CN101918589B - 糖尿病的诊断生物标志物 - Google Patents
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Abstract
本专利申请公开了用于鉴定在确诊患有前期糖尿病状态和显性II型糖尿病的患者的PBMC中差异表达的成组基因的方法。3基因特征和10基因特征据显示能准确地预测患者中的糖尿病状态。本专利申请还描述了用于在护理点设施快速诊断患者中的糖尿病状态的试剂盒。
Description
技术领域
本专利申请涉及医疗诊断领域,描述了用于对患者的糖尿病状态进行护理点检测诊断的方法和试剂盒。
相关专利申请的交叉引用
本专利申请要求于2007年11月13日提交的美国临时申请序列号60/987,540的优先权,该临时申请以引用方式全文并入本专利申请中。
背景技术
糖尿病是一组以胰岛素产生、胰岛素作用方面的缺陷或同时这两方面缺陷所引起的高血糖水平为特征的疾病。糖尿病如果不医治会造成许多严重的短期并发症,包括低血糖、酮酸症中毒或非酮症高渗性昏迷的症状。从长远来看,糖尿病据知会造成动脉硬化症、慢性肾衰竭、视网膜损伤(包括失明)、神经损伤和微血管损伤的风险增加。
糖尿病在发展中世界的流行据预测对美国的医疗保健体系具有深远影响。美国疾病控制和预防中心最近的研究表明,在过去十年里,美国糖尿病新发病例几乎翻倍。截止于2007年,美国至少5700万人患有前期糖尿病。加上已患有糖尿病的近2400万人,使得超过25%的美国人口有进一步发展糖尿病并发症的风险。根据美国糖尿病协会估计,2007年美国糖尿病耗费达1740亿美元,直接医疗费用接近1160亿美元。
尽管糖尿病的病因在本质上似乎是多因素的,但越来越多的实验证据提示,肥胖特别是腹部肥胖的发作会破坏免疫和代谢稳态,最终导致广泛的炎症应答。脂肪组织中产生炎性细胞因子如TNFα,于是免疫应答和细胞响应胰岛素的能力失调。因此,对循环免疫细胞(如单核细胞和巨噬细胞)的转录谱的变化的检测将能提供便利的途径,来在葡萄糖不耐受性的更明显征候变得显而易见之前,就能诊断糖尿病并监测其进展。
由于前述原因,对于用于诊断和监测有发展糖尿病风险的患者的快速、准确的诊断测定法,还存在着未得到满足的需求。具体地讲,对于以试剂盒型式进行的、可在护理点设施容易使用以便对患者进行早发性糖尿病例行筛选的诊断测定法,存在着未得到满足的需求。
发明内容
本公开内容描述了用于确定可诊断前期糖尿病和糖尿病疾病状态的基因特征(gene signature)表达谱的方法。本公开内容还涉及包含用于快速测量患者血样中的基因特征表达谱的试剂的诊断试剂盒。所述试剂盒形式有着高性价比,且便于在护理点设施使用。
在一个实施例中,描述了一种用于诊断患者的糖尿病的方法,该方法包括以下步骤:(a)提供取自患者的测试样本,(b)测量包含选自TOP1、CD24和STAP1基因的基因的基因特征的基因表达谱,(c)将该基因表达谱与诊断用的该基因特征的基因表达谱进行比较,(d)至少部分地基于该基因表达谱与该诊断用基因表达谱之间的基本匹配确定该患者中的糖尿病状态,以及(e)将该确定结果显示给医疗人员。
该确定步骤可通过运行一种或更多种选自以下的算法的计算机***来执行:基因表达信号的线性组合、线性回归模型、Logistic回归模型、线性判别分析(LDA)模型、最近邻模型和微阵列预测分析(PAM)。该确定步骤还可包括对该患者的代谢疾病谱的分析。
该基因特征可包括任意两种选自TOP1、CD24和STAP1基因的基因或者所有三种基因。在一个实施例中,该基因特征可包括一种或更多种选自TOP1、CD24和STAP1基因的基因以及一种或更多种选自表1或6中所列基因的基因。
该患者可具有正常BMI。该糖尿病状态可以是前期糖尿病状态或2型糖尿病状态。
该测试样本可以是血样或含有PBMC或CD11c+或CD11b+或Emr+或[CD11b+CD11c+]或[Emr+CD11b+]或[Emr+CD11c+]或[Emr+CD11b+CD11c+]细胞或者CD14+单核细胞的测试样本。
该测量可涉及实时PCR、免疫化学测定或特异性寡核苷酸杂交。
在另一个实施例中,描述了一种用于诊断患者的糖尿病的方法,该方法包括以下步骤:(a)提供取自患者的测试样本,(b)测量包含选自TULP4、AA741300、ESCO1、EIF5B、ACTR2、WNK1、COCH、SON、TPR和NOG基因的基因的基因特征的基因表达谱,(c)将该基因表达谱与诊断用的该基因特征的基因表达谱进行比较,(d)至少部分地基于该基因表达谱与该诊断用基因表达谱之间的基本匹配确定该患者中的糖尿病状态,以及(e)将该确定结果显示给医疗人员。
该确定步骤可通过运行一种或更多种选自以下的算法的计算机***来执行:基因表达信号的线性组合、线性回归模型、Logistic回归模型、线性判别分析(LDA)模型、最近邻模型和微阵列预测分析(PAM)。该确定步骤还可包括对该患者的代谢疾病谱的分析。
该基因特征可包括任意两个或任意三个选自TULP4、AA741300、ESCO1、EIF5B、ACTR2、WNK1、COCH、SON、TPR和NOG基因的基因。在一个方面,该基因特征包括TULP4、AA741300、ESCO1、EIF5B、ACTR2、WNK1、COCH、SON、TPR和NOG基因。在一个方面,该基因特征除了包括至少一个选自TULP4、AA741300、ESCO1、EIF5B、ACTR2、WNK1、COCH、SON、TPR和NOG基因的基因之外,还包括TOP1、CD24和STAP1基因。在另一个方面,该基因特征包括一种或更多种选自TULP4、AA741300、ESCO1、EIF5B、ACTR2、WNK1、COCH、SON、TPR和NOG基因的基因以及一种或更多种选自表1或6中所列基因的基因。
该患者可具有正常BMI。该糖尿病状态可以是前期糖尿病状态或2型糖尿病状态。
该测试样本可以是血样或含有PBMC或CD11c+或CD11b+或Emr+或[CD11b+CD11c+]或[Emr+CD11b+]或[Emr+CD11c+]或[Emr+CD11b+CD11c+]细胞或者CD14+单核细胞的测试样本。
该测量可涉及实时PCR、免疫化学测定或特异性寡核苷酸杂交。
在一个实施例中,描述了一种用于诊断患者的糖尿病的方法,该方法包括以下步骤:(a)提供取自患者的测试样本,(b)测量包含TCF7L2和CLC基因的基因特征的基因表达谱,(c)将该基因表达谱与诊断用的该基因特征的基因表达谱进行比较,(d)至少部分地基于该基因表达谱与该诊断用基因表达谱之间的基本匹配确定该患者中的糖尿病状态,以及(e)将该确定结果显示给医疗人员。
该确定步骤可通过运行一种或更多种选自以下的算法的计算机***来执行:基因表达信号的线性组合、线性回归模型、Logistic回归模型、线性判别分析(LDA)模型、最近邻模型和微阵列预测分析(PAM)。该确定步骤还可包括对该患者的代谢疾病谱的分析。
该基因特征可包括TCF7L2或CLC基因。在一个方面,该基因特征包括TC7L2或CLC基因的一种或更多种变体。在一个方面,该基因特征包括TCF7L2或CLC基因以及一种或更多种选自表1或6中所列基因的基因。
该患者可具有正常BMI。该糖尿病状态可以是前期糖尿病状态或2型糖尿病状态。
测试样本可以是血样或者含有PBMC或者CD11c+或CD11b+或Emr+或[CD11b+CD11c+]或[Emr+CD11b+]或[Emr+CD11c+]或[Emr+CD11b+CD11c+]细胞或者CD14+单核细胞的测试样本。
该测量可涉及实时PCR、免疫化学测定或特异性寡核苷酸杂交。
在一个实施例中,描述了一种诊断患者的糖尿病状态变化的方法,该方法包括以下步骤:(a)提供在第一时间点取自患者的第一测试样本,(b)测量该第一测试样本中包含选自TOP1、CD24和STAP1基因的基因的基因特征的第一表达谱,(c)提供在第二时间点取自该患者的第二测试样本,(d)测量该第二测试样本中该基因特征的第二表达谱,(e)将该第一表达谱与该第二表达谱进行比较,(f)至少部分地基于该第一基因表达谱与该第二基因表达谱之间的基本差异确定该患者中的糖尿病状态的变化,以及(e)将该确定结果显示给医疗人员。
在一个方面,该确定步骤可通过运行一种或更多种选自以下的算法的计算机***来执行:基因表达信号的线性组合、线性回归模型、Logistic回归模型、线性判别分析(LDA)模型、最近邻模型和微阵列预测分析(PAM)。在另一个方面,该确定步骤还可包括对该患者的代谢疾病谱的分析。
该基因特征可包括任意两种选自TOP1、CD24和STAP1基因的基因。在一个方面,该基因特征包括TOP1、CD24和STAP1基因。在另一个方面,该基因特征包括选自TOP1、CD24和STAP1基因的基因以及一种或更多种选自表1或6中所列基因的基因。
在一个方面,第一时间点和第二时间点之间的时间间隔为0年至2年,或1/4年至2年,或1/2年至2年,或2年至5年,或5年至10年,或者更长。
糖尿病状态的变化可指示向前期糖尿病状态或I I型糖尿病状态的进展。在一个方面,患者在第一时间点具有正常BMI。
第一和第二测试样本可以是血样。在一个方面,第一和第二测试样本可以是含有PBMC或者CD11c+或CD11b+或Emr+或[CD11b+CD11c+]或[Emr+CD11b+]或[Emr+CD11c+]或[Emr+CD11b+CD11c+]细胞或者CD14+单核细胞的测试样本。
该测量可涉及实时PCR、免疫化学测定或特异性寡核苷酸杂交。
在一个实施例中,描述了一种用于诊断患者的糖尿病状态变化的方法,所述方法包括以下步骤:(a)提供在第一时间点取自患者的第一测试样本,(b)测量该第一测试样本中包含选自TULP4、AA741300、ESCO1、EIF5B、ACTR2、WNK1、COCH、SON、TPR和NOG基因的基因的基因特征的第一表达谱,(c)提供在第二时间点取自该患者的第二测试样本,(d)测量该第二测试样本中该基因特征的第二表达谱,(e)将该第一表达谱与该第二表达谱进行比较,(f)至少部分地基于该第一基因表达谱与该第二基因表达谱之间的基本差异确定该患者中的糖尿病状态的变化,以及(e)将该确定结果显示给医疗人员。
在一个方面,该确定步骤可通过运行一种或更多种选自以下的算法的计算机***来执行:基因表达信号的线性组合、线性回归模型、Logistic回归模型、线性判别分析(LDA)模型、最近邻模型和微阵列预测分析(PAM)。在另一个方面,该确定步骤还可包括对该患者的代谢疾病谱的分析。
该基因特征可包括任意两种选自TULP4、AA741300、ESCO1、EIF5B、ACTR2、WNK1、COCH、SON、TPR和NOG基因的基因。在另一个方面,该基因特征包括任意三个选自TULP4、AA741300、ESCO1、EIF5B、ACTR2、WNK1、COCH、SON、TPR和NOG基因的基因。在一个方面,该基因特征包括TULP4、AA741300、ESCO1、EIF5B、ACTR2、WNK1、COCH、SON、TPR和NOG基因。在另一个方面,该基因特征包括一种或更多种选自TULP4、AA741300、ESCO1、EIF5B、ACTR2、WNK1、COCH、SON、TPR和NOG基因的基因以及一种或更多种选自表1或6中所列基因的基因。
在一个方面,第一时间点和第二时间点之间的时间间隔为0年至2年,或1/4年至2年,或1/2年至2年,或2年至5年,或5年至10年,或者更长。
糖尿病状态的变化可指示向前期糖尿病状态或I I型糖尿病状态的进展。在一个方面,患者在第一时间点具有正常BMI。
第一和第二测试样本可以是血样。在一个方面,第一和第二测试样本可以是含有PBMC或者CD11c+或CD11b+或Emr+或[CD11b+CD11c+]或[Emr+CD11b+]或[Emr+CD11c+]或[Emr+CD11b+CD11c+]细胞或者CD14+单核细胞的测试样本。
该测量可涉及实时PCR、免疫化学测定或特异性寡核苷酸杂交。
在另一个实施例中,描述了一种用于评估患者的糖尿病易感性的试剂盒,其中该评估用测试仪器作出。该试剂盒包括:(a)用于从患者收集测试样本的试剂;和(b)用于测量患者的测试样本中包含TCF7L2和CLC基因或其变体的基因特征的表达谱的试剂。
步骤(a)和(b)中的试剂足以进行多个测试。用于从患者收集测试样本的试剂可包装在无菌容器中。
该基因特征可包括一种或更多种选自TCF7L2和CLC基因的基因以及一种或更多种选自表1或6中所列基因的基因。
该测试样本可以是血样。
该试剂盒还可包括用于分离PBMC的试剂,或者用于分离CD11c+或CD11b+或Emr+或[CD11b+CD11c+]或[Emr+CD11b+]或[Emr+CD11c+]或[Emr+CD11b+CD11c+]细胞的试剂,或者用于分离CD14+单核细胞的试剂。用于测量基因特征的表达谱的试剂可以是实时PCR试剂、免疫化学测定试剂或特异性寡核苷酸杂交试剂。
在另一个实施例中,描述了一种用于评估患者的糖尿病易感性的试剂盒,其中该评估用测试仪器作出。该试剂盒包括:(a)用于从患者收集测试样本的试剂;和(b)用于测量患者的测试样本中包含TOP1、CD24和STAP1基因或其变体的基因特征的表达谱的试剂。
该基因特征可包括任意两种选自TOP1、CD24和STAP1基因的基因。在另一个方面,该基因特征包括一种或更多种选自TOP1、CD24和STAP1基因的基因。在另一个方面,该基因特征包括一种或更多种选自TOP1、CD24和STAP1基因的基因以及一种或更多种选自表1或6中所列基因的基因。
步骤(a)和(b)中的试剂足以进行多个测试。用于从患者收集测试样本的试剂可包装在无菌容器中。
该测试样本可以是血样。
该试剂盒还可包括用于分离PBMC的试剂,或者用于分离CD11c+或CD11b+或Emr+或[CD11b+CD11c+]或[Emr+CD11b+]或[Emr+CD11c+]或[Emr+CD11b+CD11c+]细胞的试剂,或者用于分离CD14+单核细胞的试剂。用于测量基因特征的表达谱的试剂可以是实时PCR试剂、免疫化学测定试剂或特异性寡核苷酸杂交试剂。
在另一个实施例中,描述了一种用于评估患者的糖尿病易感性的试剂盒,其中该评估用测试仪器作出。该试剂盒包括:(a)用于从患者收集测试样本的试剂;和(b)用于测量患者的测试样本中包含选自TULP4、AA741300、ESCO1、EIF5B、ACTR2、WNK1、COCH、SON、TPR和NOG基因的基因或其变体的基因特征的表达谱的试剂。
在一个方面,该基因特征包括一种或更多种选自TULP4、AA741300、ESCO1、EIF5B、ACTR2、WNK1、COCH、SON、TPR和NOG基因的基因。在一个方面,该基因特征包括两种或更多种选自TULP4、AA741300、ESCO1、EIF5B、ACTR2、WNK1、COCH、SON、TPR和NOG基因的基因。在一个方面,该基因特征包括三种或更多种选自TULP4、AA741300、ESCO1、EIF5B、ACTR2、WNK1、COCH、SON、TPR和NOG基因的基因。
步骤(a)和(b)中的试剂足以进行多个测试。用于从患者收集测试样本的试剂可包装在无菌容器中。
该基因特征还可包括一种或更多种选自TULP4、AA741300、ESCO1、EIF5B、ACTR2、WNK1、COCH、SON、TPR和NOG基因的基因以及一种或更多种选自表1或6中所列基因的基因。
该测试样本可以是血样。
该试剂盒还可包括用于分离PBMC的试剂,或者用于分离CD11c+或CD11b+或Emr+或[CD11b+CD11c+]或[Emr+CD11b+]或[Emr+CD11c+]或[Emr+CD11b+CD11c+]细胞的试剂,或者用于分离CD14+单核细胞的试剂。用于测量基因特征的表达谱的试剂可以是实时PCR试剂、免疫化学测定试剂或特异性寡核苷酸杂交试剂。
应理解,本专利申请并不限于本“发明内容”中所公开的实施例,而是意在涵盖在本领域技术人员技能范围内且由所附权利要求书限定的修改形式和变化形式。
前面描述的实施例具有许多优点,包括用于前期糖尿病状态的早期诊断及用于对有发展糖尿病风险或已患上糖尿病的患者进行监测的新基因特征。本公开内容还描述了带有试剂和说明书、供医疗人员在护理点设施对血样进行具有高性价且快速的检测的试剂盒。
附图说明
图1示出根据第一实施例的CLC基因对比OGTT的ROC曲线分析;
图2A示出根据第二实施例的TCF7L2组1对比OGTT的ROC曲线分析;
图2B示出根据第三实施例的TCF7L2组1+FPG对比OGTT的ROC曲线分析;
图3显示根据第四实施例的CDKN1C基因的ROC曲线分析;
图4A显示根据第五实施例的3基因特征对比OGTT的ROC分析;
图4B示出根据第六实施例的3基因特征+FPG对比OGTT的ROC分析;
图4C示出根据第七实施例的3基因特征的平均表达的柱形图;
图5A显示根据第八实施例的10基因特征对比OGTT的ROC分析;
图5B示出根据第九实施例的10基因特征+FPG对比OGTT的ROC分析;和
图5C示出根据第十实施例的10基因特征的平均表达的柱形图;
具体实施方式
除非另有定义,否则本文所用的所有技术和科学术语,其含义与本领域技术人员通常理解的含义相同。提供以下定义以帮助阐释本专利申请的公开内容和权利要求。如果本章节中的定义与别处的定义不一致,则以部分中给出的定义为准。
此外,本发明的实施应用到在本领域技术范围内的常规分子生物学技术和免疫学技术,除非另外指明。这些技术是技术人员公知的,且在文献中有充分的说明。参见例如Colignan、Dunn、Ploegh、Speicher和Wingfield“Current protocols in ProteinScience”(1999-2008)(《蛋白质科学实验指南》(1999-2008))第I和II卷,包括所有增补本(JohnWiley&Sons Inc.);以及Bailey,J.E.和Ollis,D.F.,BiochemicalEngineeringFundamentals(《生化工程原理》),McGraw-Hill BookCompany,NY,1986;Ausubel等人编辑,Current Protocols inMolecular Biology(《分子生物学实验手册》),John Wiley&Sons,Inc.,NY,N.Y.(1987-2008),包括所有增补本;Sambrook等人,Molecular Cloning:ALaboratory Manual(《分子克隆实验指南》),第2版,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989);以及Harlow和Lane,Antibodies,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)。Tom Fawcett著的“An Introduction to ROC Analysis”(《ROC分析导论》),PatternRecognition Letters 27(2006)861-874中对ROC分析进行了综述。
本文所用的“糖尿病”指任何以高浓度血液葡萄糖(高血糖)为特征的疾病。若显示以下任何一项,则确诊为糖尿病:空腹血糖含量为126mg/dL(7.0mmol/l)或以上,或在葡萄糖耐量试验中口服75g葡萄糖两小时后血糖在200mg/dL(11.1mmol/l)或以上,或者有高血糖的症状且偶然血糖在200mg/dL(11.1mmol/l)或以上。
如本文所用的,糖尿病指“1型糖尿病”或“2型糖尿病”或其他形式的糖尿病,1型糖尿病也称儿童期糖尿病、青少年糖尿病和胰岛素依赖性糖尿病(IDDM),2型糖尿病也称成人期糖尿病、肥胖症相关糖尿病和非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM),其他形式的糖尿病包括妊娠糖尿病、胰岛素抗性1型糖尿病(或“双重糖尿病”)、成人隐匿性自身免疫糖尿病(或简称LADA)和青少年成人起病型糖尿病(简称MODY,为具有强家族史的一组几种单基因疾病,在30岁年龄之前表现为2型糖尿病)。
本文所用的“糖尿病状态”指前期糖尿病状态、中期糖尿病状态(其特征为疾病阶段比前期糖尿病状态更晚)和本文所定义的显性糖尿病(包括I型和I I型糖尿病)的特征性疾病状态。
如本文所用的,“前期糖尿病状态”是患者的空腹血糖耐受性异常和空腹血糖耐受性异常的这么一种疾病状态。空腹血糖耐受性异常定义为血液葡萄糖水平在100至125mg/dL(6.1至7.0mmol/l),即空腹血糖耐受性异常。口服75g葡萄糖两小时后血糖在140mg/dL(或7.8mmol/l)或以上但不超过200mg/dL的患者,认定为葡萄糖耐受性异常。
如本文所用的,“医疗人员”是医师或经过训练的医疗技师或护理点设施的护士。
“护理点”设施可以是住院病人场所(如医院)或者门诊病人场所(如医生诊所或不需预约的诊所)。在一个实施例中,诊断测定法可作为市售试剂盒连同用于分析血样中的基因特征表达谱的仪器一起分发给消费者。在另一个实施例中,市售试剂盒可与用于监测血液葡萄糖水平的仪器和试剂组合在一起。
术语“血液葡萄糖水平”指血液中的葡萄糖浓度。正常血液葡萄糖水平(正常血糖)大约为120mg/dl。在非糖尿病人中,这个数值最大波动30mg/dl。
“高血糖”状况是血液葡萄糖水平过高的这么一种状况。通常,当血液葡萄糖水平升高到180mg/dl以上时出现高血糖。
如本文所用的,“测试样本”是任何来自患者的、含有响应糖尿病状态而差异表达基因的细胞的生物样本。生物样本可以是任何从特应性或非特应性哺乳动物(如人类)分离的生物材料,包括血液的细胞成分、骨髓、血浆、血清、淋巴、脑脊髓液或者其他分泌物如泪液、唾液或乳汁;组织或器官活检样本;或者培养的细胞。优选地,生物样本是可以最小的干预从患者收集的细胞样本。在一个优选的实施例中,测试样本是血样,或PBMC(外周血单核细胞)或CD14+单核细胞或CD11b+或CD11c+或Emr+细胞的制品。
哺乳动物可以是人类,或者可以是家畜、伴侣动物或动物园动物。虽然特别设想的是本文所描述的诊断工具适用于人类的医学治疗,但它们也可应用于兽医治疗,包括治疗伴侣动物(如狗和猫)和家畜(如马、牛和羊),或者动物园动物(如非人灵长类、猫科动物、犬科动物、牛科动物和有蹄类动物)。
如本文所用的,术语“基因表达”指通过基因的“转录”(例如通过RNA聚合酶的酶促作用)将基因中编码的遗传信息转换成RNA(例如mRNA、rRNA、tRNA或snRNA)的过程,对于编码蛋白质的基因而言,还指通过mRNA的“翻译”转换成蛋白质的过程。
“基因表达谱”指经鉴定的至少一种多核苷酸或蛋白质在生物样本中表达的表达水平。
如本文所用的,术语“引物”指天然出现的(例如作为限制性酶切片段)或合成产生的寡核苷酸,其在被置于存在核苷酸和用于核酸聚合的物质(如DNA依赖性或RNA依赖性聚合酶)的合适条件(例如缓冲液、盐、温度和pH)下时,能够充当与核酸链(模板或靶标序列)互补的引物延伸产物的合成的引发点。引物必须足够长,以在用于聚合的物质的存在下引发延伸产物的合成。典型的引物含有与靶标序列基本上互补或同源的、长度至少约10个核苷酸的序列,但优选稍长的引物。通常,引物含有约15-26个核苷酸。
如本文所用的,“基因特征”指选定的一组基因的基因表达模式,该模式提供生物样本的独特标识符。如果该组选定基因的基因表达模式与取自有糖尿病状态的患者的参考样本中的基因特征基本匹配,则该组选定基因的基因特征可诊断糖尿病状态。出于本专利申请的目的,“基因特征”可以是核酸或多肽序列(如果基因是蛋白质编码基因的话)的预定组合。基因特征可包含功能未知的基因或者没有开放阅读框的基因,包括但不限于rRNA、UsnRNA、微RNA或tRNA。
如本文所用的,“诊断用基因表达谱”指取自诊断具有特定疾病状态的患者的生物样本中的基因特征的基因表达谱。疾病状态可以是糖尿病状态或非糖尿病状态。来自患者的测试基因表达谱与表征糖尿病状态的诊断用基因表达谱之间的“基本匹配”可指示该患者有糖尿病状态。或者,来自患者的测试基因表达谱与表征非糖尿病状态的诊断用基因表达谱之间的“基本匹配”可指示该患者没有糖尿病状态。
如本文所用的,基因的“变体”意指与该基因有至少约75%同一性、更优选至少约85%同一性、极其优选至少约90%同一性、还更优选至少约95-99%同一性的基因序列,所述同一性是当将这些DNA序列与普遍野生型基因的核酸序列相比较时得出的。在一个实施例中,基因的变体是在该基因的DNA序列中有一个或多个改变的基因,所述改变包括但不限于点突变或单核苷酸多态性、缺失、***、重排、剪接供体或受***点突变以及假基因的特征性基因变更。在本专利申请当中,基因隐含包括本文所定义的该基因野生型及变体形式。
如本文所用的,“基本匹配”指测试样本中基因特征的基因表达谱与取自有确定疾病状态的患者的参考样本中基因特征的基因表达谱的比较。如果该基因特征在测试样本和参考样本中的表达水平基本上相同,则该两个表达谱“基本匹配”。也就是说,在将两个样本归一化后,它们之间没有统计学上显著的差异。在一个实施例中,基本匹配的表达谱的置信区间为至少约50%,或者约50%至约75%,或者约75%至约80%,或者约80%至约85%,或者约85%至约90%,或者约90%至约95%。在一个优选的实施例中,基本匹配的表达谱的置信区间为约95%至约100%。在另一个优选的实施例中,基本匹配的表达谱的置信区间为约95%至约100%之间的任何数值。在另一个优选的实施例中,基本匹配的表达谱的置信区间为约95%或约96%或约97%或约98%或约99%或约99.9%。
如本文所用的,“基本差异”指某基因特征在一个时间点的基因表达谱与该同一基因特征在另一时间点的基因表达谱的差异。如果该基因特征在第一和第二时间点的表达水平不同,也就是说两个样本归一化后,它们之间有统计学上显著的差异,则两个表达谱有“基本差异”。在一个实施例中,如果基因特征在第一和第二时间点的表达水平在计算出的置信区间之外,则两个表达谱有“基本差异”。在一个实施例中,基本差异的表达谱的置信区间小于约50%,或者小于约75%,或者小于约80%,或者小于约85%,或者小于约90%,或者小于约95%。
95%置信区间(CI)等于AUC+1.96×AUC的标准偏差,其中AUC为ROC曲线下面积。
如本文所用的,“ROC”指接受器操作特征(receiver operatingcharacteristic)曲线,或者简称ROC曲线,这是二进制分类器***在其甄别阈变动过程中灵敏度对(1-特异性)的图解曲线。
如本文所用的,术语“诊断”(名词或动词)指将一种糖尿病状态与另一种糖尿病状态区别开来的方法,或者相对于“正常”或“非糖尿病”(非特应性)状态而言确定患者(特应性)中是否存在糖尿病状态的方法,和/或确定糖尿病状态的性质的方法。
如本文所用的,“确定糖尿病状态”指对可用于诊断有糖尿病状态或病症的患者和/或可用于将该疾病进行分类的所信息的综合。这种信息包括但不限于家族史、人类遗传学数据、BMI、身体活动、代谢疾病谱以及取自患者的测试样本中一种或更多种基因特征的表达谱的统计分析结果。在护理点环境中,这种信息由装有适当的数据分析软件的计算机***进行分析和显示。对临床数据的综合能给主治医师提供确定该患者是否有糖尿病病症所需要的信息、与糖尿病的性质或分类有关的信息以及与预后有关的信息和/或可用于选择适当治疗法的信息。在一个实施例中,本文所述的诊断测定法能使医疗人员确定所开出的医学治疗的功效。
如本文所用的,“代谢疾病谱”指多种可诊断糖尿病状态的标准代谢度量和其他风险因子,包括但不限于空腹血糖、胰岛素、胰岛素原、c-肽、完整胰岛素、BMI、腰围、GLP-1、脂联蛋白、PAI-1、血红蛋白A1c、HDL、LDL、VLDL、甘油三酯、游离脂肪酸。可用代谢疾病谱来产生相当于2小时OGTT的优异分类模型。
葡萄糖耐量测试是施用葡萄糖以确定它从血液中被清除的速度有多快。该测试通常用来检测糖尿病、胰岛素抗性,有时用于检测反应性低血糖。葡萄糖通常是口服给予,因此该普通测试在技术上是一种口服葡萄糖耐量测试(OGTT)。
空腹血糖测试(FPG)是碳水化合物代谢测试,其测量禁食后的血浆或血液葡萄糖水平。禁食会刺激胰高血糖素这种激素的释放,继而提高血糖水平。对于没有糖尿病的人,身体会产生并处理胰岛素,以抵消葡萄糖水平的上升。有糖尿病的人不会发生这种情况,测试的葡萄糖水平将保持高水平。
本文所用的体重指数(BMI)或Quetelet指数是一种将个人的体重与身高相比较的统计测度。由于其容易测量和计算,它是鉴别肥胖症的最常用诊断工具。
如本文所用的,NGT是指正常葡萄糖耐量,IGT是指葡萄糖耐受性异常,T2D是指2型糖尿病。
如本文所用的,CD11c+、CD11b+和Emr+是人单核细胞/巨噬细胞和髓样细胞以及它们的前体的细胞表面标志物。在小鼠中,最常用的单核细胞/巨噬细胞和髓样细胞表面标志物是F4/80和CD11b,不过已报道F4/80抗体和CD11b抗体能分别与嗜酸性粒细胞和树突细胞以及NK细胞和其他T细胞和B细胞亚类反应(Nguyen等人(2007)J Biol Chem 282,35279-35292;Patsouris等人(2008)Cell Metab.8,301-309)。小鼠中的F4/80基因是人Emr 1基因的直向同源物。小鼠CD11c基因的人直向同源物是ITGAX,也称整联蛋白,αX(补体成分3受体4亚基);SLEB6;OTTHUMP00000163299;leu M5,α亚基;白血病表面抗原p150,95,α亚基;骨髓膜抗原,α亚基;p150 95整联蛋白α链(染色体:16;位置:16p11.2注释:染色体16,NC_000016.8(31274010..31301819)MIM;151510,GeneID:3687)。小鼠CD11b基因的人直向同源物是ITGAM或整联蛋白,αM(补体成分3受体3亚基),也称CD11B、CR 3A、MAC-1、MAC1A、MGC117044、MO1A、SLEB6、巨噬细胞抗原α多肽;嗜中性粒细胞黏附受体α-M亚基(染色体:16;位置:16p11.2,染色体16,NC_000016.8(31178789..31251714),MIM:120980,GeneID:3684)。可用适当的人血细胞分离试剂盒(StemCell Technologies),通过阳性选择从PBMC纯化得到CD11c+、CD11b+和Emr+和CD14+细胞。然后通过对抗适当的细胞表面标志物的荧光缀合抗体(BioLegend)的流式细胞术染色,确证分离的细胞群体的纯度(>85%)。
如本文所用的,“实时PCR”指实时聚合酶链式反应,也称定量实时聚合酶链式反应(Q-PCR/qPCR)或动力学聚合酶链式反应。实时PCR是一种基于聚合酶链式反应的实验室技术,用来扩增并同时定量靶向的DNA分子。它使得可以同时检测和定量DNA样本中的特定序列(作为绝对拷贝数来定量,或者相对于DNA输入或另外的归一化基因进行归一化时,作为相对数量来定量)。
如本文所用的,免疫化学测定是应用(一种或更多种)抗体与其抗原的反应来测量细胞提取物中某物质的浓度的生化测试。在本公开说明书中,抗原是构成基因特征的任何一种蛋白质编码基因所表达的蛋白质。在一个优选的实施例中,免疫化学测定是酶联免疫吸附测定(ELISA)。
如本文所用的,“特异性寡核苷酸杂交”指固相载体(如芯片)上的探针序列与从患者的测试样本当中的转录物产生的cDNA序列之间的杂交。如果两个核酸序列基本上互补,则发生杂交,该杂交与测试样本中cDNA序列的量成正比。然后可用本领域公知的技术实现对杂交的检测。有许多因素会影响两个核酸的杂交的效率和选择性,所述两个核酸的杂交为例如阵列上的核酸成员与靶标核酸序列的杂交。这些因素包括核酸成员长度、核苷酸序列和/或组成、杂交温度、缓冲液组成以及该核酸成员需要杂交的区域中出现空间位阻的潜在可能性。核酸成员长度和核酸成员与靶标序列退火的效率和准确性这两者之间都存在正相关性。具体地讲,与较短的序列相比,较长的序列具有较高的解链温度(TM),且在给定的靶标序列当中被重复的可能性较低,从而使随意的杂交减至最低。杂交温度与核酸成员退火效率反向变化,杂交混合物中可包括的有机溶剂(例如甲酰胺)的浓度也是如此,而盐浓度的增加则有助于结合。在严格退火条件下,较长的核酸比较短的核酸更有效地退火,不过这些较短的核酸在较为宽容的条件下是足够的。
如本文所用的,术语“抗体”包括多克隆抗体和单克隆抗体;且可为完整分子、其片断(如Fv、Fd、Fab、Fab′和F(ab)′2片断)或者完整分子和/或其片断的多聚体或聚集体;且可天然存在或例如通过免疫、合成或基因工程产生。
如本文所用的,表1、7、8、9、10A和10B中所指的探针是指呈现在GeneChip人基因组U133 Plus 2.0阵列上的探针组。
以下描述涉及本专利申请的某些实施例,以及涉及诊断患者中的糖尿病状态的具体方法。具体地讲,本专利申请提出,相比于没有糖尿病状态的患者,有多种基因在取自有糖尿病或前期糖尿病的患者的外周血单核细胞(PMBC)中存在差异表达,这些基因包括一些之前不曾认为与糖尿病状态有关的基因在内。
在一个实施例中,用微阵列分析鉴定在NGT和T2D的PBMC中差异表达的基因。用Affymetrix人基因组HG-U133Plus2芯片根据厂商说明书,对得自NGT和T2D患者(在本实例中为一群共107名患者)的PBMC的转录物进行初始筛选。选出了大约200个差异表达的基因,用微阵列显著性分析(SAM)程序得出它们的错误发现率FDR<20%,NGT和T2D之间变化倍数>1.7(参见表1)。
现通过确定在初始微阵列筛选中鉴定出的糖尿病易感性基因的不同组合的差异表达,来描述糖尿病分类的方法(参见表12A)。表12A还包括每个选定基因的Genbank检索号。
可用多种不同的技术在生物样本中测量糖尿病易感性基因的基因表达。例如,可通过使用反转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)和标记有可检测部分的寡核苷酸杂交探针,便利地实现从不同mRNA的混合物当中鉴定来自糖尿病易感性基因的mRNA。
首先,从患者收集测试样本。为获得高质量RNA,有必要使细胞裂解过程中释放的RNA酶的活性减至最低。这通常通过使用能破碎组织并同时失活或抑制RNA酶的分离方法来实现。对于内源核糖核酸酶含量低的标本,分离方案通常采用这样的提取缓冲液,其含有用以溶解细胞膜的去垢剂,以及RNA酶的抑制剂如胎盘核糖核酸酶抑制剂或氧钒基-核糖核苷复合物。从更具挑战性的样本如内源核糖核酸酶含量高的完整组织或细胞分离RNA,要求更为强烈的方法。在这些情况中,将组织或细胞在强力蛋白质变性剂(通常为异硫氰酸胍)中快速均化,以使核酸酶不可逆地失活和使细胞膜溶解。如果组织样本不能立即均化,必须将它浸入液氮中快速冷冻,并在-80℃下保存。以这种方式冷冻的样本必须在进行RNA分离之前决不能解冻,否则RNA会被冷冻过程中发生的细胞裂解过程中所释放的RNA酶快速降解。必须将组织浸入液氮池中,并用研钵和研杵磨成细粉。一旦成为粉末,将仍冷冻的组织在RNA提取缓冲液中均化。有多种RNA分离用试剂盒现可商购获得(Ambion,Quiagen)。
如本领域所公知的,首先用RNA依赖性DNA聚合酶和引物从模板mRNA反转录出cDNA的第一链,由此首先产生cDNA。根据本专利申请可使用的反转录酶包括但不限于来自HIV、HTLV-1、HTLV-II、FeLV、FIV、SIV、AMV、MMTV、MoMuLV和其他反转录病毒的反转录酶(有关综述参见例如Levin,1997,Cell 88:5-8;Verma,1977,Biochim.Biophys.Acta 473:1-38;Wu等人,1975,CRC Crit.Rev.Biochem.3:289-347)。最近,有多种试剂盒可商购获得,以供使用热稳定性反转录酶进行RT-PCR反应,例如热稳定性rTth反转录酶RNA PCR试剂盒(Applied Biosystems)。
如本文所用的,“聚合酶链式反应”或“PCR”通常指体外扩增所需的核苷酸序列的方法,在美国专利No.4,683,202、4,683,195、4,800,159和4,965,188中有所描述,这些专利的内容以引用方式全文并入本文。PCR反应涉及重复进行一系列温度循环,且通常在10-100μl的体积中进行。反应混合物包含dNTP(四种脱氧核苷酸dATP、dCTP、dGTP和dTTP的每一种)、引物、缓冲液、DNA聚合酶和核酸模板。PCR反应包括:提供一组多核苷酸引物,其中第一引物含有与核酸模板序列的一条链中的某个区域互补的序列,从而引发互补DNA链的合成,第二引物含有与该靶核酸序列的第二条链中的某个区域互补的序列,从而引发互补DNA链的合成;采用核酸聚合酶作为模板依赖性聚合剂,在允许进行以下PCR循环步骤的条件下扩增核酸模板序列:(i)使扩增需用的引物与模板序列中所含的靶核酸序列退火,(ii)使引物延伸,其中核苷酸聚合酶合成出引物延伸产物。
其他的扩增方法包括但不限于连接酶链式反应(LCR)、基于多核苷酸特异性的扩增(polynucleotide-specific based amplification,NSBA)。
本领域技术人员可容易地为所关注的核酸区域设计并合成引物。应理解,可用任何合适的方法来设计适用于本专利申请的引物。有关PCR用引物的选择,在例如2005年5月24日公布的题为“Algorithms for Selectionof Primer Pairs”(《用于选择引物对的算法》)的美国专利No.6,898,531中和2002年9月5日提交的美国序列No.10/236,480中有所描述;对于短程PCR(short-range PCR),2003年1月14日提交的美国序列No.10/341,832提供了关于引物选择的指导。另外,还有可公开获得的程序如“Oligo”、primerpremier 5(可获自PremierBiosoft公司的网站)和primer3(可获自Whitehead InstituteforBiomedical Research,Cambridge,Mass.,U.S.A的网站)。引物设计是基于多个参数,例如对于所要使用的杂交条件和寡核苷酸探针的所需长度而言的最佳解链温度(Tm)。另外,寡核苷酸设计要力图使分子可能含有的潜在二级结构(如发夹结构和探针间二聚体)减至最低,目的是使所得的探针最大化地可供进行杂交。在一个优选的实施例中,PCR方法中所用的引物将与cDNA模板中的核苷酸序列互补,且优选超越外显子-内含子边界。
在一个实施例中,PCR反应可使用巢式PCR引物。
在一个实施例中,在扩增反应中可包括可检测标记。合适的标记包括荧光染料,例如异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明、德克萨斯红、藻红蛋白、别藻蓝蛋白、6-羧基荧光素(6-FAM)、2′,7′-二甲氧基-4′,5′-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基-2′,4′,7′,4,7-六氯荧光素(HEX)、5-羧基荧光素(5-FAM)或N,N,N′,N′-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、放射性标记(例如32P、35S、3H);以及其他。标记可以是两级体系,其中扩增的DNA缀合到具有高亲和性结合伴侣的生物素、半抗原等,所述结合伴侣例如为亲和素、特异性抗体等,其中所述结合伴侣与可检测标记缀合。可将标记缀合到一中引物或同时缀合到两种引物。或者,将扩增中所用的那一批核苷酸进行标记,以将标记掺入到扩增产物中。
在一个特别优选的实施例中,本专利申请采用组合的PCR和杂交探测***,以利用如美国专利No.6,140,054和6,174,670中公开的测定***,如使用FRET探针,将这两个专利的全部内容也以引用方式并入本文。在其最简单的配置之一中,FRET(“荧光共振能量转移”)方法采用两种与被扩增核酸的同一条链上的相邻位点结合的寡核苷酸。一个寡核苷酸标记上能以第一波长吸光并响应吸光而发光的供体荧光团,第二个寡核苷酸标记上能够响应第一供体的发射光而发荧光的受体荧光团(但基本上不受激发第一供体的光源的激发,且它的发射可与第一荧光团的发射区别开来)。在该配置中,第二或受体荧光团当与第一或供体荧光团紧邻时会显示荧光大幅增加,所述紧邻例如是在这两个寡核苷酸与被扩增核酸上的相邻位点杂交(例如在PCR的退火阶段,形成发荧光复合物)而紧靠在一起时出现。随着更多的被扩增核酸积累,有更多的发荧光复合物可形成,从而发自受体探针的荧光增加,而这可进行测量。因此,该方法容许在产物形成过程中检测产物的量。
本领域技术人员还会认识到,可用本领域中的多种方法对扩增进行检测,例如在PCR反应中使用TaqManTM杂交探针,以及在发生足够的扩增后测量靶标核酸的特异性荧光。TaqMan实时PCR是通过PCR的指数阶段过程中的荧光团来测量产物的积累,而不是如常规PCR中通过在终点时的荧光团来测量。用产物的指数增加来确定阈值循环数CT(即检测到荧光出现显著指数增加时的PCR循环数),且这个PCR循环数与反应中存在的DNA模板拷贝数直接相关。
不过本领域技术人员会认识到,存在着其他类似的定量“实时”和均相核酸扩增/检测***,如基于TaqMan方法(参见美国专利No.5,538,848和5,691,146,这两个专利的全部内容以引用方式并入本文)、荧光偏振测定法(例如Gibson等人,1997,Clin Chem.,43:1336-1341)及Invader测定法(例如Agarwal等人,Diagn Mol Pathol 2000年9月;9(3):158-164;Ryan D等人,Mol Diagn 1999年6月;4(2):135-144)的那些***。这类***也适合用于所描述的本专利申请,使得能够对核酸扩增进行实时监测。
在本专利申请的另一个实施例中,将矩阵或微芯片制造成含有位点阵列,每个位点含有序列已知的寡核苷酸。在本公开说明书中,每个位点含有摩尔过量的所选定的固定化合成寡聚物,所述寡聚物被合成为含有针对糖尿病易感性基因的所需部分的互补序列。如本文所述的,通过RT-PCR扩增出PBMC中存在的糖尿病易感性基因的转录物,并进行标记。然后使微芯片上的寡聚物与经标记的、RT-PCR扩增的糖尿病易感性基因核酸杂交。杂交在严格条件下进行,以确保在杂交过程中只会发生微芯片植入序列和靶标序列之间的完美或近乎完美的匹配。每个位点所产生的荧光与PBMC中的一种或更多种糖尿病易感性基因的表达水平成比例。
在本专利申请的其他实施例中,用免疫化学领域公知的技术测量蛋白质编码基因的基因特征表达谱,所述技术包括例如基于抗体的结合测定法,如ELISA或放射免疫测定法,或者含有针对本文所定义的预定特征中的基因的蛋白质产物的抗体的蛋白质测定法。
在一个实施例中,分析来自正常葡萄糖耐受患者和2型糖尿病患者的外周血单核细胞中的TCF7L2和CLC基因的表达谱。
人Charcot-Leyden晶体蛋白基因主要在嗜酸性粒细胞中表达。CLC在NGT至IGT至T2D的PBMC中依次被下调。下表2中列出它在107名患者群体的微阵列中的表达的平均信号强度。接受器操作特征(ROC)分析证明,可用CLC基因表达水平来将NGT与IGT/T2D区分。
表2:从NGT、IGT和T2D分离的PBMC中的CLC基因表达
NGT IGT T2D
1504 900 410
用接受器操作特征(ROC)分析来进一步检验CLC基因在预测临床状态方面的性能。ROC曲线显示的是灵敏度和特异性之间的关系。也就是说,灵敏度的增加会伴随出现特异性的下降。曲线跟越接近左轴及ROC空间的顶部边缘,则测试的准确度越大。相反,曲线越接近ROC曲线图的45度对角线,则测试的准确度越小。ROC下面积是测试准确度的度量。试验准确性取决于试验能多好地将被测试集区分成所考虑的疾病的组和无所考虑的疾病的组。曲线下面积(称“AUC”)为1代表测试完美,而曲线下面积为0.5则代表测试不太有效。因此,本专利申请的优选基因和诊断方法具有大于0.50的AUC,更优选测试具有大于0.60的AUC,还更优选测试具有大于0.70的AUC。
曲线下面积(AUC)是作为CLC基因在预测患者状态方面的性能的度量来计算。对CLC基因数据的接受器操作特征(ROC)分析证明,可用CLC基因表达水平来将NGT与IGT/T2D区分(参见图1)。
编码转录因子7样2(TCF7L2)的基因的遗传变体已被指与发展2型糖尿病和β-细胞胰岛素功能受损的风险强烈相关(参见US 2006/0286588,其内容以引用方式全文并入本文)。全基因组关联研究暗示,TCF7L2中的SNP与其他标志物基因(包括CDKAL1、CDKN2A/2B、FTO、IGF2BP2和SLC30A8)中的SNP相比,所给出的预测2型糖尿病进展的终生风险分数最高(风险分数范围1.12-1.20)。TCF7L2被广泛表达,且这个转录因子据知会响应来自蛋白质Wnt家族成员的发育信号。功能研究和遗传研究指出了TCF7L2在肠的发育和肠内分泌细胞的胰高血糖素原基因表达中的关键作用。
为明确TCF7L2和CLC基因单独地或者相组合是否是糖尿病的诊断标志物,与德国美因兹的临床研究和发展研究院(Institute for ClinicalResearch&Development(IKFE))联合,从德国人中召集了180名受试者。在进行患者样本采集之前,取得了适当的IRB批准。录取标准包括:患者年龄在18-75岁之间,体重指数(BMI)≥30,之前没有确诊糖尿病,具有理解临床研究及所需程序的性质和程度的法定资格和能力。淘汰标准包括:在过去30天内献血,有胰岛素依赖性糖尿病,哺乳或怀孕妇女或者在本研究过程中计划怀孕的妇女,不实施生育控制的性活跃妇女,严重/多发性过敏症史,药物或酒精滥用,以及不服从研究要求。所有临床测量,包括75g口服葡萄糖耐量测试结果(OGTT)在内,都用标准的程序获得。
血样是通过静脉穿刺到CPT管(BD Biosciences)中进行抽取。PBMC是按照生产商的方案进行分离,最终的细胞沉淀重悬于1ml的Trizol(Invitrogen)中,并在-80℃下保存。随后,采用按照生产商的方案纯化总RNA,并将其重悬于DEPC处理过的ddH2O中。RNA定量和定性用ND-1000分光光度计(NanoDrop)进行,并通过用RiboGreen试剂盒(MolecularProbes)进行分光光度定量加以再确认。RNA模板的质量用Bioanalyzer 2100(AgilentTechnologies)进行测量。
第一链cDNA合成用来自每个患者PBMC样本的200ng总RNA进行,该总RNA用高容量cDNA反转录试剂盒(Applied Biosystems)获得。然后,用ddH2O将反应混合物稀释10倍,并取4μl在ABI Prism 7900HT序列检测***上的10ml Taqman PCR反应中用作模板。反应成分包括2X Taqman PCR主混合物(Applied Biosystems)、0.9μM的每种引物和0.25μM的荧光标记探针(Biosearch Technologies)。RT-PCR Taqman测定中所用的引物/探针组的序列在表3中示出。
反转录步骤的循环条件如下:
步骤1 | 步骤2 | 步骤3 | 步骤4 | |
温度℃ | 25 | 37 | 85 | 4 |
时间 | 10分钟 | 120分钟 | 5秒 | ∞ |
表3.TCF7L2、CLC和肌动蛋白的Taqman测定中所用的探针和引物序列
使用两种不同的对TCF7L2特异的引物/探针组合和一种针对CLC的引物/探针组,通过Taqman测定法对从各个患者的PBMC分离的RNA进行定量实时RT-PCR。PCR步骤的热循环方案如下:95℃,10分钟,然后95℃(15秒)和60℃(1分钟),40个循环。Ct值用SDS软件2.1版本(AppliedBiosystems)从原始数据计算,阈值设定在0.2至0.3。对于上述的标志物,由皮尔逊相关分析得出的轮次与轮次的重现性为R2=0.96-0.98。ΔCt(阈值循环数)值是通过将所关注的标记(例如TCF7L2)的Ct减去看家β-肌动蛋白基因的Ct(Ct TCF7L2-Ct肌动蛋白)计算。用[2-(ΔCt)×1000]的值代表TCF7L2相对于β-肌动蛋白的表达。用OGTT结果作为真实的临床状态。采用Student T检验,用归一化的Ct值来确定基因标志物的表达水平之间的统计学显著性。
基于2小时OGTT测量和现行ADA指导方针,在本研究录用的180名患者中,有104名患者被归类为NGT(正常葡萄糖耐受),49名患者被归类为IGT(葡萄糖耐受性异常),27名患者被认为有T2D(2型糖尿病)。由于在本研究中T2D受试者是首次被诊断有糖尿病,每个患者的该疾病持续时间以及PBMC在高血糖微环境中得以维持多长时间尚未明了。
基于引物/探针组数值并按葡萄糖耐受性区分的、对每个患者的归一化到β-肌动蛋白的TCF7L2和CLC表达水平的t检验分析,在表4中示出。由Student T检验得出,NGT组和IGT+T2D患者组具有统计学上显著的表达水平差异,对于TCF7L2组1、TCF7L2组3和CLC,p值分别等于0.004、0.021和0.022。这些结果表明,与NGT相比,前期糖尿病(IGT)患者或者前期糖尿病+T2D患者的PBMC中,TCF7L2和CLC基因有差异表达。
表4:Student T检验得出的TCF7L2和CLC表达水平的统计学差异
接着,与2小时OGTT进行比较,评估了TCF7L2和CLC Taqman测定法作为将患者分类成正常患者或者前期糖尿病/糖尿病患者的诊断工具的性能。产生了每个TCF7L2和CLC引物/探针组归一化ΔCt值的接受器操作特征(ROC)曲线(表5、图2A和2B)。对于TCF7L2组1和CLC PCR测定,AUC值分别为0.63和0.61。与2小时OGTT分类相比,PBMC的TCF7L2组1表达当与FPG测试联用时,能正确地将患者分类成正常患者或者前期糖尿病/糖尿病患者,AUC为0.73(图2A和2B)。CLC对TCF7L2组1没有附加价值,因此不考虑用于诊断算法。另外,将FPG≥126mg/dL的14名患者(也认为是糖尿病患者)排除在外,并不改变该测定法的性能。
表5:每种标志物探针-引物组及与FPG值的组合的ROC曲线AUC值
在一个实施例中,可将微阵列分析中选定的每种基因(参见表1)与TCF7L2组1的性能组合,以更紧密地匹配2小时OGTT结果。
在另一个实施例中,还可将与2型糖尿病风险强烈相关的基因(参见表6)与TCF7L2组1的性能组合,以更紧密地匹配2小时OGTT结果。在另一个实施例中,可将表6的基因与表1的一种或更多种基因组合以如本文所述进行测试,寻找可诊断糖尿病状态的基因特征。
表6:
在另一个实施例中,在来自NGT和T2D的PBMC中,CDKN1C(为CIP/KIP家族成员)的表达也存在差异表达。
CIP/KIP家族由CDKN2A、CDKN2B和CDKN1C三个成员组成。所有这三个成员都能抑制CDK4的活性,CDK4在调节哺乳动物细胞周期中起到重要作用。胰岛β-细胞复制在保持β-细胞量稳态中起到不可或缺的作用。已知CDK4在调节体重和胰腺β-细胞增殖中具有重要作用。在小鼠中,CDK4基因的丧失导致了β-细胞量的降低,从而导致胰岛素缺乏性糖尿病,而CDK4的激活造成了β-胰岛细胞增生症。最近,2型糖尿病的全基因组关联研究揭示,靠近CDKN2A和CDKN2B基因的核苷酸变异与2型糖尿病风险相关。另外,CDKN2A的过量表达会导致年老小鼠中胰岛增殖降低,而CDKN2B的过量表达与鼠模型中的胰岛发育不全和糖尿病有关。CDKN1C是位于染色体11p15.5上的母本表达基因(maternally expressed gene),参与Beckwith-Wiedemann综合征(BWS)的发病机理,该综合征是一种以新生儿高胰岛素血症性低血糖症以及出生前和出生后生长过度为特征的疾病。最近的研究也证实,CDKN1C被胰岛素下调,CDKN1C的变体可与2型糖尿病患者的出生体重增加相关。CIP/KIP家族除了调节细胞周期之外,在其他生物学过程如凋亡、转录调节、分化和细胞迁移中也起到重要的作用。在该107名患者群体中分析了这三种基因的表达。只有CDKN1C在NGT、IGT和T2D中显示差异表达(参见表7)。在HG-U133Plus2基因芯片上,有5种在PBMC中表达的CDKN1C探针。它们每一种在NGT和IGT/T2D之间显示差异表达(表7)。ROC分析表明,这5个探针的表达水平可用来将NGT与T2D区分(图3)。
表7:
从NGT、IGT和T2D分离的PBMC中的CDKN1C基因表达
基因 探针 PBMC中的表达 平均_NGT 平均_IGT 平均_T2D
CDKN1C 213182_x_at 是 935 1178 1784
213183_s_at 是 531 712 624
213348_at 是 2648 3246 3957
216894_x_at 是 797 1030 1439
219534_x_at 是 1092 1356 1973
本领域普通技术人员会认识到,所描述的实施例为研究作为糖尿病诊断工具的基因特征提供了前提。为研究正常受试者与前期糖尿病患者和糖尿病患者之间的基础生物学过程,进行了途径分析。即,如Yu等人,BMCCancer 7:182(2007)所述,将HG-U133Plus2芯片上的探针定位到基因本体生物过程(Gene Ontology Biological Process,GOBP)。由于表达水平非常低的基因趋向于具有较高的变异,因此将数据集当中的平均强度小于200的基因排除出途径分析。结果保留了21247种探针。为鉴定与前期糖尿病或糖尿病的发展具有显著相关性的途径,通过将NGT与IGT比较、NGT与T2D比较或NGT与IGT+T2D比较运行了全局试验程序。对于每个比较,鉴定了具有至少10种探针和显著p值(p<0.05)的途径。在这三个比较当中,有3个途径与患者结果具有一致的相关性。它们是B细胞激活(GO0042113)、体液免疫应答(GO0006959)和复制过程中DNA解旋(GO0006268)。在这3个途径当中,B细胞激活和体液免疫应答与糖尿病具有明显负相关性(在IGT/T2D中的表达较低),而复制过程中DNA解旋与糖尿病具有正相关性(在IGT/T2D中的表达较高)。
为建立来自这3个关键途径的基于途径的基因特征,将p<0.05的基因集中在一起,根据它们的统计学显著性(全局试验的z分数)进行分类。如果某基因在列表中具有超过一种探针,且这些探针的表现一致,则保留显著性最高的那一个探针。如果某基因在列表中具有超过一种探针,且这些探针的表现是相反的,则这个基因的所有探针都排除。结果获得了14种独特基因(参见下表8)。
表8:途径显著基因
PSID 基因符号 基因标题
208900_s_at TOP1 拓扑异构酶(DNA)I
216379_x_at CD24 CD24抗原(小细胞肺癌簇4抗原)
222430_s_at YTHDF2 YTH结构域家族,成员2
1554343_a_at BRDG1 BCR下游信号转导1
228592_at MS4A1 跨膜4结构域,亚家族A,成员1
216894_x_at CDKN1C 细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1C(p57,Kip2)
1558662_s_at BANK1 B细胞骨架蛋白带锚蛋白重复1
205267_at POU2AF1 POU结构域,2类,相关因子1
205859_at LY86 淋巴细胞抗原86
221969_at PAX5 配对盒基因5(B细胞谱系特异性激活物)
207655_s_at BLNK B细胞接头
206126_at BLR1 Burkitt淋巴瘤受体1,GTP结合蛋白(趋化因子(C-X-
C基序)受体5)
206983_at CCR6 趋化因子(C-C基序)受体6
204946_s_at TOP3A 拓扑异构酶(DNA)IIIα
214252_s_at CLN5 蜡样脂褐质沉积症,神经元5
为采用具有相对较高变异的基因建立特征集合,保留了10种CV>0.25的基因。为确定特征基因合的最佳数目,研究了数据集当中前2-10种基因的组合。结果表明,前3种基因在预测患者的结果方面得出最佳性能。这3种基因(TOP1、CD24和STAP1)在下表9中显示。
表9:
3种基因在分离自NGT、IGT和T2D的PBMC中的表达
途径分析得到的前3种基因
探针 基因符号 基因标题
208900_s_at TOP1 拓扑异构酶(DNA)I
216379_x_at CD24 CD24抗原(小细胞肺癌簇4抗原)
1554343_a_at STAP1 信号转导衔接蛋白家族成员1
前3个基因在各亚群中的平均表达
探针 基因 平均_NGT 平均_IGT 平均_T2D
208900_s_at TOP1 868 1145 1418
216379_x_at CD24 1767 1274 1194
1554343_a_at STAP1 373 283 265
对该107名患者群体中的该3基因特征的ROC分析(图4A和4B)证明,该特征能将NGT与IGT/T2D区分。图4C中显示了示出这些基因的平均表达的直方图。
为将非信息性基因排除,仅保留在该患者群体中有10次或更多次存在呼叫(presence call)的基因。然后将该107名患者群体划分成54名患者训练集和53名患者测试集。基于OGTT分类,在训练集中有28名NGT、17名IGT和9名T2D,而测试集中有29名NGT、16名IGT和8名T2D。为鉴定在NGT患者和IGT+T2D患者之间的具有差异表达的基因,运行了微阵列显著性分析(SAM)程序。选择错误发现率(FDR)低于20%的基因。结果选择出235种基因。为进一步缩小基因列表,保留在两组之间变化倍数大于1.5的基因和数据集当中基因平均强度大于200的基因。结果获得了17个探针组。在它们当中有4种是代表血红蛋白基因的探针。鉴于血红蛋白在红细胞中具有极高的表达,将这4种探针排除以消除可能的污染。为确定作为特征集合的基因的最佳数目,研究了训练集当中前2-13种基因的组合的性能。结果表明,基于曲线下面积(AUC),前10种基因得出最好的性能。
表10A:10种基因在分离自NGT、IGT和T2D的PBMC中的表达
探针 符号 标题
239742_at TULP4 Tubby样蛋白4
244450_at AA741300 与ALU8_人ALU亚家族SX序列有微弱相似性
235216_at ESCO1 凝集蛋白1确立同系物1(establishment of
cohesion 1 homolog 1)
201026_at EIF5B 真核生物翻译起始因子5B
200727_s_at ACTR2 ARP2肌动蛋白相关蛋白2同系物
211993_at WNK1 WNK赖氨酸缺陷型蛋白激酶1
205229_s_at COCH 凝血因子C同系物,cochlin
201085_s_at SON SON DNA结合蛋白
1557227_s_at TPR 易位的启动区(至活化的MET癌基因)
231798_at NOG 成头蛋白(Noggin)
表10B:前10种基因在各亚群中的平均表达
探针 基因 平均_NGT 平均_IGT 平均_T2D
239742_at TULP4 514 659 702
244450_at AA741300 674 461 482
235216_at ESCO1 199 262 351
201026_at EIF5B 330 440 500
200727_s_at ACTR2 2153 2751 3590
211993_at WNK1 397 505 625
205229_s_at COCH 330 231 250
201085_s_at SON 3300 4103 4900
1557227_s_at TPR 378 445 616
231798_at NOG 515 430 302
为进一步评估基因特征,确定了测试集中的患者结果。还研究了用血浆空腹血糖(FPG)水平预测前期糖尿病和糖尿病。为研究基因特征和FPG水平之间的互补作用,用这两个预测指标的组合来预测患者结局。图5中示出测试集中用FPG或10基因特征或FPG和10基因特征的组合进行的ROC分析的比较。证明10基因特征能独立地将NTG与IGT/T2D区分,且FPG和10基因特征能互补,从而更好地预测(参见图5A和5B)。该10种基因在该107名患者群体中的平均表达信号在表中和图5C柱形图中显示。
对临床数据的统计学分析鉴定出了在NGT和T2D中差异表达的3基因和10基因特征。
在另一个实施例中,描述了用于在护理点对正常状况和前期糖尿病/糖尿病进行分类或者用于预测一段确定时间里向前期糖尿病/糖尿病的发展情况的诊断测定法,该一段确定时间例如为1/2年至2年,或者2年至5年,或者5年至10年,或者更长。
或者,通过例如用ELISA或蛋白质组阵列检测mRNA编码的蛋白质来确定基因表达谱。所有这些方法都是本领域公知的。
本文的公开内容还提供试剂盒型式,其包括具有一种或更多种用于诊断患者的糖尿病状态的试剂的包装单位。该试剂盒还可包含以下一项或多项:缓冲剂、说明书和阳性或阴性对照。试剂盒可包括以合适比例混合在一起的用于执行本文所述方法的试剂的容器。试剂容器优选含有以单位量呈现的试剂,以避免在执行本发明方法时需要测量步骤。
试剂盒可包括用以收集患者血液的无菌针和管/容器。收集管通常会含有某些添加剂(肝素),以抑制血液凝结。
试剂盒还可含有用于测量患者样本中的基因特征表达谱的试剂。如本文中公开,可通过多种本领域已知的方法来测量基因特征表达谱,包括RT-PCR测定法,使用微芯片的基于寡核苷酸的测定法,或者基于蛋白质的测定法,如ELISA测定法。
在一个优选的实施例中,通过实时RT-PCR测量基因特征表达谱。
在本专利申请的一个实施例中,试剂盒包括用于扩增和检测患者血样中的基因特征表达谱的引物。引物可具有与本文所定义的任何一种糖尿病易感性基因互补的序列,所述糖尿病易感性基因包括TOP1、CD24、STAP1、TULP4、AA741300、ESCO1、EIF5B、ACTR2、WNK1、COCH、SON、TPR、NOG基因或者表1或6中所列基因的任何一者。
用于糖尿病易感性基因的实时RT-PCR的引物序列的实例在表12B和12C中公开。
在一个优选的实施例中,试剂盒试剂被设计成能在AppliedBiosystems公司的7500 Fast Dx实时PCR仪发挥作用,该PCR仪是得到美国FDA的体外诊断试剂办公室(FDA-OIVD)批准的基于PCR的技术。
在又另一个实施例中,试剂盒包括微芯片,其包括所述3基因(TOP1、CD24和STAP1)特征或10基因(TULP4、AA741300、ESCO1、EIF5B、ACTR2、WNK1、COCH、SON、TPR和NOG)特征的杂交探针的阵列。在另一个方面,微芯片还可包括一种或更多种针对一种或更多种表1或6中所列基因的杂交探针的阵列。
在一个优选的实施例中,微阵列被设计成能在Affymetrix GeneChipDx技术中发挥作用,该技术能平行测量1种至55,000种以上的mRNA的基因表达。FDA-OIVD批准这个平台用于Roche Molecular Diagnostics公司的AmpliChip P450产品和Pathwork Diagnostics公司的Tissue of Origin试验。
表12A
Claims (7)
1.用于测量TOP1、CD24和STAP1基因的基因特征的基因表达谱的试剂在制备用于通过患者的测试样本诊断患者中的糖尿病的试剂盒中的用途,其中所述用于测量基因特征的表达谱的试剂是用于实时PCR或特异性寡核苷酸杂交的试剂,其中所述糖尿病是前期糖尿病状态或2型糖尿病状态。
2.用于测量TOP1、CD24和STAP1基因以及一种或更多种选自表1或6中所列基因的基因特征的基因表达谱的试剂在制备用于通过患者的测试样本诊断患者中的糖尿病的试剂盒中的用途,其中所述用于测量基因特征的表达谱的试剂是用于实时PCR或特异性寡核苷酸杂交的试剂,其中所述糖尿病是前期糖尿病状态或2型糖尿病状态。
3.用于测量TOP1、CD24和STAP1基因的基因特征的基因表达谱的试剂和用于测量TULP4、AA741300、ESCO1、EIF5B、ACTR2、WNK1、COCH、SON、TPR和NOG基因的基因特征的基因表达谱的试剂在制备用于通过患者的测试样本诊断患者的糖尿病状态变化的试剂盒中的用途,其中所述用于测量基因特征的表达谱的试剂是用于实时PCR或特异性寡核苷酸杂交的试剂,其中所述糖尿病状态是前期糖尿病状态或2型糖尿病状态。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的用途,其中所述测试样本是血样。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的用途,其中所述测试样本包含PBMC或者CD11c+或CD11b+或Emr+或[CD11b+ CD11c+]或[Emr+ CD11b+]或[Emr+ CD11c+]或[Emr+ CD11b+ CD11c+]细胞或者CD14+单核细胞。
6.一种用于评估患者对糖尿病的易感性的试剂盒,其中所述评估用测试仪器作出,所述试剂盒包含:
a.用于从患者收集测试样本的试剂;和
b.用于测量患者的测试样本中TOP1、CD24和STAP1基因的基因特征的基因表达谱的试剂,其中所述用于测量基因特征的表达谱的试剂是用于实时PCR或特异性寡核苷酸杂交的试剂;
以及其包装,
其中所述糖尿病是前期糖尿病状态或2型糖尿病状态。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其中所述用于收集测试样本的试剂是用于收集血样的试剂。
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