CN101928666A - 一种流式电穿孔装置及*** - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种流式电穿孔装置及***，该***包括：流式电穿孔装置，其中包括：基板，以及制作在基板上的电极，所述的电极，是平行并成对放置的，每对电极包括相对设置的阳极和阴极；置于电极之上的限制流体流动的通道；所述通道起始端具有多个入口分支通道，并汇聚成一条主通道，结束端具有多个出口分支通道，所述通道上方设置具有多个流体入口及出口的顶盖；注射泵，由管道连接到所述流式电穿孔装置中顶盖的入口及出口控制流体的流速；电压源，由电连接件连接电极设定并产生脉冲电压。流式电穿孔***利用流体通道以及相连接的注射泵来实现各种悬浮液在流体通道中的连续流动，从而使细胞被电穿孔的过程能够持续进行，实现快速处理大量样品。

Description

一种流式电穿孔装置及***

技术领域

本发明涉及一种流式电穿孔装置，更具体而言，本发明涉及一种高效地利用流式电穿孔装置对细胞进行电穿孔的***。

背景技术

细胞膜是包围在细胞外周的一层薄膜，是细胞与外界进行选择性物质交换的通透性屏障。细胞膜使细胞成为一个独立的生命单位，并拥有一个相对稳定的内环境。周围环境中的一些物质可以通过细胞膜，其它的物质则不行。细胞可以通过细胞膜从周围环境摄取养料，排出代谢产物，使物质的转运达到平衡状态。所以，细胞膜的基本功能就是维持细胞内微环境的相对稳定并有选择地与外界环境进行物质交换。

研究发现，如果对细胞施加一定强度的电刺激并持续一段时间，就可以诱导细胞膜上产生一些微孔，使细胞的通透性增强，所谓细胞电穿孔(Electroporation)就是指细胞在外加脉冲电场的作用下，细胞膜脂双层上形成瞬时微孔的生物物理过程(Waver J.C.“Electroporation：A dramatic，nothermal electric field phenomenon”1992)。当细胞膜发生电穿孔时，其通透性和膜电导会瞬时增大，使亲水分子、DNA、蛋白质、病毒颗粒、药物颗粒等正常情况下不能通过细胞膜的分子得以进入细胞。在短时间内撤除电刺激后，细胞膜可以自我恢复，重新成为选择性通透屏障。与传统的化学穿孔和病毒穿孔相比，由于电穿孔具有无化学污染、不会对细胞造成永久性损伤、效率较高等优点，在生物物理学、分子生物学、临床医学等领域有着广阔的应用前景。

虽然电穿孔作用的机理并不完全清楚，但在本文中细胞电穿孔是公知的，包括细胞膜脂双层的破裂，导致在膜上形成暂时性的微孔，允许外源性分子通过扩散进入细胞。

现有技术中，主要有三类方法来完成细胞电穿孔的过程：

1将细胞放置于一对相距数毫米至数厘米的平行电极之间。使细胞在电极之间的电场中受到电刺激，以实现电穿孔的目的。(例如，美国专利U.S.Pat.5389069)

2使用微型针状电极扎入组织或细胞中对细胞进行电击，达到电穿孔的目的。(例如，美国专利U.S.Pat.5389069；中国专利申请，公开号CN 101020892A)

3将一个腔室放置在一对平行电极之间，使得细胞的悬浮溶液在腔室中流动的同时受到电击。

(例如，美国专利U.S.Pat.6773669；中国专利申请，公开号：CN 1195997A)在现有技术中公开的电穿孔设备及方法大部分不适用于处理大量的样品，也不适用于连续处理样品。也就是说，现有技术中得到的电穿孔室均是“静态”工作的，即：在电穿孔室处理完一批样品以后，需要对电穿孔室进行清洗、重新加入细胞等处理，才能继续下一批样品处理。在公开的技术中，电穿孔常常是在一次性单室试管中进行的，其用于电穿孔的最大容量通常为1毫升。在需要处理大量样品的场合中，这种技术冗长乏味，劳动强度大。研究人员在此基础上，发明了多个电穿孔腔并联的形式，这种技术有其优点，但却不能根本解决难以实现快速处理大量样品的困难。

在需要电穿孔处理大量样品时，也可采用一种半连续流式***(Flow through system)(例如，美国专利U.S.Pat.5676646)，在此***中，需要电穿孔的样品被注入电穿孔室，并且施加电脉冲穿孔。然后，将该电穿孔室抽空并根据需要重新注入多次以对大量细胞进行电穿孔。在这种***中，由于电极之间的距离通常在10毫米左右，远远大于细胞的典型尺度(10微米)，所以难以精确控制实际施加在细胞上的电场。同时，在两个平板电极产生的电场中，电场E＝V/D(V为施加在两极板之间的电压，D为两极板之间的距离)，在极板之间的距离D较大(10毫米)的传统流式电穿孔***中，需要的电压通常高达数千伏特。这给设计供电***增加了难度，也不利于节能环保。同时，这种***并不是完全连续工作的，需要对电穿孔室进行加注-电穿孔-抽空-再加注-电穿孔的操作。这种工作方式减低了效率，不能实现真正的高通量操作。

通过在小型流体通道的内部放置精密加工的电极，可以实现对电场分布的精确控制，从而实现相对较高的穿孔效率和处理速度。然而，在此类***中，电极直接和细胞悬浮液接触，在对细胞进行电穿孔的过程中，不可避免地会发生水的电解现象。伴随水的电解产生的是大量的热量、气泡以及细胞悬浮液PH值的剧烈改变，以上这些现象会显著降低细胞的存活率并破坏流道中电场的均匀性从而降低细胞的穿孔效率。

流体动力学聚焦(Hydrodynamic Focusing)技术是目前在流式细胞仪(Flow Cytometer)等设备中广泛应用的一种多层流体控制技术。根据流体动力学原理，在小型流体通道等典型的低雷诺数(Reynolds Number)状态下，流体呈现层流状态，并不会相互混合(J.B.Knight，“Hydrodynamic Focusing on a Silicon Chip：Mixing Nano liters in Microseconds”，1998)。利用该原理，可以通过设计具有多个入口通道并汇聚成一条主通道的小型流体通道，将不同的流体通过不同的流道注入，从而控制任意一层流体的厚度。虽然流体动力学聚焦的效果和实现方法随流体通道设计的不同而不同，但在本文中流体动力学聚焦技术是公知的，包括小型流体通道中的低雷诺数流体、具有多个流体入口的小型流体通道、可控的流体分层厚度。

发明内容

本发明克服了上述现有技术中的不足，本发明的目的之一是提供了一种电穿孔装置，该装置具有基于流体动力学聚焦技术设计的小型流体通道以及放置在该通道中的电极；本发明的另一目的是提供一套完整的流式电穿孔***。

为了达到上述的第一个目的，本发明所提供的流式电穿孔装置的技术方案概述如下：

一种流式电穿孔装置，包括：

基板，以及制作在基板上的电极，所述的电极，是平行并成对放置的，每对电极包括相对设置的阳极和阴极；

置于电极之上的限制流体流动的通道；所述通道起始端具有多个入口分支通道，并汇聚成一条主通道，结束端具有多个出口分支通道，所述通道上方设置具有多个流体入口及出口的顶盖。

所述通道由绝缘材料制成。

所述的绝缘材料为玻璃或者硅。

所述的通道由PDMS或者有机聚合物制成。

所述的通道宽度为5微米至10毫米。

所述的通道在起始端具有1至10个入口分支通道，在结束端具有1至10个出口分支通道。

所述的基板，由绝缘材料或导电材料覆盖表面绝缘材料制成。

所述的绝缘材料为玻璃或者硅或者塑料。

所述的电极，由导电材料制成。

所述的导电材料为金。

所述的电极，平行于流体通道成对放置。

所述的顶盖，由绝缘材料或导电材料覆盖表面绝缘材料制成。

所述的绝缘材料为玻璃或者硅或者塑料。

为了达到上述的第二个目的，本发明所提供的流式电穿孔***的技术方案概述如下：

一种流式电穿孔***，包括：

流式电穿孔装置，其中包括：

基板，以及制作在基板上的电极，所述的电极，是平行并成对放置的，每对电极包括相对设置的阳极和阴极；

置于电极之上的限制流体流动的通道；所述通道起始端具有多个入口分支通道，并汇聚成一条主通道，结束端具有多个出口分支通道，所述通道上方设置具有多个流体入口及出口的顶盖；

注射泵，由管道连接到所述流式电穿孔装置中顶盖的入口及出口，用于控制流体的流速；

电压源，由电连接件连接电极，用于设定并产生脉冲电压。

该电穿孔***用于对流体中的细胞进行电穿孔，所述的细胞包括动物细胞或者细菌，所述的动物细胞包括：原代细胞、传代细胞、神经细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞和肌细胞。

该电穿孔***用于对细胞进行电穿孔时，设定的脉冲电压为1～2000V，脉冲宽度0.05～20毫秒，脉冲间隔0.1～60秒，流体的流速0～10毫升/分钟。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

流式电穿孔***利用流体通道以及相连接的注射泵来实现细胞悬浮液在流体通道中的连续流动，从而使细胞被电穿孔的过程能够持续进行。这样就可以实现快速处理大量样品。同时，可以通过在一个流式电穿孔***中集成多个流式电穿孔装置的方式来成倍提高处理速度。

在采用半导体刻蚀等微细加工方法的条件下，相比于已公开的电穿孔设备及***，可以将电极的尺寸和电极之间的距离都缩小很多，同时，流体通道的尺寸也可以缩小到和电极尺寸相配合的程度。这样，就可以用相对于已公开的技术来说要小得多的电压来实现细胞电穿孔的目的。从而降低设备成本并节能。

利用流体动力学聚焦技术，本发明实现了不同液体在流体通道中的分层流动。使用导电的电穿孔缓冲液，将细胞悬浮液和电极隔开。在本发明中，细胞不直接和电极接触，从而避免了发生在电极区域的由电解水产生的有害效应(包括气泡、发热以及PH值的改变等)对细胞的伤害，大大提高了细胞的存活率。同时，通过提高电穿孔缓冲液的电导率，可以用相对较小的电压在细胞流过的区域形成电穿孔所需的电场强度

缩小的电极间距还带来了一个显著的优势，就是更高的电穿孔效率。因为细胞悬浮液是不均匀的，电极间距越小，就意味着电极之间的不均匀溶液越少，也就越容易控制电穿孔条件的一致性，达到高电穿孔效率。

平行于流道放置的电极可以在电场中产生一个均匀的电场分布，细胞全部在这个均匀的电场区域内流过，从而得到均一可控的高效细胞电穿孔。

在一些实施例中，采用玻璃或聚合物等透明材料来制作基板，此时，就可以通过显微镜来实时观察细胞在电穿孔过程中的变化。对于细胞生理学研究来说，这是显著的优势。

附图说明

图1是流式电穿孔装置的结构示意图；

图2是沿图1中AA’以及BB’的部分剖视图；

图3是流式电穿孔装置的分解视图；

图4是流体通道4的示意图；

图5是电极6的示意图；

图6是流式电穿孔***的各部分连接示意图；

图中，1-顶盖；2-流体通道入口；3-流体通道出口；4-流体通道；5-基板；6-电极；7-流体通道中的主通道；8-流体通道起始端的一个分支入口通道；9-流体通道起始端的另一个分支入口流道；10-流体通道起始端的细胞分支入口通道；11-流体通道结束端的一个分支出口通道；12-流体通道结束端的另一个分支出口通道；13-流体通道结束端的细胞分支出口通道；14-成对电极对中的一个电极；15-成对电极对中的另一个电极；16-流式电穿孔***中的一个流式电穿孔装置；17-流式电穿孔***中的另一个流式电穿孔装置；18-流式电穿孔***中的电压发生器；19-流式电穿孔***中的注射泵；20-电缆连线；21-电穿孔缓冲液入口密封管道；22-细胞悬浮液入口密封管道。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细描述：

1基板：

因为基板起到承托作用和在电极之间起绝缘隔离作用，所以基板需要由绝缘材料制成，或者由非绝缘材料覆盖绝缘层制成。根据本发明的基板可有任何适合以上条件的固体基板来制成，优选的基板是那些可以通过铸模或机器切割制成要求规格的基板。特别优选的是透明的玻璃或者聚合物，因为在这种情况下，可以通过显微镜实时观察细胞的状态。

在图2所示的优选实施例中，基板采用普通玻璃制成，长8厘米、宽2.5厘米、高1毫米。该基板的尺寸可由具体需求决定，并通过切割等方法得到所需尺寸的基板。

在其它实施例中，基板材料也可以采用硅，陶瓷或覆盖了绝缘层的金属。由于这些材料的加工技术在本领域中是公知的，因而本领域技术人员可以在本发明的实施中方便的采用这些材料。

2电极

电极可以由适当的导电材料或这些材料的复合物来制成。优选材料为生物兼容性好的材料，例如金、钛和掺有银离子的PDMS(聚二甲基硅氧烷，一种常用的聚合物)。当采用多种材料时(例如一种导电材料(例如金)镀在另一种导电材料(例如铜)上)，最外层的优选材料为生物兼容性好的材料。

在如图2所示的实施例中，电极材料为铬和金。首先在基板上溅射(这是一种半导体加工工艺中公知的沉积金属的方法)一层厚度为0.1微米的铬，再溅射一层厚度为0.5微米的金。然后对整个基板进行光刻(同样是半导体加工工艺中公知的制作图形的方法)得到需要的电极形状。接着腐蚀掉金层和铬层上不需要的部分。最终得到所需的电极。当然，电镀等本领域公知的加工金属的方法也可以用来制造电极。

本实施例采用铬和金来制作电极，是因为金没有生物毒性，而铬是为了增加金和玻璃之间的黏附性。在不同的需求下，其它的导电材料，例如铝、铜或者导电聚合物都可以用来制造电极。

如图2所示的实施例中，电极的高度为0.6微米，这是考虑到电极之上的流体通道需要和基板实现密封，在本实施例中，这种密封是通过键合(半导体加工工艺中公知的将两种物质紧密结合在一起的方法)实现的，所以，电极的高度不宜过大以妨碍密封。已经被实验确定的是：当采用键合密封时，电极高度从0.1微米到10微米都是合适的。当采用热压、粘合剂粘合等其它密封方式时，则不存在电极高度的限制，所以，电极高度可以由本领域技术人员根据不同的需求和加工方法来确定。

如图2所示的实施例中，电极的宽度为100微米，电极之间的距离为500微米，这种尺寸的电极所产生的电场是人胚胎肾细胞电穿孔条件的最优选电场。当需要对其它细胞进行电穿孔时，可以本领域技术人员自行选择合适的电极宽度和电极间距。

3流体通道

流体通道的作用是约束流体的流动，使细胞悬浮液按特定的轨迹流经电极区域，受到电场的作用，从而完成细胞电穿孔的过程。流体通道可以由任何适合加工成形的绝缘材料制成，或在非绝缘材料的表面覆盖一层绝缘层。优选的，流体通道的材料应是生物兼容性好的材料。

如图2所示的实施例中，采用PDMS(聚二甲基硅氧烷)来制作流体通道，这是一种公知的常用于生物器件领域的易于加工成型的生物兼容聚合物材料。所述PDMS流体通道是通过铸模的方法来得到，使用硅片充当模具。首先在普通半导体加工用硅片上利用光刻，腐蚀等工艺制作出相应的凹槽，然后将液态的PDMS溶液浇铸进硅片上的凹槽，待其凝固后将其脱模取出，就得到了成型的流体通道。当然，流体通道也可以采用玻璃、塑料、其它聚合物等材料并使用本领域所公知的一些加工方法进行加工，例如使用激光刻蚀玻璃形成流体通道。

如图2所示的实施例中，流体通道通过键合的方法和基板连接在一起。这是考虑到PDMS和玻璃之间极易通过键合来形成牢固的密封，而PDMS和玻璃之间的键合过程也很简单，只需要将PDMS和玻璃的表面用高压激发的氧等离子处理10秒左右(这是为了激发PDMS和玻璃表面的悬挂键)，然后施加一定的压力将其压紧。静置24小时后即形成可靠牢固的密封。对于其它不同的应用，本领域公知的连接方法也都适用，例如使用粘合剂将流体通道和基板密封连接在一起。

在图4所示中，在流体通道中设计了多个入口和出口以实现对细胞悬浮液的流体动力学聚焦。流体通道的起始端具有3个入口分支通道用于通入不同的流体，结束端具有3个出口分支通道用于不同的流体流出。所有的分支通道汇聚成一条主通道。入口分支通道的宽度分别为1.2毫米、0.6毫米、1.2毫米；出口通道的宽度分别为0.5毫米、0.2毫米、0.5毫米；主流道的宽度为1.2毫米，长度为30毫米。所有流道的高度都为80微米。和电极的尺寸设计一样，这组尺寸也是为人胚胎肾细胞电穿孔而设置的最优选条件。在其它应用中，本领域研究人员可以自行设置尺寸以满足不同的需求，比如在该方面的优选实施例中，主流体通道布置成直线形，以使细胞悬浮液的流动方向垂直于电场方向，从而使细胞受到适当时间的电刺激。根据不同细胞的要求，在另一些实施例中，主流体通道布置成多匝的线圈形，延长细胞在流道中通过的时间，以使细胞受到更长时间的电场作用。在其它的一些实施例中，主流体通道可以布置为环形，以适应细胞电泳分离等特别要求。在本文所述小型流体通道中，主流体通道宽度为5微米至10毫米都是可行的，同时，1至10个入口分支通道及1至10个出口分支通道也都是可行的。

4顶盖

顶盖的作用是通过和流体通道的密封连接来共同实现对细胞悬浮液的约束，并为通道提供入口和出口。任何绝缘材料或覆盖了绝缘材料的固体材料都可以用来制作顶盖。顶盖可以使用和流体通道相同的材料并和流体通道一起制造及同时一次成型。

如图1所示流式电穿孔装置的结构，包括：顶盖1；流体通道入口2和出口3；顶盖下方的流体通道4(该图中不可见具体流道布置)；流道下方的电极6(该图中不可见具体电极布置)；电极下方的基板5。为了更清楚地看出顶盖的结构，如图2所示剖面图，可以看出顶盖的结构，可以采用激光打过孔的玻璃来制作顶盖。与前述理由相同，这是为了利用玻璃容易切割、打孔并易于和PDMS材料制作的流体通道之间形成牢固的密封连接。在其它应用中，可以采用塑料、聚合物等易于加工的绝缘材料，也可以采用表面覆盖了绝缘材料的不锈钢等金属。如图2所示的剖面图，可以看出流体通道的结构和电极的部分结构。

整个流体电穿孔装置的各个部件及安装，如图3所示，基板5位于最底层，其上方置电极6，将流体通道4放在电极6上面，并与基板5键合在一起，流体通道4上面制作有顶盖1，并留有流体通道入口2和出口3。

流体通道的设计如图4所示，两侧的电穿孔缓冲液分支入口通道8、9和中央的细胞分支入口通道10汇聚而成主流体通道7。主流体通道分岔成为两侧的电穿孔缓冲液分支出口通道11、12和中央的细胞分支出口通道13。

电极的设置方式如图5所示，电极14和15在流体通道下方平行成对放置并引出流道外。5流式电穿孔***及实验方法

如图6所示，流式电穿孔***除了两个流式电穿孔装置16、17之外，整套***还需要一个电压源18和与之相配的电缆连线20、一台注射泵19和与之相配的密封管道21、22以实现细胞悬浮液的受控流动。所述电压源、电缆连线、注射泵及密封管道都是公开的和本领域技术人员容易获取的设备。

在如图6所示的***中，采用电压源输出为正负100伏特的电压源，而采用的注射泵可控的流速为0到10毫升每分钟。这也是为人胚胎肾细胞电穿孔而设置的最优选条件。本领域技术人员可以自行选择相似设备。根据需要，电压为1至2000伏特、脉冲宽度为0.05至20毫秒、脉冲间隔为0.4-60秒的电脉冲都是可行的。

本***中并行连接了两个流式电穿孔装置，本领域技术人员可以根据需要选择1至1000个流式电穿孔装置并行连接以实现更高的处理速度。

本电穿孔装置可以电穿孔动物细胞和细菌，优选的细胞系有：HEK293(人胚胎肾细胞)，Hela(人***细胞)，HepG2(人肝癌细胞)，Neuro-2A(小鼠脑神经瘤细胞)，Jurkat(人淋巴瘤细胞)，HL60(人原髓细胞)和MDCK(狗肾上皮细胞)；优选的原代细胞有：HUVEC(人脐静脉内皮细胞)，DRG(大鼠背要神经节细胞)，T淋巴细胞和人胚胎干细胞；优选的细菌有大肠杆菌，巴氏杆菌。本领域技术人员可以根据需要选择不同的细胞。

本电穿孔***可以通过电穿孔的方法使多种不同的高分子化合物进入细胞，包括核酸类(质粒DNA，线性DNA，小干扰RNA，反义核酸)，蛋白类(肽段，抗体)。优选的质粒是真核表达载体(pEGFP-C3)，本领域技术人员可以自行选择各种真核，原核表达载体使用。

本***可以显著提高本领域现有电穿孔技术的样品处理速度，实现高通量电穿孔。

***中的电压源可以对不同细胞给出不同波形的电压，在图6所示的***中，优选采用方波脉冲。本领域技术人员可以根据不同的细胞选择合适的电压源输出。

电穿孔实验中用到的缓冲液取自由KCl(氯化钾)，KH₂PO₄(磷酸二氢钾)，K₂HPO₄(磷酸氢二钾)，糖类和水组成的组。对于图2所示的实施例，优选的缓冲液配方为：1000毫升缓冲液中含KCl(15-50毫摩尔)，KH₂PO₄(0.1-2毫摩尔)，K₂HPO₄(0.1-2毫摩尔)，肌醇(20-60毫摩尔)。本领域技术人员可以根据电穿孔细胞的不同而调整各组分的浓度以取得最高的穿孔效率。

6具体制造步骤

由如下两套不同的制作工艺已经成功制造出了本发明所述装置及***。给出具体制作方法是为了帮助本领域技术人员理解本发明的制造方法，而并不是对本发明所述器件的材料，尺寸和制造方法做出限定。

制作方法A：

采用半导体制造工艺常用的4英寸玻璃片。在玻璃片上溅射0.1微米厚的铬金属层，再在铬金属层上溅射0.5微米厚的金层。对玻璃片进行光刻，制造出所需电极的形状，然后再使用碘化钾溶液腐蚀金层，使用硝酸铈铵溶液腐蚀铬层。然后将玻璃片按长8厘米，宽2.5厘米的形状用砂轮切割。这样就得到了基板及其上的电极。采用N型4英寸硅片，在光刻出流道的平面形状后，使用半导体常用的ICP干法刻蚀(感应等离子刻蚀，即使用六氟化硫和四氟化碳的高能等离子来刻蚀硅)出80微米深的槽。将液态PDMS倒入槽中，待其凝固后脱模取出。将其按长7.5厘米，宽2厘米的形状用刀片切割并在合适的位置打孔，这样就得到了流体通道和相应的顶盖。将玻璃基板的表面和PDMS流体通道表面用氧等离子处理后，紧贴在一起并施加压力，静置24小时，即得到流式电穿孔装置。

使用两个流式电穿孔装置，使用普通塑料管连接真空泵和两个流式电穿孔装置的流体入口，之间使用紫外固化粘合剂密封。在装置基板上外露的金电极上通过超声波焊接进行电缆的引出，将两个流式电穿孔装置引出的电缆同时连接到电压源上，即可完成整套流式电穿孔***的搭建。

制作方法B：

采用半导体制造工艺常用的4英寸N型硅片。在硅片上溅射0.1微米厚的铬金属层，再在铬金属层上电镀5微米厚的金层。对硅片进行光刻，制造出所需电极的形状，然后再使用碘化钾溶液腐蚀金层，使用硝酸铈铵溶液腐蚀铬层。然后将硅片按长8厘米，宽2.5厘米的形状用砂轮切割。这样就得到了基板及其上的电极。采用普通玻璃片，厚度1毫米，使用激光在其上按尺寸加工出流体通道。将玻璃片按长7.5厘米，宽2厘米的形状用砂轮切割，这样就得到了流体通道。采用普通聚四氟乙烯塑料，用激光打孔作为流体进口和出口。将塑料片按长7.5厘米，宽2厘米的形状用砂轮切割。用紫外固化粘合剂将硅基板、玻璃流体通道以及塑料顶盖粘合在一起，即得到流式电穿孔装置。

使用两个流式电穿孔装置，使用普通塑料管连接真空泵和两个流式电穿孔装置的流体入口，之间使用紫外固化粘合剂密封。在装置基板上外露的金电极上通过超声波焊接进行电缆的引出，将两个流式电穿孔装置引出的电缆同时连接到电压源上，即可完成整套流式电穿孔***的搭建。

7具体电穿孔方法

由如下的电穿孔方法已经对本发明所述装置和***进行了成功的电穿孔实验。给出具体电穿孔方法是为了帮助本领域技术人员理解电穿孔装置的使用方法，而并不是对本发明所述装置的适用范围做出限定。

收集处于对数生长期的HEK293(人胚胎肾细胞)，以转速800转/分钟离心5分钟，弃去上清液，用电穿孔缓冲液(每100毫升中含氯化钾15毫摩尔，磷酸二氢钾0.3毫摩尔，磷酸氢二钾0.85毫摩尔，肌醇56毫摩尔)重悬细胞，使得细胞的密度为2X10³个/微升，加入需要通过电穿孔进入细胞的质粒pEGFP-C3，使质粒的浓度为20微克/毫升，轻柔混合均匀。将混合好的细胞悬液100微升加入微量进样器中(上海高鸽牌，容量为250微升)，微量进样器通过软管连接在流式电穿孔装置流体通道中央的细胞分支入口通道上。将微量进样器安装在注射泵上，调节注射泵，使得流速为4微升/分钟。将不含有细胞的电穿孔缓冲液250微升加入另一个微量进样器中(上海高鸽牌，容量为250微升)，该微量进样器通过软管连接在流式电穿孔装置流体通道两侧的电穿孔缓冲液分支入口通道上。将该微量进样器安装在另一个注射泵上，调节注射泵，使得流速为18微升/分钟。可以在主流体通道中观察到细胞悬浮液被成功压缩为宽度约2.2毫米的一层流体，并处于稳定的层流状态下。当细胞悬液开始在通道中流动时，施加电脉冲刺激。电刺激的条件为：电压80V，脉冲宽度0.2ms，脉冲间隔2秒。

电穿孔结束后，通过软管将细胞悬浮液引入96孔板中进行培养。培养条件：温度37℃，二氧化碳浓度5％。24小时后在荧光显微镜下观察，可成功观察到90％以上的细胞有绿色荧光表达，表明电穿孔的转染效率达90％以上。此后使用PI(Propidium Iodide，碘化丙啶)对细胞进行染色，观察到少于20％的细胞呈现红色，表明细胞存活率达80％以上。

Claims (17)

1.一种流式电穿孔装置，包括：

基板，以及制作在基板上的电极，所述的电极，是平行并成对放置的，每对电极包括相对设置的阳极和阴极；

置于电极之上的限制流体流动的通道；所述通道起始端具有多个入口分支通道，并汇聚成一条主通道，结束端具有多个出口分支通道，所述通道上方设置具有多个流体入口及出口的顶盖。

2.如权利要求1所述的电穿孔装置，其特征在于，所述通道由绝缘材料制成。

3.如权利要求2所述的电穿孔装置，其特征在于，所述的绝缘材料为玻璃或者硅。

4.如权利要求1所述的电穿孔装置，其特征在于，所述的通道由PDMS或者有机聚合物制成。

5.如权利要求1所述的电穿孔装置，其特征在于，所述的通道宽度为5微米至10毫米。

6.如权利要求1所述的电穿孔装置，其特征在于，所述的通道在起始端具有1至10个入口分支通道，在结束端具有1至10个出口分支通道。

7.如权利要求1所述的电穿孔装置，其特征在于，所述的基板，由绝缘材料或导电材料覆盖表面绝缘材料制成。

8.如权利要求7所述的电穿孔装置，其特征在于，所述的绝缘材料为玻璃或者硅或者塑料。

9.如权利要求1所述的电穿孔装置，其特征在于，所述的电极，由导电材料制成。

10.如权利要求9所述的电穿孔装置，其特征在于，所述的导电材料为金。

11.如权利要求1所述的电穿孔装置，其特征在于，所述的电极，平行于流体通道成对放置。

12.如权利要求1所述的电穿孔装置，其特征在于，所述的顶盖具有1至10个入口，1至10个出口。

13.如权利要求1所述的电穿孔装置，其特征在于，所述的顶盖，由绝缘材料或导电材料覆盖表面绝缘材料制成，并可以和流体通道采用相同的材料并同时一次成型。

14.一种流式电穿孔***，其特征在于，包括：

流式电穿孔装置，包括：

基板，以及制作在基板上的电极，所述的电极，是平行并成对放置的，每对电极包括相对设置的阳极和阴极；

置于电极之上的限制流体流动的通道；所述通道起始端具有多个入口分支通道，并汇聚成一条主通道，结束端具有多个出口分支通道，所述通道上方设置具有多个流体入口及出口的顶盖。

注射泵，由管道连接到所述流式电穿孔装置中顶盖的入口及出口，用于控制流体的流速；

电压源，由电连接件连接电极，用于设定并产生脉冲电压。

15.如权利要求14所述的电穿孔***，其特征在于，该***可以并行连接1至1000流式电穿孔装置。

16.如权利要求14所述的电穿孔***，其特征在于，该电穿孔***用于对流体中的细胞进行电穿孔，所述的细胞包括动物细胞或者细菌，所述的动物细胞包括：原代细胞、传代细胞、神经细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞和肌细胞。

17.如权利要求14所述的电穿孔***，其特征在于，该电穿孔***用于对细胞进行电穿孔时，设定的脉冲电压为1～2000伏，脉冲宽度0.05～20毫秒，脉冲间隔0.1～60秒，各流体通道入口的流体流速0～10毫升/分钟。

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