CN101928670A - 一种抗生素的高产菌株及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗生素的高产菌株及其制备方法和用途。所述的高产菌株是属于Glarea lozoyensis的诱变菌株,以CGMCC 2933的保藏编号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。通过下述步骤制备得到:(a)将保藏号为ATCC20957的种子液和亚硝基胍混合,得到混合液a;(b)将混合液a和破壁酶混合,得到原生质体;(c)原生质体再生,得到单菌落;和(d)培养单菌落,得到诱变菌株。所得菌株遗传稳定性好,产量性状稳定,发酵生产的杂质少,适合于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及抗生素制备领域,尤其涉及一种抗生素的高产菌株及其制备方法和用途。
背景技术
在过去的几十年时间里,严重危害人类健康的真菌感染,无论是其发生频率还是感染种类都在不断增加,特别是在免疫抑制患者中。而在这段时间里,临床上应用比较多的两性霉素和咪唑类以及***类抗真菌药物也因其神经毒性大和耐药性等原因在临床实施上有一定的局限性。新型抗真菌药物——棘白霉素类抗生素是20世纪70年代发现的一组天然产物,具有类似的环状多肽核心和不同的脂肪酸侧链的结构特征,能竞争性地抑制真菌细胞壁的β-D-葡聚糖的合成。棘白霉素类药物优点为毒性低、杀菌活性强并且具有优良的药物动力学性质。
棘白菌素家族包括棘白菌素类、西洛芬净、纽莫康定类、棘孢曲菌素类、牡仑康定以及WF11899A等成员。其中echincandins和pneumocandin类药物是研究的最为深入并且已经得到临床应用的两类抗真菌药物。
Caspofungin属pneumocandin的一种水溶性半合成衍生物,由Merck公司开发作为一种广谱的抗真菌/抗肺囊虫药物。在II期临床对照实验中发现,患有侵染性肺部曲霉病的免疫抑制患者,在使用两性霉素B和氮唑类药物无明显效果的情况下使用caspofungin(静脉注射50-70mg/d)取得良好的疗效。在128例感染HIV的患者中,caspofungin用于念珠菌食管炎的有效率达到了85%,而两性霉素B只有66.7%。这类药物可以有效地用于杀灭对氮唑类和两性霉素B产生抗性的真菌。没有溶血毒性以及较少的药物相互作用也使得这类药物比传统的抗真菌药物具有更大的优势。
Pneumocandin是由Glarea lozoyensis产生的一类天然抗真菌药物,按照其结构中脯氨酸上取代基的不同主要分为三大类:A0(3-羟基-4-甲基脯氨酸)、B0(3-羟基脯氨酸)和C0(4-羟基脯氨酸),此外,根据环状多肽上取代基的不同,pneumocandin A0又可以分为A0,A1,A2,A3,A4,A5六小类,B0又可以分为B0,B1,B2,B3,B4,B5六小类。其中A0,A1,A3,A4,和B0五种成分是由野生型菌株ATCC20868产生的,但主要产物为A0。ATCC20868经NMU诱变处理之后得到一株能够同时产A0和B0的突变株ATCC20957,ATCC20957生产菌B0生产能力较低并且杂质A0含量偏高。
因此,本领域迫切需要提供一株B0产量较高且杂质A0含量降低的更符合工业化生产的遗传性状稳定、高产的菌株。
发明内容
本发明旨在提供一种ATCC20957的突变新菌株。
本发明的另一个目的是提供所述新菌株的制备方法。
本发明的再一个目的是提供所述新菌株的用途。
本发明的第四个目的是提供通过所述新菌株得到式I化合物的制备方法。
在本发明的第一方面,提供了一种Glarea lozoyensis的诱变菌株,以CGMCC 2933的保藏编号2009年3月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
在本发明的第二方面,提供了一种如上所述的诱变菌株的制备方法,所述的方法包括步骤:
(a)将保藏号为ATCC20957的Glarea lozoyensis的种子液和亚硝基胍混合,得到混合液a;
(b)将混合液a和破壁酶混合,得到原生质体;
(c)原生质体再生,得到单菌落;和
(d)培养单菌落,得到如上所述的诱变菌株。
在另一优选例中,步骤(a)中,以混合液a的总体积计,亚硝基胍的浓度为10-20μg/ml;步骤(b)中,以混合液a和破壁酶混合后的总体积计,破壁酶的浓度为10-50mg/ml。
在另一优选例中,所述破壁酶中含有下述的一种或一种以上物质:溶壁酶、蜗牛酶、纤维素酶。
在另一优选例中,各单一酶浓度范围在10-40mg/ml。
在另一优选例中,步骤(a)中的种子液中的菌丝处于种子生长的对数生长期。
在另一优选例中,步骤(a)中,以所述种子液总体积计,其中细胞干重为5-10g/L。
在本发明的第三方面,提供了一种如上所述的诱变菌株的用途,用于制备如式I所示的化合物;
在本发明的第四方面,提供了一种如式I所示的化合物的制备方法,所述的方法包括步骤:
(1)15-35℃下,在发酵培养基培养如上所述的诱变菌株得到如式I所示的化合物。
在另一优选例中,以发酵培养基总体积计,所述发酵培养基中含有以下组分:L-脯氨酸15-50g/l,谷氨酸钠6-20g/l,酵母提取物6-20g/l,果糖4-20g/L,无机盐1.5-7g/L,微量元素10-50g/L。
在另一优选例中,所述无机盐选自下述的一种或其混合:磷酸盐、硫酸盐。
在另一优选例中,培养时,所述发酵培养基中还含有甘露醇10-100g/L。
在另一优选例中,以发酵培养基总体积计,如上所述的诱变菌株的接种量为4-10v/v%。
在另一优选例中,所述发酵培养基的初始pH5.3-6.0。
据此,本发明提供了一株B0产量较高且杂质A0含量降低的更符合工业化生产的遗传性状稳定、高产的菌株。
附图说明
图1显示了本发明提供的新菌株CGMCC 2933的实验流程图。
图2显示了Pneumocandin类药物的结构,其中Pneumocandin B0就是本发明的式I化合物。
具体实施方式
发明人意外地发现,菌株Glarea lozoyensis ATCC20957经过亚硝基胍(NTG)的诱变,再利用溶壁酶得到原生质体后,通过对再生的原生质体进行筛选可以得到高产突变株(保藏编号CGMCC 2933),该突变株经过发酵可以得到高产量的式I化合物。在此基础上,完成了本发明。
新菌株
本发明提供一种生产式I化合物的新菌株,该菌株分类学上属于Glarealozoyensis,已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC 2933。
新菌株的制备方法
本发明提供提供一种保藏号为CGMCC 2933的新菌株的制备方法,所述的方法如下所示的流程进行:
出发菌株→种子液→NTG诱变处理→溶壁酶去壁制取原生质体→稀释涂布平皿→挑取单菌落传种斜面→摇瓶初筛→挑出高产菌株→传种斜面→摇瓶复筛→挑出高产菌株罐上验证并且进行稳定性试验→保藏菌种
具体地,本发明提供的方法包括步骤:
(a)将保藏号为ATCC20957的Glarea lozoyensis的种子液和亚硝基胍混合,得到混合液a;
(b)将混合液a和破壁酶混合,得到原生质体;
(c)原生质体再生,得到单菌落;和
(d)培养单菌落,得到新菌株。
在本发明的一个实施例中,新菌株可以通过以下途径得到:摇瓶培养1-3天后的ATCC20957种子液(细胞干重,DCW 5-10g/l)中加入适量NTG,继续培养1-2天后将种子液离心、洗涤,沉淀悬浮后利用溶壁酶进行细胞破壁得到原生质体。稀释后的原生质体涂布于高渗PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)平板进行培养得到重组细胞单菌落。对上述单菌落进行筛选,得到诱变新菌株。
进一步地,本发明还提供了将诱变得到的新菌株发酵得到式I化合物的方法。
在本发明的一个实施例中,诱变得到新菌株及新菌株发酵得到式I化合物的方法为:
(1)出发菌株:Glarea lozoyensis ATCC20957
(2)出发菌株种子培养
将保藏的ATCC 20957菌株甘油管融化后接种于种子培养基中(装液量50mL/250mL),25-30℃、200-300rpm摇床振荡培养1-3天,至菌丝干重达到5-10g/L 左右。
种子培养基组分为:蔗糖10-20g/L,酵母提取物4-10g/L,大豆蛋白胨10-20g/L,KH2PO4 1.5-2g/L,MgSO4·7H2O 0.4-1g/L,微量元素10-50g/L,初始pH值为5.3-6.0。121℃灭菌20分钟。
微量元素:FeSO4·7H2O 10-20g/L,MnSO4·H2O 10-20g/L,ZnSO4·7H2O2-10g/L,CaCl2 0.7-2.0g/L,H3BO3 0.56-2.0g/L,CuCl2·2H2O 0.25-2.0g/L,(NH4)6Mo7O24·7H2O 0.19-2.0g/L,浓盐酸500ml/L。
(3)单菌落分离
出发菌株种子液先经过NTG诱变处理,再经过溶壁酶破壁处理,所得原生质体再生获得突变菌株。
(4)诱变菌株筛选
原生质体涂布于高渗PDA培养基,培养10-12天后的单菌落接种于斜面培 养基进行培养。8-10天后挖块接种于种子培养基(装液量25mL/250mL),25-30℃、280rpm摇床振荡培养6-10天。种子培养基接种到发酵培养基(装液量25mL/250mL)中,25-30℃、200-300rpm摇床振荡培养6-12天。培养结束后用甲醇萃取发酵液,高效液相色谱测定发酵液中式I化合物含量。
其中所涉及各培养基组成可参见文献Pneumocandins from Zalerionarboricola,Journal of antibiotics,Vol 45,No.12,Dec 1992,1867-1874.
高渗PDA平板培养基:马铃薯300g/L,葡萄糖20g/L,琼脂15g/L,蔗糖273.6g/L,121℃灭菌20分钟。
采用高效液相色谱法测定发酵液中式I化合物的含量:
色谱柱:Phenomex C18(4.6mm×250mm,5μm),
流动相:乙腈∶水=50∶50,
柱温35℃,
等梯度洗脱,流速为1.0mL/分钟,
进样量5μL,检测波长210nm。
(5)诱变菌株发酵
相关技术方案在文献中有报道,详见Biotechnology andBioengineering,Vol 78,No.3,May 5 2002以及Journal of industrialmicrobiology,11(1993),95-103。
本发明提到的上述特征,或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用,说明书中所揭示的各个特征,可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明,所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
本发明的主要优点在于:
1、获得了一株高产且遗传性状稳定的诱变新菌株。
2、由于新菌株遗传稳定性好,且产生的杂质较少,有利于式I化合物生产中产物分离纯化,和工艺放大,因此适合工业化生产。
3、在优化条件下发酵生产式I化合物,产量可达到5g/L。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。
本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的,例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。
除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明实施例中发酵液中式I化合物的含量的高效液相色谱法测定方法:
色谱柱:Phenomex C18(4.6mm×250mm,5μm),
流动相:乙腈∶水=50∶50,
柱温35℃,
等梯度洗脱,流速为1.0mL/分钟,
进样量5μL,检测波长210nm。
实施例1
诱变得到新菌株CGMCC 2933
1.诱变
将保藏的ATCC 20957菌株甘油管融化后以4%的接种量接种于种子培养基中(装液量50mL/250mL),25℃、280rpm摇床振荡培养2天,至菌丝干重达到5-10左右。在种子液中以10μg/mL的浓度加入诱变剂NTG,继续培养1天。培养1天后,取含NTG的种子液10mL,5000rpm离心10分钟,所得沉淀用两倍体积的0.6M的NaCl洗涤两次以除去培养基和NTG。
种子培养基:蔗糖10g/L,酵母提取物5g/L,大豆蛋白胨10g/L,KH2PO41.5g/L,MgSO4·7H2O 0.4g/L,微量元素10g/L,初始pH值为5.3。121℃灭菌20分钟。
微量元素:FeSO4·7H2O 10g/L,MnSO4·H2O 10g/L,ZnSO4·7H2O 2g/L,CaCl2 0.7g/L,H3BO3 0.56g/L,CuCl2·2H2O 0.25g/L,(NH4)6Mo7O24·7H2O0.19g/L,浓盐酸500ml/L。
2.原生质体制备及单菌落分离
洗后菌丝加入含有20mg/mL的溶壁酶(2000单位/mg),10mg/ml蜗牛酶(5单位/mg)和10mg/ml纤维素酶(15单位/mg)的酶混合液(0.5MNaCl磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液溶解(pH6.0))10mL,30℃下80rpm震荡酶解5h。用棉花过滤酶解后的反应液以除去菌丝得到只含有原生质体的单细胞悬浮液。取1mL此溶液14000rpm离心10分钟,沉淀用1mL的含0.5MNaCl磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH6.0)溶解。将此液稀释成不同倍数均匀涂布于含0.8M蔗糖的高渗PDA培养基25℃培养8-10天以获得单菌落。
3.高产菌株CGMCC 2933的筛选过程
挑选培养10天后的单菌落接种于斜面培养基进行培养。8天后挑取0.5-1cm2面积的菌落接种于种子培养基(装液量25mL/250mL),25℃、280rpm摇床振荡培养8天。种子培养基按4%接种量接种到发酵培养基(装液量25mL/250mL)中,25℃、280rpm摇床振荡培养14天(培养至7天时补加5%甘露醇、0.5%脯氨酸)。
实施例2
新菌株CGMCC 2933生产式I化合物
将种子培养基按4%接种量将实施例1得到的新菌株CGMCC 2933接种到发酵培养基中,培养在摇瓶中进行,培养温度25℃。培养14天后,式I化合物的产量达到5g/L(培养至7天时补加5%甘露醇、0.5%脯氨酸)。
发酵培养基:L-脯氨酸15g/L,谷氨酸钠6g/L,酵母提取物(购自Oxiod公司)6g/L,果糖4g/L,KH2PO4 1.5g/L,MgSO4·7H2O 0.4g/L,甘露醇50g/L,微量元素10ml/L,初始pH值为5.3。121℃灭菌20分钟。
微量元素:FeSO4·7H2O 10g/L,MnSO4·H2O 10g/L,ZnSO4·7H2O 2g/L,CaCl2 0.7g/L,H3BO3 0.56g/L,CuCl2·2H2O 0.25g/L,(NH4)6Mo7O24·7H2O 0.19g/L,浓盐酸500ml/L。
对比例
用以下方法比较出发菌株ATCC 20957与突变株CGMCC 2933产式I化合物的能力:
用实施例2的培养方法分别培养出发菌株和突变株,培养结束后用两倍体积的甲醇萃取发酵液,高效液相色谱测定发酵液中式I化合物含量。结果见表 1。
表1
菌种编号 | 式I化合物产量(g·L-1) |
ATCC20957 CGMCC 2933 | 1.1 5.2 |
其中所涉及各培养基组成如下:
筛选培养基:马铃薯300g/L,葡萄糖20g/L,琼脂15g/L,蔗糖273.6g/L,121℃灭菌20分钟。
斜面培养基:马铃薯300g/L,葡萄糖20g/L,琼脂15g/L,121℃灭菌20分钟。
种子培养基:蔗糖10g/L,酵母提取物5g/L,大豆蛋白胨10g/L,KH2PO41.5g/L,MgSO4·7H2O 0.4g/L,微量元素10g/L,初始pH值为5.3。121℃灭菌20分钟。
发酵培养基:L-脯氨酸15g/L,谷氨酸钠6g/L,酵母提取物(购自Oxiod公司)6g/L,果糖4g/L,KH2PO4 1.5g/L,MgSO4·7H2O 0.4g/L,甘露醇50g/L,微量元素10ml/L,初始pH值为5.3。121℃灭菌20分钟。
微量元素:FeSO4·7H2O 10g/L,MnSO4·H2O 10g/L,ZnSO4·7H2O 2g/L,CaCl2 0.7g/L,H3BO3 0.56g/L,CuCl2·2H2O 0.25g/L,(NH4)6Mo7O24·7H2O 0.19g/L,浓盐酸500ml/L。
实施例3
新菌株CGMCC 2933稳定性
采用如实施例2的培养方式及培养基组成,进行传代培养。结果见表3
表3 新菌种传代稳定性
传代次数 | F1 | F2 | F6 |
式I化合物产量(g/L) | 5.2 | 5.0 | 5.3 |
结果表明,新菌株稳定性好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并非用以限定本发明的实质技术 内容范围,本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中,任何他人完成的技术实体或方法,若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同,也或是一种等效的变更,均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。
Claims (12)
1.一种Glarea lozoyensis的诱变菌株,以CGMCC 2933的保藏编号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.一种如权利要求1所述的诱变菌株的制备方法,其特征在于,所述的方法包括步骤:
(a)将保藏号为ATCC20957的Glarea lozoyensis的种子液和亚硝基胍混合,得到混合液a;
(b)将混合液a和破壁酶混合,得到原生质体;
(c)原生质体再生,得到单菌落;和
(d)培养单菌落,得到如权利要求1所述的诱变菌株。
3.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤(a)中,以混合液a的总体积计,亚硝基胍的浓度为10-20μg/ml;步骤(b)中,以混合液a和破壁酶混合后的总体积计,破壁酶的浓度为10-50mg/ml。
4.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述破壁酶中含有下述的一种或一种以上物质:溶壁酶、蜗牛酶、纤维素酶。
5.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤(a)中,以所述种子液总体积计,其中细胞干重为5-10g/L。
7.一种如式I所示的化合物的制备方法,其特征在于,所述的方法包括步骤:
(1)15-35℃下,在发酵培养基培养如权利要求1所述的诱变菌株得到如式I所示的化合物。
8.如权利要求7所述的制备方法,其特征在于,以发酵培养基总体积计,所述发酵培养基中含有以下组分:L-脯氨酸15-50g/l,谷氨酸钠6-20g/l,酵母提取物6-20g/l,果糖4-20g/L,无机盐1.5-7g/L,微量元素10-50g/L。
9.如权利要求7所述的制备方法,其特征在于,所述无机盐选自下述的一种或其混合:磷酸盐、硫酸盐。
10.如权利要求7所述的制备方法,其特征在于,培养时,所述发酵培养基中还含有甘露醇10-100g/L。
11.如权利要求7所述的制备方法,其特征在于,以发酵培养基总体积计,如权利要求1所述的诱变菌株的接种量为4-10v/v%。
12.如权利要求7所述的制备方法,其特征在于,所述发酵培养基的初始pH5.3-6.0。
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