Duf283：在Dicer蛋白家族的成员中发现了这个推定结构域。这个蛋白是参与RNAi和相关过程的dsRNA核酸酶。这个约100个氨基酸结构域无已知功能，但是确实含有3个可能的锌配体(PF03368，IPR005034)。

DExD：该家族的成员包括DEAD和DEAH盒螺旋酶。螺旋酶参与将核酸解旋。DEAD盒螺旋酶参与RNA代谢的各种方面，包括核转录、pre mRNA剪接、核糖体生物发生、核胞质运输、翻译、RNA腐烂和细胞器基因表达(PF00270，IPR011545)。

RNAse III：核糖核酸酶III蛋白的标志(PF00636，IPR000999)。

DsRB(双链RNA结合基序)：通过HMM_iterative_training搜集的用于种子(seed)的序列，结合dsRNA的蛋白共有的推定基序。至少一些DSRM蛋白似乎结合至特异性的RNA靶标。由Staufen例示，其在早期果蝇胚胎中参与至少五种不同的mRNA的定位。还有通过人类的干扰素诱导的蛋白激酶，其是对dsRNA的细胞反应的一部分(PF00035，IPR001159)。

这些结构域可以通过基于计算机的搜索使用例如PROSITE档案资料PD0C50821(PAZ结构域)，PDOC00448(RNase III结构域)，PDOC50137(dsRB结构域)和PDOC00039(DExD/DexH结构域)而容易地识别(PROSITE可从www.expasy.ch/prosite获得)。或者，可以使用BLOCKS数据库和算法(blocks.fhcrc.org)鉴定PAZ(IPB003100)或DUF283(IPB005034)结构域。其它的数据库和算法也是可以获得的(pFAM：http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/INTERPRO：http://www.ebi.ac.uk/interpro/；上述的PF数值是指pFAM数据库和算法，IPR数值是指INTERPRO数据库和算法)。

通常，在植物中，DCL2蛋白将双链RNA加工成约22个核苷酸的短干扰RNA分子，DCL3蛋白将双链RNA加工成约24个核苷酸的短干扰RNA分子，DCL4将双链RNA加工成约21个核苷酸的短干扰RNA分子。DCL1参与从pre-microRNA分子至microRNA的加工。不将本发明限制于特定的作用模式，通常认为24个核苷酸长的寡核苷酸介导甲基化和染色质重塑，而21和22个核苷酸长的寡核苷酸通常介导序列特异性的RNA降解(二者均与其他蛋白和多肽组合)。

Dicer样蛋白在本领域中是熟知的。Dicer样3酶是那些编码含有氨基酸序列的蛋白的酶，所述氨基酸序列相对于含有可按照以下登录号NP_189978从数据库获得的氨基酸序列的蛋白具有至少约60％或至少约65％或至少约70％或至少约75％或至少约80％或至少约85％或至少约90％或至少约95％的序列同一性或实质上相同。

Dicer样4蛋白是那些编码含有氨基酸序列的蛋白的蛋白，所述氨基酸序列相对于含有可按照以下登录号AAZ80387；P84634从数据库获得的氨基酸序列的蛋白具有至少约60％或65％或70％或75％或80％或85％或90％或95％的序列同一性或实质上相同。

Dicer样2蛋白是那些编码含有氨基酸序列的蛋白的蛋白，所述氨基酸序列相对于含有可按照以下登录号NP_001078101从数据库获得的氨基酸序列的蛋白具有至少约60％或65％或70％或75％或80％或85％或90％或95％的序列同一性或实质上相同。

Dicer样1蛋白是那些编码含有氨基酸序列的蛋白的蛋白，所述氨基酸序列相对于含有可按照以下登录号Q9SP32从数据库获得的氨基酸序列的蛋白具有至少约60％或65％或70％或75％或80％或85％或90％或95％的序列同一性或实质上相同。

可以用于检测RNAseIII酶活性的酶检测在例如Lamontagne等人，Mol CellBiol.2000 February；20(4)：1104-1115中有描述。可以根据本领域中产生21-24ntsiRNA的标准方法进一步分析得到的切割产物。

为了本发明的目的，两个相关核苷酸或氨基酸序列的“序列同一性”(以百分比表示)，是指两个优化比对的序列中具有相同残基(x100)的位置数目除以所比较的位置的总数目。空隙(即比对中存在于一个序列而不存在于另一个序列的残基的位置)被认为是具有不相同残基的位置。通过Needleman和Wunsch算法(Needleman和Wunsch 1970)进行两个序列的比对。以上的计算机辅助的序列比对可以方便地使用标准软件程序如GAP(GAP是Wisconsin Package Version 10.1(Genetics Computer Group，Madision，Wisconsin，USA)的一部分)，使用具有空隙产生罚分为50和空隙延伸罚分为3的缺省计分阵距而进行。当这样的序列具有至少约75％，特别是至少约80％，更特别是至少约85％，非常特别是约90％，尤其是约95％，更尤其是约100％，更加尤其为相同的序列同一性时，序列被称为“实质上相似”。然后清楚的是：当RNA序列与DNA序列实质上相似或具有某种程度的序列同一性时，DNA序列中的胸腺嘧啶(T)被认为与RNA序列中的尿嘧啶(U)等同。因此当本申请中指明19个连续核苷酸的序列具有与19个核苷酸的序列至少94％的序列同一性时，这样意味第一序列的19个核苷酸中的至少18个与第二序列的19个核苷酸中的18个相同。

因此，本发明提供了减少植物细胞或其他真核细胞(或植物或真核生物)中的靶核酸表达的方法，该方法通过引入能够减少存在于真核细胞的一种且相同的靶核酸的表达的至少两种抑制性RNA分子，其中抑制性RNA分子中的一种主要通过DCL1或相似的RNAse切割，而另一种抑制性RNA分子主要通过DCL4或相似的RNAse切割。不限制本发明，这样的方法可以通过将靶向感兴趣核酸的microRNA和靶向相同的感兴趣核酸的双链发夹RNA特别是较长的hpRNA(含有例如至少50，60，90，120，150，300个核苷酸的双链RNA区)引入一个细胞中而进行。

本发明还提供通过减少植物细胞或其他真核细胞(或植物或真核生物)中的靶核酸表达的方法，该方法通过引入能够减少存在于真核细胞的一种且相同的靶核酸的表达的至少两种抑制性RNA分子，其中抑制性RNA分子中的一种主要通体DCL3或相似的RNAse切割，而另一种抑制性RNA分子主要通过DCL4或相似的RNAse切割。不限制本发明，这样的方法可以通过将针对靶基因的调节区(如启动子区)的抑制性RNA引入一个细胞而进行，而另一种抑制性RNA针对靶基因的转录区。以另一种方式，这样的方法可以通过给细胞提供编码抑制性RNA的两个嵌合基因而进行，嵌合基因的表达由依赖DNA的RNA聚合酶II识别的启动子所指导，而另一种嵌合基因的表达是由依赖DNA的RNA聚合酶III的启动子，如亚型3的启动子所指导。

相似地，本发明提供抑制性RNA的其他组合如：

●一种抑制性RNA主要被DCL1或相似的RNAse切割且一种抑制性RNA主要被DCL2或相似的RNAse切割；

●一种抑制性RNA主要被DCL1或相似的RNAse切割且一种抑制性RNA主要被DCL3或相似的RNAse切割；

●一种抑制性RNA主要被DCL2或相似的RNAse切割且一种抑制性RNA主要被DCL3或相似的RNAse切割；和

●一种抑制性RNA主要被DCL2或相似的RNAse切割且一种抑制性RNA主要被DCL4或相似的RNAse切割。

如本文使用的，术语“启动子”表示在转录起始过程中被依赖DNA的RNA聚合酶识别和结合(直接的或非直接的)的任何DNA。启动子包括转录起始位点和转录起始因子的结合位点和RNA聚合酶，并可以含有各种其他的基因表达调节蛋白可以结合的位点(例如增强子)。

如本文使用的术语“调节区”意思是参与给定DNA序列(如编码蛋白或多肽的DNA)的转录驱动和转录时间和水平的控制(即调节)的任何DNA。例如，5’调节区(或“启动子区”)是定位于编码序列上游(即5’)的DNA序列并且其包含启动子和5’非翻译引导序列。3’调节区是定位于编码序列下游(即3’)的DNA序列并且其包含合适的转录终止(和/或调节)信号，包括一个或多个多腺苷酸化信号。

在本发明的一个具体实施方式中，启动子是被RNA聚合酶II识别的启动子。RNA Pol II启动子包括最常见的已知启动子。在本发明的另一个具体实施方式中，启动子是被RNA聚合酶III识别的启动子。如本文使用的“被依赖DNA的RNA聚合酶III识别的启动子”是通过RNA聚合酶III的聚合酶作用而指导相关DNA区的转录的启动子。这些包括编码5S RNA，tRNA，7SL RNA，U6snRNA和一些其他小的稳定RNA的基因，许多参与RNA加工。Pol III使用的启动子多数需要转录区内的+1下游序列元件。但是少数pol III模板不需要基因内的启动子元件。这些被称为3类启动子。换句话说。“3类Pol III启动子”是那些被RNA聚合酶III识别的启动子并含有所有的顺式作用元件，在正常情况下被RNA聚合酶III转录的区域的上游与RNA聚合酶III相互作用。因此这样的3类Pol III启动子可以轻易地在嵌合基因中与异源区结合，异源区如本发明的dsRNA编码区的转录是需要的。

通常，3类Pol III启动子含有TATA盒(定位于人类U6 snRNA基因的-25至-30之间)和邻近序列元件(PSE，定位于人类U6 snRNA的-47和-66之间)。其还可以含有远端序列元件(DSE，定位于人类U6 snRNA的-214至-244之间)。

可以发现3类Pol III启动子与例如编码7SL RNA，U3 snRNA和U6 snRNA的基因结合。这样的序列已经从拟南芥、水稻和番茄中分离出来，并可以在核苷酸序列数据库的下列条目中找到：7SL RNA(X72228)的拟南芥基因AT7SL-1、7SLRNA(X72229)的拟南芥基因AT7SL-2、7SL RNA(AJ290403)的拟南芥基因AT7SL-3、啤酒花(Humulus lupulus)H17SL-1基因(AJ236706)、啤酒花H17SL-2基因(AJ236704)、啤酒花H17SL-3基因(AJ236705)、啤酒花H17SL-4 gene(AJ236703)、拟南芥U6-1 snRNA基因(X52527)、拟南芥U6-26 snRNA gene(X52528)、拟南芥U6-29 snRNA基因(X52529)、拟南芥U6-1 snRNA基因(X52527)、玉米(Zea mays)U3 snRNA基因(Z29641)、马铃薯(Solanum tuberosum)U6 snRNA基因(Z17301；X60506；S83742)、番茄U6 smal核RNA基因(X51447)、拟南芥U3C snRNA基因(X52630)、拟南芥U3B snRNA基因(X52629)、水稻(Oryza sativa)U3 snRNA启动子(X79685)，番茄U3 smal核RNA基因(X14411)、小麦(Triticum aestivum)U3 snRNA基因(X63065)、小麦U6 snRNA基因(X63066)。

不言而喻仅需很少量的实验即可以从其他种类的番茄、水稻或拟南芥或从其他植物物种分离出变体3类Pol III启动子。可以使用U6 snRNA，U3 snRNA或7SLRNA的编码序列(如通过登录号鉴定的任何上述序列的编码序列和另外的蚕豆(Vicia faba)U6snRNA编码序列(X04788)，U6 snRNA的玉米DNA(X52315)或7SL RNA的玉米DNA(X14661))作为探针从这样的植物中分离基因组克隆的库，并且上游序列，优选转录区上游约300-400bp可以被分离并用作3类Pol III启动子。或者，可以使用基于PCR的技术如反向PCR或

分离基因组序列(其包括与已知转录区相邻的启动子序列)。另外，任何相连的3类Pol III启动子序列或任何上述启动子序列(通过其登录号鉴定的)可以在严谨杂交条件下用作探针或作为信息来源以产生PCR引物以便从其他种类或植物物种中分离相应的启动子序列。

本文使用的“严谨杂交条件”意思是如果在探针和靶序列之间有至少95％和优选至少97％的序列同一性时杂交通常会发生。严谨杂交条件的例子是在含有下列成分的溶液中孵育过夜：50％甲酰胺，5x SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH 7.6)，5x Denhardt溶液，10％硫酸葡聚糖和20μg/ml变性的剪切的载体DNA如鲑鱼***DNA，然后在0.1x SSC中在约65℃洗涤杂交支持物。其他杂交和洗涤条件是熟知的并在Sambrook等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor，NY(1989)，特别是第11章中有举例说明。

虽然3类Pol III启动子不需要定位于转录区的顺式作用元件，然而明确的是通常定位于转录起始位点下游的序列可以包括在本发明的嵌合构建体中。

还观察到最初从单子叶植物中分离的3类Pol III启动子可以在双子叶和单子叶植物细胞和植物中都有好的效果，而最初从双子叶植物中分离的3类Pol III启动子只在双子叶植物细胞和植物中被有效地使用。另外，当使用含有源自相同或紧密相关的物种的3类Pol III启动子的嵌合基因时获得最有效的基因沉默。

通常，Pol III聚合酶介导的转录的终止子区由寡dT延伸构成，所述延伸是含有至少4个T残基，但是显然可以含有更多T残基的连续T残基的延伸。

在本发明的一个具体实施方式中，启动子是组成型启动子。在本发明的另一个具体实施方式中，启动子的活性通过外部或内部刺激(可诱导的启动子)被增强，所述刺激如但不限于激素、化学化合物、机械脉冲、无生命或有生命的应激条件。还可以以时间或空间的方式调节启动子的活性(组织特异性启动子；发育调节的启动子)。

在本发明的特定具体实施方式中，启动子是植物表达的启动子。如本文使用的，术语“植物表达的启动子”意思是能够控制(起始)植物细胞中转录的DNA序列。这包括植物来源的任何启动子，但还包括能够指导植物细胞中转录的非植物来源的任何启动子，即某些病毒或细菌来源的启动子如CaMV35S(Hapster等人，1988 Mol.Gen.Genet.212，182-190)、地下三叶草病毒启动子No 4或No 7(WO9606932)、或T-DNA基因启动子但还有组织特异性或器官特异性的启动子，包括但不限于种子特异性的启动子(例如WO 89/03887)、器官原基特异性的启动子(An等人，1996 The Plant Cell 8，15-30)、茎特异性启动子(Keller等人，1988 EMBO J.7：3625-3633)、叶特异性启动子(Hudspeth等人，1989 Plant Mol Biol 12：579-589)、叶肉特异性启动子(如光诱导的Rubisco启动子)、根特异性启动子(Keller等人，1989Genes Devel.3：1639-1646)、块茎特异性启动子(Keil等人，1989 EMBO J.8：1323-1330)、脉管组织特异性启动子(Peleman等人，1989 Gene 84：359-369)、雄蕊选择性启动子(WO 89/10396，WO 92/13956)、裂开区特异性启动子(WO97/13865)等等。

本发明还考虑使用人工或人造的microRNA分子与主要通过不同于microRNA加工途径的RNAi加工途径而加工的抑制性RNA组合。在植物中，这是指与Dicer样1的RNAse III活性不同的RNAi加工途径。针对特定靶核酸的人工microRNA分子的产生在本领域中已经很好地建立。

如本文使用的，“miRNA”是约20-22个核苷酸长度的RNA分子，其可以被加载至RISC复合物上并指导另一种RNA分子的切割，而另一种RNA分子含有与miRNA分子的核苷酸序列实质上互补的核苷酸序列，其中可以发生一个或多个下列错配：

●所述miRNA的5’末端的核苷酸和靶RNA分子中对应核苷酸序列之间的错配；

●所述miRNA的位置1至位置9的核苷酸的任一个和靶RNA分子中的对应核苷酸序列之间的错配；

●所述miRNA的位置12至位置21的核苷酸的任一个和靶RNA分子中的对应核苷酸序列之间的三个错配，只要没有两个以上连续的错配；

●miRNA的位置10和11上不允许错配(标明了所有的miRNA位置，从miRNA分子的5’末端开始)。

从“pre-miRNA”分子通过蛋白如存在于任何植物细胞中的DCL蛋白加工miRNA，并加载至RISC复合物上，在那里miRNA可以指导靶RNA分子的切割。

通常从pri-microRNA分子(原始转录本)加工pre-microRNA分子。在动物中，通过埋入原始转录本的茎环的精确切割而由Drosha-DGCR8复合物起始microRNA的成熟。pre-microRNA侧翼的单链RNA段对于将pri-miRNA加工成pre-miRNA是重要的。切割位点似乎是通过距离茎-ssRNA连接点的距离确定的(Han等人2006，Cell 125，887-901，887-901)。

如本文使用的，“pre-miRNA”分子是约100至200个核苷酸的RNA分子，优选为约100至约130个核苷酸，其可以采用包含双链RNA茎和单链RNA环的二级结构并进一步包含位于双链RNA茎中的miRNA的核苷酸序列(和其互补序列)。优选地，miRNA和其互补物定位于距离miRNA双链RNA茎的自由末端约10至约20个核苷酸。单链环区的长度和序列不重要，并可以有相当大的变化，例如在30至50nt的长度之间。优选地，非配对和配对的RNA结构之间的自由能差异为-20至-60kcal/mol之间，特别为约-40kcal/mol。miRNA和miRNA^*之间的互补性不需要是完全的，并且可以容忍非配对核苷酸的约1至3个凸出。可以通过本领域中常规的计算机算法如mFOLD预测RNA分子所采用的二级结构。通过5’末端的互补程度测定来自通过DCL活性释放的并加载至RISC复合物的pre-miRNA的双链RNA茎的特定链，其中在5’末端最少参与被切割的dsRNA茎的不同链的核苷酸之间的氢键的链被加载至RISC复合物上并决定靶RNA分子降解的序列特异性。但是，如果根据经验来自特定合成pre-miRNA分子的miRNA分子是无功能的(引物在RSIC复合物上加载了“错误的”链)，立即明确的是这个问题可以通过交换pre-miRNA分子的dsRNA茎的各自的链上的miRNA分子和其互补物的位置而解决。如在本领域中已知的，涉及两个氢键的A和U或涉及两个氢键的G和U之间的结合比涉及三个氢键的G和C之间的结合弱。

天然存在的miRNA分子可以包含于其天然存在的pre-miRNA分子内，但是也可以被引入已有的pre-miRNA分子骨架(通过将通常从这样的已有的pre-miRNA分子加工而来的miRNA的核苷酸序列替换为另一种感兴趣的miRNA的核苷酸序列)。pre-miRNA的骨架也可以是完全合成的。同样，合成的miRNA分子可以包含于或从已有的pre-miRNA分子骨架或合成的pre-miRNA骨架加工。有趣的是，已经观察到一些pre-miRNA骨架因为其被正确加工成设计的microRNA的效率而相对于其它的骨架是优选的，特别是当被表达为嵌合基因时，其中除了pre-microRNA以外，其它DNA区(如非翻译引导序列或转录终止和多腺苷酸化区)被并入原始转录本中。特别地，已经发现含有pre-microRNA和其它或多或少互补区的原始转录本的转录可以干扰原始转录本至pre-microRNA和最终至设计的microRNA的正确加工。其它pre-microRNA骨架，如例如pre-microRNA398，可能对于这样的不正确加工倾向性较低一些。可以预见的是在总的大多是双链RNA的区中的pre-miRNA分子的切割位点的特定固定位置上的一个或多个未组织的单链区的存在影响设计的pre-miRNA分子的正确加工并引起一些事实：相对于例如来自原始转录本的源自pre-miR171骨架的加工来说，例如来自原始转录本的源自pre-miR398骨架的加工较小倾向于错误。

技术人员立即明确的是额外序列的存在可以对原始转录RNA分子折叠成二级RNA结构有影响，特别是对于突出或单链RNA结构(否则的话是位于双链RNA茎(sub)结构中)的存在和定位。应该小心地保持单链RNA或凸出结构相对于pre-miRNA的位置，即核苷酸的距离。特定RNA核苷酸序列的二级RNA结构可以容易地使用本领域中熟知的软件工具和算法如MFOLD(Zucker等人2003Nucleic Acids Research 31，3406-3415)来预测。另外，本领域完全存在这样的技术：通过在核苷酸序列中置换核苷酸而设计或修饰核苷酸，从而新形成的核苷酸显示对核苷酸序列的另一部分的或多或少的互补性并以这种方式影响双链RNA茎或单链RNA凸出的产生。

本发明的另一个目的是提供含有根据本发明的抑制性RNA分子的组合的宿主细胞、植物细胞、非人类真核生物和植物。通过传统培育方法产生的含有本发明的抑制性RNA分子的组合的配子、种子、胚胎(合子胚或体细胞胚)、后代或植物的杂交体也包括在本发明的范围内。

如本文使用的，“人工引入的dsRNA分子”是指直接引入dsRNA分子，其可以例如通过从编码这样的dsRNA分子的嵌合基因转录而外源性或内源性发生，但是不指在真核细胞或植物细胞内部将单链RNA分子转变成dsRNA。

本文描述的方法和手段被认为适于所有的植物细胞和植物、裸子植物和被子植物，双子叶和单子叶植物细胞和植物，包括但不限于拟南芥，苜蓿，大麦，大豆，玉米(corn)或玉米(maize)，棉花，亚麻，燕麦，豌豆，油菜(rape)，水稻，黑麦，红花，高粱，大豆，向日葵，烟草和其他烟草品种，包括烟草(Nicotianabenthamiana)，小麦，芦笋，甜菜，花椰菜，白菜，胡萝卜，菜花，芹菜，黄瓜，茄子，生菜，洋葱，油菜(oilseed rape)，辣椒，马铃薯，南瓜(pumpkin)，萝卜，菠菜，南瓜(squash)，番茄，西葫芦，杏(almond)，苹果，杏(apricot)，香蕉，黑莓，蓝莓，可可，樱桃，椰子，蔓越莓，海枣，葡萄，柚子，番石榴，猕猴桃，柠檬，酸橙，芒果，甜瓜，油桃，橙子，木瓜，百香果，桃子，花生，梨，菠萝，开心果，李子，树莓，草莓，橘子，核桃，西瓜，芸苔属(Brassica)蔬菜，甘蔗，蔬菜(包括菊苣，生菜，番茄)，浮萍科(Lemnaceae)(包括来自浮萍属(Lemna)，Wolffiella属，紫萍属(Spirodela)，Landoltia属，无根萍属(Wolffia)的物种)和甜菜。

还相信根据本发明的方法可以应用于其它真核细胞。因此真核生物还可以是真菌、酵母或霉菌或动物如人类、哺乳动物、鱼、牛、山羊、猪、绵羊、啮齿动物、仓鼠，小鼠，大鼠，豚鼠，兔子，灵长类动物，线虫，贝类，虾，蟹，龙虾，昆虫，果蝇，鞘翅类昆虫，双翅目昆虫，鳞翅目昆虫和同翅类昆虫。细胞可以处于生物中或源自该生物。细胞可以在细胞培养物中或在体外的组织或器官中。在优选的具体实施方式中，如果细胞是人类细胞或如果细胞是动物细胞(包括人类细胞)，则细胞是在培养物中。细胞可以是体细胞、干细胞、造血细胞、神经细胞、成纤维细胞、内皮细胞、癌细胞、永生细胞系的细胞或是被病毒感染的或能够被病毒感染的细胞。细胞可以是肝细胞、心细胞、肾细胞、大脑细胞、眼细胞、神经细胞、皮肤细胞、肌肉细胞、骨细胞或其它源自人类或其它动物体的细胞。

可以通过各种方法包括磷酸钙转染、DEAE葡聚糖介导的转染、电穿孔、微弹轰击、显微注射至核等实现将嵌合基因(或RNA分子)引入宿主细胞。

将嵌合基因引入植物细胞的方法在本领域中是熟知的并包括农杆菌(Agrobacterium)介导的转化、粒子枪递送、显微注射、完整细胞的电穿孔、聚乙二醇介导的原生质体转化、原生质体的电穿孔、脂质体介导的转化、硅须介导的转化等。然后可以将以这种方法获得的转化细胞再生为成熟的能繁殖的植物。

可以通过将嵌合基因注射进入受精的***的前核，通过移植细胞，优选移植未分化的细胞进入发育中的胚胎而产生嵌合胚胎，移植重组细胞的核进入去核的胚胎或活化的***等而产生转基因动物。用于产生转基因动物的方法在本领域已经很好地建立，包括美国专利4，873，191；Rudolph等人1999(TrendsBiotechnology 17：367-374)；Dalrymple等人(1998)Biotechnol.Genet.Eng.Rev.15：33-49；Colman(1998)Bioch.Soc.Symp.63：141-147；Wilmut等人(1997)Nature 385：810-813；Wilmut等人(1998)Reprod.Fertil.Dev.10：639-643；Perry等人(1993)Transgenic Res.2：125-133；Hogan等人Manipulating the Mouse Embryo，2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory press，1994及其组中引用的参考文献。

通过传统培育方法产生的含有本发明的嵌合基因的配子、种子、胚胎、后代、植物或动物的杂交体也包括在本发明的范围内。

除非另有说明，如本文使用的“感兴趣的基因的核苷酸序列”通常是指在序列上对应于从这样感兴趣的基因转录而来的RNA的核苷酸序列的DNA链的核苷酸序列。

明确的是上述方法可以在体内或体外应用于真核细胞。另外，当本文所述的方法应用于动物或人类时，可以包括治疗、诊断和非治疗和非诊断方法。人工核酸的组合如本文所描述的抑制性RNA分子的组合也可以用作上述治疗方法的目的的药物。因此，本发明还提供了一种含有至少两种本文定义的抑制性RNA分子的组合物，以及含有这样的核酸组合的试剂盒以作为组合的制备物而用于治疗方法中的同时、单独或相继的应用。

下列非限制性实施例描述了根据本发明的方法和手段。除非另有说明，否则在实施例中，所有的重组DNA技术根据Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY和Ausubel等人(1994)Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols，USA的卷1和卷2所述的标准规程进行。植物分子工作的标准材料和方法在由BIOS科学出版有限公司(UK)和Blackwell科学出版社(UK)联合出版的R.D.D.Croy的Plant Molecular Biology Labfax(1993)中有描述。其它标准分子生物学技术的参考文献包括Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ThirdEdition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，Brown(1998)Molecular BiologyLabFax，Second Edition，Academic Press(UK)的卷I和卷II。聚合酶链式反应的标准材料和方法见于Dieffenbach和Dveksler(1995)PCR Primer：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，and in McPherson at al.(2000)PCR-Basics：From Background to Bench，First Edition，Springer Verlag，Germany。

实施例：

实施例1：针对报告基因的Pol II转录的和Pol III转录的嵌合基因的组合

为了测试含有从被RNA聚合酶II(例如CaMV35S启动子)识别的启动子表达一个的和从被RNA聚合酶III(例如AtU6启动子)识别的启动子表达的另一个的编码hpRNA的转基因的组合是否将增加靶基因的沉默的效应，在含有编码35S-或AtU6-PDShp42抑制性RNA的转基因的拟南芥属植物之间杂交，并且鉴定同时含有两种转基因的后代植物，将PDS靶基因的沉默程度与只含有一种转基因的植物比较。以相似的方式，在表达35S驱动的或AtU3驱动的GUS hpRNA转基因的拟南芥属植物之间进行杂交以比较与单一转基因相比的组合的效应。

a)嵌合基因

含有35S或AtU6指导的PDShp42和35S或AtU3指导的hpGUS转基因的转基因的转基因拟南芥系已经在WO 2004/073390中有详细描述(并入本文作为参考；特别参见实施例2和实施例5)。

简单地说，为了产生PDShp42嵌合基因，将寡核苷酸退火产生双链DNA片段，当被转录时，双链DNA片段将产生具有自我互补(互补正义和反义区，每个为42个核苷酸)的RNA转录本，以致在折叠时转录本具有通过9nt单链环连接的42个连续碱基对的双链(双的)区。正义区的核苷酸序列对应于拟南芥属的八氢番茄红素去饱和酶基因的部分序列(AT4G14210.2的1570至1611位核苷酸，可以从http://www.arabidopsis.org/servlets/TairObject？type＝locus&name＝AT4G14210获得)并且反义区对应于42个核苷酸的互补物。将DNA片段可操作地连接至CaMV35S启动子序列和章鱼碱合成酶3’末端区(转录终止/多腺苷酸化信号)或连接至拟南芥的U6小RNA基因的启动子和能够作为Pol III类启动子的转录终止子起作用的寡dT序列(8T’s)。当将沉默构建体转移至拟南芥时，内源PDS基因的表达的有效下调产生显示光漂白作用的叶子(参见例如图1B)。光漂白作用的程度是基因沉默程度的指征，因此是沉默构建体的有效性的指征。

为了产生编码GUShp92的嵌合基因，合成了GUS倒转重复DNA序列，其含有对应于GUS基因的正义序列(GUS ORF的nt 512-697)的186个核苷酸，在3’末端与对应于186nt片段的最初93个核苷酸(GUS ORF的512-604核苷酸)的反义序列融合。因此GUS倒转重复序列的转录产生具有互补的正义和反义区的RNA，能够杂交形成93个碱基对的由单链环连接的双链区域。这个倒转重复序列或者可操作地连接至CaMV35S启动子序列和章鱼碱合成酶3’末端区，或者连接至拟南芥的U3小RNA基因的启动子和用于转录终止的寡dT序列(9T’s)，或者连接至拟南芥的U6小RNA基因的启动子和寡dT序列。当被转移至含有作为靶基因的CaMV35S-GUS转基因的拟南芥时，使用常规GUS分析以MUG作为底物测定通过编码嵌合基因的抑制性RNA或其组合对GUS基因的下调的效率。

b)Northern分析

Northern blot分析显示从两种类型的GUShp93转基因产生的hpRNA被差别地加工成转基因植物中的较短形式(图2)。35S系主要显示21nt种类(图2，图板A泳道1-6，图板B泳道1，2，4，6)而U6系显示24nt和/或22nt种类(图2，图板A7-22，图板B 8，9，10，11，12，15-18和22)。另外，在中间体RNA加工种类模式中可以看到有差别。35S-GUShp93系显示主要是对应于GUShp93RNA环的～90nt的RNA种类，而U6-GUShp93系中主要的片段是全长GUShp93RNA。

相似的，Northern blot分析显示从两种类型的PDShp42转基因产生的hpRNA也被差异性地加工成较短形式(图1A)。确实，泳道1-6(对应于含有35S启动子驱动的转基因的植物)显示既有24nt又有21nt长的siRNA种类，而泳道7-12(对应于含有U6启动子驱动的PDShp42转基因的植物)则只显示24nt种类。另外，在中间体RNA加工种类模式中可以看到有差别。

总之，这些结果表明U6和35S转录的hpRNA是被差异性加工的，主要是通过依赖于DCL3和/或DCL2的加工途径加工U6驱动的转录本(如果不是全部的话)，而35S驱动的转录本主要通过DCL4和/或DCL3途径加工。这还表明观察到的35S-和AtU6-hpRNA指导的沉默通过不同的途径起作用。因此分析植物以确定两种类型的构建体的组合是否将提供程度上和/或持续时间上和/或稳定性上的改善的沉默。

c)同时含有两种类型的hp转基因的植物的表型分析。

将含有35S-PDShp42转基因的杂合亲代植物(雄性)与AtU6-PDShp42转基因的杂合亲代植物(雌性)杂交，获得同时含有两种转基因的F1后子代植物并与含有一个或另一个转基因的亲代植物相比。

Pol II系	Pol III系	获得的F1种子
			35S-PDShp42	AtU6-PDShp42	35S-2X U6-3235S-2X U6-3635S-7X U6-3335S-7X U6-4035S-16X U6-3335S-16X U6-4035S-19X U6-3235S-19X U6-36

基于叶子漂白的强度，来自至少四个杂交的F1植物显示与亲代U6系相比的更大程度的PDS基因沉默(图1B)。

以相似的方式，将含有35S-GUShp93转基因的植物与含有AtU6-GUShp93或AtU3-GUShp93的转基因的植物杂交并获得同时含有两种转基因的后代。通过PCR从35S-和AtU3/AtU6-指导的GUShp93系之间的杂交中鉴定出F1种群自交产生的F2系，其含有单独的35S-或Pol III-指导的转基因或同时含有这两种类型的转基因。F2系对于编码抑制性RNA的基因是纯合的或杂合的(分开的)。虽然本实验不能排除拷贝数效应，但是可以通过分析足够的系而确定沉默的平均程度。

Pol II系	Pol III系	获得的F1	获得的F2
				35S-GUShp93(pMBW479)	AtU6+20-GUShp93(pMBW488)	479-AX 488-6488-13X 479-1479-1X 488-6479-4X 488-1488-1X 479-2	479-AX 488-6488-13X 479-1479-4X 488-1488-1X 479-2

35S-GUShp93(pMBW479)	AtU6-GUShp93(pMBW486)	479-5X 486-2486-2X 479-4	486-2X 479-4
				35S-GUShp93(pMBW479)	AtU3+136-GUShp93(pMBW480)	479-1X 480-2479-4X 480-6	479-1X 480-2
35S-GUShp93(pMBW479)	AtU3-GUShp93(pMBW481)	479-2X 481-1479-5X 481-8	479-5X 481-8

因此分析含有单独转基因或其组合的不同转基因植物的GUS表达。来自一个杂交(479-AX 488-6)的F3植物的分析显示这些植物似乎比那些只含有一种转基因的植物具有更均衡的沉默。图3中图解表示了来自35S-GUShp93x U6-GUShp93杂交的不同F3植物的MUG分析的结果。

Pol II和Pol III转录本使用的加工途径的差别显然不仅涉及使用的不同的启动子——Pol III启动子优先在核的核仁区有活性，而Pol II启动子在核的其它区有活性——还涉及转录本的结构。Pol II转录本还含有源自35S启动子(用于制作构建体)的转录的5’引导部分，以及由所使用的ocs 3’终止子的转录所产生的3’UTR区，和polyA尾。这些额外的5’和3’序列总计为35S构建体产生的Pol III转录本的200-300nt。相反，制作的U6构建体表达含有发夹部分(双链区加单链环)的转录本，具有额外的约20nt的5’区域，但无任何polyA尾。因此，Pol II和Pol III转录本将折叠成十分不同的结构。认为RNA转录本在转录后通过双链RNA结合蛋白(DRBP)被迅速结合，不同的转录本可以被不同的DRBP结合，引起差异性接近DCL蛋白并整合进入不同类型的RISC复合物。这相应地预期引起对转录基因沉默(TGS)的不同贡献。涉及启动子区的特别的甲基化和PTGS。认为Pol III驱动的产生对应于启动子区的24体的转录本在介导TGS中特别有效。

实施例2：针对PHYB内源性基因的microRNA和hpRNA的组合

使用常规重组DNA技术，按顺序可操作地连接下列DNA区而构建编码针对拟南芥的植物色素B编码区的抑制性hpRNA的第一嵌合基因：启动子区、当被转录时产生正义RNA分子的DNA区(其对应于登录号EF193580的789位核苷酸至809位核苷酸的PHYB编码区的序列)、与正义RNA分子互补的反义RNA分子和3’末端区。

使用常规重组DNA技术构建了含有编码pri-microRNA miR159骨架的转录区的第二嵌合基因，其中将microRNA适应为含有来自PHYB编码区的核苷酸序列(TTATAAGTTTCATGAAGATGA)并且在microRNA^*区制造相应的改变。将pre-microRNA的编码区可操作地与植物表达的启动子和转录终止区连接。

将嵌合基因分别引入伴有选择性标记的T-DNA载体，产生转基因拟南芥植物，其含有嵌合基因的任一种(图ZZ)。也通过杂交最初的转化体而产生同时含有两种嵌合基因的转基因F1植物。然后将这些植物自交以产生将用于沉默程度分析的F2种子。沉默的程度可以通过测定白光下种子中长出的苗的胚轴长度而确定。胚轴越长，PHYB基因沉默的程度越强，因为PHYB是白光下胚轴延伸的抑制物。

同时含有两种转基因的植物显示比单独含有每个转基因的植物更高程度的PHYB基因的沉默。

实施例3：针对EIN2启动子区的正义RNA和针对EIN2编码区和启动子的hpRNA的组合

为了检查编码正义RNA和编码hpRNA的转基因的共表达是否可以诱导比单独的每个构建体更强的启动子沉默(TS)，产生了两个构建体。两者都靶向拟南芥EIN2基因的启动子区，但是hpRNA构建体进一步含有双链部分中EIN2基因的部分转录区。将含有hpRNA启动子构建体的转基因植物与含有正义启动子构建体的植物杂交。通过与亲代系的比较而分析F2种群的EIN2的沉默程度。结果表明靶向EIN2启动子区的正义-和hpRNA-EIN2转基因产生比单独的编码hpRNA或编码正义RNA的转基因更强的沉默(图2)。

a)嵌合基因

使用常规的重组DNA技术构建编码针对EIN2基因启动子的正义RNA的第一嵌合基因，其含有下列可操作地连接的DNA区：启动子区、当被转录时产生对应于EIN2基因(登录号AF141202)的全长序列的nt 1-1217的RNA分子的DNA区——包括部分启动子区(～810bp)——和章鱼碱合成酶基因的3’末端区。

构建编码针对EIN2基因启动子的发夹RNA的第二嵌合基因，其含有下列可操作地连接的DNA区：启动子区、当被转录时产生对应于EIN2基因序列(从核苷酸1至核苷酸1217)的正义RNA分子的DNA区(其包括部分启动子区和部分转录的DNA区)和与正义RNA分子互补的反义RNA分子，以及ocs 3’末端区。

将嵌合基因***伴有选择性标记基因(新霉素磷酸转移酶或潮霉素转移酶)的T-DNA载体，并且产生含有嵌合基因的转基因的拟南芥植物。

b)表型分析

通过使含有转基因中任一种或两种组合的转基因种子在黑暗中在含有ACC(氨基-环丙烷-1-羧酸)的培养基上发芽而分析EIN2表达的沉默。图4B中表明了这个分析的结果，其表明当与亲代系中获得的沉默比较时，在某些正义×hpRNA的杂交中EIN2沉默的程度增强了。

c)Northern分析

对从转基因植物中分离的小RNA的Northern blot分析显示当靶向EIN2启动子的构建体存在时siRNA积累(图4A)，这表明EIN2启动子构建体被正确地制作并正确地表达。有趣的是，在所分析的四组正义、hpRNA和正义×hpRNA系中的两组中，正义×hpRNA杂交(hp-2×s-2和hp-3×s-3，用箭头表示)似乎比其对应的正义(s)和hpRNA(hp)亲代系积累更多的siRNA(图4A)。这与显示于图4B的EIN2沉默的表型结果是一致的，其中EIN2的沉默在某些产生于正义×hpRNA杂交的子代植物中增强。

hpRNA和正义组合策略的可能改进是使用不同的启动子分别驱动hpRNA和正义转基因的表达。这可以使转基因的转录沉默最小化：如果相同的启动子用于两种转基因，则很可能发生转录沉默。

本申请要求欧洲申请号07015956.1和美国临时申请号61/013604的优先权，其全部内容并入本文作为参考。

本文讨论和/或参考的所有出版物的全部内容并入本文。

Claims

1.一种减少真核细胞或生物中靶核酸的表达的方法，其包括下列步骤：引入每种能够减少所述真核细胞或生物中第一靶核酸的表达的至少两种抑制性RNA分子的组合，其中所述抑制性RNA分子主要通过细胞或生物中不同的RNAi分子加工途径被加工成为21至24个核苷酸长度的寡核苷酸。

2.一种减少真核细胞或生物中第一和第二靶核酸的表达的方法，其包括下列步骤：引入至少两种抑制性RNA分子的组合，其中所述抑制性RNA分子的一种能够减少所述真核细胞或生物中第一靶核酸的表达，所述抑制性RNA分子的另一种能够减少所述真核细胞或生物中第二靶核酸的表达，并且其中所述抑制性RNA分子主要通过细胞或生物中不同的RNAi分子加工途径被加工成长度为21至24个核苷酸的寡核苷酸。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中两种抑制性RNA分子靶向第一靶核酸的相同区、重叠区或非重叠区。

4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其中两种抑制性RNA分子不共价结合。

5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其中从不同的启动子，如依赖PolII和Pol III的启动子表达两种抑制性RNA分子。

6.根据权利要求1至5所述的方法，其中主要通过不同的dicer或Dicer样蛋白将所述抑制性RNA分子切割成21至24个核苷酸长度的寡核苷酸。

7.根据权利要求1至6任一项所述的方法，其中所述真核细胞是植物细胞或所述真核生物是植物。

8.根据权利要求1至6任一项所述的方法，其中所述真核细胞是动物细胞或所述真核生物是动物。

9.根据权利要求1至8任一项所述的方法，其中所述抑制性RNA分子的一种主要通过DCL1或具有相似功能和特异性的RNAse被切割，所述抑制性RNA分子的另一种主要通过DCL4或具有相似功能和特异性的RNAse被切割。

10.根据权利要求1至8任一项所述的方法，其中所述抑制性RNA分子的一种主要通过DCL3或具有相似功能和特异性的RNAse被切割，所述抑制性RNA分子的另一种主要通过DCL4或具有相似功能和特异性的RNAse被切割。

11.根据权利要求1至8任一项所述的方法，其中所述抑制性RNA分子的一种主要通过DCL1或具有相似功能和特异性的RNAse被切割，所述抑制性RNA分子的另一种主要通过DCL2或具有相似功能和特异性的RNAse被切割。

12.根据权利要求1至8任一项所述的方法，其中所述抑制性RNA分子的一种主要通过DCL1或具有相似功能和特异性的RNAse被切割，所述抑制性RNA分子的另一种主要通过DCL3或具有相似功能和特异性的RNAse被切割。

13.根据权利要求1至8任一项所述的方法，其中所述抑制性RNA分子的一种主要通过DCL2或具有相似功能和特异性的RNAse被切割，所述抑制性RNA分子的另一种主要通过DCL3或具有相似功能和特异性的RNAse被切割。

14.根据权利要求1至8任一项所述的方法，其中所述抑制性RNA分子的一种主要通过DCL2或具有相似功能和特异性的RNAse被切割，所述抑制性RNA分子的另一种主要通过DCL4或具有相似功能和特异性的RNAse被切割。

15.根据权利要求1至14任一项所述的方法，其中所述抑制性RNA分子中的一种是能够减少第一靶核酸的表达的miRNA分子、pre-microRNA分子或pri-miRNA分子，其中所述另一种抑制性RNA分子是含有互补的或实质上互补的第一和第二RNA区的双链RNA分子，所述第一RNA区含有对应于第一或第二靶核酸的核苷酸序列的至少19个连续核苷酸，并且所述第二RNA区含有对应于与第一或第二靶核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列的至少19个连续核苷酸，其中所述第一和第二RNA区彼此杂交至少18或19个碱基对。

16.根据权利要求1至15任一项所述的方法，其中所述抑制性RNA分子的一种含有来自所述靶核酸分子的启动子区的至少19个连续核苷酸，所述另一种抑制性RNA分子含有来自被转录成RNA分子的所述靶核酸分子区的至少19个连续核苷酸。

17.根据权利要求1至16任一项所述的方法，其中从引入所述真核细胞的编码抑制性RNA的基因转录所述抑制性RNA分子。

18.根据权利要求17所述的方法，其中在RNA聚合酶II识别的启动子的控制下从编码抑制性RNA的基因转录所述抑制性RNA分子的一种，并且在RNA聚合酶III识别的启动子的控制下从编码抑制性RNA的基因转录所述另一种抑制性RNA。

19.根据权利要求1至18任一项所述的方法，其中所述靶核酸是病毒核酸或基因或其转录区。

20.根据权利要求1至19任一项所述的方法，其中所述靶核酸是转基因或其区域。

21.根据权利要求1至18任一项所述的方法，其中所述靶核酸是细胞中的内源性基因、其启动子、其转录本或其区域。

22.根据权利要求1至21任一项所述的方法，其中相对于所述真核细胞或生物中单独的任一种抑制性RNA分子来说，两种抑制性RNA分子的组合减少第一靶核酸的表达至更大的程度。

23.根据权利要求1至22任一项所述的方法，其中相对于所述真核细胞或生物中的单独的任一种抑制性RNA分子来说，两种抑制性RNA分子的组合更稳定地减少第一靶核酸的表达。

24.根据权利要求1至23任一项所述的方法，其中相对于所述真核细胞或生物中存在单独任一种抑制性RNA分子时的靶核酸的减少来说，两种抑制性RNA分子的组合对第一靶核酸的表达的减少对外部因素敏感性较低。

25.一种真核细胞，其含有能够减少所述真核细胞中第一靶核酸表达的至少两种抑制性RNA分子，其中所述抑制性RNA分子通过细胞中不同的RNAi分子加工途径被加工成21至24个核苷酸长度的寡核苷酸。

26.一种真核细胞，其含有能够减少所述真核细胞中第一和第二靶核酸的表达的至少两种抑制性RNA分子，其中所述抑制性RNA分子的一种能够减少所述真核细胞或生物中第一靶核酸的表达，所述抑制性RNA分子的另一种能够减少所述真核细胞或生物中第二靶核酸的表达，其中所述抑制性RNA分子通过细胞中不同的RNAi分子加工途径被加工成21至24个核苷酸长度的寡核苷酸。

27.根据权利要求25或26所述的细胞，其中两种抑制性RNA分子靶向第一靶核酸的相同区、重叠区或非重叠区。

28.根据权利要求25至27任一项所述的细胞，其中两种抑制性RNA分子不共价结合。

29.根据权利要求25至28任一项所述的细胞，其中从不同的启动子例如依赖Pol II和Pol III的启动子表达两种抑制性RNA分子。

30.根据权利要求18所述的真核细胞，其中所述抑制性RNA分子主要通过不同的dicer或Dicer样蛋白被切割成21至24个核苷酸长度的寡核苷酸。

31.根据权利要求25至30任一项所述的真核细胞，其在植物中。

32.根据权利要求25至30任一项所述的真核细胞，其在动物中。

33.根据权利要求25至30任一项所述的真核细胞，其中所述抑制性RNA分子的一种主要通过DCL1或相似的RNAse被切割，所述抑制性RNA分子的另一种主要通过DCL4或相似的RNAse被切割。

34.根据权利要求25至30任一项所述的真核细胞，其中所述抑制性RNA分子主要通过DCL3或相似的RNAse被切割，所述抑制性RNA分子的另一种主要通过DCL4或相似的RNAse被切割。

35.根据权利要求25至30任一项所述的真核细胞，其中所述抑制性RNA分子主要通过DCL1或相似的RNAse被切割，所述抑制性RNA分子的另一种主要通过DCL2或相似的RNAse被切割。

36.根据权利要求25至30任一项所述的真核细胞，其中所述抑制性RNA分子主要通过DCL1或相似的RNAse被切割，所述抑制性RNA分子的另一种主要通过DCL3或相似的RNAse被切割。

37.根据权利要求25至30任一项所述的真核细胞，其中所述抑制性RNA分子主要通过DCL2或相似的RNAse被切割，所述抑制性RNA分子的另一种主要通过DCL3或相似的RNAse被切割。

38.根据权利要求25至30任一项所述的真核细胞，其中所述抑制性RNA分子主要通过DCL2或相似的RNAse被切割，所述抑制性RNA分子的另一种主要通过DCL4或相似的RNAse被切割。

39.根据权利要求25至38任一项所述的真核细胞，其中所述抑制性RNA分子的一种是能够减少所述靶核酸的表达的miRNA分子、pre-microRNA分子或pri-miRNA分子，其中所述另一种抑制性RNA分子是含有互补的或实质上互补的第一和第二RNA区的双链RNA分子，所述第一RNA区含有对应于第一或第二靶核酸的核苷酸序列的至少19个连续核苷酸，并且所述第二RNA区含有对应于与第一或第二靶核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列的至少19个连续核苷酸，其中所述第一和第二RNA区彼此杂交至少18或19个碱基对。

40.根据权利要求25至38任一项所述的真核细胞，其中所述抑制性RNA分子的一种含有来自所述靶核酸分子的启动子区的至少19个连续核苷酸，并且所述另一种抑制性RNA分子含有来自被转录成RNA分子的所述靶核酸分子区的至少19个连续核苷酸。

41.根据权利要求25至40任一项所述的真核细胞，其中从引入所述真核细胞的编码抑制性RNA的基因转录所述抑制性RNA分子。

42.根据权利要求25至41任一项所述的真核细胞，其中在RNA聚合酶II识别的启动子控制下从编码抑制性RNA的基因转录所述抑制性RNA分子的一种，并且在RNA聚合酶III识别的启动子控制下从编码抑制性RNA的基因转录所述另一种抑制性RNA。

43.根据权利要求25至42任一项所述的真核细胞，其中所述靶核酸是病毒核酸或基因或其转录区。

44.根据权利要求25至42任一项所述的真核细胞，其中所述靶核酸是转基因或其区域。

45.根据权利要求18至34任一项所述的真核细胞，其中所述靶核酸是细胞中的内源性基因，其启动子其转录本或其区域。

46.一种非人类真核生物，其实质上或完全由根据权利要求25至45任一项所述的细胞组成。

47.根据权利要求46所述的非人类真核生物，其中相对于所述真核生物中所述真核细胞或生物中的单独任一种抑制性RNA分子来说，两种抑制性RNA分子的组合减少第一靶核酸的表达至更大的程度。

48.根据权利要求38所述的非人类真核生物，其中相对于所述真核生物中的单独任一种抑制性RNA分子来说，两种抑制性RNA分子的组合更稳定地减少第一靶核酸的表达。

49.根据权利要求38所述的非人类真核生物，其中相对于所述真核生物中存在单独任一种抑制性RNA分子时的靶核酸的减少来说，两种抑制性RNA分子的组合对第一靶核酸的表达的减少对外部因素敏感性较低。

50.一种物质组合物，其含有权利要求1至24任一项所述的至少两种抑制性RNA分子，能够减少真核细胞中第一靶核酸的表达或真核细胞中第一和第二靶核酸的表达，其中所述抑制性RNA分子主要通过细胞中不同的RNAi分子加工途径被加工成21至24个核苷酸长度的寡核苷酸。

51.根据权利要求50所述的组合物，其中靶基因选自致病性动物病毒基因，癌症相关基因，致癌基因，免疫调节基因，编码细胞因子、生长因子、酶或转录因子的基因。

52.根据权利要求50或51所述的组合物，其进一步含有药学上可接受的载体、兽医上可接受的载体或农业上可接受的载体。

53.一种试剂盒，其含有权利要求1至24任一项所述的至少两种抑制性RNA分子，作为组合的制备物同时、单独或顺序用于真核生物中第一靶核酸表达的减少或真核细胞中第一和第二靶核酸的表达的减少。

54.一种根据权利要求50至52任一项所述的物质组合物，其用作药物。

55.根据权利要求50至52任一项所述的物质组合物在制备用于治疗由病毒感染或癌症引起的疾病的药物中的用途。

56.一种治疗或预防动物中疾病的方法，该方法包括向有此需要的动物给予根据权利要求50至52任一项所述的组合物。