CN101918845B - 评估糖萼状态的方法及其在鉴定血管相关疾病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及在影响血管健康的疾病和炎性疾病中特别有用的诊断和治疗工具及应用。具体来说，所述诊断和治疗工具利用了内皮糖萼的适当检测或调节。

Description

评估糖萼状态的方法及其在鉴定血管相关疾病中的应用

发明领域

本发明涉及在影响血管健康的疾病和炎性疾病中特别有用的诊断和治疗工具及应用。具体来说，所述诊断和治疗工具利用了内皮糖萼(glycocalyx)的适当检测或调节。 

发明背景

血管疾病是现代人类社会中发病和死亡的主因。尽管心血管和脑血管疾病，例如充血性心力衰竭和心肌梗塞的灾难性事件、心源性猝死或中风，已被广泛认知，但血管机能障碍也可能阻塞向其他器官或身体部分例如肠、肾脏、上肢或下肢的血液供应(例如外周动脉阻塞性疾病)。 

血管疾病的中心病因要素是动脉粥样化形成，即在内膜下层中粥样斑块的进行性形成，这促成了动脉和微动脉中的炎性动脉粥样硬化病变。斑块沉积可以导致动脉狭窄，引起由动脉提供给器官的血液供应不足。更通常情况下，斑块的炎症可能造成纤维帽破裂，导致血栓形成以及随之而来的梗塞形成。 

对血管病原性变化，尤其包括内皮机能障碍、血管渗透性增加、白细胞和血小板凝集增加以及最终的动脉粥样化形成和动脉粥样硬化的发病和/或发展速度的易感性倾向，可以由各种不同的风险因子或疾病状态增加或与它们相关，其中包括例如急性或慢性炎性状态和疾病，以及慢性血管激惹。例如，患有慢性炎性疾病例如类风湿性关节炎和***性红斑狼疮的患者，可能遭受加速的动脉粥样化形成(Solomon等，2003.Circulation 107：1303-7；Roman等，2003.N Engl J Med 349：2399-406)；人类血流中内毒素水平的升高已经与动脉粥样硬化的风险 增加相关联(Stoll等，2004.Arterioscler Thromb Vasc Biol 24：2227-36)；在高胆固醇饮食的兔中重复地给药内毒素，已显示出增加了动脉粥样硬化病变(Lehr等，2001.Circulation 104：914-20)；甚至单一的炎性激惹例如疫苗接种、C反应性蛋白灌注或内毒素给药，也可能在人类中引起内皮机能障碍。 

因此，对于能够在特别是具有发生血管改变的风险或已知患有血管病的对象和患者组中检测血管壁对致动脉粥样化刺激的易感性的诊断工具，存在着迫切需求。此外，对于允许增加血管壁对抗致动脉粥样化刺激的保护能力，从而提供进一步治疗和预防措施的新的靶，也存在着需求。 

发明简述

本发明致力于上面讨论的本技术领域中的需求。 

更具体来说，本发明进一步讲述了用于检测血管易感性和致病原因的诊断工具。所述诊断工具与当前已知的用于血管疾病的诊断手段相比，优选具有一种或多种优点，例如更高的检测速度、灵敏度、特异性和/或简便性，更早检测到血管病理变化，同时检测多种相关参数，从较少的起始材料或从通过微创性或非创性技术获得的起始材料进行检测。 

本发明还进一步讲述了用于减轻血管易感性和致病原因的方式。本发明的预防性或治疗性干预与当前已知的用于血管疾病的治疗方法相比，优选具有一种或多种优点，例如尤其是更高的治疗效能、特异性和/或耐受性，在疾病的包括血管机能障碍发生前或早期阶段在内的各种不同阶段起作用，通过可能与现有疗法互补的新的机制起作用。 

具体来说，本发明人最终结论性地证实，促进血管易感性和疾病发生的激惹，如炎性激惹，在内皮糖萼中引起了可证实的改变，例如 降低了***的和微血管的糖萼的体积或维度，增加了糖萼的渗透性，使糖萼成分例如透明质酸和硫酸乙酰肝素释放，以及参与糖萼代谢的酶的水平的改变。 

此外，鉴于内皮完整性(包括糖萼功能)对血管健康的重要性，因此本发明人考虑到，监测与糖萼相关的参数或标志物，能够提供关于血管机能障碍和疾病的风险或存在，以及对炎性激惹的致动脉粥样化易感性的有价值的信息。此外，本发明人还考虑到，旨在保护和/或重建糖萼完整性(例如通过补充糖萼组成成分，刺激糖萼的产生，或通过抑制糖萼的分解)的预防性和/或治疗性干预，可以防止血管机能障碍和疾病，以及炎症和对炎性激惹的致动脉粥样化易感性，或改善它们的预后。 

因此，一方面，本发明提供了用于在对象中诊断血管疾病或对血管疾病的易感性的方法，包括在所述对象中检测糖萼的状态、体积或维度，糖萼的渗透性，糖萼的释放和/或糖萼代谢的一种或多种酶的活性的变化。例如而非限制性的，糖萼体内平衡的这些方面的变化，可以与不具有血管疾病或对血管疾病易感性的对照对象或多个对象进行比较，以评估是否发生了可以指示病理表型的显著差异。 

另一方面，本发明提供在用于在对象中诊断对炎性激惹的致动脉粥样化易感性的方法，包括在所述对象中检测糖萼的状态、体积或维度，糖萼的渗透性，糖萼的释放和/或糖萼代谢的一种或多种酶的活性的变化。例如而非限制性的，糖萼体内平衡的这些方面的变化，可以与未暴露于炎性激惹的对照对象或多个对象进行比较，以评估是否发生了可以指示病理表型的显著差异。 

在实施方案中，糖萼的状态、体积或维度，糖萼的渗透性，糖萼的释放和/或糖萼代谢的一种或多种酶的活性的所述扰动，可以在单个血管中(例如在单个动脉或微动脉中)，在组织、身体部位、器官的 水平上和/或***水平上进行检测，对此没有限制。 

优选情况下，在上面定义的诊断方法中，为了确定糖萼的状态、体积或维度，糖萼的渗透性，糖萼的释放和/或糖萼代谢的一种或多种酶的活性所必需的测量，可以在从对象取出的生物学样品上进行。这样的体外测定方法一般容易执行，并可按照高通量分析进行。适合的样品包括但不限于从对象获得的全血、血浆或血清样品。这些体液在体内直接与血管内皮组织接触，因此对糖萼的扰动具有响应性。此外，至少某些糖萼指示物，例如但不限于与糖萼结合的凝集素样蛋白，也可以在尿样中检测到。 

在实施方案中，可以在从对象取出的样品、例如血液、血浆或血清样品中诊断糖萼的扰动，包括在所述样品中检测尤其是糖萼衍生的分子的存在和/或浓度，这些糖萼衍生的分子是例如寡糖或多糖，糖胺聚糖，透明质酸，硫酸乙酰肝素或蛋白多糖；催化糖萼合成代谢或分解代谢的酶，例如透明质酸酶；和/或可以掺入或以其他方式结合糖萼的内源或外源(例如注入的)物质，因此可以提供关于(***性的)糖萼的体积或维度和/或其分子可接近性的信息。例如而非限制性的，在样品例如在血浆或尿样中测定到的通常与糖萼相关的内源凝集素样蛋白的分布情况，可以提供关于糖萼的体积或维度和/或其分子可接近性的适合信息。例如而非限制性的，糖萼体内平衡的指示物或标志物的改变，例如上面所陈述的，可以与对照对象或多个对象进行比较，以评估是否发生了可以指示病理表型的显著差异。 

在实施方案中，上述或其他糖萼标志物的存在和/或浓度，可以通过本技术领域已知的测定技术相继或同时检测，所述技术为例如免疫沉淀，酶联免疫吸附分析(ELISA)，放射免疫分析(RIA)，比色和荧光酶活性分析等。 

在本发明的另一个实施方案中，糖萼的状态可以通过尺寸分布方 法来确定，其中测定了单个毛细血管的内皮糖萼维度或糖萼宽度(GW)。此外，尺寸分布方法还可以提供对血管中红细胞宽度(RBCW)、血管直径(VD)和毛细血管体积储备(CVR)的测量。因此，不从测试对象取出样品。尺寸分布方法和技术的使用，可以带来一种或多种优点，例如通量速度，患者的紧张和样品收集人员的减少；较低成本的检测，与参比的自动比较，便携式装置，更快的检测；和/或避免了麻烦的和对后勤有要求的基于实验室的技术和人员等。本发明的方法和装置的另一个优点是在家的个人化监测，能够例如通过与中央和/或操作工作站的连接，(半)永久性地对状态进行监视。因此，本发明提供了对患者中血管疾病或对炎性激惹的致动脉粥样化易感性的诊断。 

因此，本发明还提供了糖萼监测(GM)装置，该装置被构建用于检测糖萼的状态，和/或化合物对糖萼、例如催化糖萼合成代谢和分解代谢的酶的状态的影响，和/或可以被掺入或以其他方式结合糖萼的内源或外源物质，例如通常与糖萼结合的内源性凝集素样蛋白。 

此外，本发明涉及试剂盒，含有上面定义的糖萼监测器，软件，以及使用所述糖萼监测器执行诊断方法所需的可选的一种或多种缓冲液、反应试剂、校准被分析物、阳性和/或阴性对照，和/或使用说明书。 

在另一个优选实施方案中，上述或其他糖萼标志物的存在和/或浓度，可以使用生物传感器装置相继或同时检测。生物传感器优选情况下将灵敏和特异的生物成分(例如与待测定被分析物以高亲和性和特异性结合的受体；或催化涉及待测定被分析物的反应的酶；或待测定酶的底物)，与允许监测生物学事件(例如所述结合或反应)的物理、化学或生理化学检测器相结合。生物传感器技术的使用可以带来一种或多种优点，例如：使用较小的样品体积，可以逐步提高通量并减少患者的紧张和样品收集人员；在一个样品中同时检测两种或更多种标志物的可能性；一次性使用的、便携的和潜在低成本的检测；更快的 检测；和/或避免了麻烦的和对后勤有要求的基于实验室的技术等。 

因此，本发明还提供了生物传感器装置，它被构建成用于在从对象获取的样品中检测糖萼衍生分子，催化糖萼合成代谢或分解代谢的酶，和/或可以被掺入或以其他方式结合糖萼的内源或外源物质，例如通常与糖萼结合的内源性凝集素样蛋白的存在和/或浓度。 

此外，本发明涉及试剂盒，含有上面定义的生物传感器装置，以及使用所述生物传感器装置执行诊断方法所需的可选的一种或多种缓冲液、反应试剂、校准被分析物、阳性和/或阴性对照，和/或使用说明书。 

本发明还涉及在上面定义的本发明的用于在对象中诊断血管疾病或对炎性激惹的致动脉粥样化易感性的诊断方法中，使用上面定义的生物传感器装置或包含它的试剂盒。 

在其他实施方案中，某些诊断方法可能需要在对象身体上进行。例如但非限制性的，可以通过实施例中显示的舌下微循环的垂直偏振光谱(OPS)成像，在人类和其他对象中测量单个毛细血管中内皮糖萼的状态和/或厚度。另一个例子是，可以使用有创性显微镜可视化技术在对象、主要是动物对象的单个血管中检测糖萼，该技术包括注射与糖萼结合蛋白相结合的荧光标记物或糖萼渗透示踪分子。作为另一个例子，可以通过本发明的尺寸分布方法，这是一种非创性的方法，来监测或测定糖萼状态。优选情况下，尺寸分布方法使用糖萼监测器进行。 

另一方面涉及糖萼组成成分在制备药物中的应用，所述药物用于治疗血管疾病，用于降低对炎性激惹的致动脉粥样化易感性，或用于治疗炎性疾病。相关的方面涉及将糖萼组成成分用作药物，或用于治疗血管疾病，用于降低对炎性激惹的致动脉粥样化易感性，或用于治 疗炎性疾病。此外，还提供了含有糖萼组成成分的药物组合物，特别是用于治疗血管疾病，用于降低对炎性激惹的致动脉粥样化易感性，或用于治疗炎性疾病。同样还公开了在需要治疗的对象中用于治疗血管疾病，用于降低对炎性激惹的致动脉粥样化易感性，或用于治疗炎性疾病的方法，包括向所述对象给药治疗或预防有效量的糖萼组成成分。 

另一方面涉及糖萼分解代谢的酶的抑制剂在制备药物中的应用，所述药物用于治疗血管疾病，用于降低对炎性激惹的致动脉粥样化易感性，或用于治疗炎性疾病。相关的方面涉及将糖萼分解代谢的酶的抑制剂用作药物，或用于治疗血管疾病，用于降低对炎性激惹的致动脉粥样化易感性，或用于治疗炎性疾病。还提供了含有糖萼分解代谢的酶的抑制剂的药物组合物，特别是用于治疗血管疾病，用于降低对炎性激惹的致动脉粥样化易感性，或用于治疗炎性疾病。同样还公开了在需要治疗的对象中用于治疗血管疾病，用于降低对炎性激惹的致动脉粥样化易感性，或用于治疗炎性疾病的方法，包括向所述对象给药治疗或预防有效量的糖萼分解代谢的酶的抑制剂。 

应该认识到，上述的诊断方法和治疗性干预可以组合或同步使用，特别是对个体患者有利地定制治疗方法。例如，当上述的诊断测定方法测定到患者中糖萼的一种或多种特定组成成分显著减少时，随后在所述患者中进行的治疗可以旨在补充所述组成成分。在另一个例子中，当上述诊断测定方法测定到患者中一种或多种特定糖萼降解酶活性过高，那么在所述患者中进行的治疗可以旨在抑制所述酶。因此，在实施方案中，可以在本发明的诊断测定的基础上确定或决定本文中定义的适合的预防性或治疗性干预。 

此外，本发明的诊断方法和装置(例如生物传感器，尺寸分布方法和/或糖萼监测器)，甚至可以在单个患者中，根据糖萼的状态和参数例如体积或维度、渗透性、释放、糖萼代谢酶类的活性等，用于监 测任何对血管疾病或炎症的治疗性干预(例如本文公开的治疗；或其他治疗，例如尤其是在糖尿病患者中改善胰岛素敏感性的疗法，癌症患者中的肝素疗法，现有的被设计用于在炎性疾病中改善内皮功能的治疗等)的有效性。 

正如提到的，炎症倾向于增加发生血管疾病的机会。因此，在实施方案中，上面定义的用于确定血管疾病的存在或风险，用于确定对炎性激惹的致动脉粥样化易感性的诊断方法，和/或上面定义的涉及糖萼调节的血管疾病的治疗，在患有炎症的对象中，例如在具有炎症病症或疾病的患者中，可能特别有用。 

正如还提到的，血管疾病可能与各种不同风险因子和激惹、例如慢性血管激惹相关。因此，在实施方案中，上面定义的用于确定血管疾病的存在或风险的诊断方法，和/或上面定义的涉及糖萼调节的血管疾病的治疗，在具有一种或多种选自衰老、吸烟、高血糖症和血脂异常的风险因子的对象中，和/或在患有一种或多种选自局部缺血-再灌注损伤、1型糖尿病、2型糖尿病、高血糖症、胰岛素抗性、代谢综合征、血脂异常、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、高血压、癌症、传染病和创伤的风险疾病的对象中，可能特别有用。 

本发明的这些以及其他的方面和优选实施方案，将在下面的部分和随附的权利要求书中描述。 

附图说明

图1a.在使用或不使用依那西普(Etanercept)预处理的情况下，在内毒素激惹之前和之后测定了***性糖萼的体积。数据被表示成平均值±SEM，^*p＜0.05，#p＜0.01。 

图1b.在基线下(空心菱形；实心菱形)、盐水(实心正方形)和依那西普组(空心正方形)中血浆葡聚糖40的清除曲线。在盐水组中与在依那西普组中相比，在内毒素注入4小时后，葡聚糖40的血浆清除速度增加了。在每个时间点描述的值被表示成平均值±SEM。 

图1c和1d显示了通过单个舌下毛细血管的直接成像测定的LPS(内毒素)对糖萼维度的影响。在内毒素激惹之前(1c)和之后(1d)测定了毛细血管糖萼的维度。X轴显示了毛细血管糖萼的维度(单位为微米)。 

图2.在不使用(点)或使用(菱形)依那西普预处理的情况下，在用内毒素激惹的人类志愿者中血浆透明质酸水平(图2a)和透明质酸酶活性(图2b)。数据被表示成平均值±SEM(^*相对于基线p＜0.05，#组之间p＜0.05)。 

图3.在人类志愿者中，在内毒素激惹过程中通过血浆IL-6水平评估了炎性标志物(图3a，不使用(点)或使用(菱形)依那西普预处理)和血浆中CRP的血浆水平(图3b，不使用(黑色条)或使用(白色条)依那西普预处理)。显示了凝结的激活(图3c，通过凝血酶原片段1+2评估)和纤维蛋白溶解(图3d，通过D-二聚体水平测定)参数；(点：LPS+盐水，菱形：LPS+依那西普)。数据被表示成平均值±SEM(^*相对于基线p＜0.05， 

相对于基线p＜0.01，#组之间p＜0.05)。 

图4.描绘了本发明的测量方法与现有技术的测量方法的比较。 

图5.描绘了在存在和不存在***的情况下，血管直径作为测量到的红细胞宽度(图5a)、糖萼宽度(图5b)和糖萼宽度相对于健康对照的变化(图5c)的函数。 

图6.描绘了血管直径作为在健康对照对象和癌症对象中测量到的红细胞宽度(图6a)和糖萼宽度(图6b)，以及糖萼宽度相对于健康对照的变化(图6c)的函数。 

图7.描绘了在用VEGF受体抑制性化合物处理后，血管直径作为在健康对照对象和癌症对象中测量到的红细胞宽度(图7a)和糖萼宽度(图7b)，以及糖萼宽度相对于健康对照的变化(图7c)的函数。 

图8.描绘了血管直径作为在健康对照对象和糖尿病对象中测量到的红细胞宽度(图8a)和糖萼宽度(图8b)，以及糖萼宽度相对于健康对照的变化(图8c)的函数。 

图9.描绘了在用糖模拟化合物处理后，血管直径作为在健康对照对象和糖尿病对象中测量到的红细胞宽度(图9a)和糖萼宽度(图9b)，以及糖萼宽度相对于健康对照的变化(图9c)的函数。 

发明详述

定义

本文中使用的单数形式的“a”、“an”和“the”包括单数和复数指称物两者，除非上下文明确表明不是这样。 

本文使用的术语“包含(comprising)”、“包含(comprises)”和“包含(comprised of)”与“包括(including)”、“包括(includes)”或“含有(containing)”、“含有(contains)”同义，是包含性的或开放性的，不排除其他的、没有列举的成员、元素或方法步骤。应该认识到，本文中使用的术语“包含(comprising)”、“包含(comprises)”和“包含(comprised of)”包含了术语“由……构成(consisting of)”、“由……构成(consists)”和“由……构成(consists of)”。 

由终点值所叙述的数字范围包括相应范围内包含所有的数字和分数，以及所叙述的终点值。 

本文使用的术语“大约”当指称可测量的值例如参数、量、持续时间等时，意味着包含具体值的或距离具体值的+/-10％或以下的偏差，优选+/-5％或以下，更优选+/-1％或以下，更优选+/-0.1％或以下，在此范围内这样的偏差适合于在本文公开的发明中执行。应该理解，修饰词“大约”所指称的值，本身也被具体地、优选地公开。 

所有在本说明书中引用的文献，在此以其全文引为参考。 

除非另有定义，否则所有在公开的发明中使用的术语，包括技术和科学术语，具有本发明所属技术领域的普通专业人员通常理解的意义。作为进一步的指导，包含了术语的定义以更好地理解本发明的讲述内容。 

术语“对象”或“患者”优选指称作为治疗、观察或实验的对象的动物，更优选为温血动物，更优选为脊椎动物，更优选为哺乳动物，具体来说包括人类和非人类哺乳动物。术语“哺乳动物”包括任何照此分类的动物，包括但不限于人类，家畜和农畜，动物园动物，运动动物，宠物动物，伴侣动物和实验动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠、兔、狗、猫、豚鼠、牛、奶牛、绵羊、马、猪和灵长动物，例如猴和猿。特别优选的是人类对象，包括其两种性别和所有年龄范围的。 

本文中使用的词组例如“需要治疗的对象”包括从给定病症例如血管疾病或炎症的治疗获益的对象。这样的对象可以包括但不限于已经被诊断患有所述病症的对象，倾向于发生所述病症的对象，和/或将要在其中预防所述病症的对象。 

术语“样品”一般是指从生物学来源获得的未纯化或纯化形式的材料。生物学样品典型情况下可以从其生物学来源，例如从感兴趣的对象，通过用于体液、组织、细胞等的收集、抽取、活组织检查或切除等的适合的方法来获得。在本发明中特别有用的样品包括源自于对象的全血、血浆、血清和尿液。生物学样品可以被进一步加工，以制备其适合的衍生物，例如但不限于细胞或组织裂解液、匀浆液、上清液、级份等。样品可以被细分，以分离或富集其在本发明的诊断方法中将要使用的部分(例如预计含有感兴趣的被分析物的部分)。因此，样品可以直接用于本发明的方法，或者在使用前可以被加工、提取或纯化到不同的程度。 

疾病病症

正如在概述部分中提到的，本发明描述了在血管疾病和炎症中特别有用的诊断、预防和治疗工具和方法。具体来说，血管疾病和炎症可以通过糖萼的状态进一步表征。 

本文使用的术语“血管疾病”是指任何影响血管***，包括心脏和血管的疾病、紊乱或病症。血管疾病包括但不限于心血管疾病，脑血管疾病，外周血管疾病、动脉粥样硬化和动脉硬化血管疾病。术语包含了症状发生前的血管病变以及引起明显症状的血管机能障碍。例如，术语包括了由于粉瘤和动脉粥样硬化斑块的发生所引起的血管狭窄、阻塞或动脉瘤导致的症状发生前的以及有症状的血管机能障碍，以及由此产生的疾病和紊乱。血管疾病的具体例子包括但不限于动脉粥样硬化、充血性心力衰竭、冠心病(CAD)、心源性猝死、心肌梗塞、局部缺血、中风、外周血管疾病例如外周动脉阻塞性疾病(PAOD)、静脉血栓栓塞和肺栓塞。 

术语“易感性”在指称疾病时，是指对象对疾病例如血管疾病的易感性、可能性、易损性或倾向性。 

术语“炎症”具有本技术领域中给它的定义。作为进一步的指导，该术语一般是指在血管化组织中对由物理、化学和/或生物学试剂引起的细胞或组织损伤的应答，在急性形式中其特征为典型的疼痛、发热、发红、肿胀和功能丧失的结果，并用作启动有害因子和/或受损组织的消除、稀释或隔离的机制。在组织学上，炎症涉及一系列复杂的事件，包括小动脉、毛细血管和小静脉的膨胀，伴随有渗透性和血流的增加，流体包括血浆蛋白的渗出，和白细胞迁移到炎性病灶中。 

此外，术语包含由由外部物理或化学损伤或由生物学试剂例如病毒、细菌、真菌、原生动物或后生动物寄生虫感染引起的炎症，以及似乎未受刺激而引起的、例如在不存在可证实的损伤或感染的情况下 发生的炎症，对自身抗原应答的炎症(自体免疫炎症)，对移植的异种或同种异体细胞、组织或器官应答的炎症，对过敏原应答的炎症等。该术语涵盖了急性炎症和慢性炎症二者。此外，术语包含了局部或局部化炎症，以及***性炎症，即一种或多种炎症过程不局限于特定的组织，而是在内皮和/或其他器官***中普遍发生。 

本文使用的术语“炎症”具体涵盖了包含炎性成分的病变，尤其包括局部和***性、以及急性和慢性炎性状态、病症或疾病。优选但不是限制性的，术语可以是指任何下述病症： 

-恶病质，例如与癌症或传染性疾病例如AIDS有关的恶病质； 

-革兰氏阴性脓毒病，内毒素诱导的休克，脓毒性休克综合征，***性炎性反应综合征或多器官机能障碍综合征(MODS)； 

-免疫接种； 

-移植物抗宿主病变，例如移植物抗宿主病(GVHD)或排斥移植的异种或同种异体组织和器官，例如排斥同种异体骨髓或脐带血移植物； 

-急性和慢性感染性和寄生性过程，例如病毒、细菌或真菌性感染，和原生动物或后生动物寄生虫，优选包括脑型疟或脑膜炎球菌性脑膜炎； 

-过敏性病症，例如过敏性鼻炎，过敏性结膜炎，哮喘，湿疹，荨麻疹，接触性皮炎，***性过敏反应(过敏性反应)或过敏性休克，更优选选自过敏性鼻炎和哮喘； 

-慢性炎性病症(一般包括一组不同种类的病症，典型情况下涉及一种或多种炎性过程，和/或在缺少可证实的原因例如感染或组织损伤的情况下先天性或适应性免疫成分的慢性或复发性局部或***性活性)，和/或自身免疫疾病(一般涉及针对自身组织或组织成分即自身抗原的免疫应答，包括自身抗体应答或细胞介导的应答，也包括器官特异性和非器官特异性自身免疫病症。优选情况下，这样的病症可以选自急性感染后脑脊髓炎(ADEM)；阿狄森氏病；阿茨海默病(AD)；关节强硬性脊椎炎；抗磷脂抗体综合征(APS)；再生障碍性贫血；动 脉粥样硬化；自体免疫胃炎；自体免疫肝炎；自体免疫血小板减少症；贝切特病；腹泻；皮肌炎；I型糖尿病；II型糖尿病；家族性地中海热；家族性冷诱导的自体炎性综合征；古德帕斯丘综合征；痛风；假性痛风；格雷夫斯病；吉-巴综合征(GBS)；桥本病；遗传性周期热；特发性血小板减少性紫癜；炎性肠病(IBD)，包括克隆病和溃疡性结肠炎；局部缺血-再灌注损伤；川崎病；混合***病；穆-韦综合征；多发性脑硬化(MS)；重症肌无力；眼球阵挛-肌阵挛综合征(OMS)；视神经炎；萎缩性甲状腺炎；骨关节炎；帕金森症(PD)；天疱疮；恶性贫血；结节性多动脉炎；多肌炎；手术后或创伤性炎症；原发性胆汁性肝硬化；原发性黏液水肿；银屑病；银屑病关节炎；风湿热；类风湿关节炎；赖特尔综合征；硬皮病；舍伦格综合征；中风-局部缺血；***性红斑狼疮(SLE)；青少年特发性关节炎***性发作；多发性大动脉炎；颞动脉炎；白癫风；温抗体型自身免疫性溶血性贫血；和韦格纳肉芽肿。 

炎症和炎性疾病和病症，例如上面列出的，可以构成或产生炎性激惹，能够以不同的易感性导致患者中的动脉粥样化形成。 

更具体来说，本发明涉及诊断、预防和/或治疗性工具和/或方法，在其特征为糖萼的状态改变，例如糖萼宽度和/或毛细血管体积储备的变化的病症中特别有用。更优选情况下，病症选自但不限于癌症，糖尿病例如I型糖尿病或II型糖尿病，肾衰竭，早发动脉粥样硬化，脓毒症，高血压，恶性高血压，先兆子痫。 

糖萼

本文中使用的“糖萼”一般是指血管内皮细胞腔表面上富含多糖的细胞外基质。糖萼主要包含蛋白多糖、糖胺聚糖和糖蛋白(例如选择蛋白，粘附分子等)，它们在体内与水和来自循环血液的大量分子、尤其包括血浆蛋白、脂类和酶结合。 

“糖萼的状态”是指特定时间点时糖萼的状况，包括相对位置。糖萼的状态可以由糖萼的参数定性。术语“变化”在指称糖萼的参数(例如体积或维度，宽度，渗透性，酶活性等)时，一般包含了任何方向(例如增加或减少)和程度的这种变化。例如，参数值的“减少”可以包括与相关参比值、例如所述参数在对照(健康)对象中的值相比，减少了至少大约10％，或至少大约20％，或至少大约30％，或至少大约40％，或至少大约50％，或至少大约60％，或至少大约70％，或至少大约80％，或至少大约90％。例如，参数值的“增加”可以包括与相关参比值、例如所述参数在对照(健康)对象中的值相比，增加了至少大约10％，或至少大约20％，或至少大约40％，或至少大约60％，或至少大约80％，或至少大约100％，或至少大约150％或200％，或甚至至少大约500％等。应该认识到，糖萼参数的变化导致糖萼状态的变化。 

更典型情况下，涉及糖萼退化的病症，其特征为糖萼体积或维度的减小，糖萼渗透性的增加，糖萼释放的增加(即导致糖萼层厚度的降低)，糖萼降解酶类活性的增加和/或糖萼合成酶类活性的降低。理想情况下，例如本文公开的治疗性干预，将逆转这些趋势。 

术语“糖萼代谢的酶”一般包括参与糖萼或其一个或多个组分的合成代谢(即形成)或分解代谢(即降解)的酶。优选但不是限制性的，术语包括透明质酸酶、髓过氧化物酶、肝素酶和其他外切和内切糖苷酶。 

正如指出的，有利情况下，内皮糖萼的上述特征，可以通过在从对象获取的样品中检测一种或多种与糖萼相关的标志物来确定。具体来说，这样的标志物可以包括糖萼衍生分子，糖萼代谢酶类，和/或正常情况下与糖萼结合的内源或外源物质。 

特别适合用于本文的检测的糖萼衍生分子，包括但不限于透明质 酸、硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、多配体聚糖-1和总血浆糖胺聚糖(GAG)成分。一般来说，这些分子可能由于进行中的糖萼降解或释放而释放到血流中，因此可以指示糖萼的退化性变化。 

特别适合用于本文的检测的糖萼代谢酶，包括但不限于透明质酸酶、髓过氧化物酶、肝素酶和其他外切和内切糖苷酶。例如，这些酶的循环水平的增加或降低，可以指示正在进行的由它们催化的酶反应，允许评估糖萼的体内平衡。 

特别适合用于本文的检测的内源或外源糖萼结合物质，包括但不限于糖萼渗透示踪分子，例如尤其是葡聚糖40，或正常情况下与糖萼结合的内源凝集素样蛋白。例如，可选地在注射或灌注后，这些物质的循环量说明了糖萼从血流中排除这些物质的能力，从而可以估计糖萼的体积或维度和分子可接近性。 

生物传感器

正如提到的，本发明还涉及被构建用于在从对象获取的样品中检测一种或多种与糖萼相关的标志物、例如上面定义的标志物的生物传感器装置，以及所述生物传感器在本发明的诊断方法中的应用。 

本文使用的术语“生物传感器”，一般是指利用一种或多种固定化的生物敏感材料(例如受体，抗体，酶，底物，细胞器或全细胞)，在被分析样品中检测和/或定量一种或多种所需感兴趣的被分析物的器件或装置。固定化的生物敏感材料与所述所需被分析物之间的结合或化学反应，被转换成可检测的物理、化学或生理化学信号。 

在优选实施方案中，所述固定化的生物敏感材料可以是能够与本文定义的糖萼衍生分子、糖萼代谢酶或内源或外源糖萼结合物质特异性结合的受体，例如但不限于肽、多肽、蛋白，抗体，适配子或肽模拟物。这种结合优选可以表现出高的亲和性，即具有的亲和性常数(K_A) 为K_A≥1×10⁵M^-1，更优选K_A≥1×10⁶M^-1，例如K_A≥1×10⁷M^-1，更优选K_A≥1×10⁸M^-1，更优选K_A≥1×10⁹M^-1，例如K_A≥1×10¹⁰M^-1，K_A≥1×10¹¹M^-1或K_A≥1×10¹²M^-1，或甚至更高，其中K_A＝[R_A]/[R][A]，R表示受体，A表示所需被分析物。 

在另一个实施方案中，所述固定化的生物敏感材料，可以是能够被打算检测的糖萼代谢酶作用并化学改变的物质。 

在另一个实施方案中，所述固定化生物敏感材料，是能够作用并化学改变上面定义的糖萼衍生分子或内源或外源糖萼结合物质的酶。 

本发明考虑到了任何用于将固定化生物敏感材料与所需被分析物之间的结合或反应转换成可检测信号，以及检测所述信号的适合的方式。 

具体来说，本发明的产生的信号和生物传感器装置的相应检测器元件，可以利用生理化学、光学(例如使用表面等离子体激光共振，或基于吸光值或荧光的变化)、压电、电化学(例如使用电极检测氧化还原反应)、温度测量或磁性检测方式，但不限于此。生物传感器的通用设计和使用在本技术领域中是已知的，可以适用于本发明的应用(参见例如《生物传感器：实用方法》(第二版)(Biosensors：APractical Approach，2nd ed.)，Cooper J和Cass T主编，Oxford UniversityPress 2003，ISBN 0199638462；以及《生物传感器：理论与应用》(Biosensors：Theory and Applications)，DG Buerk，TechnomicPublishing Company 1993，ISBN 0877629757)，在此特别引为参考。 

治疗

正如在概述部分中进一步解释的，本发明也考虑到了通过糖萼组成成分，或使用糖萼分解代谢的酶的抑制剂，进行血管和炎性病症或疾病、例如上面叙述的相应疾病的治疗，或进行降低对炎性激惹的致 动脉粥样化易感性的治疗。 

术语“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”既包括对已经发生的病症的治疗，例如已经发生的血管或炎性疾病的疗法，又包括其目的在于预防或减少不想要的疾病发生的机会，例如防止血管或炎性疾病感染和发展的机会的预防性或阻抑性措施。有益的或所需的临床结果可以包括但不限于缓解一种或多种症状或一种或多种生物学标志物(例如炎性细胞因子，发烧，粉瘤等)，降低疾病的程度，稳定(即不恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾病的的发展，缓解或缓和疾病状态等。“治疗”也可以意味着与如果不接受治疗所预期的存活相比，延长存活。 

术语“预防有效量”是指在对象中抑制或延迟研究人员、兽医、医生或其他临床医师所查找的病症的发作的活性化合物或药剂的量。本文中使用的“治疗有效量”是指在对象中引发研究人员、兽医、医生或其他临床医师所查找的生物学或医药学应答，可以尤其包括缓解待治疗疾病或病症的症状的活性化合物或药剂的量。用于确定治疗或预防有效剂量的方法在本技术领域中是公知的。 

可用于在上面定义的疾病状态中预防和/或治疗性修复糖萼的糖萼组成成分，包括优选但不限于糖胺聚糖，肝素、尤其包括分级的肝素，糖模拟物，透明质酸合成途径的底物或中间体，以及木糖苷(它引发GAG合成)。 

在上面定义的疾病状态的治疗中可用作进行抑制的靶的糖萼分解代谢酶类，包括优选但不限于透明质酸酶、髓过氧化物酶、肝素酶和其他外切和内切糖苷酶。 

术语“抑制”包括了糖萼分解代谢酶类、特别是其糖萼降解酶活性的任何程度的抑制，例如与不存在抑制剂的情况下所述酶的活性相 比，抑制了至少大约10％，至少大约20％，至少大约30％，至少大约40％，至少大约50％，至少大约60％，至少大约70％，至少大约80％，至少大约90％，或甚至大约100％。这种抑制的程度可以通过本技术领域已知的测定方法来测量。 

术语“抑制剂”一般是指能够获得所需靶、例如糖萼分解代谢酶的抑制的物质或分子。 

本发明考虑到了任何类型的抑制剂，例如既包括可逆抑制剂，即非共价地与酶和/或酶-底物复合物结合的抑制剂，又包括不可逆抑制剂，即共价地改变通常位于酶的活性位点中的一个或多个氨基酸的抑制剂。在可逆抑制剂中，本发明考虑到了但不限于竞争性抑制剂、非竞争性抑制剂、混合型抑制剂、部分竞争性抑制剂和反竞争性抑制剂。 

本文中使用的抑制剂的适合的类型包括优选但不限于多肽或蛋白；抗体；肽；肽模拟物；适配子；化学物质，优选为有机分子，更优选为有机小分子；脂类；糖类；核酸等。 

本文中使用的术语“有机化合物”或“有机分子”是指它们在本技术领域中的广泛内涵。术语涵盖了作为天然产物以及半合成或全合成的有机分子。 

本文中使用的术语“有机小分子”是指其尺寸与药物中常用的有机分子相当的有机化合物。术语排除了生物大分子(例如蛋白，核酸等)。优选的有机小分子尺寸范围最高大约5000Da，例如最高大约4000，优选最高3000Da，更优选最高2000Da，更优选最高大约1000Da，例如最高大约900、800、700、600或最高大约500Da。 

术语“抗体”在本文中以其最广义的含义使用，一般是指任何免疫结合剂。术语具体来说涵盖了完整的单克隆抗体，多克隆抗体，由 至少两个完整抗体形成的多价(例如2-、3-或更多价)和/或多特异性抗体(例如双或多特异性抗体)，以及抗体片段(包括例如Fab，Fab′，F(ab′)2，Fv和scFv片段；双链抗体；线性抗体；单链抗体分子)，只要它们表现出所需生物学活性(具体为特异性结合目标抗原的活性)，以及这些片段的多价和/或多特异性复合物(双抗体、三抗体和多抗体)。术语“抗体”不仅包括通过包含免疫接种的方法产生的抗体，而且包括任何多肽例如重组表达的多肽，它们被制造成含有至少一个能够与目标抗原上的表位特异性结合的互补性决定区(CDR)。因此，术语适用于这样的分子，不论它们是体外还是体内生产的。 

本文使用的术语“适配子”是指能够与靶分子例如蛋白或肽，更典型为肽特异性结合的单链或双链寡聚DNA、寡聚RNA或寡聚DNA/RNA，或其任何类似物。有利情况下，适配子对它们的靶可以显示出相当高的特异性和亲和性(例如K_A在1×10⁹M^-1的级别)。适配子的生产描述在尤其是US 5,270,163；Ellington & Szostak 1990(Nature346：818-822)；Tuerk & Gold 1990(Science 249：505-510)；或Klussmann主编的《适配子手册：功能性寡核苷酸和它们的应用》(The AptamerHandbook：Functional Oligonucleotides and Their Applications)，Wiley-VCH 2006，ISBN 3527310592，在此特别引为参考。 

本文中使用的术语“肽模拟物”是指与相应的肽拓扑学类似的非肽类试剂。合理地设计肽的肽模拟物的方法，在本技术领域中是已知的。例如，基于硫酸酯化的8聚体肽CCK26-33的三种肽模拟物、基于11聚体肽底物P的两种肽模拟物的合理设计以及相关的肽模拟物设计原理，描述在Horwell 1995(Trends Biotechnol 13：132-134)中，在此特别引为参考。 

药物剂型

为了治疗血管和/或炎性疾病，有利情况下，本发明的活性物质， 

例如特别是糖萼组成成分和/或糖萼分解代谢酶的抑制剂，被配制成药 物剂型。 

这种药物组合物优选包含本发明的一种或多种活性物质，或其可药用的形式例如N-氧化物形式，加成盐，药物前体，其溶剂合物或立体化学异构体形式，以及一种或多种可药用载体/赋形剂。 

术语“可药用的盐”是指可药用酸或碱的加成盐。可药用酸或碱的加成盐是指包含本发明的活性物质并能够形成的有治疗活性的无毒性酸和无毒性碱的加成盐形式。具有碱性性质的本发明的活性物质，可以通过将所述碱形式用适合的酸处理，转变成它们的可药用酸加成盐。适合的酸包括例如无机酸例如氢卤酸，例如盐酸或氢溴酸，硫酸，硝酸，磷酸和类似的酸；或有机酸例如乙酸，丙酸，羟基乙酸，乳酸，丙酮酸，草酸，丙二酸，琥珀酸(即丁二酸)，马来酸，延胡索酸，苹果酸，酒石酸，柠檬酸，甲磺酸，乙磺酸，苯磺酸，对甲基苯磺酸，环己烷氨基磺酸，水杨酸，对氨基水杨酸，扑酸等酸。具有酸性性质的本发明的活性物质，可以通过将所述酸形式用适合的有机碱或无机碱处理，转变成它们的可药用碱加成盐。适合的碱盐形式包括例如铵盐，碱和碱土金属盐，例如锂、钠、钾、镁、钙的盐等，与有机碱的盐，例如苄星青霉素、N-甲基-D-葡萄糖胺、海巴明盐，以及与氨基酸例如精氨酸、赖氨酸等的盐。 

本文使用的“载体”或“赋形剂”包括任何和所有的溶剂，稀释剂，缓冲液(例如中性缓冲盐水或磷酸缓冲盐水)，增溶剂，胶体，分散介质，介质，填充剂，螯合剂(例如EDTA或谷胱甘肽)，氨基酸(例如甘氨酸)，蛋白，崩解剂，粘合剂，润滑剂，润湿剂，乳化剂，甜味剂，着色剂，调味剂，增香剂，增稠剂，用于获得储库效应的药剂，包衣，抗真菌剂，防腐剂，抗氧化剂，张力控制剂，吸收延迟剂等。这些用于药物活性物质的介质和试剂的使用，在本技术领域中是公知的。除了任何常规介质或试剂与活性物质不相容的情况下之外，它在治疗组合物中的应用都可以考虑。 

用于配制药物组合物的说明性的、非限制性的载体包括例如水包油或油包水乳液，包含或不包含适合于静脉内(IV)使用的有机助溶剂的水性组合物，脂质体或含有表面活性剂的囊泡，微球，微珠和微粒体，粉末，片剂，胶囊，栓剂，水性混悬液，气溶胶，以及其他对于本技术领域的普通专业人员来说显而易见的载体。 

本发明的药物组合物可以配制成用于基本上任何给药途径，例如但不限于经口给药(例如经口摄入或吸入)，鼻内给药(例如鼻内吸入或鼻内粘膜给药)，肠胃外给药(例如皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内或胸骨内注射或灌注)，透过皮肤或透过粘膜(例如口、舌下、鼻内)给药，局部给药，直肠、***或气管内滴注等。通过这种方式，通过本发明的方法和组合物可以获得的治疗效应，依赖于本发明的给定应用的具体需要，可以是例如***性的、局部的、组织特异性的等。 

例如，对于口服给药来说，药物组合物可以配制成丸剂，片剂，涂漆片剂，包衣(例如糖包衣)片剂，颗粒，硬明胶胶囊和软明胶胶囊，水性、醇性或油性溶液，糖浆，乳液或混悬液。在非限制性例子中，口服剂型的制备，可以通过将适合量的粉末形式的活性物质，以及可选地包含细分散的一种或多种固体载体，均匀地充分地混合在一起，并将混合物配制成丸剂、片剂或胶囊，来适合地完成。示例性而非限制性的固体载体包括磷酸钙，硬脂酸镁，滑石粉，糖类(例如葡萄糖，甘露糖，乳糖或蔗糖)，糖醇(例如甘露糖醇)，糊精，淀粉，明胶，纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，低熔点蜡和离子交换树脂。含有药物组合物的压缩片剂，可以通过将活性成分与例如上面描述的固体载体均匀充分地混合以提供具有必需的压缩性质的混合物，然后将混合物在适合的机器中压制成所需的形状和尺寸，来制备。模制片剂可以通过在适合的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末状活性物质的混合物，来制造。用于软明胶胶囊和栓剂的适合的载体是例如脂肪、蜡、半固体和液体多元醇、天然油或硬化油等。 

例如，对于口用或鼻用气溶胶或吸入给药来说，药物组合物可以用说明的载体配制，例如与盐水、聚乙二醇或二醇、DPPC、甲基纤维素配制成溶液，或与粉状分散剂混合，并进一步使用苯甲醇或其他适合的防腐剂，用于增加生物利用度的吸附促进剂，氟烃，和/或其他本技术领域中已知的增溶剂或分散剂，配制成混合物。用于以气溶胶或喷雾剂形式给药的适合的药物剂型，是例如本发明的活性物质或它们的生理可耐受盐，在可药用溶剂例如乙醇或水、或这些溶剂的混合物中的溶液、混悬液或乳液。如果需要，剂型也可以附加地包含其他药物辅助剂，例如表面活性剂、乳化剂和稳定剂以及推进剂。作为说明，投送可以使用一次性使用的投送装置，烟雾喷雾器，呼吸激活的粉末吸入器，气溶胶剂量计量式吸入器(MDI)，或任何其他可以在本技术领域中使用大量喷雾器投送装置。此外，也可以使用烟雾探杆或通过气管内管直接给药。 

通过粘膜局部给药的载体的例子依赖于具体的途径，例如经口、舌下、鼻内等。当口服给药时，说明性的例子包括药品级甘露糖醇、淀粉、乳糖、硬脂酸镁、糖钠、纤维素、碳酸镁等，其中甘露糖醇是优选的。当鼻内给药时，说明性的例子包括聚乙二醇，磷脂，二醇和糖脂，蔗糖和/或甲基纤维素，带有或不带有增量剂例如乳糖和防腐剂例如苯扎氯铵、EDTA的粉末混悬液。在具体的说明性实施方案中，使用大约0.01-0.2％的磷脂1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)作为等渗水性载体，用于以大约0.1到3.0mg/ml的浓度鼻内给药本发明的活性物质。 

例如，对于肠胃外给药来说，药物组合物可以有利地用适合的溶剂、稀释剂、增溶剂或乳化剂等配制成溶液、混悬液或乳液。适合的溶剂包括但不限于水，生理盐水溶液或醇类，例如乙醇、丙醇、甘油，以及糖溶液，例如葡萄糖、转化糖、蔗糖或甘露糖醇溶液，或可选地提到的各种溶剂的混合物。可注射溶液或混悬液可以按照现有技术配 制，使用适合的无毒性、肠胃外可接受的稀释剂或溶剂，例如甘露糖醇、1，3-丁二醇，水，Ringer′s溶液或等渗氯化钠溶液，或适合的分散剂或润湿剂和助悬剂，例如无菌、无刺激、不挥发油，包括合成的单脂酰或二脂酰甘油酯，以及脂肪酸，包括油酸。本发明的活性物质及其可药用盐也可以冷冻干燥，获得的冷冻干燥物可用于生产注射或灌注制剂。例如，用于静脉内使用的载体的一个说明性的例子包括10％USP乙醇，40％USP丙二醇或聚乙二醇600，以及补足量的USP注射用水(WFI)的混合物。其他用于静脉内使用的说明性载体包括10％USP乙醇和USP WFI；0.01-0.1％三乙醇胺在USP WFI中；或0.01-0.2％二棕榈酰二磷脂酰胆碱在USP WFI中；以及1-10％鲨烯或肠胃外植物油在水中的乳液。用于皮下或肌肉内使用的载体的说明性例子包括磷酸缓冲盐水(PBS)溶液，5％葡萄糖在WFI中，和0.01-0.1％三乙醇胺在含5％葡萄糖或0.9％氯化钠的USP WFI中，或10％USP乙醇、40％丙二醇和补足量的可接受的等渗溶液例如5％葡萄糖或0.9％氯化钠的1比2或1比4的混合物；或0.01-0.2％二棕榈酰二磷脂酰胆碱在USP WFI和1到10％鲨烯或肠胃外植物油在水中的乳液中。 

在水性剂型是优选的情况下，它可以包含一种或多种表面活性剂。例如，组合物可以采用包含至少一种适合的表面活性剂、例如磷脂表面活性剂的胶束分散体的形式。磷脂的说明性的例子包括二酰基磷脂酰甘油，例如二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DPMG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)和二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)，二酰基磷脂酰胆碱，例如二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DPMC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)；二酰基磷脂酸，例如二肉豆蔻酰磷脂酸(DPMA)、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)和二硬脂酰磷脂酸(DSPA)；以及二酰基磷脂酰乙醇胺(DPME)，二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)。典型情况下，水性剂型中表面活性剂：活性物质的摩尔比率将为大约10∶1到大约1∶10，更典型为大约5∶1到大约1∶5，但是任何有效量的表面活性剂可用于水性剂型中，以最好地适合于特定的所需目标。 

当采取栓剂的形式直肠给药时，这些剂型可以通过将本发明的活性物质与适合的非刺激性赋形剂、例如可可脂、合成的甘油酯或聚乙二醇进行混合来制备，这些赋形剂在通常温度下是固体，但是在直肠空腔中液化和/或溶解，以释放药物。 

适合用于微胶囊、植入物或杆的载体，是例如乙醇酸和乳酸的共聚物。 

本技术领域的专业人员将会认识到，上面的描述是说明性的而不是彻底的。事实上，许多其他的配制技术和可药用赋形剂和载体溶液是本技术领域的专业人员熟知的，开发适合的配药和治疗方式，以将本文描述的具体组合物用于各种不同的治疗方式中，也同样是公知的。 

本发明的活性物质可以单独或与本技术领域任何已知的血管疾病或炎性疾病疗法组合(“组合疗法”)使用。本文考虑到的组合疗法可以包含给药至少一种本发明的活性物质和至少一种其他的药物或生物活性成分。所述本发明的活性物质和所述药物或生物活性成分，可以在相同的或不同的药物剂型中，同时或以任何次序相继给药。 

可选地与待给药的一种或多种其他活性化合物组合使用的本发明的活性物质的剂量或量，依赖于具体的情况，并且通常适应于具体的环境，以获得最适效应。因此，取决于待治疗病症的本质和严重性，也取决于待治疗人类或动物的性别、年龄、体重、总体健康、饮食、给药方式和时间，以及个体响应性，取决于给药途径、使用的化合物的作用效能、代谢稳定性和持续时间，取决于疗法是急性还是慢性还是预防性的，或取决于其他活性化合物是否与本发明的药剂一起给药。 

非限制性的，依赖于疾病的类型和严重性，典型的每日剂量可以在从大约1μg/kg到100mg/kg体重或以上的范围内，取决于上面提到 的因素。对于长达几天或以上的重复给药来说，依赖于病症，治疗持续到疾病症状的所需抑制发生为止。本发明的活性物质的优选剂量可以在从大约0.05mg/kg到大约10mg/kg体重的范围内。因此，可以向患者给药一剂或多剂大约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)。这样的剂量可以间歇地给药，例如每周或每三周。 

尺寸分布方法

在本发明的另一个实施方案中，本发明人确定了用于评估糖萼状态的方法。糖萼的状态可以使用尺寸分布方法进行评估，其中确定了单个毛细血管的内皮糖萼维度或糖萼宽度(GW)。此外，尺寸分布方法还为血管中红细胞的宽度(RBCW)、血管直径(VD)和毛细血管体积储备(CVR)提供了测量。 

本文中使用的“红细胞宽度(RBCW)”被定义为在血管的微动脉区段处红细胞宽度的多次测量的平均值。因为微动脉区段的特征是仅仅便于灌注排成一线的红细胞(如图4中所示)，因此可以进行单个红细胞宽度的测量。 

本文使用的“血管直径(VD)”被定义为灌注有排成一线的红细胞的血管的微动脉区段的直径。本发明人令人吃惊地发现，在测量RBCW的过程中，少量百分比的红细胞伸展到内皮腔内膜上的糖萼结构域中，而大多数时间中它们是不含红细胞的。因此，RBCW的测量也提供了许多延伸到糖萼结构域中的测量值，因此提供了血管直径的值。已经显示，在微动脉区段处对红细胞宽度(RBCW)的多次测量的最大值，为血管直径(VD)提供了精确的测量。 

本文中使用的“糖萼宽度(GW)”是红细胞宽度与血管直径之间的缝隙的维度。因为糖萼宽度(GW)是指每个毛细血管的内皮糖萼的维度，因此它指示了糖萼的状态。 

本文中使用的“毛细血管体积储备(CVR)”被定义为RBCWmax的二次幂与RBCW的二次幂的比率。CVR可以按照下式定义： 

$\mathrm{CVR}=\frac{\mathrm{RBCW}{\max }^2}{{\mathrm{RBCW}}^2},$

当VD等于或大于单个RBC的最大宽度时，RBCWmax等于VD。 

在所有其他情况下，RBCWmax等于单个RBC的最大宽度。 

尺寸分布测量可以在使用临床显微镜获得的图像上进行。在第一种情况下，对血管进行可视化，并捕获流过血管的红细胞的连续图像。对于每个图像，测量可视化的红细胞的RBCW，并获得尺寸分布。对于给定的血管，测量方法测量至少10个，优选超过50、100、250、500、1000、2500、5000个或以上的RBCW值。这些值的测量显示，少量百分比的红细胞伸展到内皮腔内膜上的糖萼结构域中，而大多数时间中它们是不含红细胞的。因此，尺寸分布测量提供了统计学分布，其中大部分测量值提供了血管中实际的RBCW值，而只有少量百分比的测量值提供了实际血管直径的测量。因此，来自尺寸分布测量的p50值提供了血管中实际的平均RBCW值，而p99值提供了对应于血管直径值的最大RBCW值。本文中使用的术语“p50值”表示实际值有50％的机会可能低于所述值，并且实际值也有50％的机会可能高于所述值。因此，“p50值”是指平均RBCW值或对应于RBCW中值。本文中使用的术语“p99值”表示实际值有99％的机会可能低于所述值，并且实际值有1％的机会可能高于所述值。因此，“p99值”对应于RBCW最大值，因此对应于血管直径。 

本文中使用的“平均(average)”值是指被测量值的平均值(mean)、中值或众值。本文中使用的平均值(mean)是指数据组的算术平均值。本文中使用的中值是指将数据组的较大一半与较小一半分隔开的数值。本文中使用的众值(mode value)，是指在数据组中出现频率最高的值。 

从实际RBCW值和血管直径的测量值，可以确定糖萼宽度(GW)，因为糖萼宽度等于[血管直径减去实际RBCW值]除以2。通过确定糖萼宽度，尺寸分布方法提供了糖萼的状态。 

糖萼的状态可以通过按照给出的式确定CVR值进行进一步评估。因为CVR值提供了关于血管直径和糖萼宽度二者的信息，因此该值也可用于评估糖萼的状态。在糖萼宽度保持不变但血管直径减小或增加的情况下，与糖萼宽度值相反，CVR值将提供关于糖萼的状态的甚至更精确的信息。 

这种方法的优点在于本发明提供了不需要鉴定血管壁腔内面的准确位置就能测定糖萼状态的策略。此外，它不需要使用白细胞诱导的RBC宽度的暂时变宽(参见图4)。 

因此，本发明的测量方法允许在临床以及实验性活体显微镜记录中所有成像的RBC灌注微血管中，自动化地、非创性地评估微血管红细胞宽度、血管直径、糖萼宽度和毛细血管体积储备。 

本文使用的术语“非创性”是指不机械穿透也不破裂皮肤的步骤。因此，步骤不需要在身体中切口或取出生物学组织。 

此外，本发明人发现，在给定微血管中，只需要几秒钟的红细胞灌注就允许分析红细胞宽度、血管直径、糖萼宽度，以及毛细血管体积储备。此外，所有给定视野中的微血管可以同时进行分析，因此记录单个视野只花费几秒钟，记录多个视野可以在一或几分钟时间内完成。因此，本发明的测量方法在短时间内提供了来自超过100根血管的红细胞宽度、血管直径、糖萼宽度和毛细血管体积储备的精确分布。 

更优选情况下，微血管是指具有小的直径的血管，优选情况下直径小于100μm，更优选小于50μm，更优选小于25μm、20μm、19μm、 18μm、17μm、16μm、15μm、14μm、13μm、12μm、11μm、10μm、9μm、8μm、7μm，更优选小于或等于大约10μm。 

在优选实施方案中，本发明还涉及用于评估糖萼的状态的方法，包括下列步骤： 

(a)测量血管、优选微血管中红细胞的宽度(RBCW)； 

(b)从红细胞宽度测量值的尺寸分布确定糖萼的宽度(GW)，由此评估糖萼的状态。 

在更优选实施方案中，本发明还涉及用于评估糖萼的状态的方法，包括下列步骤： 

(a)测量血管、优选微血管中红细胞的宽度(RBCW)； 

(a1)确定测量的RBCW的尺寸分布 

(b)从测量的RBCW的尺寸分布确定糖萼的宽度(GW)，由此评估糖萼的状态。 

此外，在步骤(a)中获得的测量值的尺寸分布，可以进一步用于确定毛细血管体积储备。 

根据本发明的方法，糖萼宽度可以被定义为(血管直径(VD)减去红细胞宽度(RBCW))除以2。 

毛细血管体积储备可以被定义为当糖萼体积可以被红细胞获得时，最大血管血液体积的比率，按照下式确定： 

$\mathrm{CVR}=\frac{\mathrm{RBCW}{\max }^2}{{\mathrm{RBCW}}^2},$

当VD等于或大于单个RBC的最大宽度时，RBCWmax等于VD。 

在所有其他情况下，RBCWmax等于单个RBC的最大宽度。 

在另一个实施方案中，本发明涉及用于评估糖萼的状态的方法，包括下列步骤： 

(a)测量血管、优选微血管中至少10个、优选超过50、100、250、500、1000、2500或5000个红细胞的宽度； 

(b)对于至少10个、优选超过50、100、250、500、1000个血管，优选微血管，重复步骤(a)；以及 

(c)从红细胞宽度测量值的尺寸分布确定糖萼的宽度，由此评估糖萼的状态。 

在另一个实施方案中，本发明涉及用于评估糖萼的状态的方法，包括下列步骤： 

(a)测量血管、优选微血管中至少10个、优选超过50、100、250、500、1000、2500或5000个红细胞的宽度； 

(b)对于至少10个、优选超过50、100、250、500、1000个血管，优选微血管，重复步骤(a)；以及 

(b1)确定测量的RBCW的尺寸分布 

(c)从尺寸分布确定糖萼的宽度，由此评估糖萼的状态。 

在有两个实施方案中，本发明的方法附加地包括下列步骤： 

(d)从红细胞宽度测量值的尺寸分布确定毛细血管体积储备。 

在本发明的另一个实施方案中，用于评估糖萼状态的方法包括下列步骤： 

(a)测量第一个血管、优选微血管中至少10个、优选超过50、100、250、500、1000、2500或5000个红细胞的宽度； 

(b)对于至少10个、优选超过50、100、250、500、1000个血管，优选微血管，重复步骤(a)； 

(c)确定RBCs的最大宽度值和中值宽度值；以及 

(d)确定最大宽度值与中值宽度值之间的差值； 

其中所述差值确定了糖萼宽度，并评估了糖萼的状态。 

在本发明的另一个实施方案中，本发明人发现，测量可以在几分钟内进行，因此本发明能够对受控的刺激作出响应，检测红细胞宽度、血管直径、糖萼宽度和毛细血管体积储备的动态变化。 

因此，本发明提供了用于鉴定调节糖萼状态的化合物、心血管风险因子或生活方式因子的方法，包括下列步骤： 

(a)在存在和不存在所述化合物、心血管风险因子或生活方式因子的条件下，测量血管中至少10个、优选超过50、100、250、500、1000、2500或5000个红细胞的宽度； 

(b)对于至少10个、优选超过50、100、250、500、1000个血管，重复步骤(a)；以及 

(c)按照本发明的方法评估糖萼的状态， 

其中在存在和不存在所述化合物、心血管风险因子或生活方式因子的条件下糖萼状态的差异鉴定调节糖萼的状态的所述化合物、心血管风险因子或生活方式因子。 

在另一个实施方案中，本发明涉及用于筛选化合物的方法，包括下列步骤： 

(a)在存在至少一种化合物的情况下，测量血管、优选微血管中至少10个、优选超过50、100、250、500、1000、2500或5000个红细胞的宽度； 

(b)对于至少10个、优选超过50、100、250、500、1000个血管，优选微血管，重复步骤(a)； 

(c)对于至少一种其他的化合物重复步骤(a)和(b)的测量； 

(d)在不存在化合物的情况下重复步骤(a)和(b)的测量，由此建立对照测量；以及 

(c)在存在和不存在所述化合物的情况下评估糖萼的状态并确定GW，以及可选的RBCW、VD和CVR； 

其中相对于使用的化合物和对照测量来评估糖萼的状态，由此筛 选所述化合物调节糖萼状态的能力。 

在另一个实施方案中，本发明涉及用于鉴定调节糖萼和/或毛细血管体积储备的化合物、心血管风险因子或生活方式因子的方法，所述方法包括： 

a)将定义了在不存在所述化合物、心血管风险因子或生活方式因子的情况下至少一个血管中红细胞(RBCs)的平均宽度值的信息，导入到计算机程序中， 

b)将定义了在存在所述化合物、心血管风险因子或生活方式因子的情况下至少一个血管中红细胞(RBCs)的平均和最大宽度值的信息，导入到计算机程序中， 

c)评估在存在所述化合物、心血管风险因子或生活方式因子的情况下的GW，是否与不存在所述化合物、心血管风险因子或生活方式因子的情况下的GW不同，以及 

d)鉴定在c)中被评估为阳性的化合物、心血管风险因子或生活方式因子。 

根据本发明，术语心血管风险因子和生活方式因子是指一种或多种选自衰老、吸烟、高血糖症和血脂异常的风险因子；和/或在患有一种或多种选自局部缺血-再灌注损伤、1型糖尿病、2型糖尿病、高血糖症、胰岛素抗性、代谢综合征、血脂异常、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、高血压、癌症、传染病和创伤的风险疾病的对象中。 

因此，一方面，本发明提供了用于在对象中诊断癌症和糖尿病或对癌症和糖尿病的易感性的方法，包括在所述对象中检测糖萼状态的变化。例如而非限制性的，在被诊断患有癌症或糖尿病的对象中糖萼状态的变化，可以与没有被诊断为患有癌症或糖尿病或不具有对癌症或糖尿病易感性的对照对象或多个对象进行比较，以评估是否发生了可以指示病理表型的显著差异。 

在其他实施方案中，某些诊断方法可能需要在对象身体上进行。例如而非限制性的，正如实施例中所示，通过活体显微镜记录成像，在人类和其他对象中，测量第一个血管、优选微血管中至少10个、优选超过50、100、250、500、1000、2500或5000个红细胞的宽度，并对于至少10个、优选超过50、100、250、500、1000个血管重复该测量。 

应该指出，这种类型的活体显微镜记录测量技术是简单快速的诊断方法，不需要包括注射与糖萼结合蛋白结合的荧光标记物或糖萼通透示踪分子的有创性显微镜可视化技术。 

应该认识到，上述的诊断方法和治疗性干预可以组合或同步使用，特别是用于有利地对个体患者定制治疗。例如，当如上所述的诊断测定方法确定了患者中糖萼的状态明显改变时，随后在所述患者中进行的治疗可以旨在恢复糖萼的状态。 

此外，本发明的诊断方法可用于即使在单个患者中，监测任何用于恢复糖萼状态的治疗性干预(例如本文公开的治疗；或其他治疗，例如尤其是在糖尿病患者中改进胰岛素敏感性的疗法，癌症患者中的肝素疗法，现有的被设计用于在炎性疾病中改善内皮功能的治疗方法等)，对糖萼的状态而言的有效性。 

本发明的另一个实施方案涉及储存在计算机可读介质或类似的独立计算机装置上的计算机程序，被构造用于： 

(a)读取RBCW分布数据；以及 

(b)根据本发明的方法确定糖萼的状态，由此确定GW以及可选的RBCW、VD和CVR。 

在另一个实施方案中，本发明涉及含有数据的计算机装置，数据包括通过使用本发明的方法获得的在至少一个血管中红细胞的平均宽 度值。 

在另一个实施方案中，本发明涉及含有编码手段的计算机程序，适合用于执行下述步骤，其中所述程序在数据处理***上运行或执行： 

(i)包含本发明的方法步骤或 

(ii)用于从RBCs宽度分布数据确定GW以及可选的RBCW、VD和CVR的方法步骤。 

在另一个实施方案中，本发明涉及本文描述的计算机程序，其中将尺寸分布数据和GW，以及可选的RBCW、VD和CVR值与标准值进行比较。优选情况下，所述标准值通过从数据库检索获得。 

在另一个实施方案中，本发明涉及鉴定调节糖萼的化合物的方法，所述方法包括： 

(a)将定义了在不存在所述化合物的情况下至少一个血管中RBCW值的信息，导入到计算机程序中， 

(b)将定义了在存在所述化合物的情况下至少一个血管中RBCW值的信息，导入到计算机程序中， 

(c)按照本发明的方法确定糖萼的状态， 

(d)评估在存在所述化合物的情况下糖萼的状态，是否与不存在所述化合物的情况下糖萼的状态不同，以及 

(e)鉴定在d)中被评估为阳性的化合物。 

在另一个实施方案中，本发明涉及操作数据处理***的方法： 

(i)包含本发明的方法步骤或 

(ii)用于从RBCW分布数据确定红细胞宽度、血管直径、糖萼维度和/或毛细血管体积储备的方法步骤。 

在另一个实施方案中，本发明涉及数据处理***，包含了执行本发明的方法步骤和/或用于从RBCs宽度分布数据确定红细胞宽度、血 管直径、糖萼维度和/或毛细血管体积储备的方法步骤的手段。 

在另一个实施方案中，本发明涉及计算机可读介质，其上储存由编码手段，适合于执行本发明的方法的每个步骤。 

在另一个实施方案中，本发明涉及含有数据的计算机装置，数据包括通过使用本发明的方法获得的红细胞宽度、血管直径、糖萼维度、毛细血管体积储备和/或RBCs宽度分布数据。 

应该指出，本发明的装置能够可视化和确定所有种类动物的糖萼的状态，包括小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔等，而且也可以在人类中。可视化可以在身体的任何可以对血管进行可视化的部位上进行，优选在舌、耳、皮肤、甲皱、眼睛等上进行。 

上述的方面和实施方案得到了下列非限制性实施例的支持。 

实施例

实施例1 

本实施例证明了内毒素诱导的炎性反应在人类中导致糖萼体积或维度的减小，并且肿瘤坏死因子-α(TNFα)在该过程中发挥作用。具体来说，健康的男性志愿者静脉内接受了低剂量的内毒素，进行(n＝8)或未进行(n＝13)可溶性TNFα受体依那西普的预处理。估算了基线处和内毒素激惹后4小时时的全身性和微血管糖萼： 

材料与方法 

研究设计 

研究了21位健康的高加索男性志愿者。研究得到了阿姆斯特丹医学中心学术管理审查委员会(Institutional Review Board of the AcademicMedical Centre，Amsterdam)的批准，从所有志愿者获得了书面同意书。参加者没有心血管疾病史。对象不吸烟。没有使用任何药物，在研究 前一个月没有任何发热疾病。医学史、身体检查、常规实验室检查、心电图和胸部X-射线都正常并可比。所有实验在禁食过夜后进行。在所有对象中进行了基线测量，包括***性糖萼体积、微血管糖萼厚度和生物化学。5天后，分配对象进行盐水(n-13)或依那西普(n＝8；Enbrel 

50mg，Wyeth Pharmaceuticals，Madison，NJ，USA)肌肉内注射。48小时后，所有对象接受静脉内内毒素弹丸注射(1ng/kg体重，UnitedStates Pharmacopeial Convention Inc，Rockville，MD，USA)。正如以前发表的，记录了与内毒素血症有关的临床症状的发病、时间和严重性(Suffredini等，1999.J Infect Dis 172：1278-82)。在内毒素注入后，定期测量生命指征，包括血压、心率和体温。在内毒素注入后大约4小时，与基线测量处于一天的同一时间，测量了***性糖萼体积和微血管糖萼厚度。 

***性糖萼体积的估算 

***性糖萼体积按照以前发表的，通过从糖萼可渗透的示踪剂葡聚糖Dextran 40的血管内分布体积中减去循环血浆体积来估算(Nieuwdorp M等，2006.Diabetes 55：480-6；Suffredini等，1999，同上)。循环血浆体积使用以前发表的方法进行计算(Orth等，1998.AnesthAnalg 87：1234-8)。标记的自体红细胞的血管内分布体积被用于定量循环血浆体积。抽取血液，以1,330rpm离心5分钟。然后将荧光素钠(荧光素二钠25％，250mg/ml，AZUA Pharmacy，Amsterdam，theNetherlands)添加到红细胞级份中，放置5分钟。在仔细清洗后，将标记的红细胞重新悬浮在盐水中，恢复到初始体积(60ml)并重新注入。随后，在注入后第4、5、6和7分钟抽取血液。使用标记的红细胞在总红细胞池中的分数，来估算循环红细胞体积(V_ERY)。注射前未标记的红细胞用作阴性对照。标记的红细胞在血液中的分数使用FACScan分析仪(FACS Calibur 

，Becton Dickinson，Mountain View，USA)测量。计数至少100,000个细胞。数据通过Cellquest(BectonDickinson，San Jose，CA，USA)分析。在将肝素处理过的血液在5分钟内在Hettich-Haematokrit离心机(Hettich，Tuttlingen，Germany)中以 10,000rpm离心后，测量血细胞比容(Ht)。循环血浆体积使用下式从V_ERY和大血管Ht计算：循环血浆体积＝([1-Ht]x V_ERY)/Ht. 

葡聚糖40(Rheomacrodex；NPBI International，Emmercompascuum，the Netherlands)被用作探针，用于评估血管内体积，这包含了糖萼区的体积。在注入葡聚糖40之前，注射10ml葡聚糖1(Promiten；NPBIInternational，Emmer-compascuum，the Netherlands)药丸以减弱过敏性反应的风险。静脉内注射100ml葡聚糖40，然后在第5、7、10、15、20和30分钟重复取血样。通过在将葡聚糖40葡萄糖聚合物水解后测量注入后样品中葡萄糖浓度的增加，来计算葡聚糖40的浓度(Van Kreel等，1998.Clin Chim Acta 275：71-80)。每个时间点的葡萄糖浓度使用己糖激酶方法评估一式两份(Gluco-quant，Hitachi 917；Hitachi)。为了确定葡聚糖40的初始血管内分布体积，通过测量到的葡聚糖40浓度的指数拟合来估算注射时葡聚糖40的浓度。指数时间常数(τ[min])被用于确定葡聚糖40的***清除速度(τ^-1min^-1)。 

微血管糖萼的估算 

单个毛细血管中内皮糖萼的厚度，通过舌下微循环的垂直偏振光谱(OPS)成像进行测量(Cytometrics，Philadelphia，PA，USA)，正如以前所发表的(Nieuwdorp等，2006，同上；Nieuwdorp等，2006.Diabetes55：1127-32)。简单来说，在5个独立的毛细血管中，在毛细血管白细胞通过之前和之后立即测量流动的红细胞的宽度。在健康的毛细血管中，糖萼通过将红细胞与已知作为红细胞排除区的内皮腔内表面相分离，限制了毛细血管血液的填充。在稳态条件下，该红细胞排除区代表了限制内皮糖萼最大可能厚度的上限。因为白细胞暂时压缩毛细血管内皮糖萼，因此相应的毛细血管红细胞柱的暂时变宽可用于估计毛细血管糖萼的维度(Han等，2006.Journal of Fluid Mechanics 554：217-35)。使用5x物镜收集了以728×576像素尺寸记录的图像，提供了325×放大倍数，帧频为25/秒。图像的分析由单个观察人员使用ImagePro Plus(Media Cybernetics，Silverspring，MD，USA)进行，他对于参 加者的临床详细情况不了解。在自发的毛细血管白细胞通过之前和之后，使用数字测径器测量了毛细血管解剖学直径和流动红细胞柱的宽度。对于每个参加者，测定了至少5个毛细血管中糖萼的维度。计算这些结果的平均值，并用于进一步分析。此外，作为毛细血管密度的指示，对每个视野的毛细血管数量进行了计数。 

获取血样和实验室方法 

在基线测量时，以及在内毒素注入后t＝0和1/2、1、3、4和24小时时，从对象抽取血液样品。离心后，将等分试样在液氮中快速冷冻，储存在-80℃。白细胞血浆浓度以及亚分数在EDTA血浆中使用标准化的流式细胞分析测定。血浆CRP水平使用可商购测定试剂测量(Roche，Switzerland)。血浆可溶性2型TNFα受体(sTNFR2)水平使用酶联免疫吸附分析(ELISA)进行测量(R&D Systems Inc，Minneapolis，MN，USA)，作为有效的依那西普给药的标志物。由TNFα活性诱导的细胞因子血浆IL-6的水平，使用细胞测量珠阵列技术(Cytometric BeadArray technique)(R&D systems，Minneapolis，MN，USA)测量。凝血酶原活化片段F1+2(Dade Behring，Marburg，Germany)通过ELISA测量，以估算凝血酶产生。使用自动化定量乳胶颗粒免疫分析(Biomerieux，Durham，NC，USA)测量了D-二聚体水平，作为纤维蛋白形成和随后的内源性纤维蛋白溶解的反映。定量血浆透明质酸通过ELISA测量(Echelon Biosciences，Salt Lake City，UT，USA)，它测定了透明质酸(包括低和高分子量)总量。硫酸乙酰肝素在将血浆用肌动蛋白酶E(Sigma，St.Louis，MO，USA)预处理后通过ELISA测量(SeikagakuCorporation，Tokyo，Japan)。总血浆透明质酸酶活性使用以前发表的方法进行少量改动来测定(24)。简单来说，将CovaLink板(Nunc，Wiesbaden，Germany)用生物素化的透明质酸(0.2mg/mL，HyluMed 无菌IUO透明质酸钠，Genzyme Corp，Cambridge，MA，USA)包被。将血浆样品稀释800倍，添加到板中，在pH3.7下在37℃放置2.5小时。使用牛透明质酸酶(Sigma，St.Louis，MO，USA)制作标准曲线。透明质酸的剩余量通过与亲和素-生物素复合物(Vectastain，Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA)的结合，然后添加邻苯二胺(OPD)和30％H₂O₂来测定。板在读板器中在OD 492nm测量。 

单核细胞流式细胞术步骤 

将全血样品收集在无热源肝素锂试管中，然后与9倍体积的冰冷的红细胞裂解缓冲液温育10分钟，在4℃离心10分钟。将剩余的细胞用冰冷的PBS洗两次。为了进行流式细胞术分析，将0.5×10⁶个细胞温育在混合有抗体的FACS缓冲液中。按照制造商的推荐对所有反应试剂进行滴定，以获得最适的结果。细胞表面染色使用荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记的小鼠抗人类CD14抗体(IgG2a)，别藻蓝蛋白(APC)标记的抗人类CD18抗体(IgG1)和藻红蛋白(PE)标记的抗人类CD11b抗体(IgG1)和抗CD62L抗体(IgG1)(R&D Systems，San Jose，CA，USA)来进行。适合的同种型对照抗体被用于校正非特异性抗体结合。染色后，将细胞洗涤，固定在4％聚甲醛中，通过流式细胞术使用FACSCalibur流式细胞仪进行分析。数据使用CellQuest软件(BectonDickinson，Franklin Lakes，NJ，USA)分析。 

统计学分析 

所有值提供为平均值±SEM。内毒素-盐水和内毒素-依那西普组之间基线特征的差异通过独立样品T-检验进行分析。处理组内的变化通过单向方差分析法进行分析。处理组之间的变化通过双向方差分析法(相互作用处理和时间)进行分析。***性糖萼体积和其他参数之间的关联性使用spearman秩相关检验(双侧检验)来计算。P＜0.05被认为代表了统计学显著的差异。 

结果 

使用或不使用依那西普预处理情况下对内毒素注入的临床响应 

在内毒素注入之前，在盐水与依那西普组之间没有观察到临床特征的差异。内毒素注入和***性糖萼体积测量耐受良好，没有遇到严重的不利反应。内毒素注入引起特征性的临床症状，例如寒战、头痛、 肌痛和恶心。这些症状在两个组中都是暂时的，但是在盐水组中与依那西普组中相比，发生得更频繁和更强烈(数据未显示)。在依那西普预处理后，sTNFR2水平显著增加(从1.8±0.2到520±34ng/mL，p＜0.0001)，表明依那西普已有效给药。在内毒素注入后4小时，依那西普组中血浆水平保持升高(646±83ng/mL)，在盐水组中sTNFR2血浆水平仅受轻微影响(从2.1±0.3到内毒素注入后4小时的5.2±0.5，p＜0.01)。在盐水组中，内毒素注入后4小时，血压、心率和体温显著变化(收缩压：从127±11到119±5mmHg，ns；舒张压：从67±8到51±9mmHg，p＜0.01；心率：从59±6到82±5，p＜0.01；以及体温：从36.6±0.5℃到38.3±0.4℃，p＜0.01，所有参数都是与基线相比)。依那西普减弱了这些变化(收缩压：从125±7到123±10mmHg，ns；舒张压：从69±6到67±6mm Hg，ns；心率：从62±4到69±3，ns；以及体温：从36.6±0.5℃到37.3±0.5℃，ns，所有参数都是与基线相比)。 

依那西普减弱由内毒素诱导的糖萼扰动 

在两个组之间比较了基线***性糖萼的体积(盐水组：1.6±0.6对依那西普组：1.7±0.5升，ns)。在内毒素注入后，盐水组中***性糖萼的体积显著减小(到0.8±0.4升，p＜0.01)，这主要是由于葡聚糖40分布体积的减小(4.7±0.6到4.1±0.9升，p＜0.05，参见图1a和1b)。循环血浆体积增加(从3.1±0.4到3.3±0.7升，p＜0.05)，并伴有血细胞比容值的少量下降(0.44±0.03到0.41±0.03％，p＜0.01)。此外，内毒素导致葡聚糖40的***清除速度(τ^-1)的两倍的增加(从0.008±0.005到0.015±0.008min^-1，p＜0.01)。依那西普减弱了由内毒素诱导的糖萼体积的丧失(到1.1±0.2升，p＜0.01)，其基础在于降低了葡聚糖40分布体积(4.6±0.6到3.9±0.5升，p＜0.05)，而不影响循环血浆体积(2.9±0.5到2.8±0.6升，ns)，血细胞比容值(0.43±0.02到0.42±0.02％，ns)或葡聚糖40的***清除速度(0.009±0.002到0.009±0.001min^-1，ns)。 

对于微血管糖萼来说，内毒素注入导致盐水组中微血管糖萼中值 厚度的降低(从1.1到0.4μm，p＜0.01，参见图1c和1d)。糖萼的丧失导致毛细血管血液填充的轻微增加，正如由白细胞通过之前毛细血管红细胞柱的宽度的增加(从4.9±0.2到5.3±0.3μm，ns)所反映的。此外，糖萼的丧失伴随有毛细血管解剖学直径的减小(从7.0±0.2到6.2±0.3μm，p＜0.05)。在内毒素激惹后毛细血管密度显著降低(从每个视野60±18到44±16，p＜0.01)，在依那西普预处理组中具有类似的变化(从59±7到43±15，p＜0.01)。 

内毒素注入后糖萼成分的改变 

在内毒素注入后第一个小时内，盐水组中糖萼释放的标志物即血浆透明质酸水平显著上升(从62±18到85±24ng/mL，p＜0.05)，而依那西普减少了由内毒素诱导的释放(从58±13到46±10ng/mL，p＜0.05)(图2a)。在内毒素注入后4小时，盐水组中血浆透明质酸酶活性显著降低(与基线相比-56±20％，p＜0.01)，而在依那西普组中透明质酸酶活性没有受到影响(与基线相比-8±14％，ns；图2b)。值得注意的是，在内毒素激惹后4小时期间，硫酸乙酰肝素的血浆水平没有显著变化，不论对于何种预处理来说(盐水组：从5.3±1.1到5.5±1.2μg/mL对依那西普组：从5.4±1.3到5.1±1.0μg/mL，ns，与基线相比)。但是，在内毒素注入24小时后，在盐水组中血浆硫酸乙酰肝素水平增加得更多(11.2±2.1μg/mL对依那西普组的7.4±1.5μg/mL，p＜0.01)。 

依那西普处理降低了由TNFα诱导的炎性反应和凝结反应 

在内毒素激惹后，盐水组中的炎性标志物升高(IL-6：从4.2±6.3到678±427pg/mL，CRP：从0.5±0.4到26.7±7.6mg/L，p＜0.01，与基线相比，参见图3a和3b)。依那西普显著降低了这种增加(IL-6：从4.6±3.1到127±98pg/mL，p＜0.05，与基线相比，CRP：从0.6±0.4到16.0±3.4mg/L，p＜0.01，与基线相比，图3a和3b)。与此平行地，在内毒素后4小时，在两个处理组中，与基线相比循环白细胞的数量加倍。 

对于内毒素注入后白细胞的分化来说，在4小时时在盐水组中观察到了单核细胞计数的76±29％的显著下降(与基线相比p＜0.01)，而依那西普与51±32％的程度较低的下降相关(与基线相比p＜0.05)。在两个组之间，在CD14⁺单核细胞计数之间没有区别(27±10对26±13％，ns)。但是，在盐水后与依那西普相比，CD11b⁺/CD18⁺(Mac-1复合物)单核细胞计数较高(中值0.82±0.2对0.65±0.1，p＜0.01)。最后，在内毒素后4小时，在盐水组中表达CD62L⁺(L-选择蛋白)的单核细胞的百分率降到最低，而在依那西普组中，观察到了增加(-8±37％对+66±42％，p＜0.05)。 

于此平行，从内毒素激惹后3小时开始，盐水组中由内毒素诱导的凝血酶的产生和随后的纤维蛋白溶解的标志物明显增加(F1+2：从0.3±0.1到2.8±1.5nmol/L，D-二聚体：从.2±0.1到0.4±0.1mg/L，p＜0.05，与基线相比；图3c和3d)，然而依那西普明显降低了这种增加(F 1+2：从0.3±0.1到2.1±0.9nmol/L，以及D-二聚体：从0.2±0.1到0.3±0.1mg/L，p＜0.05)。当将两个组的基线和内毒素注入后4小时的数据合并时，在***性糖萼体积与F1+2或D-二聚体水平之间之间存在反相关性(分别为r＝-0.74和r＝-0.60，二者p＜0.01)。 

结论 

这些数据证明，部分由TNFα介导的炎性活性导致了内皮糖萼的扰动。这种机制造成了血管易感性的炎性诱导的增加。与本发明的数据相一致，本发明提供了炎性和血管疾病的诊断和治疗方法，包括检测和调节糖萼的健康。 

实施例2 

本实施例提供了本发明的方法和两种现有技术的方法之间的比较例。本发明的方法与(1)其中使用了由白细胞诱导的RBC宽度的暂时变宽的现有技术方法，以及(2)其中使用了示踪剂评估糖萼状态的现有技术方法进行了比较(参见图4)。 

本发明的方法(图4A和4C)通过执行确定了红细胞宽度(RBCW)、血管直径(VD)、毛细血管体积储备和糖萼宽度(GW)的尺寸分布测量，测量了灌注有红细胞(3)的单个毛细血管(1)中内皮糖萼(2)的状态。对于进行单个测量来说，血管需要可视化5秒，其中在至少10个血管中进行了超过100个RBCW测量。通过可视化大约1分钟，测量的数量可以增加至少10倍。测量的RBCW值的尺寸分布能够精确地评估糖萼的状态。 

2.1 由白细胞诱导的RBC宽度的短暂变宽

基于白细胞诱导的RBC宽度的短暂变宽的现有技术方法(图4B)，在所有可视化血管中每次测量测量了大约2个白细胞，因此在收集到足够确定糖萼状态的数据之前，需要至少10分钟的可视化时间。此外，应该指出，这种类型的测量只能够在稀少的允许白细胞(4)通过的血管上进行。对于小血管例如微血管来说，需要极其长的可视化时间。 

首先，使用这种方法获得的糖萼宽度的数据，可以与使用本发明的方法进行的测量相比。但是，应该指出，本发明的数据相对于现有技术的方法，误差容限较小，即百分置信度较高。这可以由个体白细胞宽度的差异来解释。 

其次，使用本发明的方法，与基于白细胞诱导的RBC宽度的短暂变宽的现有技术方法相比，数据的获得快10-100倍。 

2.2 示踪剂方法

使用在血流中添加示踪剂，进行了现有技术的糖萼状态的测量。该方法需要从患者获取血液，将血液在患者外部标记，并将标记的血液注入患者。几小时，通常4小时后，从患者抽取血液并分析。该分析提供了关于糖萼状态的信息。 

与本发明的方法相比： 

(1)该现有技术方法是非常劳动密集的，花费长时间； 

(2)该现有技术方法对于患者来说是非常令人不快的。事实上，某些患者对示踪剂发生了过敏反应，将患者的生命置于危险之中。 

(3)此外，因为某些较小的血管只允许被红细胞有限灌注，因此该现有技术方法只能提供可能不精确的糖萼状态的一个测量。 

实施例3 

本实施例证明了通过本发明的方法确立糖萼的状态，能够快速检测糖萼状态的变化。 

材料与方法 

通过执行尺寸分布测量，从而确定红细胞宽度(RBCW)、血管直径(VD)、毛细血管体积储备和糖萼宽度(GW)，测量了单个毛细血管中内皮糖萼的状态。使用MicroScan视频显微镜***(MicroVision Medical，The Netherlands)，获得了临床舌下视频显微图像。***是手持式视频显微镜，具有LED照明，装备有5x放大倍数。为了改善红细胞速度的评估，引入了频闪观测照明。***具有标准视频输出(PAL或NTSC)，与AD捕获装置相连，以便将图像转变成数字信号，直接记录到计算机硬盘驱动器上。 

这里，红细胞宽度(RBCW)被呈现为在便于单排红细胞注入的微血管区段处进行的红细胞宽度的多次测量的中值。血管直径(VD)是在便于单排红细胞注入的微血管区段处进行的红细胞宽度的多次测量的最大值或p99值，糖萼宽度是红细胞宽度与血管直径之间的间隙的维度。毛细血管体积储备(CVR)是(VD)^2/(RBCW)^2的比率。 

通过执行尺寸分布测量，从而从临床显微镜获得的图像确定RBCW，确定了糖萼的状态。对于测量来说，使用了直接从给定血管中红细胞柱宽度的连续测量值推演红细胞宽度、血管直径、糖萼宽度和 毛细血管体积储备的本发明的新算法。该方法分析了给定血管中超过1000个RBCW值的分布，从而显示出很少百分比的RBCW测量延伸到了内皮腔内膜上的糖萼结构域中，该结构域中一般不包含RBCs。在给定的微血管中，只需要几秒钟的RBC灌注，就允许分析糖萼的状态，并且给定视野中所有的微血管被同时分析。记录单个视野只花费数秒，多个视野的记录在一分钟或几分钟内完成。结果，获得了来自100个以上血管的红细胞宽度、血管直径、糖萼宽度和毛细血管体积储备的精确分布。 

结果 

在舌下喷洒三***酯处理的对象与未处理的对照对象之间，比较了糖萼状态的测量值。舌下喷洒三***酯提供了受控的刺激，因为已知三***酯引起糖萼的损伤。如图5a和5b中所示，可以在处理和未处理对象的糖萼状态之间看到明显的区别。如在本实施例中进行的糖萼状态的动态变化的检测，可以在几分钟内进行检测。糖萼的状态与RBCW直接相关(图5a对5b)。 

结果还显示，只分析100个RBCs，提供了类似的结果。 

结论 

这些数据证明，可以使用本发明的方法进行糖萼的状态的检测。此外，显示出本发明的方法提供了检测糖萼状态的动态变化的快速和准确的方法。 

实施例4 

本实施例证明了通过使用实施例2中描述的方法建立糖萼的状态，本发明能够区分癌症和健康对照情况下糖萼的状态。 

结果 

在被诊断患有癌症的对象与健康对照对象之间，比较了糖萼状态 的测量。如图6a和6b中所示，可以在健康和癌症对象的糖萼状态之间看到明显的区别。如在本实施例中进行的糖萼状态的动态变化的检测，可以在几分钟内进行检测。 

在用VEGF受体抑制化合物治疗诊断的对象后，该治疗的效果可以被可视化，如图7a和7b中所示。 

结论 

这些数据证明，糖萼的状态可用于诊断对糖萼的损伤，在本实施例中损伤由癌症引起。此外，可以评估使用特定化合物治疗癌症的效果。 

实施例5 

本实施例证明了通过使用实施例2中描述的方法建立糖萼的状态，本发明能够区分糖尿病和健康对照情况下糖萼的状态。此外，也可以评估治疗的效果。 

21名不吸烟，患有2型糖尿病，没有大血管疾病的明显病征的男性患者，被用作糖尿病组，其中大血管疾病的明显病症被定义为在身体检查时的心肌梗塞、中风、外周血管疾病史，或大血管疾病的病征。13名血糖正常、不吸烟、健康的男性对象，用作对照组。 

结果 

在被诊断患有糖尿病的对象(没有微蛋白尿)和健康对照对象之间，比较了糖萼状态的测量。如图8a和8b中所示，可以在健康和糖尿病对象的糖萼状态之间看到明显的区别。正如在本实施例中进行的糖萼状态的动态变化的检测，可以在几分钟内进行检测。 

在用糖模拟物化合物治疗经诊断的对象后，该治疗的效果可以被可视化，如图9a和9b中所示。 

结论 

这些数据证明，糖萼的状态可用于诊断对糖萼的损伤，在本实施例中损伤由糖尿病引起。此外，可以评估使用特定化合物治疗糖尿病的效果。 

Claims (3)

1.用于评估糖萼的状态的离体方法，包括下列步骤：

(a)测量在至少一个微血管的图像或显微镜记录中至少10个红细胞的宽度；

(b)对于至少10个微血管重复步骤(a)；以及

(c)从红细胞柱宽度测量值的尺寸分布获得糖萼宽度的估计值；其中糖萼宽度等于对应于最大红细胞宽度值的红细胞宽度分布的P99值与对应于红细胞宽度值中值的红细胞宽度分布的P50值之间的差的一半；

由此评估糖萼的状态。

2.权利要求1的方法，附加地包括下列步骤：

(d)从红细胞宽度测量值的尺寸分布确定毛细血管体积储备，其中毛细血管体积储备是最大红细胞宽度值的平方除以平均红细胞宽度值的平方。

3.用于鉴定调节糖萼状态的化合物、心血管风险因子或生活方式因子的离体方法，包括下列步骤：

(a)在存在和不存在所述化合物、心血管风险因子或生活方式因子的条件下，测量在至少一个微血管的图像或显微镜记录中至少10个红细胞的宽度；

(b)对于至少10个微血管重复步骤(a)；

(c)按照权利要求1或2的方法评估糖萼的状态，

其中在存在和不存在所述化合物、心血管风险因子或生活方式因子的条件下糖萼状态的差异鉴定调节糖萼的状态的所述化合物、心血管风险因子或生活方式因子。

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