CN101928325A - 一种制备天然18-α甘草酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种天然18-α甘草酸及其制备方法,其中18-α甘草酸含量为90%~99%,其制备方法主要由提取、分离、层析、结晶、重结晶工序组成。本发明的制备工艺重现性好,所得到的18-α甘草酸含量高,成本低,质量稳定可控,适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明公开了一种用于肝病治疗的天然18-α甘草酸的制备方法,属于医药领域范畴。
背景技术
甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草Glycyrrhiza in flataBat.、或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的根和根茎,主产于内蒙古、新疆、甘肃等地。甘草入药已有悠久历史,《神农本草经》就将其列为药之上乘,古代医学家尊称其为“国老”。由于其资源珍贵,被国家列入国家二级保护野生药材。甘草化学成分种类较多,主要含三萜皂苷类、黄酮类、生物碱、多糖等成分。以甘草入药开发的制剂很多,临床上得到了较广泛的应用,主要用于肝病、呼吸道疾病、胃病等方面的治疗。
甘草酸(C42H62O16)属于甘草中三萜皂苷类成分,也是甘草中起保肝、抗炎作用的主要成分。以甘草酸为中间体开发出的药用原料及制剂很多,临床主要用于肝炎的治疗,如甘草酸单铵盐、甘草酸二钾盐、异甘草酸镁等。由于甘草酸分子结构的18位碳原子是一个手性碳,因此甘草酸具有一对同分异构体,即18-α甘草酸和18-β甘草酸。构象研究表明,由于空间位阻效应,18-α甘草酸在溶解性、旋光度等理化性质以及药理活性等许多方面与18-β甘草酸都具有很大的差别。在临床使用上,以两种甘草酸异构体分为主要成分的制剂都具有广泛应用,如复方甘草酸苷片是以18-β甘草酸单铵盐为主要活性成分,而异甘草酸镁注射液是以18-α甘草酸单镁盐为主要成分。因此,通过深入研究,明确18-α甘草酸和18-β甘草酸不同作用特点,具有很好的现实意义。
根据文献报道,在天然甘草药材中,甘草酸以18-α甘草酸和18-β甘草酸两种构型同时存在,在《RP-HPLC法测定甘草中甘草酸差向异构体的含量》(沈阳药科大学学报,2008,11期)介绍了测定甘草酸中两种异构体含量的方法。本专利发明人通过研究也证明,天然甘草中同时存在两种构型的甘草酸,其中18-α甘草酸的含量较低。由于二者结构相似,分离难度大,而且在不同产地、不同来源的甘草中含量差异较大,因此,很难从天然甘草中制备18-α甘草酸。目前市场上应用较广泛的异甘草酸镁是18-α甘草酸镁盐,其制备方法是通过将甘草酸铵盐在强碱溶液中经过异构化反应制备得到的,属于非天然产物范畴,与本发明所述的制备方法有本质的差异。在其他公开和发表文献或专利中,尚未见从甘草药材中分离制备天然18-α甘草酸的报道。
发明内容
本发明的目的是从资源综合开发利用的角度出发,提供了一种从天然甘草药材中分离制备得到的天然18-α甘草酸。
本发明还提供了一种从天然甘草药材中分离制备得到天然18-α甘草酸的制备方法。
本发明的另一目的在于提供一种含有一定比例的18-α甘草酸药物组合物的制备方法,临床用于肝病的治疗。
本发明的优势在于制备天然18-α甘草酸采用的是现代中药分离纯化技术,提高了中药材资源的利用率。
本发明的优势还在于在采用分离纯化技术制备天然18-α甘草酸的过程中,由于没有进行化学反应,减少了带入反应副产物和杂质的风险,进一步提高了产品的安全性。
根据本发明的比较优选的实施方案,从甘草中分离纯化天然18-α甘草酸的制备方法包括如下步骤:
(1)取甘草药材,粉碎成粗粉,加入适量一定浓度的氨水浸泡提取一定时间,将其中的甘草酸类成分充分转化成甘草酸铵盐,过滤,药渣再加一定浓度的氨水浸泡提取数次,合并提取液,减压浓缩至一定体积,静置,放置至室温,过滤,得浓缩液。
(2)取浓缩液,在搅拌状态下向浓缩液中缓缓加入一定浓度的酸溶液适量,调节溶液至一定的PH值,放冷,进行酸沉,使18-β甘草酸充分沉淀,离心过滤,分别得到以18-β甘草酸为主要成分的固体物和以18-α甘草酸为主要成分的滤液。
(3)取滤液,过一定型号的大孔吸附树脂柱,薄层监测,上柱完成后,加水充分洗脱去除无机盐及其他大极性杂质后,改用一定浓度的乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,减压浓缩至稠膏。
(4)取稠膏,加入含有一定比例有机溶剂的水溶液适量,溶解,低温静置结晶,过滤,即得天然18-α甘草酸粗品。
(5)取18-α甘草酸粗品,加入含有一定比例有机溶剂的水溶液适量,溶解,低温静置结晶,过滤,即得天然18-α甘草酸纯品。
上述步骤(1)中所述的“一定浓度的氨水”是指浓度为0.2%~5%的氨水溶液,优选浓度为0.5%~2%,最佳浓度为0.8%;每次浸泡提取时间为3~12小时,优选为6小时;浸泡提取次数为1~3次,优选为2次。
上述步骤(2)中所述的“一定浓度的酸溶液”是指含有一定比例的有机酸或无机酸的水溶液,所用的酸可以是硫酸、盐酸、磷酸、乙酸、甲酸和草酸中的一种或几种的组合,优选为盐酸和草酸;酸溶液的浓度为0.1%~2%,优选为0.5%;调节溶液的PH值范围为PH2.5~5.0,优选为PH3.0~4.0,最佳PH点为3.6;酸沉的适宜温度为2℃~20℃,优选为5℃~15℃,最佳温度为6℃~8℃。
上述步骤(3)中所用的大孔树脂型号可为HPD-100、HPD-300、HPD-400、HPD-500、HPD-600,或D101、XDA-8。通过正交试验优选,综合上样量、吸附率、解吸速度等各方面因素,优选树脂型号为HPD-600大孔树脂。上柱完成后,用水洗净杂质,然后使用乙醇洗脱,通过对洗脱率、样品得率、样品含量的综合筛选,洗脱乙醇的浓度为70%~95%,最佳浓度为80%。根据本发明优选的技术方案,将事先处理好的大孔树脂装柱,对所用层析柱的规格和材质无特殊要求,可根据实际生产的需要选定,并按常规操作方法装填,装柱量不少于柱高的2/3,最好选用直径与柱高比在1∶5-1∶6的柱。乙醇的洗脱速度优选为1000-1500毫升/分钟。
上述步骤(4)中所用的有机溶剂可以为甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇、异丙醚、冰醋酸中的一种或几种的组合,优选为异丙醇;结晶适宜温度为-10℃~20℃,优选为-8℃~10℃,最佳温度为-4℃。
上述步骤(5)中所用的有机溶剂可以为甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇、甲酸、冰醋酸中的一种或几种的组合,优选为甲醇;结晶适宜温度为-10℃~20℃,优选为-5℃~10℃,最佳温度为2℃~5℃。
根据本发明的技术方案,可在制得的天然18-α甘草酸中加入适当的辅料制成一定形式的药物制剂,包括片剂、胶囊、滴丸、软胶囊或注射液。
本发明通过科学可行的方法从甘草中经提取、分离、纯化、结晶等一系列步骤,特别是运用18-α甘草酸和18-β甘草酸在一定PH条件下溶解度不同的原理使二者达到有效分离的这一关键步骤,制得的天然18-α甘草酸含量大于90%。
本发明运用现代中药分离纯化技术,提供了一种含量高、成分明确、质量可控的天然18-α甘草酸及其制备方法,与传统化学转化的制备工艺相比,具有资源利用率高、生产成本低、无反应副产物产生等优点。本发明的制备工艺已经通过多批生产验证,证明其重复性、稳定性都好,适合工业化生产,易于推广,具有很强的实用性。
以下通过本发明提供的天然18-α甘草酸的药理研究来进一步说明发明的实用性:
1、天然18-α甘草酸对D-半乳糖胺盐酸盐致大鼠急性肝损伤的影响
1.1试验目的
探讨天然18-α甘草酸对D-半乳糖胺盐酸盐致大鼠急性肝损伤的影响。
1.2试验材料
SD大鼠,雌雄各半,160-220g;天然18-α甘草酸,白色结晶性粉末,江苏天晟药业有限公司提供,批号:20100326。临用时称取适量用蒸馏水配成所需浓度。
主要试剂:D-半乳糖胺盐酸盐(D-GalN);ALT及AST试剂盒。
1.3方法与结果
大鼠40只,随机分成4组,每组10只。均自由取食,自由饮水,给药组分别每日灌胃给予天然18-α甘草酸10mg/kg,20mg/kg,40mg/kg,连续七天;于末次给药后1小时腹腔注射10%D-GalN生理盐水溶液0.5ml/100g体重(500mg/kg),48小时后,采血收集血清,用于ALT、AST的测定;肝脏用10%***液固定,石蜡包埋切片,HE染色,用于组织病理学检查。根据每种病变程度,记为“-”、“+”、“++”、“+++”,分别换算成0、1、2、3分,计算每组的平均积分值。ALT、AST的测定按试剂盒说明书进行。
结果表明,对照组血清ALT、AST水平明显升高,而天然18-α甘草酸中、高剂量组对血清ALT、AST均有显著的降低作用。组织病理学检查结果表明,模型组小鼠肝细胞有明显坏死,汇管区有炎细胞浸润,而天然18-α甘草酸各剂量组使肝细胞坏死明显减轻,炎细胞浸润明显减少。提示,天然18-α甘草酸对D-GalN诱导的大鼠急性肝损伤模型有明显的保护作用。
具体实施方式
以下实施例中所用甘草药材来源于新疆喀什,含量测定用甘草酸对照品由江苏天晟药业有限公司提供,生产中所用水为纯化水,其他试剂为分析纯,所用辅料为药用级。
以下实施内容是为了对权利要求的技术特征给予说明,并进一步说明本发明的实用性,不应理解为对本发明的药材来源或对本发明权利要求的限制。
实施例一:
取甘草50kg,粉碎成粗粉,加入浓度为0.5%的氨水400L浸泡提取2次,每次浸泡8小时,合并提取液,过滤,滤液于70℃减压浓缩至50L,静置,放置至室温,过滤,得浓缩液。
取浓缩液,在搅拌状态下向浓缩液中缓缓加入1%的盐酸溶液适量,调节溶液至PH4.0,放冷,离心过滤,取滤液,过型号为XDA-8大孔吸附树脂柱,上柱完成后,加水200L充分洗脱后,改用70%的乙醇100L洗脱,收集乙醇洗脱液,60℃减压浓缩至稠膏。
取稠膏,加入20%的甲醇-水溶液5000ml溶解,于5℃下静置结晶,过滤,得天然18-α甘草酸粗品650g。
取上述18-α甘草酸粗品,加入50%甲醇-水溶液2600ml,加热溶解,于-5℃下静置结晶,过滤,即得天然18-α甘草酸370g(本品经高效液相色谱法检测,含量为97.2%,紫外最大吸收波长为252.0nm)。
实施例二:
取甘草100kg,粉碎成粗粉,加入浓度为0.2%的氨水1000L浸泡提取2次,每次浸泡6小时,合并提取液,过滤,滤液于70℃减压浓缩至80L,静置,放置至室温,过滤,得浓缩液。
取浓缩液,在搅拌状态下向浓缩液中缓缓加入0.4%的草酸溶液适量,调节溶液至PH3.6,放冷,离心过滤,取滤液,过型号为HPD-600大孔吸附树脂柱,上柱完成后,加水500L充分洗脱后,改用75%的乙醇400L洗脱,收集乙醇洗脱液,65℃减压浓缩至稠膏。
取稠膏,加入35%的异丙醇-水溶液8000ml溶解,于2℃下静置结晶,过滤,得天然18-α甘草酸粗品950g。
取上述18-α甘草酸粗品,加入50%丙酮-水溶液2600ml,加热溶解,于-4℃下静置结晶,过滤,即得天然18-α甘草酸470g(本品经高效液相色谱法检测,含量为99.1%,紫外最大吸收波长为252.0nm)。
实施例三:
取甘草100kg,粉碎成粗粉,加入浓度为2%的氨水600L浸泡提取3次,每次浸泡12小时,合并提取液,过滤,滤液于75℃减压浓缩至120L,静置,放置至室温,过滤,得浓缩液。
取浓缩液,在搅拌状态下向浓缩液中缓缓加入0.4%的甲酸溶液适量,调节溶液至PH3.0,放冷,离心过滤,取滤液,过型号为HPD-100大孔吸附树脂柱,上柱完成后,加水400L充分洗脱后,改用80%的乙醇500L洗脱,收集乙醇洗脱液,65℃减压浓缩至稠膏。
取稠膏,加入35%的乙醇-水溶液6000ml溶解,于4℃下静置结晶,过滤,得天然18-α甘草酸粗品1100g。
取上述18-α甘草酸粗品,加入40%乙醇-水溶液2200ml,加热溶解,于-5℃下静置结晶,过滤,即得天然18-α甘草酸660g(本品经高效液相色谱法检测,含量为92.1%,紫外最大吸收波长为252.2nm)。
实施例四:
取甘草50kg,粉碎成粗粉,加入浓度为1%的氨水500L浸泡提取2次,每次浸泡9小时,合并提取液,过滤,滤液于75℃减压浓缩至60L,静置,放置至室温,过滤,得浓缩液。
取浓缩液,在搅拌状态下向浓缩液中缓缓加入1%的磷酸溶液适量,调节溶液至PH4.2,放冷,离心过滤,取滤液,过型号为D101大孔吸附树脂柱,上柱完成后,加水300L充分洗脱后,改用75%的乙醇150L洗脱,收集乙醇洗脱液,65℃减压浓缩至稠膏。
取稠膏,加入25%的丙酮-水溶液4000ml溶解,于2℃下静置结晶,过滤,得天然18-α甘草酸粗品680g。
取上述18-α甘草酸粗品,加入35%甲醇-水溶液2900ml,加热溶解,于-4℃下静置结晶,过滤,即得天然18-α甘草酸385g(本品经高效液相色谱法检测,含量为98.2%,紫外最大吸收波长为252.0nm)。
实施例五(天然18-α甘草酸胶囊的制备):
取实施例四中的天然18-α甘草酸100g,淀粉25g,β-环糊精123g,微粉硅胶2g,混匀,制粒,过60目筛,干燥后装成1000粒胶囊,即得。用法用量为:口服,每次2粒,每日3次。
Claims (8)
1.一种天然18-α甘草酸,其特征在于18-α甘草酸含量为90%-99%。
2.一种天然18-α甘草酸的制备方法,由以下步骤组成:
步骤(1):取甘草药材,粉碎成粗粉,加入适量一定浓度的氨水浸泡提取一定时间,过滤,药渣再加一定浓度的氨水浸泡提取数次,合并提取液并减压浓缩至一定体积,静置,放置至室温,过滤,得浓缩液。
步骤(2):取浓缩液,在搅拌状态下向浓缩液中缓缓加入一定浓度的酸溶液适量,调节溶液至一定的PH值,放冷,进行酸沉,使18-β甘草酸充分沉淀,离心过滤,分别得到以18-β甘草酸为主要成分的固体物和以18-α甘草酸为主要成分的滤液。
步骤(3):取滤液,过一定型号的大孔吸附树脂柱,薄层监测,上柱完成后,加水充分洗脱去除无机盐及其他大极性杂质后,改用一定浓度的乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,减压浓缩至稠膏。
步骤(4):取稠膏,加入含有一定比例有机溶剂的水溶液适量,溶解,低温静置结晶,过滤,即得天然18-α甘草酸粗品。
步骤(5):取18-α甘草酸粗品,加入加入含有一定比例有机溶剂的水溶液适量,溶解,低温静置结晶,过滤,即得天然18-α甘草酸。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于步骤(1)中所述的“一定浓度的氨水”是指浓度为0.2%~5%的氨水溶液,优选浓度为0.5%~2%,最佳浓度为0.8%;每次浸泡提取时间为3~12小时,优选为6小时;浸泡提取次数为1~3次,优选为2次。
4.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于步骤(2)中所述的“一定浓度的酸溶液”是指含有一定比例的有机酸或无机酸的水溶液,所用的酸可以是硫酸、盐酸、磷酸、乙酸、甲酸和草酸中的一种或几种的组合,优选为盐酸和草酸;酸溶液的浓度为0.1%~2%,优选为0.5%;调节溶液的PH值范围为PH2.5~5.0,优选为PH3.0~4.0,最佳PH点为3.6;酸沉的适宜温度为2℃~20℃,优选为5℃~15℃,最佳温度为6℃~8℃。
5.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于步骤(3)中所用的大孔树脂型号可以为HPD-100、HPD-300、HPD-400、HPD-500、HPD-600,或D101、XDA-8,优选的大孔吸附树脂型号为HPD-600。
6.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于步骤(4)中所用的有机溶剂可以为甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇、异丙醚、冰醋酸中的一种或几种的组合,优选为异丙醇;结晶适宜温度为-10℃~20℃,优选为-8℃~10℃,最佳温度为-4℃。
7.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于步骤(5)中所用的有机溶剂可以为甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇、甲酸、冰醋酸中的一种或几种的组合,优选为甲醇;结晶适宜温度为-10℃~20℃,优选为-5℃~10℃,最佳温度为2℃~5℃。
8.根据权利要求1所述的天然18-α甘草酸,其特征在于可以加入药学上可接受的载体制成口服剂型或注射液。
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C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20101229 |