CN101932320B - 膜融合抑制剂 - Google Patents

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Abstract

提供了安全性出色，并且以病毒增殖周期中不同于常规阶段的阶段为目标、可用作抗病毒剂的药剂。配制了含有以下述化学式(1)表示的表没食子儿茶素没食子酸酯衍生物、或其异构体或它们的盐的药剂。这可以用作抑制病毒的膜融合的膜融合抑制剂。在下述式中，R1-R6各自为氢原子、卤素、钠、钾或者直链或支链的饱和或不饱和酰基，相同或者不同均可，所述酰基还可以被一个或者多个取代基所取代，所述R1-R6中的至少一个为所述酰基，R7-R16为氢原子、卤素、钠或钾，相同或者不同均可。

Description

膜融合抑制剂
技术领域
本发明涉及抑制病毒的膜融合的抑制剂。
背景技术
流感病毒、肝炎病毒等多种多样的病毒所引起的感染被认为问题重重，现正对各种抗病毒剂进行研究。病毒的增殖周期大体上分为感染细胞、病毒在感染细胞内增殖以及增殖病毒被释放到感染细胞外。于是，采用了针对所述各个阶段的方法。
对病毒的增殖周期进行简单说明。首先，具有包膜的病毒识别细胞表面的唾液酸受体并与之结合。由此启动细胞的胞吞作用(内吞作用)，病毒在被包到细胞膜内的同时被摄入细胞内。接着，如果包有病毒的吞噬体内部被酸化，则通过包膜中的膜融合蛋白质(例如血凝素(HA)等)的膜融合活性，吞噬体的膜(细胞来源)与病毒的包膜(病毒的膜)相融合。一旦发生所述膜融合，则进一步通过称为M2的蛋白质的作用在膜上开孔(脱壳)，将病毒的RNA释放到细胞内。以上即为病毒感染细胞的机制。下面对病毒在感染细胞中的复制和释放机制进行说明。释放到细胞内的病毒RNA又被输送到感染细胞的细胞核内，并将其作为来源，在感染细胞内大量合成作为新病毒的组件的RNA和蛋白质等。接着，在感染细胞内合成的病毒基因组与一部分蛋白质联合起来形成病毒核心，并向细胞膜移动。此外，合成的膜融合蛋白、神经氨酸酶(NA)也向细胞膜移动和结合。接着，向细胞膜移动的病毒被包装在具有膜融合蛋白、NA的细胞膜内，并在细胞膜表面出芽。此时，出芽的病毒与感染细胞的细胞膜表面所具有的唾液酸受体相结合，通过细胞膜的NA切断唾液酸受体，从而将出芽的病毒释放到细胞外。通过所述方式进行病毒的感染、复制和释放，并通过释放出来的病毒再感染未感染细胞。
作为抗病毒剂的具体实例，例如，对于流感病毒而言，介入细胞感染阶段的M2抑制剂(非专利文献1和非专利文献2)、介入增殖·释放阶段的NA抑制剂(非专利文献3-非专利文献5)正被开发。M2抑制剂是抑制镶嵌在病毒包膜中的蛋白质M2的活性的药剂，已知有例如盐酸金刚烷胺。藉此，由于M2的活性被抑制，因而防止了感染细胞内的病毒脱壳。因此，病毒来源的RNA不会被输送至细胞核，从而可以阻断RNA、蛋白质自身的合成。另一方面，NA抑制剂是抑制存在于病毒包膜中的NA的活性的药剂，已知有例如扎那米韦(Zanamivir)(注册商标Relenza)、奥塞米韦(Oseltamivir)(磷酸奥塞米韦；注册商标Tamiflu)等。藉此，由于NA的活性被抑制，因而即便病毒在感染细胞内复制，也不能切断出芽的病毒与唾液酸受体的结合。因此，出芽的病毒不能从感染细胞的膜表面分离，最终发生凝集。
但是，M2抑制剂对于诸如乙型流感病毒等M2缺陷病毒而言没有效果，就副作用而言也被认为问题重重。NA抑制剂，就药价昂贵、副作用而言也问题重重。另外，无论对于哪一种抗病毒剂，都担心耐性病毒的出现。基于上述原因，一直在寻求以与病毒增殖周期中现有阶段不同的阶段为目标，并且安全性也出色的药剂。
现有技术文献
非专利文献1：Zlydnikov，D.M.et al，；Study of rimantadine in theUSSR：a review of the literature.Rev.Infect.Dis.3，408-421，(1981).
非专利文献2：Duff K.C. & Ashley R.H.；The transmembranedomain of influenza A M2 protein forms amantadine-sensitive protonchannels in planar lipid bilayers.Virology 190，485-489，(1992).
非专利文献3：Woods，J.M.et al，；4-guanidino-2，4-dideoxy-2，3-dehydro-N-acethylneuraminic acid is ahighly effective inhibitor both of the sialidase(neuraminidase)and ofgrowth of a wide range of influenza A and B viruses in vitro.Antimicrob.Agents Chemother.37，1473-1479，(1993).
非专利文献4：von Itzstein M.et al，；Rational design of potentsialidase-based inhibitors of influenza virus replication.Nature 363，418-423，(1993).
非专利文献5：Kim C.U.et al，；Influenza neuraminidase inhibitorspossessing a novel hydrophobic interaction in the enzyme active site.J.Am.Chem.Soc.119，681-690，(1997).
发明内容
因此，本发明的目的是提供安全性出色、并且以病毒增殖周期中新的阶段为目标、可用作抗病毒剂的药剂。
为了实现上述目的，本发明为抑制病毒的膜融合的膜融合抑制剂，其特征在于含有以下述化学式(1)表示的表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate，EGCG)的衍生物，或者其异构体或它们的盐
【化1】
Figure BPA00001188028600031
在前述化学式(1)中，
R1-R6各自为氢原子、卤素、钠、钾或者直链或支链的饱和或不饱和酰基，相同或者不同均可，前述酰基还可以被一个或者多个取代基取代，前述R1-R6中的至少一个为前述酰基，R7-R16为氢原子、卤素、钠或钾，相同或者不同均可。
本发明人进行了不懈地研究，结果发现，EGCG和EGCG衍生物不同于前述M2抑制剂和NA抑制剂，其抑制由膜融合蛋白质所引起的膜融合，由此完成了本发明。通过本发明的膜融合抑制剂，可以在前述病毒增殖周期的感染阶段中抑制包有病毒的吞噬体的膜(细胞来源)与病毒的包膜(病毒的膜)之间的膜融合。这样，由于膜融合自身被抑制，因此可以阻断下游的阶段，即脱壳和复制自身。此外，由于是以病毒增殖周期中的不同于现有抗病毒剂所针对的阶段作为靶标，因此，通过本发明的膜融合抑制剂，能够抑制例如用前述M2抑制剂、NA抑制剂不能阻断的病毒感染。再者，在本发明的EGCG衍生物中，基本骨架EGCG为例如茶等中所含有的儿茶素(catechin)，其安全性出色充分为人所知，另外，R1-R6的酰基也是安全性出色的物质。因此，可以认为，本发明的膜融合抑制剂还是安全性出色的药剂。
另外，在本发明中，EGCG衍生物抑制病毒的膜融合蛋白质所引起的膜融合的机理并不清楚，但是推测，是通过EGCG衍生物中的酰基将EGCG送递到膜融合蛋白质的膜融合结构域附近，从而抑制膜结合蛋白质所引起的膜融合。此外，本发明并不以任何方式局限于该推测的机理。
附图说明
图1为示出本发明的实施例1中的EGCG衍生物的浓度与噬斑(plaque)形成之间的关系的曲线图。
图2为示出本发明的前述实施例1中的EGCG衍生物的浓度与噬斑形成之间的关系的曲线图。
图3为示出本发明的实施例2中在EGCG衍生物存在下的血球凝集分析的结果的照片。
图4为示出本发明的实施例3中的EGCG衍生物的浓度与噬斑形成之间的关系的曲线图。
图5为示出本发明的前述实施例3中的EGCG衍生物的浓度与噬斑形成之间的关系的曲线图。
图6为示出本发明的实施例4中的EGCG衍生物的浓度与噬斑形成之间的关系的曲线图。
图7为示出本发明的实施例5中病毒感染后的小鼠体重随时间变化的曲线图。
图8为示出本发明的实施例6中在小鼠微粒体来源的葡萄糖醛酸代谢酶存在下的EGCG衍生物的残留率的曲线图。
图9为示出本发明的实施例7中的EGCG衍生物的浓度与噬斑形成之间的关系的曲线图。
图10为示出本发明的实施例8中的EGCG衍生物的浓度与噬斑形成之间的关系的曲线图。
图11为示出本发明的前述实施例8中的EGCG衍生物的浓度与噬斑形成之间的关系的曲线图。
图12为示出本发明的实施例9中在EGCG衍生物存在下的发育鸡卵的存活率的曲线图。
图13为示出本发明的前述实施例9中在EGCG衍生物存在下的发育鸡卵的存活率的曲线图。
图14为本发明的实施例10中的EGCG衍生物的浓度与噬斑形成之间的关系的曲线图。
图15为示出本发明的实施例11中在EGCG衍生物存在下有无HA蛋白质表达的照片。
图16为示出本发明的前述实施例11中在EGCG衍生物存在下有无MI蛋白质表达的照片。
具体实施方式
本发明的膜融合抑制剂为如前所述的抑制病毒的膜融合的膜融合抑制剂，其特征在于含有以下述化学式(1)表示的表没食子儿茶素没食子酸酯的衍生物，或者其异构体或它们的盐：
【化2】
Figure BPA00001188028600051
前述化学式(1)中，
R1-R6各自为氢原子、卤素、钠、钾或者直链或支链的饱和或不饱和的酰基，相同或者不同均可，前述酰基还可以被一个或者多个取代基取代，前述R1-R6中的至少一个为前述酰基，R7-R16为氢原子、卤素、钠或钾，相同或者不同均可。
另外，前述化学式(1)中的“A-D”为表没食子儿茶素没食子酸酯中各环的标号。在本发明的下文中，表没食子儿茶素没食子酸酯被称为“EGCG”，EGCG的衍生物被称为“EGCG衍生物”。
在本发明中，EGCG衍生物包括例如以前述化学式(1)表示的化合物的盐、互变异构体、立体异构体、光学异构体、几何异构体等异构体，还包括异构体的混合物。对前述盐没有特别的限制，可以例举出例如无机酸盐、有机酸盐、无机碱盐、有机碱盐、酸性或碱性氨基酸盐等。前述异构体可以通过例如各种色谱法等现已公知的分离方法纯化。另外，本发明中的前述EGCG衍生物也包括例如使以前述化学式(1)表示的化合物进行氧化、还原、水解、轭合等代谢而产生的化合物。
对R1-R6中的前述酰基的主链长度没有特别的限制，例如，包括羰基碳在内的原子数为2-20，优选为4-20，更优选为8-18，进一步优选为12-16。另外，所谓前述酰基的主链长度是指酰基中最长链的原子数，例如，除了碳原子之外，还可以包括氮原子、硫原子、磷原子、氧原子、硼原子、卤素原子等。
对R1-R6中的前述酰基的碳原子数没有特别限制，例如，包括羰基碳在内为2-20，优选为4-20，更优选为8-18、进一步优选为12-16。另外，前述碳原子数例如更优选为4、8、12、16或20，进一步优选为8、12或16，特别优选为12或16。另外，在前述酰基又被前述取代基取代的情况下，前述碳原子数优选为不含例如前述取代基的碳原子数的数。而且，前述不饱和酰基例如既可以为顺式，也可以为反式。
作为前述酰基，没有特别限制，可以列举例如甲酰基(C1)、乙酰基(C2)、丙酰基(C3)、丁酰基(C4)、异丁酰基(C4)、戊酰基(C5)、异戊酰基(C5)、新戊酰基(C5)、己酰基(C6)、辛酰基(C8)、香叶酰基(geranoyl)(3，7-二甲基辛-2，6-二烯酰基)(C10)、反式-8-甲基-6-壬烯酰基(C10)、十一烷酰基(C11)、月桂酰基(十二烷酰基)(C12)、十三烷酰基(C13)、12-(二甲氨基)月桂基(12-(二甲氨基)十二烷酰基)(C14)、法呢酰基(farnesoyl)(3，7，11-三甲基十二碳-2，6，10-三烯酰基)(C15)、棕榈酰基(十六酰基)(C16)、十七酰基(C17)、硬脂酰基(十八酰基)(C18)、亚油酰基(linoleyl)(C18)、亚麻酰基(linoleonyl)(C18)、十九烷酰基(C19)、花生酰基(二十烷酰基)(C20)等。此外，所列举酰基的括号内的“C”表示包含羰基碳在内的碳数。
在前述酰基中，特别优选例如下述化学式表示的酰基等。此外，不饱和键的位置不限于此。作为具体实例，对于反式-8-甲基-壬烯酰基(C10)的不饱和键(双键)，不限于在下面示出的6位，例如，在2-5位和7位中的任何一个位置均可。
【化3】
丁酰基(C4)
Figure BPA00001188028600081
辛酰基(C8)
Figure BPA00001188028600082
反式-8-甲基-6-壬烯酰基(C10)
Figure BPA00001188028600083
香叶酰基(C10)
Figure BPA00001188028600084
月桂酰基(C12)
Figure BPA00001188028600085
12-(二甲氨基)十二烷酰基(C14)
Figure BPA00001188028600086
【化4】
法呢酰基(C15)
Figure BPA00001188028600091
棕榈酰基(C16)
Figure BPA00001188028600092
硬脂酰基(C18)
亚油酰基(二烯：C18)
Figure BPA00001188028600094
亚麻酰基(三烯：C18)
Figure BPA00001188028600095
花生酰基(C20)
Figure BPA00001188028600096
对前述酰基的种类没有特别限制，如前所述，不饱和酰基、饱和酰基中的任何一种均可。在用于预防病毒感染细胞时，例如，在主链长度相同的酰基中，不饱和酰基是优选的，且不饱和键的数目多是优选的。对前述酰基中的不饱和键的数目没有特别限制，例如为1-3，优选为2-3。另外，在用于感染细胞之前的病毒时，例如，在主链长度相同的酰基中，饱和酰基是优选的。
对R1-R6中的前述取代基没有特别限制，可以列举例如烷基、氨基、烷基氨基和二烷基氨基等。
作为前述烷基，可以列举例如碳原子数为1-6的直链或者支链烷基，优选为甲基。另外，作为前述烷基氨基中的烷基，可以列举例如碳原子数为1-6的直链或者支链烷基，优选为甲氨基。作为前述二烷基氨基中的烷基，可以列举例如碳原子数为1-6的直链或者支链烷基，优选为二甲氨基。这些烷基可以相同，也可以不同。
在前述化学式(1)中，R1-R6中有两处以上为前述酰基也可以，仅任一处为酰基也可以。对于前者，各部位的酰基例如，相同也可以，不同也可以。在本发明中，优选R1-R6中仅一处为酰基，此时，对其他的R没有特别限制，但是优选例如为氢原子。
在前述化学式(1)中，对R1-R6中的酰基的位置没有特别限制，但优选例如B环的R1和R2和D环的R5和R6中至少一处具有前述酰基，特别优选R1、R2、R5和R6中的任何一处具有前述酰基。此时，对其他R没有特别限制，但优选例如为氢原子。
此外，在前述化学式(1)中，优选B环的R1、R2和R3中至少一处为酰基，更优选地，B环的R1、R2和R3中最好只有一处为酰基。B环被修饰的EGCG衍生物的出色归因于例如其代谢稳定性。
在前述化学式(1)中，R7-R16为如前所述的氢原子、卤素、钠或钾，可以相同也可以不同，但是，优选地，最好如下述化学式(2)所示的为氢原子。在下述式(2)中，例如，R1-R6中的任何一个为前述酰基也可以。作为具体实例，优选例如R1-R6中至少一处或者任一处为前述酰基，更优选地，R1、R2、R5和R6中的至少一处或任一处最好为前述酰基，在前述酰基中，优选例如丁酰基、辛酰基、反式-8-甲基-6-壬烯酰基、香叶酰基、月桂酰基、12-(二甲氨基)十二烷酰基、法呢酰基、棕榈酰基、硬脂酰基、亚油酰基、亚麻酰基或花生酰基。
【化5】
Figure BPA00001188028600111
在本发明中，“卤素”是指任意的卤族元素。作为前述卤素，可以例举例如氟、氯、溴和碘。另外，在本发明中，对“烷基”没有特别限制。作为前述烷基，可以列举例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基等。对于结构中含有烷基的基团或者由烷基衍生的基团(烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、羧基烷基、烷氧基羰基烷基、烷氧基烷基、链烯氧基烷基等)，也是适用的。
在取代基等为具有链状结构的基团(例如烷基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、羧基烷基、烷氧基羰基烷基、烷氧基烷基、链烯氧基烷基等)的情况下，只要对其没有特别的限制，则为直链状或者支链状均可。对于取代基等的一部分中含有链状结构的情况，例如，对于取代烷基、取代芳基等中的取代基含有链状结构的情况也是一样的。在取代基等存在异构体的情况下，只要对其没有特别的限制，则哪一种异构体均可。例如，单就“丙基”而言，正丙基和异丙基中的任何一个均可。单就“丁基”而言，正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基中的任何一个均可。单就“萘基”而言，1-萘基和2-萘基中的任何一个均可。
本发明中的EGCG衍生物例如为一种也可以，两种以上联合使用也可以。例如，可以是在R1-R6中的不同部位含有酰基的两种以上EGCG衍生物，也可以是含有不同酰基的两种以上EGCG衍生物。作为具体实例，可以是如下衍生物中的任何两种以上或者含有全部三种的混合物：B环的R1为前述酰基的EGCG衍生物、R2为前述酰基的EGCG衍生物、R3为前述酰基的EGCG衍生物；也可以是如下衍生物中的任何两种以上或者含有全部三种的混合物：D环的R4为前述酰基的EGCG衍生物、R5为前述酰基的EGCG衍生物、R6为前述酰基的EGCG衍生物。另外，也可以是如下衍生物的混合物：B环的R1-R3中的至少任一个为前述酰基的EGCG衍生物和D环的R4-R6中的至少任一个为前述酰基的EGCG衍生物。
对本发明的膜融合抑制剂所适用的病毒没有特别限制，可以例举例如流感病毒、Semliki森林病毒、HIV-1等。对病毒的类型也没有特别限制，可以例举例如流感的甲型、乙型、丙型。作为甲型流感病毒，对其没有特别限制，可以例举例如H1N1、H5N1、H3N2等。此外，作为乙型流感病毒，可以例举例如InfluenzaB/Yamanashi/166/98等。另外，作为前述流感病毒，可以例举例如哺乳类感染性流感病毒、鸟类感染性流感病毒等。如前所述，本发明中的EGCG衍生物与现有的以NA、M2为靶标的抗病毒剂不同，是阻止纳入细胞内的病毒与细胞进行膜融合的膜融合抑制剂。因此，特别是对于NA缺陷病毒(例如丙型流感病毒等)、对NA抑制剂表现出耐性的病毒、M2缺陷病毒(例如乙型流感病毒等)、对金刚烷胺等M2抑制剂表现出耐性的病毒等，尤其有效。
本发明的膜融合抑制剂只要含有前述EGCG衍生物即可，对其形态没有任何限制。作为前述形态，可以例举例如溶液、分散液等液体、固体、粉末等。另外，对于剂型没有特别限制，可以根据例如给药方法适当设定，可以例举液剂、胶囊剂、锭剂、粒剂(细粒剂)、散剂等。作为前述给药方法，对其没有特别限制，可以例举口服给药、非口服给药。作为非口服给药，可以例举例如经皮给药、腹腔内给药、静脉注射等静脉内给药、肌肉给药、皮下注射等皮下给药、直肠给药等，优选为经皮给药。本发明的膜融合抑制剂可以例如根据其给药形式，以例如含有前述EGCG衍生物的口服剂、舌下剂、滴鼻剂、漱口剂、涂抹药等形式给药，另外，作为EGCG衍生物、含有该EGCG衍生物的溶液或分散液，可以采用注射、喷雾器、抽吸器等给药。另外，作为前述EGCG衍生物或者含有该EGCG衍生物的粉末，可以采用例如喷雾器、抽吸器等给药。另外，由于本发明的膜融合抑制剂可以降低病毒的感染能力，还可以例举例如含有前述EGCG衍生物的洗手剂、涂抹剂等洗涤剂形式。通过利用所述的本发明膜融合抑制剂来处理手、桌子等被认为存在病毒的地方，可以使所存在病毒的感染能力降低，并且可以试着预防病毒感染。另外，还可以使本发明的膜融合抑制剂担当掩蔽物。
本发明的膜融合抑制剂可以用于例如预防病毒感染以及治疗病毒感染。本发明的膜融合抑制剂的给药对象可以列举例如人、猪、白鼬、大鼠、小鼠、牛等哺乳类，鸭、鸡等鸟类等。
在本发明的膜融合抑制剂中，对前述EGCG衍生物的含量没有特别限制，可以根据例如给药目的、给药方法适当地决定。在本发明的膜融合抑制剂为漱口剂的情况下，优选例如每次含有20-2000nmol/L的EGCG衍生物。另外，在本发明的膜融合抑制剂为滴鼻剂的情况下，优选例如每次含有20-2000nmol/L的EGCG衍生物。
本发明的膜融合抑制剂还可以根据例如其剂型、给药方法适当地含有添加剂、载体等。作为前述添加剂，可以例举例如赋形剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂、除臭剂、乳化剂、表面活性剂、助溶剂、助悬剂、张度剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、稳定剂、吸收促进剂等。对其添加比例没有特别限制，可以在不损害前述EGCG衍生物的效果的范围内添加。
接下来，本发明的表达抑制剂是抑制病毒蛋白质表达的表达抑制剂，其特征在于含有前述EGCG衍生物。本发明的表达抑制剂以含有前述EGCG衍生物为特征，对其他构成、形态、使用方法等没有限制，与前述膜融合抑制剂相同。通过本发明的EGCG衍生物，可以在例如病毒感染细胞之时抑制前述细胞内的病毒蛋白质的表达。因此，可以抑制病毒在感染细胞内增殖的前面阶段。另外，对于本发明的表达抑制剂，对其表现出表达抑制效果的机理没有特别的限制，例如，不限于如前所述的膜融合抑制机理。
接下来，本发明的抗病毒剂的特征在于含有本发明的膜融合抑制剂。本发明的抗病毒剂只要含有本发明的膜融合抑制剂即可，对其他构成没有任何限制。本发明的抗病毒剂的形态、使用方法也同前所述。另外，本发明的抗病毒剂只要含有前述EGCG衍生物即可，对其表现出抗病毒效果的机理也没有特别的限制，例如，不限于如前所述的膜融合抑制机理。
对本发明的抗病毒剂所适用的病毒没有特别的限制，可以例举与前述相同的病毒。其中，基于同样的理由，优选适用NA缺陷病毒、NA抑制剂耐性病毒、M2缺陷病毒、M2抑制剂耐性病毒等。
本发明的抗病毒剂还可以含有M2抑制剂。本发明的膜融合抑制剂与M2抑制剂在病毒感染中所涉及的机理不同。因此，在本发明的抗病毒剂含有本发明的膜融合抑制剂和M2抑制剂的情况下，会通过本发明的膜融合抑制剂抑制病毒的膜融合，并且即便出现膜融合，也会通过M2抑制剂阻断脱壳，由此可以在两个阶段抑制病毒感染。另外，本发明的抗病毒剂还可以含有NA抑制剂。在本发明的抗病毒剂含有本发明的膜融合抑制剂和NA抑制剂的情况下，可通过本发明的膜融合抑制剂抑制病毒的膜融合从而阻断复制，并且即便病毒被复制，还会通过NA抑制剂来阻断所述复制病毒的释放，由此可以抑制病毒的感染和复制病毒的释放两个阶段
对本发明中的EGCG衍生物的制备方法没有特别的限制。作为前述方法，可以采用例如有机合成法、利用酶等的化学合成法等现已公知的方法。作为前述利用酶的化学合成法，对其没有特别的限制，可以例举例如WO2007/105280中公开的利用脂肪酶的方法。即，在有机溶剂中，以EGCG和酰基供体为底物，利用脂肪酶进行酶反应，从而酰化EGCG的方法。通过所述方法，可以例如选择性地酰化EGCG。此外，在下文中，作为一个实例，例示出使用脂肪酶的方法，但是本发明对于EGCG衍生物的制备方法并没有任何的限制。
作为前述脂肪酶，可以使用例如IUB No.3.1.1.3.的脂肪酶。作为具体实例，可以例举黑曲霉(Aspergillus niger)等曲霉(Aspergillus)属来源脂肪酶；皱褶假丝酵母(Candida rugosa)、柱状假丝酵母(Candidacylindracea)、南极假丝酵母(Candida antarctica)等假丝酵母(Candida)属来源脂肪酶；荧光假单胞菌(Pseudomons fluorescens)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)、施氏假单孢菌(Pseudomonas stutzeri)等假单孢菌(Pseudomonas)属来源脂肪酶；产碱菌(Alcaligenes)属来源脂肪酶；洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)等伯克霍尔德菌(Burkholderia)属来源脂肪酶；猪胰脏来源的脂肪酶等。所述脂肪酶均可通过现已公知的方法制备，但是也可以使用例如Lipase AS“AMANO”、Lipase AYS“AMANO”、Lipase PS“AMANO”、Lipase AK“AMANO”20、Lipase AH“AMANO”(全部为商品名，天野Enzyme社制备)、Lipase MY、Lipase OF、Lipase PL、Lipase PLC、Lipase PLG、Lipase QLM、LipaseQLC、Lipase QLG、Lipase SL、Lipase TL(全部为商品名，名糖产业社制备)、Lipase PPL、来源于南极假丝酵母的L4777脂肪酶丙烯酸树脂、来源于猪胰脏的L3126 Lipase(全部为商品名，Sigma-Aldrich公司制备)等市售商品。此外，各市售商品的物理化学性质如各自的商品说明书中所记载，同样地，还可以使用表现出相同物理化学性质的酶。
另外，也可以是具有如下文所示(1)-(8)的任何一个物理化学特性和酶学特性的脂肪酶：
(1)分子量35,000，等电点4.10(例如黑曲霉来源)；
(2)分子量64,000，等电点4.30，80℃处理10分钟失活(例如皱褶假丝酵母来源)；
(3)最适pH8，最适温度60℃，在pH4-10的范围内特别稳定，在70℃以下特别稳定(例如荧光假单胞菌来源)；
(4)分子量60,000，最适pH6-7，pH稳定性3-8，最适温度40-50℃，在37℃以下的溶液状态中特别稳定(例如柱状假丝酵母来源、皱褶假丝酵母来源)；
(5)分子量30,000，等电点4.5，最适pH8-9.5，pH稳定性7-10，最适温度50℃，在40℃以下特别稳定(例如产碱菌属来源)；
(6)分子量31,000，等电点4.9，最适pH7-9，pH稳定性6-10，最适温度65-70℃，在50℃以下特别稳定(例如产碱菌属来源)；
(7)分子量31,000，等电点5.2，最适pH7-9，pH稳定性6-10，最适温度65-70℃，在60℃以下特别稳定(例如洋葱假单胞菌来源、洋葱伯克霍尔德菌来源)；
(8)分子量27,000，等电点6.6，最适pH7-8，pH稳定性6-9，最适温度50℃，在40℃以下特别稳定(例如施氏假单孢菌来源)。
作为前述有机溶剂，对其没有特别限制，可以使用例如乙腈、丙酮、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)等。另外，例如，指示疏水性的参数(log P值)在-0.35～0.28的范围的有机溶剂也可以，作为所述有机溶剂，可以例举前述的乙腈(log P值：-0.45～0.19)、丙酮(log P值：-0.16～0.19)、DMF(log P值：-1.01～0.28)、DMSO(log P值：-1.35～0.28)。除此之外，还可以使用满足前述参数的现已公知的溶剂。前述log P是溶剂固有的值，因此本技术领域技术人员能够选择满足前述参数的溶剂。此外，log P是将目的物质添加到辛醇和水的混合溶液中，达到平衡时在辛醇层和水层中的前述目的物质的浓度比以常用对数表示的数值，如前所述，一般作为指示物质疏水性的参数。
作为本发明中的酰基(R-CO-)供体，可以例举例如羧酸乙烯酯(R-CO-O-CH＝CH2)。此外，作为前述酰基，可以例举如前所述的直链或支链饱和或不饱和酰基。
在前述酶反应溶液中使用DMF的情况下，对EGCG的添加比例没有特别的限制，例如，为0.2-100mmol/L，优选为0.5-50mmol/L，更优选为0.5-20mmol/L。对酰基供体的添加比例没有特别的限制，可以根据例如反应液中EGCG的添加比例适当地决定。作为具体实例，EGCG和酰基供体的添加比例(摩尔比)例如为1∶1-1∶10，优选为1∶1-1∶5，更优选为1∶1-1∶3。另外，反应液中脂肪酶的添加比例可以根据例如EGCG、酰基供体的添加比例、脂肪酶的比活性等适当地决定，对其没有特别的限制，例如，对于EGCG 1mmol/L的情况，例如为500-50,000U/L，优选为500-5,000U/L，更优选为1,000-2,500U/L。
对酶反应的条件没有特别限制，反应温度为例如45-75℃的范围。前述反应时间可以根据例如底物、酶的量适当地决定，对其没有特别的限制，例如为30分钟-24小时(1440分钟)，优选为1小时(60分钟)-3小时(180分钟)，更优选为1.5小时(90分钟)-3小时(180分钟)。
还可以在前述反应液中添加碱性催化剂。作为前述碱性催化剂，可以例举例如三乙胺等叔胺、吡啶等。对反应液中碱性催化剂的添加比例没有特别的限制，例如为5-720mmol/L，优选为12-240mmol/L，更优选为12-48mmol/L。
EGCG中前述酰基导入的位置可以根据例如所使用脂肪酶的种类来选择。另外，EGCG中导入的酰基数可以根据例如所使用有机溶剂的种类、反应时间决定。例如，有机溶剂的疏水性相对越高(亲水性相对越低)，所导入酰基数越可以相对地减少，有机溶剂的亲水性相对越高(疏水性相对越低)，所导入酰基数越可以相对地增加。另外，通过混合使用二种以上有机溶剂，也可以调节导入的酰基数。作为具体实例，例如，在导入1个酰基时，优选使用乙腈等，例如，在导入1-2个酰基时，优选使用丙酮、乙腈等，例如，在导入3-5个酰基时，优选使用DMSO、DMF等。
再者，即便是在使用相同有机溶剂的情况下，也可以通过联合控制温度时间、反应温度等来调节导入的酰基数。下文示出其实例，但不限于此。在使用DMF的情况下，通过例如将反应温度设定为约57℃-约70℃的范围、延长反应时间(例如约3-5小时)，可以优先获得向EGCG中选择性地导入了2个酰基的衍生物；另一方面，通过降低反应温度(例如比57℃低约5℃的温度)、缩短反应时间(例如约1-3小时)，可以选择性地导入1个酰基。另外，通过使用将丙酮与DMF以相同的量(质量)混合得到的混合溶剂，也可以向EGCG中选择性地导入1个酰基。
另外，导入的酰基数可以通过向反应液中添加前述碱性催化剂来增加。在此情况下，再向EGCG中的哪个部位引入酰基取决于例如脂肪酶的位置选择性。
通过例如相对高地设定反应温度，可以相对地提高前述酶反应的EGCG衍生物收率。如前所述，反应温度通常为45-75℃，但是从提高收率这一点来看，优选为57-75℃，更优选为57-70℃。特别是在反应温度为57-70℃的情况下，可以实现约35-45％的前述EGCG酰化衍生物的收率。此外，前述收率是指在以反应中所使用的EGCG为100％的情况下，EGCG酰化衍生物(例如全部单酰化衍生物)的比例(转化效率)。
在本发明中，对于EGCG衍生物而言，例如，如前所述，可以使用任何一种，也可以使用两种以上的混合物。在从前述混合物中分离一种EGCG衍生物时，可以通过使用例如色谱法等现已公知的方法来制备。
接下来，本发明的感染防止方法为防止病毒感染的方法，其特征在于给予受试者前述EGCG衍生物。在本发明中，特征在于使用前述EGCG衍生物，对其他构成、条件等没有任何限制。前述EGCG衍生物、其使用方法等例如如前所述。另外，在本发明中，作为前述EGCG衍生物，也可以给予例如本发明的膜融合抑制剂、表达抑制剂或抗病毒剂等。
在本发明中，对受试者没有任何限制，可以例举例如人、猪、白鼬、大鼠、小鼠、牛等哺乳类、鸭、鸡等鸟类等。另外，前述受试者可以是例如生物体自身，也可以是自生物体采集的细胞、组织、它们的培养物。
在前述受试者为生物体的情况下，作为前述给药方法，对其没有特别限制，可以例举例如非口服给药和口服给药。作为非口服给药，可以例举例如经皮给药、腹腔内给药、静脉内给药、肌肉给药、皮下给药、直肠给药等，优选为经皮给药。对于前述非口服给药，可以采用例如内服、滴鼻、含漱、注射、喷雾器或抽吸器等来给予前述EGCG衍生物。另外，作为经皮给药方法，包括例如用含有EGCG衍生物的洗涤剂洗手、用含有EGCG衍生物的擦拭剂等擦拭等。
另外，在前述受试者为自生物体采集的细胞、组织等的情况下，作为前述给药方法，对其没有特别的限制，可以例举例如添加到培养基中等。
针对前述受试者给予前述EGCG衍生物的给药时期没有特别的限制，例如，可以在病毒感染前，也可以在病毒感染后。如前所述，EGCG衍生物可以抑制例如感染细胞中病毒蛋白质的增殖、病毒来源的膜融合蛋白质所介导的膜融合，从而可以阻断病毒感染的初期阶段。因此，也可以认为，本发明是例如感染细胞中病毒蛋白质的表达抑制方法，或者，病毒的膜融合抑制方法。
实施例
接下来，对本发明的实施例进行说明。但是，本发明并不受限于下述实施例。
实施例1
(1)EGCG衍生物的制备
通过下述方法来制备EGCG衍生物，作为膜融合抑制剂。
向100mL DMF中混入1g EGCG、927mg下文示出的酰基供体和50000U脂肪酶(商品名Lipase PL，名糖产业社制备)，并在57℃孵育2小时进行酶反应。
【表1】
Figure BPA00001188028600191
随后，在过滤、浓缩孵育后的反应液之后，上样至柱色谱(球状、中性、40-50μm、商品名为Silica GelN60，关东化学株式会社制备)，从而除去作为杂质的未反应酰基供体。对所得反应生成物进行电喷雾电离质量分析(ESI-MS)，结果可以确认，在EGCG的B环的R1或R2，或者，D环的R5或R6中，通过酯结合引入了1个上述表1所示酰基。
此外，为了确认EGCG的哪一个位置被酯化，通过质子核磁共振(H1 NMR)对前述反应生成物进行分析。结果示于下表。
【表2】
*：B环酯化的EGCG衍生物与D环酯化的EGCG衍生物的比
导入了前述No.1-No.10酰基的EGCG衍生物在下文中被分别称为EGCG-C4(EGCG-But)、EGCG-C8(EGCG-Oct)、EGCG-C12(EGCG-Lau)、EGCG-C16(EGCG-Pal)、EGCG-C18(EGCG-Ste)、EGCG-C20(EGCG-Eic)、EGCG-C18-DE(EGCG-linoleyl)、EGCG-C18-TE(EGCG-linolenoyl)、EGCG-C15-Far(EGCG-Far)、EGCG-C10-Trans(EGCG-Trans)。所述EGCG衍生物为前述化学式(2)所示的EGCG衍生物，前述各部位(R1、R2、R5或R6)为表2所示结构式的酰基。使用所述EGCG衍生物来进行以下实验。
(2)对病毒感染细胞的预防
将前述各EGCG衍生物以使其达到规定浓度0-128μM(μmol/L)的方式分别溶解于OptiMEM(0.2％DMSO)，从而制得各种样本溶液(No.1-No.10)。另一方面，将犬肾培养细胞(MDCK)在装有培养液的6孔培养板中培养到汇合(约8小时)。从前述培养板除去培养液，将培养的细胞层用D-PBS洗涤，然后加入1.2mL前述样本溶液，在CO2存在下，于37℃孵育2小时。除去前述样本溶液，用D-PBS洗涤细胞层，之后将用DMEM(0.2％BSA)悬浮的流感病毒(A/PR8/34/H1N1)以使其MOI＝2.5×10-4的方式加入前述细胞层。接着，于室温下孵育1小时，之后使含有6.0×10-4％胰蛋白酶和0.2％BSA的0.8％琼脂糖凝胶在前述细胞层上重叠。在CO2存在下，再于37℃孵育52-60小时，之后对前述细胞层中显现出的噬斑数进行计数。并且，将没有添加EGCG衍生物(0μmol/L)的噬斑数作为100，算出噬斑形成比(％)。作为比较例，使用未导入酰基的EGCG来代替EGCG衍生物，进行同样的处理。No.1-No.6的EGCG衍生物和EGCG的结果示于图1。图1为示出EGCG衍生物的浓度与噬斑形成比之间的关系的曲线图。该图中的噬斑形成比以没有添加EGCG衍生物(0μmol/L)情况下的噬斑数为100％的相对值(％)表示(下同)。另外，下表示出了有关No.1-No.10的EGCG衍生物和EGCG的抗病毒活性(EC50)、细胞毒性(CC50)和SI。
【表3】
预防病毒感染的效果
Figure BPA00001188028600211
＊1：抗病毒效果(50％有效浓度)
＊2：细胞毒性(50％细胞毒性浓度)
＊3：选择性(选择指数＝CC50/EC50)
如图1所示，确认了通过预先向细胞中添加EGCG衍生物，与添加EGCG(◆)相比，噬斑形成减少，其中尤以EGCG-16、EGCG-C12中的现象显著。另外，如前表所示，通过预先向细胞中添加EGCG衍生物，获得了比比较例EGCG更出色的抗病毒效果。此外，细胞毒性方面的问题也不复存在。特别是对于EGCG-12、EGCG-C15-Far、EGCG-16、ECGC-C18-DE、EGCG-C18TE，其各自的EC50为3-7的范围，与EGCG的EC50(94.60)相比，表现出极高的抗病毒效果。其中，对于EGCG-C18-DE而言，由于其EC50低，CC50高，因而可知其在低浓度下会展现出出色的抗病毒效果，并且毒性也极低。另外可知，EGCG-C18-TE在极低浓度下会展现出出色的抗病毒效果。还对主链长度相同(12)的EGCG-C12和EGCG-C15-Far进行了比较，结果显示，具有不饱和键的一方抗病毒效果高。另外，同样地，将主链长度相同(18)的EGCG-C18、EGCG-C18-DE和EGCG-C18-TE进行了比较，结果表明，具有不饱和键、并且不饱和键数越多，抗病毒效果越高。如上所述，预先向细胞中添加EGCG衍生物会展示出出色的抗病毒效果，因此可以说，本发明的膜融合抑制剂可以作为病毒感染的预防剂使用。
(3)对病毒感染能力的抑制
将各种EGCG衍生物以使其达到规定浓度(0-10000nmol/L)的方式溶解于OptiMEM(0.2％DMSO)中，再添加流感病毒(A/PR8/34/H1N1)，并在室温下孵育30分钟。将犬肾培养细胞(MDCK)在装有培养液的6孔培养板中培养到汇合(约8小时)。从前述培养板中除去培养液，将培养的细胞层用D-PBS洗涤，然后以使流感病毒的MOI＝2.5×10-4的方式加入前述含有EGCG衍生物和流感病毒的样本溶液。接着，于室温下孵育1小时，之后使含有6.0×10-4％胰蛋白酶和0.2％BSA的0.8％琼脂糖凝胶于前述细胞层上重叠。在CO2存在下，再于37℃孵育52-60小时，之后对前述细胞层中显现的噬斑数进行计数。并且，将没有添加EGCG衍生物(0μmol/L)的噬斑数作为100，算出噬斑形成比(％)。作为比较例，使用未导入酰基的EGCG来代替EGCG衍生物，进行同样的处理。其结果示于图2。图2为示出EGCG衍生物的浓度与噬斑形成比之间的关系的曲线图。另外，下表示出了有关EGCG衍生物和EGCG的抗病毒效果(EC50)和SI。
【表4】
感染能力的抑制效果
Figure BPA00001188028600231
＊1：抗病毒效果(50％有效浓度)
＊2：选择性(选择指数＝CC50/EC50)
如图2所示，可以确认，通过向流感病毒中预先添加EGCG衍生物，与添加EGCG添加(◇)相比，噬斑形成显著减少。另外，如前表所示，通过向流感病毒中预先添加EGCG衍生物，获得了比比较例EGCG更出色的抗病毒效果。特别是对于EGCG-C12、EGCG-C16、EGCG-C18、EGCG-C18-DE、EGCG-C18-TE，其各自的EC50为0.02-0.118，与EGCG的EC50(0.391)相比，表现出极高的抗病毒效果。其中，对于EGCG-C18而言，由于表示抗病毒效果与毒性之比的SI极高，因而可知其在低浓度下会展现出出色的抗病毒效果，并且毒性也极低。由这些结果可以认为，利用EGCG衍生物，能够抑制病毒对细胞的感染能力，也可以认为其显示出对病毒的直接灭活效果。另外，由预先向病毒中添加EGCG衍生物的情况可知，本发明的膜融合抑制剂可以作为病毒感染的预防剂使用。
实施例2
通过血细胞凝集确认了本发明中的EGCG衍生物不仅以NA作为靶标，还以利用HA的膜融合作为靶标。
红细胞凝集分析
将在实施例1中制备的EGCG-C16(EGCG-Pal)溶解于D-PBS(0.2％DMSO)中，从而制得规定浓度的样本溶液。EGCG-C16的浓度以使后述处理时的终浓度分别为0、0.25、0.5、1、2、4、8、16μmol/L的方式设定。将25μL前述样本溶液加入96孔培养板中。再将25μL用D-PBS悬浮的流感病毒(A/PR8/34/H1N1)悬浮液(6.5×105TCID50)加入前述培养板中。将前述培养板于室温下孵育30分钟，之后加入50μL用D-PBS以1/200稀释的鸡红细胞的凝集液。将前述培养板于4℃孵育1小时，之后观察红细胞的凝集度，从而评价EGCG-C16的凝集抑制效果。作为对照，使用D-PBS来替代流感病毒悬浮液，并以同样方式进行评价。另外，作为比较例，使用EGCG来替代EGCG-C16。
结果示于图3。该图为示出在EGCG存在下的红细胞凝集的照片。在该图中，上起1-2排为使用EGCG-C16的结果(病毒)，3-4排为针对EGCG-C16的对照的结果(无病毒)，5-6排为使用EGCG的结果(病毒)，7-8排为针对EGCG的对照的结果(无病毒)。另外，横排是改变EGCG衍生物的浓度(μmol/L)的结果。
如该图所述，在病毒存在下，在没有添加EGCG-C16(0μmol/L)时确认有红细胞凝集，但是随着EGCG-C16的浓度增加，红细胞凝集得到抑制(4、8、16μmol/L)。由这些结果可知，EGCG-C16抑制利用HA的膜融合。与此相对，对于比较例EGCG，即便是使其终浓度增加到16μmol/L，也不能确认有红细胞的凝集抑制。此外，对于其他EGCG衍生物，也得到了相同的结果。通过以上结果可以认为，与前述实施例一样，利用EGCG衍生物，会有效地抑制膜融合，藉此可以防止病毒感染。
实施例3
比较了EGCG衍生物和抗病毒作用机理不同的扎那米韦(注册商标Relenza)和磷酸奥塞米韦(注册商标Tamiflu)预防病毒感染细胞的效果和抑制病毒感染能力的效果。
同实施例1那样评价预防病毒感染的效果和感染能力的抑制。另外，比较例使用扎那米韦、磷酸奥塞米韦或EGCG来替代EGCG衍生物，除此之外进行相同的处理。
预防病毒感染的效果的结果示于图4和下表5。图4为显示EGCG-C16的浓度与噬斑形成比之间的关系的曲线图。如图4所示，通过向细胞中预先添加EGCG-C16，与比较例相比，可以极其有效地减少噬斑形成。此外，就其他EGCG衍生物而言，也获得了相同的效果。另外，如下表5所示，通过向细胞中预先添加EGCG衍生物，与比较例相比，其展现出极其出色的预防病毒感染的效果。具体而言，EGCG衍生物展现出的效果是扎那米韦的约5.4-12.7倍，磷酸奥塞米韦的约8.3-19.3倍，EGCG的约13.5-31.6倍。
【表5】
预防病毒感染的效果
Figure BPA00001188028600251
＊1：抗病毒效果(50％有效浓度)
接下来，抑制病毒感染能力的结果示于图5和下表6。图5是示出EGCG-C16的浓度与噬斑形成比之间的关系的曲线图。如图5所示，通过向病毒中预先添加EGCG-C16，与比较例相比，可以有效地减少噬斑形成。此外，就其他EGCG衍生物而言，也获得了相同的结果。另外，如下表6所示，通过向病毒中预先加入EGCG衍生物，可以较比较例更为出色地抑制病毒的感染能力。具体而言，EGCG衍生物所表现出来的效果是扎那米韦的约21-315倍，磷酸奥塞米韦的约187-2810倍，EGCG的约1.3-20倍。
【表6】
抑制感染能力的效果
Figure BPA00001188028600261
＊1：抗病毒效果(50％有效浓度)
由以上结果可知，利用EGCG衍生物，可以比EGCG、现有的抗病毒剂更为有效地防止病毒感染。
实施例4
确认了EGCG-16对病毒感染细胞的治疗效果。
将EGCG-C16以使其达到规定浓度(0、2、8、32、64、128nmol/L)的方式溶解于OptiMEM(0.2％DMSO)中，从而制得样本溶液。将犬肾培养细胞(MDCK)在6孔培养板中培养到汇合。从前述培养板中除去培养液，并将培养的细胞层用D-PBS洗涤，之后将700μL用DMEM(0.2％BSA)悬浮的流感病毒(A/PR8/34/H1N1)液以使其MOI＝2.5×10-4的方式加入前述细胞层中。接着，在室温下孵育1小时，之后用D-PBS洗涤前述细胞层。加入700μL前述EGCG-C16的样本溶液，并在CO2存在下，于37℃孵育2小时。除去前述样本溶液，用D-PBS洗涤细胞层，之后将含有6.0×10-4％胰蛋白酶和0.2％BSA的0.8％琼脂糖凝胶于前述细胞层上重叠。然后，在CO2存在下，再于37℃孵育52-60小时，之后对前述细胞层中显现的噬斑数进行计数。并且，将没有添加EGCG衍生物(0μmol/L)的噬斑数作为100，算出噬斑形成比(％)，藉此来评价EGCG衍生物预防病毒感染的效果。作为比较例，使用未导入酰基的EGCG来代替EGCG衍生物，进行同样的处理。这些结果示于图6。图6是示出EGCG衍生物的浓度与噬斑形成比之间的关系的曲线图。
如图6所示，通过向病毒感染的细胞中添加EGCG衍生物，可以确认，与添加EGCG时相比，噬斑形成显著减少。此外，就其他EGCG衍生物而言，也获得了同样的结果。由这些结果可知，即便是在存在已被病毒感染的细胞的情况下，也可以抑制病毒从感染细胞中释放。为此，可以认为，可以防止由感染细胞释放的病毒所引起的进一步感染。
实施例5
确认了EGCG衍生物在体内预防感染的效果。
将小鼠(Bulb/C雌性小鼠，6周龄)分为A-D四组，每组5只，分别装入单独的笼子里。对各组小鼠，改变条件进行以下所示的处理。
A组：EGCG-C16给药(-)/流感病毒感染(-)
B组：EGCG-C16给药(+)/流感病毒感染(-)
C组：EGCG-C16给药(-)/流感病毒感染(+)
D组：EGCG-C16给药(+)/流感病毒感染(+)
对各小鼠进行***麻醉，对于A组和C组小鼠，分别经鼻接种D-PBS(2％DMSO)，而对于B组和D组小鼠，则分别经鼻接种20μL含有718μmol/L EGCG-C16的D-PBS(2％DMSO)溶液。2小时后，对通过腹腔内注射10％戊巴比妥液麻醉的前述小鼠经鼻接种20μL5×106TCID50/mL的流感病毒(A/FM1/H1N1)。经鼻接种病毒后，每天测定小鼠的体重，并进行体重变化和存活率的评价。这些结果示于图7。该图是示出病毒感染后小鼠的体重随时间变化的曲线图。
在作为对照的没有感染流感病毒的A组和B组中，没有观察到体重变化。而对于未给予EGCG衍生物的C组，因感染流感病毒，体重锐减。与此相对，对于预先给予EGCG衍生物的D组而言，在约1周的时间里，体重有些许减少，但随后急剧增加。这样，通过预先给予EGCG衍生物，可以抑制病毒感染所引起的体重降低，因此可以认为，利用本发明的EGCG衍生物，可以预防流感病毒感染后的病情加重。
实施例6
确认了D环中具有酰基的EGCG衍生物以及B环中具有酰基的EGCG衍生物的抗病毒效果。
同实施例1那样制备EGCG-C16。作为前述EGCG-C16，使用：在前述化学式(2)中，B环的3位(R1)为棕榈酰基(C16)的衍生物和4位(R2)为棕榈酰基的衍生物的混合物(下文中称为“B环衍生物”)，以及D环的4位(R5)为棕榈酰基(C16)的衍生物和6位(R6)为棕榈酰基的衍生物的混合物(下文中称为“D环衍生物”)。此外，在化学式(2)中，前述R以外的R全部为氢原子。
将1.25μL 10mg/mL小鼠微粒体(日本Charles River株式会社)与0.25μL 1％3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸盐(3-((3-Cholamidopropyl)dimethylammonium)-1-propanesulfonate)(CHAPS，Dojindo社)水溶液溶解在8.5μL 0.1mol/L磷酸钾水溶液(pH7.4)中。通过将所述溶液于冰上孵育30分钟，洗脱出前述微粒体中的葡萄糖醛酸代谢酶。将此作为反应液A。接着，使10μL 10mmol/L EGCG-C16、5.0μL 10mg/mL L-α-溶血磷脂酰胆碱(Lysophosphatidylcholine)(Wako社)和20μL 30mmol/L UDP-葡萄糖醛酸三钠(UDP-Glc；Nacalai社)分别溶解于155μL反应缓冲液(1.0mol/L Tris-HCl(pH7.4)：0.1mol/LMgCl2∶H2O＝2∶1∶13)。将它们分别作为反应液B。接着，通过在37℃的水浴中混合前述反应液A和反应液B，进行EGCG-C16的葡萄糖醛酸轭合反应。使反应达规定时间(0、0.5、1、1.5、3、6、12、24分钟)之后，为停止代谢反应，向200μL反应液中添加200μL乙腈(HPLC级；关东化学株式会社)。接下来，将前述反应液用0.45μm PTFE制的DISMIC过滤器(Ekicrodisc 13CR；Gelman Science社)过滤，之后将约40μL在下述条件下用于HPLC分析。
HPLC分析***(日本分光株式会社)中载有WP300-C4柱(5μm，4.6×150mm，GL Science社)，将EGCG-C16的代谢反应液在波长265nm处解析。对于HPLC分析的流动相，使用含有0.1％三氟乙酸(HPLC级；Wako社)的蒸馏水(HPLC级；关东化学株式会社)作为A液，使用含有0.1％三氟乙酸的乙腈(HPLC级；关东化学株式会社)作为B液。然后，通过下述方式梯度设定B液在全体(A液+B液)中所占的体积百分率，即在洗脱时间0、3、10、22、26、28、30分钟，所述体积百分率分别为0、0、25、100、100、0、0％；并以流速1.5mL/min进行分析。并且，将未反应的反应液中的EGCG-C16的峰面积作为100％，求出在规定时间的反应液中的EGCG-C16的峰面积比例，作为EGCG-C16的残留率％。作为比较例，使用未导入酰基的EGCG来替代EGCG衍生物，并进行同样的处理。这些结果示于图8。该图为示出EGCG-C16的反应时间与EGCG-C16残留率之间的关系的曲线图。该图中的D环为D环衍生物，B环是指B环衍生物。
如该图所示可知，在历经24分钟的时间里，对于D环衍生物而言，峰面积减少到开始时的0.5％，而对于B环衍生物而言，残留了44％，代谢稳定性更为出色。
实施例7
确认了D环中具有酰基的EGCG-C16和B环中具有酰基的EGCG-C16预防病毒感染的效果。
同实施例1那样，将前述实施例6中的B环衍生物或D环衍生物预先添加到细胞中，并确认其预防病毒感染的效果。其结果示于图9。该图为示出B环衍生物和D环衍生物的浓度与噬斑形成比之间关系的曲线图。如该图所示可知，对于B环衍生物和D环衍生物而言，未见抗病毒效果有差异，表明具有同样出色的效果。另外，对于B环衍生物，对3位(R1)为棕榈酰基(C16)的衍生物和4位(R2)为棕榈酰基的衍生物进行了分离，并以同样的方式确认了抗病毒效果，结果发现，在异构体之间未见效果有差异，表明具有同样出色的效果。另外，对于D环衍生物，对4位(R5)为棕榈酰基(C16)的衍生物和6位(R6)为棕榈酰基的衍生物也进行了分离，并以同样的方式确认了抗病毒效果，结果发现，在异构体之间未见效果有差异，表明具有同样出色的效果。此外，对于EGCG-C16以外的EGCG衍生物也获得了同样的结果。
实施例8
对具有相同主链长度的酰基的EGCG衍生物确认了抗病毒效果。
对在实施例1中制得的EGCG-C18、EGCG-C18-DE和EGCG-C18-TE，确认了预防病毒感染的效果和抑制病毒感染能力的效果。所述EGCG衍生物各自的酰基主链长度为18。
首先，同实施例1那样，将前述各EGCG衍生物预先添加到细胞中，并确认了预防病毒感染的效果。此外，作为比较例，还以同样的方式确认了EGCG预防病毒感染的效果。其结果示于图10。该图为示出各EGCG衍生物的浓度与噬斑形成比之间的关系的曲线图。如该图所示，可以确认，与EGCG相比较，每一种EGCG衍生物在低浓度下的噬斑形成均减少。其中，酰基中具有不饱和键的EGCG-C18-DE(EGCG-DE)和EGCG-C18-TE(EGCG-TE)在极低浓度下可以更有效地减少噬斑形成，尤以EGCG-C18-TE的效果显著。由这些结果可知，在酰基的主链长度相同的情况下，具有不饱和键的一方会显现出高的预防病毒感染的效果，进一步地，不饱和键的数目越多，越会显现出高的预防病毒感染的效果
另外，同实施例1那样，将前述各EGCG衍生物预先添加到病毒中，并确认了抑制病毒感染能力的效果。此外，作为比较例，还以同样的方式确认了EGCG抑制感染能力的效果。其结果示于图11。该图为示出各EGCG衍生物的浓度与噬斑形成比之间的关系的曲线图。如该图所示，，可以确认，与EGCG相比，每一种EGCG衍生物在低浓度下的噬斑形成均减少。其中，酰基为饱和脂肪酸的EGCG-C18在极低浓度下可以更有效地减少噬斑形成。由这些结果可知，在酰基的主链长度相同的情况下，饱和脂肪酸一方显现出高的抑制感染能力的效果。
实施例9
在发育鸡卵中确认了EGCG衍生物抑制病毒感染的效果。
配制含有EGCG-C16和A型流感病毒(A/H5N1)并含有0.2％DMSO的OptiMEM溶液。以使前述溶液中的EGCG-C16达1.25μmol/L，前述流感病毒达100TCID50/卵的方式进行配制。将所述儿茶素和病毒的混合溶液在20℃下孵育30分钟，之后将100μL接种到12日龄的发育鸡卵(n＝8)。接着，将前述发育鸡卵在37℃孵育30分钟，之后确认随时间的存活率(％)。另外，作为比较例，接种Tamiflu、EGCG，来替代前述EGCG衍生物，并以同样的方式确认存活率。另外，作为对照，还以同样的方式确认了没有接种EGCG衍生物、而仅接种流感病毒的发育鸡卵的存活率。
这些结果示于图12。该图为示出发育鸡卵随时间的存活率的曲线图。在该图中，存活率是以8个发育鸡卵全部存活的状态作为100％时的相对值(％)。如该图所示，在没有EGCG衍生物添加(◆)、EGCG(▲)和Tamiflu(□)中，全部表现出相同的表现，在32小时全部引起死亡，与此相对，利用EGCG-C16(○)，可以维持长时间生存。
另外，使用含有规定浓度(0.5、1、5、10μmol/L)的EGCG-C16的D-PBS(2％DMSO)溶液，并使对发育鸡卵接种流感病毒的条件为0.1、1.0或10TCID50/卵，除此之外，以同前所述的方式确认了自流感病毒接种起24小时后的存活率(n＝8)。
其结果示于图13。该图为示出在EGCG衍生物各浓度中的发育鸡卵的存活率的曲线图。该图中的存活率是以8个发育鸡卵全部存活的状态作为1的相对值。如该图所示，即便使流感病毒的接种浓度增加，通过增加EGCG衍生物的浓度，也可以充分地防止存活率的降低。
实施例10
确认了EGCG衍生物抑制各种病毒的感染能力的效果。
作为病毒，使用A/Beijing/262/95(H1N1)、A/Panama/2007/99(H3N2)和InfluenzaB/Yamanashi/166/98，作为EGCG衍生物，使用EGCG-C16。将前述EGCG衍生物预先添加到各种病毒中，除此之外，以同前述实施例1相同的方式确认抑制感染能力的效果。此外，作为比较例，以同样的方式确认了EGCG抑制感染能力的效果。
其结果示于图14(A)-(C)。该图(A)为A/Beijing/262/95(H1N1)引起的噬斑形成比的曲线图，该图(B)为A/Panama/2007/99(H3N2)引起的噬斑形成比的曲线图，该图(C)为InfluenzaB/Yamanashi/166/98引起的噬斑形成比的曲线图。如各图所示，对于每一种病毒，与EGCG相比较，EGCG-C16均表现出噬斑形成的显著减少。由此可知，本发明的EGCG衍生物对各种病毒均表现出出色的效果。
实施例11
使预先添加有EGCG衍生物的病毒感染细胞，并确认了病毒蛋白质血凝素(HA)和基质蛋白(MI)是否表达。
将EGCG-C16以使其达规定浓度(20nmol/L)的方式溶解于OptiMEM(0.2％DMSO)中，再添加流感病毒(A/PR8/34/H1N1)，配制样本溶液。将此样本溶液在室温下孵育30分钟。另一方面，将犬肾培养细胞(MDCK)在装有培养液的6孔培养板中培养到汇合(约8小时)。从前述培养板中除去培养液，并将培养的细胞层用D-PBS洗涤，之后以使流感病毒的MOI＝0.15的方式加入前述孵育后的样本溶液。接着，在室温下孵育1小时，之后使含有6.0×10-4％胰蛋白酶和0.2％BSA的0.8％琼脂糖凝胶于前述细胞层上重叠。在CO2存在下，再于37℃孵育规定时间(6、8、10小时)。将规定时间培养的细胞用甲醇固定，并用一抗和二抗进行HA和MI的检测。作为前述一抗，使用抗HA抗体(制品名：小鼠抗甲流血凝素(Mouse Anti-influenza A hemagglutinine)，Abcam社制，稀释比1∶1000，稀释液：2％乳，溶于PBS-tween)或抗MI抗体(制品名：小鼠抗甲流基质蛋白(Mouse Anti-influenza A matrix)，AbD社制，稀释比1∶1000，稀释液：2％乳，溶于PBS-tween)，作为二抗，使用德克萨斯红标记抗体(制品名：Anti-IgG Mouse-Goat Texas Red：Funakoshi社制，稀释比1∶1000，稀释液：2％乳，溶于PBS-tween)。另外，作为阴性对照，向前述培养细胞中添加没有添加EGCG衍生物的OptiMEM(0.2％DMSO)，来替代前述含有EGCG-16的样本溶液，并以同样的方式进行HA和MI的检测。
其结果示于图15和图16。图15为示出培养细胞中的HA表达的照片，图16为示出培养细胞中的MI表达的照片。前述两幅图中的上一行为阴性对照的结果，下一行为添加EGCG-C16的结果，“h”表示孵育时间。如前述两幅图的上一行所示，确认了在没有添加EGCG衍生物的情况下，通过培养8小时以上，HA和MI有表达。与此相对，如前述两幅图的下一行所示，通过将EGCG衍生物预先添加到病毒中，即便通过培养10小时以上，HA和MI也被确认没有表达。由这些结果可知，通过EGCG衍生物，细胞内病毒来源的HA和MI的表达被抑制。这样，利用EGCG衍生物，能够抑制病毒蛋白质在感染细胞内增殖的前面阶段。另外，由于会抑制病毒蛋白质在感染细胞内增殖的前面阶段，因此，很显然，通过联合使用现有的M2抑制剂以及扎那米韦(注册商标Relenza)和奥塞米韦(磷酸奥塞米韦；注册商标Tamiflu)等NA抑制剂，能够在两个阶段进行阻断。另外，对于对M2抑制剂、NA抑制剂有耐性的病毒而言，显然也有效。
产业上利用的可能性
根据本发明，可以在病毒增殖周期的感染阶段中抑制包有病毒的吞噬体的膜(细胞来源)与病毒包膜(病毒的膜)之间的膜融合。这样，由于膜融合自身被抑制，因此可以阻断下游的阶段，即脱壳和复制自身。此外，由于是以不同于现有抗病毒剂所针对的阶段作为靶标，因此，通过本发明的膜融合抑制剂，还能够抑制例如用现有的M2抑制剂、NA抑制剂不能阻断的病毒感染。再者，在本发明中，EGCG衍生物的基本骨架EGCG为例如茶等中所含有的儿茶素，其安全性出色充分为人所知。另外，R1-R6的酰基也是安全性出色的物质。因此，可以认为，本发明的膜融合抑制剂还是安全性更为出色的药剂。

Claims (9)

1.流感病毒的膜融合抑制剂，为一种混合物，其含有以下物质作为以下述化学式(1)表示的表没食子儿茶素没食子酸酯衍生物或它们的盐：
化学式(1)中，R1为亚油酰基或亚麻酰基且R1-R16中除上述具体定义的R1之外的其他基团各自为氢原子的下述化学式(1)表示的表没食子儿茶素没食子酸酯衍生物或它们的盐，
化学式(1)中，R2为亚油酰基或亚麻酰基且R1-R16中除上述具体定义的R2之外的其他基团各自为氢原子的下述化学式(1)表示的表没食子儿茶素没食子酸酯衍生物或它们的盐，
化学式(1)中，R5为亚油酰基或亚麻酰基且R1-R16中除上述具体定义的R5之外的其他基团各自为氢原子的下述化学式(1)表示的表没食子儿茶素没食子酸酯衍生物或它们的盐，和
化学式(1)中，R6为亚油酰基或亚麻酰基且R1-R16中除上述具体定义的R6之外的其他基团各自为氢原子的下述化学式(1)表示的表没食子儿茶素没食子酸酯衍生物或它们的盐，
【化1】
Figure FDA0000400574480000011
2.一种抑制流感病毒的膜融合的膜融合抑制剂，其特征在于，其含有以下物质的混合物作为表没食子儿茶素没食子酸酯衍生物或它们的盐
化学式(1)中，R1为亚油酰基或亚麻酰基且R1-R16中除上述具体定义的R1之外的其他基团各自为氢原子的下述化学式(1)表示的表没食子儿茶素没食子酸酯衍生物或它们的盐，
化学式(1)中，R2为亚油酰基或亚麻酰基且R1-R16中除上述具体定义的R2之外的其他基团各自为氢原子的下述化学式(1)表示的表没食子儿茶素没食子酸酯衍生物或它们的盐，
化学式(1)中，R5为亚油酰基或亚麻酰基且R1-R16中除上述具体定义的R5之外的其他基团各自为氢原子的下述化学式(1)表示的表没食子儿茶素没食子酸酯衍生物或它们的盐，和
化学式(1)中，R6为亚油酰基或亚麻酰基且R1-R16中除上述具体定义的R6之外的其他基团各自为氢原子的下述化学式(1)表示的表没食子儿茶素没食子酸酯衍生物或它们的盐，
【化1】
Figure FDA0000400574480000021
3.权利要求2记载的膜融合抑制剂，其中所述膜融合抑制剂为针对选自神经氨酸酶缺陷病毒、神经氨酸酶抑制剂耐性病毒、M2缺陷病毒和M2抑制剂耐性病毒的至少一种病毒的膜融合抑制剂。
4.一种抑制流感病毒蛋白质表达的表达抑制剂，含有权利要求2记载的膜融合抑制剂。
5.权利要求4记载的表达抑制剂，其中所述蛋白质为血凝素蛋白质和基质蛋白中的至少一种。
6.一种抗病毒剂，含有权利要求2记载的膜融合抑制剂。
7.权利要求6记载的抗病毒剂，其中还含有神经氨酸酶抑制剂和M2抑制剂中的至少一种。
8.权利要求6记载的抗病毒剂，其中所述抗病毒剂是针对选自神经氨酸酶缺陷病毒、神经氨酸酶抑制剂耐性病毒、M2缺陷病毒和M2抑制剂耐性病毒中的至少一种病毒的抗病毒剂。
9.权利要求2记载的膜融合抑制剂的用途，用于制造防止病毒感染的药物。
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Wai Har Lam等."A potential prodrug for a green tea polyphenol proteasome inhibitor: evaluation of the peracetate ester of (-)-epigallocatechin gallate [(-)-EGCG]".《Bioorganic &amp *

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