CN101917996A - 降低血压的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于降低血压的方法和药物。本发明还提供了用于治疗或预防高血压的方法和药物。

Description

降低血压的方法
技术领域
本发明涉及用于降低血压和治疗或预防高血压的方法和药物。特别地，本发明具体地在此提供了在肾病患者中治疗高血压和高血压前期(prehypertension)及降低血压的方法和药物。本发明进一步提供了在对象中治疗高血压和高血压前期及降低血压的方法和药物中所使用的具体化合物，所述对象包括但不限于患有肾病的对象。
背景技术
血压上升和高血压是很重要的公共健康问题。血压上升或高血压的发展与许多风险因素有关，包括年龄、种族、家族史、肥胖、缺乏活动、吸烟、饮酒、饮食、糖尿病、和压力。通常来说，对象在连续两次或更多次的情况中，收缩压为从120到139mmHg或舒张压为从80到89mmHg，就可以被视为高血压前期。而一个对象在连续两次或更多次的情况中，收缩/舒张压为大于或等于140/90mmHg都可被视为高血压。
患有血压上升或高血压的个体会有显著较大的风险发展出许多种失调(disorder)和并发症。这些失调和并发症的程度与严重性提示迫切需要能够降低血压和能够治疗高血压或预防/逆转高血压的进展的早期和有效的治疗策略。血压的相对较小的下降就能显著减少与高血压有关的共病率(co-morbidity)和共同死亡率(co-mortality)。例如，在40-69岁的成年人中，收缩压减少20mmHg(约等于舒张压减少10mmHg)与由于中风和其它血管疾病造成的死亡减少两倍多有关(Lewington等(2002)Lancet360：1903-1913.)。
患有血压上升的个体，包括高血压和高血压前期的对象，是异种(heterogeneous)群体。这部分是因为与血压上升有关的多因素病因和许多内在机制(Welsh等(2004)Int J Clin Pract.58：956-63.)。例如，血压上升可能由其它潜在疾病例如慢性肾病或心力衰竭导致。这些患者群体的异种性(heterogeneity)导致对于抗高血压治疗的不同的响应(Laragh等Hypertension 12：223-226.)。
最常用的血压药物包括：利尿剂；β-阻断剂(BB)；血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂；血管紧张素受体阻断剂(ARB)；和钙通道阻断剂(CCB)。然而，这些主要类别的抗高血压药各自的优点与缺点都随可能存在的潜在疾病而不同(Brunner等(1990)J Hypertens.8：3-11.)。例如，利尿剂对于肾病患者是禁忌的，这是因为体积消耗(volume depletion)可能导致到肾脏的血流减少及肾功能的进一步退化。
此外，单一药物的抗高血压治疗在多至全部患有高血压的患者的三分之二中是不成功的(Chobanian等(2003)Hypertension 42：1206-52.)。而且，有证据显示，不同的高血压患者对不同种类的药物的响应明显不同。文献中曾建议一些治疗法则，其旨在在是否存在引人注目的适应证(如心力衰竭、慢性肾病、复发中风预防)的基础上预测个体对不同的抗高血压药的响应(Chobanian等(2003)Hypertension 42：1206-52.)。然而，即使使用这些法则，高血压控制依然是成问题的。
因此，本技术领域需要可以有效降低血压和治疗高血压与高血压前期的方法和药物。本发明通过提供用于在对象中(包括患有肾病的对象)降低血压和治疗或预防高血压或高血压前期的新方法和药物而满足上述需要。这些方法和药物可以在需要其的对象中单独或与其它治疗组合使用，以在需要其的对象中降低血压和治疗高血压或高血压前期。
发明内容
大体而言，本发明涉及用于在患有肾病的对象中降低血压或预防血压上升和用于治疗或预防高血压或高血压前期的方法和药物。本发明进一步提供能够在任何对象中，包括但不限于在患有肾病的对象中，有效降低血压或预防血压上升和用于治疗或预防高血压或高血压前期的具体化合物。
本发明提供了用于在患有肾病的对象中治疗或预防高血压或高血压前期的方法和药物。在一方面，本发明提供了用于在患有肾病的对象中治疗或预防高血压或高血压前期的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的能够抑制低氧诱导因子(HIF)脯氨酰基羟化酶活性的化合物，从而在对象中治疗高血压或高血压前期。在另一方面，本发明提供用于在患有肾病的对象中预防高血压的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的能够抑制低氧诱导因子(HIF)脯氨酰基羟化酶活性的化合物，从而在患有肾病的对象中预防高血压。在一方面，所述患有肾病的对象是高血压前期的。在另一方面，本发明提供可以抑制HIF脯氨酰基羟化酶活性的化合物在制备用于在患有肾病的对象中治疗或预防高血压或高血压前期的药物中的应用。
在一个实施方案中，本发明提供了在患有肾病的对象中降低血压或预防血压上升的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的能够抑制低氧诱导因子(HIF)脯氨酰基羟化酶活性的化合物，从而在该对象中降低血压或预防血压上升。本发明在此还预期能够抑制HIF脯氨酰基羟化酶活性的化合物在制备用于在患有肾病的对象中降低血压的药物中的应用。在本发明的各实施方案中，还预期用于在患有肾病的对象中降低收缩压、或降低舒张压、或降低平均动脉压的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的能够抑制低氧诱导因子(HIF)脯氨酰基羟化酶活性的化合物，从而分别降低收缩压、或降低舒张压、或降低平均动脉压。
在本发明的各实施方案中，所述患有肾病的对象或所述肾病对象是患有肾脏失调或疾病的对象，所述肾脏失调或疾病包括但不限于急性肾衰竭、慢性肾病、末期肾病、肾损伤、膜性肾病等。
所述患有肾病的对象也可以是具有由选自以下的失调导致的高血压或高血压症风险的对象：慢性肾病、急性肾衰竭、和肾功能不全。这些对象可以包括具有已知与发展血压上升或高血压或高血压症的风险增加相关的多种因素中的一种或多种不同的对象。这些风险因素包括如高血压家族病史、糖尿病、肥胖、某些种族或人种、惯于久坐的生活方式、年龄、饮酒、吸烟、使用咖啡因、饮食、钠敏感性和盐摄取、肾病和肾功能不全、睡眠窒息症、妊娠、肝硬化、库欣氏病、某些药物、情绪因素、压力等。
在用于在患有肾病的对象中治疗或预防高血压或高血压前期或降低血压的方法和药物中使用的化合物是HIF脯氨酰基羟化酶抑制剂。在具体实施方案中，在用于在患有肾病的对象中治疗高血压的方法和药物中使用的化合物是2-氧代戊二酸的结构模拟物，其能够与2-氧代戊二酸竞争性地抑制目标HIF脯氨酰基羟化酶和与铁非竞争性地抑制目标HIF脯氨酰基羟化酶。在另一个实施方案中，在本发明的方法和药物中使用的化合物是式A的杂环羰基甘氨酸：
Figure BPA00001177066100041
其中，X是任选地被取代的杂环部分。
在具体的实施方案中，这些化合物包括但不限于取代的3-羟基-吡啶-2-羰基-甘氨酸、4-羟基-哒嗪-3-羰基-甘氨酸、3-羟基-喹啉-2-羰基-甘氨酸、4-羟基-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-羰基-甘氨酸、4-羟基-2-氧代-1，2-二氢-萘啶-3-羰基-甘氨酸、8-羟基-6-氧代-4，6-二氢-吡啶并吡嗪-7-羰基-甘氨酸、4-羟基-异喹啉-3-羰基-甘氨酸、4-羟基-噌啉-3-羰基-甘氨酸、7-羟基-噻吩并吡啶-6-羰基-甘氨酸、4-羟基-噻吩并吡啶-5-羰基-甘氨酸、7-羟基-噻唑并吡啶-6-羰基-甘氨酸、4-羟基-噻唑并吡啶-5-羰基-甘氨酸、7-羟基-吡咯并吡啶-6-羰基-甘氨酸、和4-羟基-吡咯并吡啶-5-羰基-甘氨酸。可以通过测量化合物对HIF脯氨酰基羟化酶的抑制活性来确定用于本实施方案中的化合物，例如使用在此描述的酶分析。更普遍地，可以通过测量化合物诱导的HIF稳定化来确定用于本实施方案中的化合物，例如使用在此描述的基于细胞的分析。(参见例如实施例1和2)。
除上述方法和药物之外，本发明提供了式I的化合物在用于在对象中治疗或预防高血压或高血压前期，或降低血压的方法中的应用，所述方法包括向所述对象给药有效量的式I化合物或其药学上可接受的盐、酯、或前药：
Figure BPA00001177066100042
其中，
A选自苯或吡咯环；
q是1、2或3；
W选自(C1-C3)-烷基、(C1-C3)-烷氧基或(C6-C10)-芳基氧基，其中每一个可以是未被取代的或被一个或多个卤素、(C1-C3)-烷基、(C1-C3)-烷氧基、或(C6-C10)-芳基取代；且
R选自氢、烷基、或氰基。
本发明在此还提供了式I的化合物在制备用于在对象中治疗高血压或高血压前期的药物中的应用。
在一个实施方案中，本发明提供了在需要其的对象中降低血压或预防血压上升的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的式I化合物，从而在对象中降低血压或预防血压上升。本发明在此还预期式I的化合物在制备用于在需要其的对象中降低血压或预防血压上升的药物中的应用。在本发明不同实施方案中还预期用于在需要其的对象中降低收缩压、或降低舒张压、或降低平均动脉压的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的式I化合物，从而在对象中分别降低收缩压、或降低舒张压、或降低平均动脉压。
在一个实施方案中，本发明提供了用于在患有高血压前期的对象中预防高血压的方法和药物，所述方法包括向所述对象给药有效量的式I化合物，从而在患有高血压前期的对象中预防高血压。在本方面的某些实施方案中，所述对象具有发展血压上升或高血压、高血压症、或高血压前期的风险。这些对象可以包括具有已知与发展血压上升或高血压或高血压症的风险增加相关的多种因素中的一种或多种的对象。这些风险因素包括如高血压家族病史、糖尿病、肥胖、某些种族或人种、惯于久坐的生活方式、年龄、饮酒、吸烟、使用咖啡因、饮食、钠敏感性和盐摄取、肾病和肾功能不全、睡眠窒息症、妊娠、肝硬化、库欣氏病、某些药物治疗、情绪因素、压力等。在一个实施例中，所述具有高血压或高血压症风险的对象具有选自以下组中的失调：肾病和肾功能不全。在各实施方案中，所述具有高血压或高血压症风险的对象是非贫血的。在一些实施方案中，所述高血压或高血压症与肾病有关。
在本发明的某些实施方案中，将式I的化合物给药至对象以治疗高血压，其中所述高血压进一步选自以下组中：轻度高血压、中度高血压、严重高血压、和极严重的高血压。
在本发明的各实施方案中，所述对象是哺乳动物对象。在具体的实施方案中，所述对象是人类对象。
在一些实施方案中，所述对象以前曾经或目前正使用一种或多种血压药物治疗，所述药物包括但不限于ACE抑制剂(例如贝那普利、福辛普利、赖诺普利、喹那普利)、ARB(例如氯沙坦)、BB(例如酒石酸美托洛尔、倍他洛尔、缬沙坦)、利尿剂(例如氢***)、血管扩张药(例如硝酸异山梨酯)、α-阻滞剂、CCB、和他汀类。在具体的实施方案中，本发明的方法进一步包括使用第二种治疗化合物治疗所述对象，所述第二种治疗化合物选自以下组中：ACE抑制剂、ARB、α-阻滞剂、BB、血管扩张药、CCB、和他汀类。
在这方面的一些实施方案中，所述化合物选自式I(a)的化合物，或其药学上可接受的盐、酯、或前药：
其中W和R如上所定义。
在具体实施方案中，所述式I(a)的化合物选自以下化合物或其药学上可接受的盐、酯、或前药：其中W选自(C1-C3)-烷氧基或(C6-C10)-芳基氧基，其中每一个可以是未被取代的或被一个或多个(C1-C3)-烷基和/或(C1-C3)-烷氧基取代；且R选自氢、烷基、或氰基。
在这方面的其它实施方案中，所述化合物选自式I(b)的化合物，或其药学上可接受的盐、酯、或前药：
其中，
W1选自(C1-C3)-烷基，其可以是未被取代的或被一个或多个(C1-C3)-烷氧基或(C6-C10)-芳基取代；
W2和W3各自独立地选自卤素或(C1-C3)-烷基；且
R选自氢、烷基、或氰基。
在本发明的各实施方案中，用于所述方法的化合物或用于制备药物的化合物选自以下组中：{[4-羟基-7-(4-甲氧基-苯氧基)-异喹啉-3-羰基]-氨基}-乙酸、[(4-羟基-1-甲基-7-苯氧基-异喹啉-3-羰基)-氨基]-乙酸、[(1-氰基-4-羟基-5-苯氧基-异喹啉-3-羰基)-氨基]-乙酸、[(1-氰基-4-羟基-7-异丙氧基-异喹啉-3-羰基)-氨基]-乙酸、{[1-氰基-7-(2，6-二甲基-苯氧基)-4-羟基-异喹啉-3-羰基]-氨基}-乙酸、{[3-溴-7-氰基-4-羟基-1-(4-甲氧基-苯甲基)-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-5-羰基]-氨基}-乙酸、{[3-氯-7-氰基-4-羟基-1-(4-甲氧基-苯甲基)-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-5-羰基]-氨基}-乙酸、{[2，3-二氯-7-氰基-4-羟基-1-(4-甲氧基-苯甲基)-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-5-羰基]-氨基}-乙酸、{[7-氰基-1-(2-氟-苯甲基)-4-羟基-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-5-羰基]-氨基}-乙酸、{[7-氰基-4-羟基-1-(3-甲氧基-苯甲基)-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-5-羰基]-氨基}-乙酸、[(7-氰基-4-羟基-1-萘-2-基甲基-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-5-羰基)-氨基]-乙酸。
在本发明的某些实施方案中，将式I的化合物给药至对象以治疗高血压，其中所述高血压进一步选自以下组中：轻度高血压、中度高血压、严重高血压、和极严重的高血压。
在本发明的各实施方案中，所述对象是哺乳动物对象。在具体实施方案中，所述对象是人类对象。
在一些实施方案中，所述对象以前曾经或目前正使用一种或多种血压药物治疗，所述药物包括但不限于ACE抑制剂(例如、贝那普利、福辛普利、赖诺普利、喹那普利)、ARB(例如氯沙坦)、BB(例如酒石酸美托洛尔、倍他洛尔、缬沙坦)、利尿剂(例如氢***)、血管扩张药(例如硝酸异山梨酯)、α-阻滞剂、CCB、和他汀类。在具体实施方案中，本发明的方法进一步包括使用第二种治疗化合物治疗所述对象，所述第二种治疗化合物选自以下组中：ACE抑制剂、ARB、α-阻滞剂、BB、血管扩张药、CCB、和他汀类。
根据本说明书的公开，本发明的这些和其它方面以及实施方案对本领域技术人员而言是容易明白的，而所有上述方面和实施方案都是具体地预期的。
附图说明
图1给出的数据显示出本发明的方法在哺乳动物对象中有效地降低收缩压。
具体实施方式
应当理解本发明不受本文所述的具体方法、方案、细胞系、分析和试剂的限制，因为这些都是可以变化的。还应当理解，本文中所用的术语的目的是描述本发明的具体实施方案，而决不是为了限定如所附的权利要求所述的本发明的范围。
必须注意，本文和权利要求中所用的单数形式“一”和″所述″包括复数情况，除非文中另外明确指出。因此，举例来说，″一个化合物″可以包括复数个这样的化合物以及本领域技术人员所熟知的同等物，等等。
除非另有说明，否则这里所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的含义相同。尽管类似或等同于这里所描述的方法和物质的任何方法和物质都可用于本发明的实践或实验中，但本文仍描述了优选的方法、装置和物质。这里引用的所有出版物都以其整体援引加入，目的是阐述和揭示这些出版物中报告的可以用于本发明的方法、试剂和工具。本文中公开的任何内容，均不应被视为承认本发明不先于此公开而被发明。
除非另有说明，否则本发明在实践中将采用本技术领域中的常规化学、生物化学、分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学和药理学的方法。这些技术在文献中有充分解释。参见例如Gennaro，A.R.，ed.(1990)Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th ed.，Mack Publishing Co.；Colowick，S.等，eds.，Methods In Enzymology，Academic Press，Inc.；Handbook of Experimental Immunology，Vols.I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell，eds.，1986，Blackwell Scientific Publications)；Maniatis，T.等，eds.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd edition，Vols.I-III，ColdSpring Harbor Laboratory Press；Ausubel，F.M.等，eds.(1999)Short Protocolsin Molecular Biology，4th edition，John Wiley&Sons；Ream等，eds.(1998)Molecular Biology Techniques：An Intensive Laboratory Course，AcademicPress)；PCR(Introduction to Biotechniques Series)，2nd ed.(Newton&Grahameds.，1997，Springer Verlag)。
本发明大体上涉及用于在患有肾病的对象中降低血压或预防血压上升和用于治疗或预防高血压或高血压前期的方法和药物。本发明进一步提供在任何对象中，包括但不限于患有肾病的对象，有效降低血压或预防血压上升和用于治疗或预防高血压或高血压前期的具体化合物。
本发明提供用于在患有肾病的对象中治疗或预防高血压或高血压前期的方法与药物。在一个方面，本发明提供用于在患有肾病的对象中治疗高血压或高血压前期的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量能够抑制低氧诱导因子(HIF)脯氨酰基羟化酶活性的化合物，从而在对象中治疗高血压或高血压前期。在另一方面，本发明提供在患有肾病的对象中预防高血压的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的能够抑制低氧诱导因子(HIF)脯氨酰基羟化酶活性的化合物，从而在患有肾病的对象中预防高血压。在一个方面，所述患有肾病的对象是高血压前期的。在另一个方面，本发明提供能够抑制HIF脯氨酰基羟化酶活性的化合物在制备用于在患有肾病的对象中治疗或预防高血压或高血压前期的药物中的应用。
在一个实施方案中，本发明提供了用于在患有肾病的对象中降低血压或预防血压上升的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的能够抑制低氧诱导因子(HIF)脯氨酰基羟化酶活性的化合物，从而在对象中降低血压或预防血压上升。本发明在此还预期能够抑制HIF脯氨酰基羟化酶活性的化合物在制备用于在患有肾病的对象中降低血压的药物中的应用。在本发明不同的实施方案中还预期用于在需要其的对象中降低收缩压，或降低舒张压，或降低平均动脉压的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的能够抑制低氧诱导因子(HIF)脯氨酰基羟化酶活性的化合物，从而在对象中分别降低收缩压、或降低舒张压、或降低平均动脉压。
在本发明的各实施方案中，所述患有肾病的对象或所述肾病对象是患有肾脏失调或疾病的对象，所述肾脏失调或疾病包括但不限于急性肾衰竭、慢性肾病、末期肾病、肾损伤、膜性肾病等。
所述患有肾病的对象也可以是由选自以下组中的失调而导致具有高血压或高血压症风险的对象：慢性肾病、急性肾衰竭、和肾功能不全。这些对象可以包括具有已知与发展血压上升或高血压或高血压症的风险增加相关的多种因素中的一种或多种的对象。这些风险因素包括如高血压家族病史、糖尿病、肥胖、某些种族或人种、惯于久坐的生活方式、年龄、饮酒、吸烟、使用咖啡因、饮食、钠敏感性和盐摄取、肾病和肾功能不全、睡眠窒息症、妊娠、肝硬化、库欣氏病、某些药物治疗、情绪因素、压力等。
除上述方法和药物之外，本发明提供了式I的化合物在用于在对象中治疗或预防高血压或高血压前期或降低血压的方法中的应用，所述方法包括向所述对象给药有效量的式I化合物，或其药学上可接受的盐、酯、或前药：
Figure BPA00001177066100101
其中，
A选自苯或吡咯环
q是1、2或3；
W选自(C1-C3)-烷基、(C1-C3)-烷氧基或(C6-C10)-芳基氧基，其中每一个可以是未被取代的或被一个或多个卤素、(C1-C3)-烷基、(C1-C3)-烷氧基、或(C6-C10)-芳基取代；且
R选自氢、烷基、或氰基。
本发明在此还提供式I的化合物在制备用于在对象中治疗高血压或高血压前期的药物中的应用。
在一个实施方案中，本发明提供了用于在需要其的对象中降低血压或预防血压上升的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的式I化合物，从而在对象中降低血压或预防血压上升。本发明在此还预期式I的化合物在制备用于在需要其的对象中降低血压或预防血压上升的药物中的应用。在本发明不同的实施方案中还预期用于在需要其的对象中降低收缩压、或降低舒张压、或降低平均动脉压的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的式I化合物，从而在对象中分别降低收缩压、或降低舒张压、或降低平均动脉压。
在一个实施方案中，本发明提供了用于在患有高血压前期的对象中预防高血压的方法和药物，所述方法包括向所述对象给药有效量的式I化合物，从而在所述患有高血压前期的对象中预防高血压。在本发明的某些实施方案中，所述对象具有发展血压上升或高血压、高血压症、或高血压前期的风险。这些对象可以包括具有已知与发展血压上升或高血压或高血压症的风险增加相关的多种因素中的一种或多种的对象。这些风险因素包括例如高血压家族病史、糖尿病、肥胖、某些种族或人种、惯于久坐的生活方式、年龄、饮酒、吸烟、使用咖啡因、饮食、钠敏感性和盐摄取、肾病和肾功能不全、睡眠窒息症、妊娠、肝硬化、库欣氏病、某些药物治疗、情绪因素、压力等。在一个实施方案中，所述具有高血压或高血压症风险的对象患有选自以下组中的失调：肾病和肾功能不全。在各实施方案中，所述具有高血压或高血压症风险的对象是非贫血的。在一些实施方案中，所述高血压或高血压症与肾病有关。
在本发明的某些实施方案中，将式I的化合物给药至对象以治疗高血压，其中所述高血压进一步选自以下组中：轻度高血压、中度高血压、严重高血压、和极严重的高血压。
在本发明的各实施方案中，所述对象是哺乳动物对象。在具体的实施方案中，所述对象是人类对象。
确定对象是否患有高血压或高血压症可以使用本领域技术人员接受和使用的任何测量方法。在人类对象中，收缩压低于120mmHg和舒张压低于80mmHg通常被认为是正常或最佳的。收缩压高于120mmHg但低于140mmHg，或舒张压高于80mmHg但低于90mmHg可以被认为是高血压前期。收缩压为140mmHg或以上或舒张压为90mmHg或以上可以被认为是高血压。在患有高血压的对象中可能出现显著的健康风险，特别是当在出现病症(condition)例如糖尿病、肥胖、心脏病、肾病、吸烟、或其它有关的风险因素的情况下发生高血压时。因此，本发明预期治疗具有高正常血压的对象，以防止高血压或高血压症。在某些实施方案中，适于使用本方法和药物治疗的人类对象是患有高血压的对象，特别是当所述对象具有上述病症时。
平均动脉压(MAP)表示对象中的名义上的平均血压。MAP的定义为在单独的心动周期中的平均动脉压。平均动脉压可以根据本领域技术人员接受和使用的任何方法来测定。例如，平均动脉压可以根据以下公式计算：(舒张压+1/3[收缩压-舒张压])。(参见Rogers等(2001)Ann Intern Med.134：1024-32.)在一个实施方案中，本发明提供了可用于在患有血压上升或高血压或高血压症的对象中降低平均动脉压的方法和药物。
收缩压高于约140mmHg或舒张压高于约90mmHg的人类对象被认为患有高血压。高血压可以进一步分类为轻度高血压(阶段1，收缩压介于140至159mmHg之间；舒张压介于90至99mmHg之间)、中度高血压(阶段2，收缩压介于160至179mmHg之间；舒张压介于100至109mmHg之间)、严重高血压(阶段3，收缩压介于180至209mmHg之间；舒张压介于110至119mmHg之间)、或极严重的高血压(阶段4，收缩压高于210mmHg；舒张压高于120mmHg)。因此，在某些实施方案中，适合用本发明的方法和药物治疗的人类对象是患有高血压的对象，所述高血压包括轻度高血压、中度高血压、严重高血压和极严重的高血压。
本态性高血压(essential hypertension)，亦称为原发性高血压或特发性高血压，占所有高血压病例的约90％。本态性高血压的原因尚不知晓，但可能与主要器官和身体***中的不同的并发症和异常有关，所述主要器官和身体***包括心脏、肾、血管、神经和激素。本发明提供了用于在对象中治疗本态性高血压的方法和药物。在一个实施方案中，所述方法包括对需要其的病人给药式I的化合物，从而在所述对象中治疗高血压。
在其它实施方案中，所述方法和药物可以用于治疗具有发展高血压或高血压症的风险的对象。例如，具有风险的对象可以例如通过已知与发展血压上升或高血压或高血压症的风险增加的不同因素中的一个或多个进行评价来确定的。这些风险因素包括例如高血压家族病史、糖尿病、肥胖、某些种族或人种、惯于久坐的生活方式、年龄、饮酒、吸烟、使用咖啡因、饮食、钠敏感性和盐摄取、肾病和肾功能不全、睡眠窒息症、妊娠、肝硬化、库欣氏病、某些药物、情绪因素、压力等。例如，血压上升和高血压经常与肾病和不同的肾病变有关。因此，在本发明的各实施方案中，所述需要其的对象是患有肾病(包括肾功能不全)的失调的对象。本发明在此特别地预期，在特定的方面，所述具有风险的对象可以是没有血压上升的对象，例如，具有正常血压或甚至低于正常血压的对象，例如收缩压在120mmHg或以下，或舒张压在80mmHg或以下。然而，这些对象将患有能够提高其发展高血压或高血压症可能性的潜在病症如肾病。
在患有肾病的对象中，高血压是普遍的病症。(Agarwal等(2005)Hypertension 46：514-520.)本发明的方法和药物在患有肾病的对象中降低血压(参见例如实施例2)。特别地，本发明的方法和药物在患有肾病的对象中降低收缩压、舒张压和平均动脉压。因此，本发明的方法和药物可用于在患有肾病的对象中降低血压。此外，本发明的方法和药物可用于在对象中治疗与肾病有关的高血压。
患有慢性肾病的对象显示血压随着时间逐渐上升。这种公认的现象在这些对象中经常导致高血压或高血压症的发展(参见例如实施例1和实施例2)。本发明的方法和药物防止在这些对象中通常观察到的血压上升。因此，本发明提供了可用于在对象中预防与肾病有关的高血压的方法和药物。具体而言，本发明证实给药(HIF)脯氨酰基羟化酶抑制剂可预防与肾病有关的高血压，和特别地，降低血压。
在某些方面，所述具有风险的对象是曾经或目前正使用一种或多种血压药物治疗的对象，所述血压药物包括例如ACE抑制剂(例如贝那普利、福辛普利、赖诺普利、喹那普利)、ARB(例如氯沙坦)、BB(例如酒石酸美托洛尔、倍他洛尔、缬沙坦)、利尿剂(例如氢***)、血管扩张药(例如硝酸异山梨酯)、α-阻滞剂、CCB、和他汀类。
化合物
在此提供的用于所述方法或药物的化合物是HIF脯氨酰基羟化酶抑制剂。在此使用的术语″HIF脯氨酰基羟化酶″是指能够在HIF的α亚单位中羟基化脯氨酸残基的酶。这种HIF脯氨酰基羟化酶包括Taylor(2001)Gene275：125-132所描述的EGL-9(EGLN)2-氧代戊二酸-和铁-依赖性双加氧酶家族的蛋白成员；其表征于Aravind和Koonin(2001)Genome Biol 2：RESEARCH0007；Epstein等(2001)Cell 107：43-54；和Bruick和McKnight(2001)Science 294：1337-1340。HIF脯氨酰基羟化酶的实例包括人SM-20(EGLN1)(GenBank Accession No.AAG33965；Dupuy等(2000)Genomics69：348-54)、EGLN2同种型1(GenBank Accession No.CAC42510；Taylor，前述)、EGLN2同种型2(GenBank Accession No.NP 060025)、和EGLN3(GenBank Accession No.CAC42511；Taylor，前述)；小鼠EGLN1(GenBankAccession No.CAC42515)、EGLN2(GenBank Accession No.CAC42511)、和EGLN3(SM-20)(GenBank Accession No.CAC42517)；和大鼠SM-20(GenBank Accession No.AAA19321)。此外，HIF脯氨酰基羟化酶可包括线虫(caenorhabditis elegans)EGL-9(GenBank Accession No.AAD56365)和黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)CG1114基因产物(GenBank Accession No.AAF52050)。术语″HIF脯氨酰基羟化酶″还包括前述全长蛋白的任何活性片段。
能够抑制HIF脯氨酰基羟化酶的活性的化合物是能够降低或抑制至少一种HIF脯氨酰基羟化酶的活性的任何化合物。这些化合物在此被称为″脯氨酰基羟化酶抑制剂″或″PHI″。在具体的实施方案中，用于本方法和药物中的化合物是2-氧代戊二酸的结构模拟物，其中所述化合物能够与2-氧代戊二酸竞争性地抑制目标HIF脯氨酰基羟化酶和与铁非竞争性地抑制目标HIF脯氨酰基羟化酶。能够抑制HIF脯氨酰基羟化酶活性的化合物已在例如国际公开第WO 03/049686号、第WO 02/074981号、第WO 03/080566号、第WO 2004/108681号、第WO 2006/094292号、第WO 2007/038571号、第WO 2007/090068号、第WO 2007/070359号、第WO 2007/103905号和第WO 2007/115315号中描述。
在具体的实施方案中，所述用于在患有肾病的对象中治疗的高血压的方法和药物的化合物是2-氧代戊二酸的结构模拟物，其能够与2-氧代戊二酸竞争性地抑制目标HIF脯氨酰基羟化酶和与铁非竞争性地抑制目标HIF脯氨酰基羟化酶。在另一个实施方案中，用于本方法和药物的化合物是式A的杂环羰基甘氨酸：
Figure BPA00001177066100141
其中X是任选地被取代的杂环部分。这些脯氨酰基羟化酶抑制剂(PHI)包括但不限于各种被取代的3-羟基-吡啶-2-羰基-甘氨酸、4-羟基-哒嗪-3-羰基-甘氨酸、3-羟基-喹啉-2-羰基-甘氨酸、4-羟基-2-氧代-1，2-二氢喹啉-3-羰基-甘氨酸、4-羟基-2-氧代-1，2-二氢-萘啶-3-羰基-甘氨酸、8-羟基-6-氧代-4，6-二氢-吡啶并吡嗪-7-羰基-甘氨酸、4-羟基-异喹啉-3-羰基-甘氨酸、4-羟基-噌啉-3-羰基-甘氨酸、7-羟基-噻吩并吡啶-6-羰基-甘氨酸、4-羟基-噻吩并吡啶-5-羰基-甘氨酸、7-羟基-噻唑并吡啶-6-羰基-甘氨酸、4-羟基-噻唑并吡啶-5-羰基-甘氨酸、7-羟基-吡咯并吡啶-6-羰基-甘氨酸、4-羟基-吡咯并吡啶-5-羰基-甘氨酸等。
在本发明的各实施方案中，所提供的方法和药物使用式I的化合物，或其药学上可接受的盐、酯、或前药：
其中，
A选自苯或吡咯环；
q是1、2或3；
W选自(C1-C3)-烷基、(C1-C3)-烷氧基或(C6-C10)-芳基氧基、其中每一个可以是未被取代的或被一个或多个卤素、(C1-C3)-烷基、(C1-C3)-烷氧基、或(C6-C10)-芳基取代；且
R选自氢、烷基、或氰基。
在一个实施方案中，所述方法包括向所述对象给药有效量的式I化合物，从而在所述对象中治疗高血压。在其它实施方案中，将式I的化合物用于制备用于在需要其的对象中降低血压的药物。
术语″烷基″是指饱和的一价烃基并且实例为基团如甲基、乙基、正丙基、异丙基等。被一个或多个烷基取代的烷基可包括但不限于正丁基、叔丁基、正戊基、2-甲基-戊基、1-乙基-2-甲基-戊基等。被芳基取代的烷基可包括但不限于苯甲基、1-萘-2-基-乙基等。
术语″烷氧基″是指基团″烷基-O-″并包括例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基等。
术语″芳基″是指具有单独的环或复数个稠环的一价芳香碳环基团，并包括例如苯基、萘基等。
术语″芳基氧基″是指基团芳基-O-基团并包括例如苯氧基、萘氧基等。
术语″氰基″是指基团-CN。
术语″卤素″或”卤”是指氟、氯、溴和碘。
在一些实施方案中，用于本方法和药物中的化合物选自式I(a)的化合物，或其药学上可接受的盐、酯、或前药：
其中W和R如上定义。
在具体的实施方案中，所述式I(a)的化合物选自以下化合物或其药学上可接受的盐、酯、或前药：其中W选自(C1-C3)-烷氧基或(C6-C10)-芳基氧基，其中每一个可以是未被取代的或被(C1-C3)-烷基和/或(C1-C3)-烷氧基取代；且R选自氢、烷基、或氰基。
在其它实施方案中，所述化合物选自式I(b)的化合物，或其药学上可接受的盐、酯、或前药：
其中，
W1选自(C1-C3)-烷基，其可以是未被取代的或被一个或多个(C1-C3)-烷氧基或(C6-C10)-芳基取代，；
W2和W3各自独立地选自卤素或(C1-C3)-烷基；且
R选自氢、烷基、或氰基。
在本发明的各实施方案中，用于所述方法的化合物或用于制备药物的化合物选自以组中：[(4-羟基-1-甲基-7-苯氧基-异喹啉-3-羰基)-氨基]-乙酸(A)、{[4-羟基-7-(4-甲氧基-苯氧基)-异喹啉-3-羰基]-氨基}-乙酸(C)、[(1-氰基-4-羟基-5-苯氧基-异喹啉-3-羰基)-氨基]-乙酸(I)、[(1-氰基-4-羟基-7-异丙氧基-异喹啉-3-羰基)-氨基]-乙酸(D)、{[1-氰基-7-(2，6-二甲基-苯氧基)-4-羟基-异喹啉-3-羰基]-氨基}-乙酸(J)、{[3-溴-7-氰基-4-羟基-1-(4-甲氧基-苯甲基)-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-5-羰基]-氨基}-乙酸(K)、{[2，3-二氯-7-氰基-4-羟基-1-(4-甲氧基-苯甲基)-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-5-羰基]-氨基}-乙酸(H)、{[7-氰基-1-(2-氟-苯甲基)-4-羟基-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-5-羰基]-氨基}-乙酸(G)、{[7-氰基-4-羟基-1-(3-甲氧基-苯甲基)-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-5-羰基]-氨基}-乙酸(E)、[(7-氰基-4-羟基-1-萘-2-基甲基-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-5-羰基)-氨基]-乙酸(F)。
适用于本发明方法和药物的化合物可以使用任何常规的公知的方法来识别。适合的分析方法在本技术领域是公知的。例如，化合物抑制HIF脯氨酰基羟化酶活性的能力可以在如实施例1中所述的酶分析方法测试。在一定条件下将化合物与经放射性标记的α-氧代戊二酸、可被羟基化的HIFα-肽、和HIF脯氨酰基羟化酶如EGLN3组合，其中在所述条件下在没有化合物存在的情况下，所述HIF脯氨酰基羟化酶能够羟基化所述HIFα-肽和将所述α-氧代戊二酸转化成琥珀酸根和二氧化碳；测量所释出的二氧化碳的水平，其中在存在化合物的情况下释出的二氧化碳的量的下降确认HIF脯氨酰基羟化酶的抑制剂。或者，可以使用实施例2的HIFα稳定化分析来间接地测试化合物抑制HIF脯氨酰基羟化酶活性的能力。
在某些方面，本发明所述的方法进一步包括使用选自ACEI、ARB、α-阻滞剂、BB、血管扩张药、CCB和他汀类中的第二种治疗化合物来治疗所述对象。
药学制剂和给药途径
如本领域所熟知的，本发明所述方法所使用的PHI可以直接给药至所述对象或在包含赋形剂的药物(药学制剂)中给药。药学上可接受的赋形剂是本领域可得到的，并包括在不同药典中列出的那些(参见例如USP、JP、EP、和BP、FDA网页(www.fda.gov)，Inactive Ingredient Guide 1996，和Handbook of Pharmaceutical Additives，ed.Ash；Synapse InformationResources，Inc.2002.)本治疗方法可以包括对患有或具有患高血压或高血压症风险的对象给药有效量的化合物或药物。在一些实施方案中，所述对象是哺乳动物对象，而在具体实施方案中，所述对象是人类对象。
在某些方面，所述PHI可以与第二种治疗化合物一起给药或配制。在具体实施方案中，本发明所述的方法和药物进一步包括将PHI与至少一种选自ACE抑制剂、ARB、α-阻滞剂、BB、血管扩张药、利尿剂、CCB和他汀类的活性成分组合给药或配制。
有效量如剂量的化合物可以容易地通过常规实验确定，有效和方便的给药途径及适当的制剂也是如此。
不同的制剂和给药***在本领域中是可以得到的(参见例如Gennaro，ed.(2000)Remington′s Pharmaceutical Sciences，如上所述；和Hardman，Limbird，和Gilman，eds.(2001)The Pharmacological Basis of Therapeutics，如上所述)。合适的给药途径可以例如包括口服给药、直肠给药、局部给药、鼻部给药、肺部给药、眼部给药、肠道给药和非胃肠道给药。非肠道给药的主要途径包括静脉内给药、肌肉内给药、和皮下给药。给药的次要途径包括腹膜内给药、动脉内给药、关节内给药、心脏内给药、脑池内给药、皮内给药、病灶内给药、眼内给药、胸膜内给药、鞘内给药、子宫内给药和心室内给药。待治疗的适应证以及药物的物理、化学和生物性质决定应该使用哪种类型的制剂和给药途径，以及应优选局部还是全身递送。
有效份量或治疗有效量是指可以引起接受研究人员、兽医、医生或其它临床医师研究的组织、***、动物或人的生物学或医学响应(例如血压的下降等)的活性成分或药物组合物的量。治疗上有效的剂量最初可使用本领域熟知的各种技术来估计。用于动物研究中的最初剂量可以基于在细胞培养实验中确定的有效浓度。适合人类对象的剂量范围可以例如使用从动物研究或细胞培养实验获得的数据确定。
这些分子的毒性和治疗效力可以通过标准药学程序在细胞培养或实验动物中确定，例如通过确定LD50(对50％的群体致死的剂量)ED50(对50％的群体治疗有效的剂量)。毒性作用和治疗作用的剂量比例是治疗指数，其可以以比例LD50/ED50表示。优选显示出高治疗指数的化合物。剂量优选地落在几乎没有毒性或无毒性的ED50的循环浓度的范围内。取决于所使用的剂型和/或给药途径，剂量可以在该范围内变化。根据对象的具体病症，确切的制剂、给药途径、剂量和剂量间隔应根据本领域熟知的方法来选择。
剂量的量和间隔可单独地调节，以提供足够达至所需效果(例如适当的血压降低或维持等)的活性部分的血浆水平，即最小有效浓度(MEC)。所述MEC对于每个化合物而言不同，但可以从例如体外数据和动物实验来估算。达到所述MEC所需要的剂量取决于个体的特性和给药途径。在局部给药或选择性吸收的情况中，药物的有效局部浓度可能不会与血浆浓度有关。
给药的活性成分或组合物的量可能取决于多个因素，包括受治疗的对象的性别、年龄和体重，病情的严重程度，给药方式和处方医生的判断。
实施例
参考以下实施例可进一步理解本发明，但这些实施例仅仅是本发明的示例。提供这些实施例的目的仅仅是解释所主张的本发明。本发明的范围不受所示例的实施方案的限制，这些实施方案的目的仅仅是为了说明本发明的一个方面。任何在作用上等价的方法都包括在本发明的范围之内。根据前面的描述和附图，除这里描述的本发明的各种变体以外的那些变体对于本领域技术人员而言将是显而易见的。所述变体也意图处于所附的权利要求的范围之内。
实施例1：HIF脯氨酰基羟化酶抑制实验
氧代戊二酸α-[1-14C]-钠盐、α-氧代戊二酸钠盐和HPLC纯化的肽可以分别获自商业来源例如Perkin-Elmer(Wellesley MA)、Sigma-Aldrich、及SynPep Corp.(Dublin CA)。分析中所用的肽可以是HIFα的片段，包括但不限于任何保留有至少一个HIFα的官能或结构特征的片段。HIFα的片段包括例如由人类HIF-1α由氨基酸401至603(Huang等，前述)、氨基酸531至575(Jian等(1997)J.Biol.Chem.272：19253-19260)、氨基酸556至575(Tanimoto等，前述)、氨基酸557至571(Srinivas等(1999)Biochem.Biophys.Res.Commun.260：557-561)和氨基酸556至575(Ivan和Kaelin(2001)Science 292：464-468)所定义的区域。此外，HIFα片段包括任何包含基序LXXLAP的最少一次的出现的片段，例如在人类HIF-1α天然序列由L397至P402和由L559至P564中出现。可以用于分析中的其他片段是国际公开WO 2005/118836公开的HIFα的片段，其援引加入本文。例如，用于筛选分析中的HIF肽可包含[甲氧基香豆素]-DLDLEALAPYIPADDDFQL-酰胺。
HIF-PH如HIF-PH2(EGLN1)可以在如昆虫Hi5细胞中表达，并例如经过SP离子交换色谱柱而部份地纯化。酶活性使用Kivirikko和Myllyla(1982，Methods Enzymol.82：245-304)所描述的分析通过捕获14CO2来测定。实验反应包含50mM HEPES(pH 7.4)、100μM α-氧代戊二酸钠盐、0.30μCi/mL氧代戊二酸α-[1-14C]-钠盐、40μM FeSO4、1mM抗坏血酸盐、1541.8单位/mL过氧化氢酶，包含或不含50μM肽底物和不同浓度的本发明化合物。通过加入HIF-PH酶开始反应。
肽依赖性转换百分比通过以存在底物肽时的转换百分比减去不存在肽时的转换百分比计算得到。抑制百分比和IC50使用在给定的抑制剂浓度下的肽依赖性转换百分比计算得到。每一个抑制剂的IC50数值的计算都使用GraFit软件(Erithacus Software Ltd.，Surrey UK)进行。EGLN3分析中的示例化合物的IC50的范围为约6至1160纳摩尔。因此，如下举例的用于所述方法和药物中的化合物是HIF脯氨酰基羟化酶的抑制剂。
实施例2：基于细胞的HIFα稳定化分析
将源于不同组织的人类细胞分别接种于35mm的培养碟中，并在37℃、20％O2、5％CO2的情况下在标准培养基例如DMEM(达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modification of Eagle′s medium))，10％FBS(胎牛血清)中生长。当细胞层达到融合时，将培养基替换成OPTI-MEM培养基(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad CA)，将细胞层在20％O2、5％CO2中在37℃下温育约24小时。然后将化合物或0.013％DMSO(二甲亚砜)加入现存的培养基并继续温育过夜。
温育之后，移除培养基，离心分离，并储存以供分析(参见下面的VEGF和EPO分析)。所述细胞在冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤两次，然后在1mL的10mM Tris(pH 7.4)、1mM EDTA、150mM氯化钠、0.5％IGEPAL(Sigma-Aldrich，St.Louis MO)、和蛋白酶抑制剂混合物(Roche MolecularBiochemicals)中在冰上裂解15分钟。细胞裂解产物在3,000xg和4℃下离心5分钟，收集细胞溶质部份(上清液)。将细胞核(小颗粒)再悬浮并在100μL的20mM HEPES(pH 7.2)，400mM氯化钠、1mM EDTA、1mM二硫苏糖醇、和蛋白酶混合物(Roche Molecular Biochemicals)中裂解，在13,000xg和4℃下离心5分钟，收集核蛋白部份(上清液)。
使用QUANTIKINE免疫分析(R&D Systems，Inc.，Minneapolis MN)根制造商的指导来分析细胞核部份的HIF-1α。
实施例3：使用HIF脯氨酰基羟化酶抑制剂治疗在慢性肾病动物模型中降低高血压
尿毒性慢性肾病(CKD)人群的病理生理特征是高血压。通过5/6肾切除术产生的大鼠残余肾模型是公认的CKD动物模型，其能够展示该病理(Priyadarshi等(2002)Kidney Int 61：542-546；Coleman等(2006)Proc NatlAcad Sci USA 103：5965-5970.)。用于产生大鼠残余肾模型的外科手术程序根据Priyadarshi等(前述)所描述的所述程序的修改而进行，或根据Tanaka等(2005，Lab Invest 85：1292-1307)所描述的所述程序的修改而进行。单独的研究使用雄性Sprague Dawley大鼠(280-300g)或雌性Wistar大鼠(220-250g)。
将动物分成两组，其中一组(假手术组)接受假外科手术而另一组(Nx)接受如下所述的5/6肾切除术。将动物用异氟烷麻醉，并开中线腹部切口，接着钝剥离肾蒂。将两个或三个左肾的动脉分支扎紧以梗塞三分二的左肾，而右肾则同时进行肾切除术。所述梗塞通过观察肾脏颜色变化来证实。保持动物体温不变，并直接向腹部给药暖的(～37℃)盐水(1.0mL)。然后，将切口缝合并容许动物复原并可自由获得有规律的食物和水。密切监测动物的体重和死亡率。
自外科手术后35日开始，将Nx和假手术组的动物随机地分组，并以运载体或化合物A治疗。将化合物以每剂量20或40mg/kg化合物通过口服强饲每周给药三次。使用Kent XBP1000***(Kent Scientific Corp.，Torrington，CT)或Muromachi尾套血压***(Muromachi Kikai Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)，这两种***都具有体积/压力纪录技术，且按照制造商的指导来测量血压(BP)。将大鼠置于灯下轻微地使其温暖，并在测量前小心地使其适应。BP以从每个时期获得的3个独立的测量的平均值的形式纪录，并以平均±SEM的形式报告。使用单因素方差分析(ANOVA)和Student-Newman-Keuls法(SigmaStat，SPSS Science，Chicago，IL)比较结果。
相对于仅使用运载体治疗的动物，根据本发明方法使用化合物治疗Nx组的动物一致地导致较低的血压。例如，在一个实验中，以20或40mg/kg的化合物A治疗Nx组大鼠逆转了先前存在的高血压(图1)。在外科手术后三周进行的收缩压(SBP)的基线测量表明，与假手术组相比较，在所有Nx组中已发展出相同程度的高血压(SBP平均增加约42％)。与以运载体治疗的Nx组大鼠(195.7±24.4)相比较，以20mg/kg(167±26.7mmHg)和40mg/kg(155.4±42.9mmHg)的化合物A治疗的Nx组大鼠的SBP显著下降(p＜0.05)。
这些结果显示本发明的方法和药物在高血压慢性肾病的大鼠模型中能够有效地降低收缩压。此外，这些结果显示本发明的方法和药物在患有CKD的对象中可有效地降低血压。这些结果进一步证实本发明的方法和药物可有效地治疗或预防高血压。
实施例4：在动物模型***中使用不同的HIF脯氨酰基羟化酶抑制剂治疗能够降低高血压
在另一系列的实验中，在外科手术后35日，将接受5/6肾切除术的大鼠根据上述实施例3所述的剂量计划使用HIF脯氨酰基羟化酶抑制剂治疗。将选自化合物A和C-K中的单独的化合物以8、20、30或40mg/kg(参见表1和表2)通过口服强饲给药。在第35日(基线)纪录收缩压并在给药最后一剂化合物后立刻再次记录。表1和表2显示向Nx大鼠口服给药本发明不同的化合物四周后的收缩压的变化。表1报告了收缩压自基线的变化(化合物从基线水平降低血压的程度)，表2报告了自运载体的变化(与用运载体治疗的Nx大鼠比较，化合物降低血压的程度)。
如表1所示，使用本发明的方法或药物治疗的Nx大鼠显示自基线降低的收缩压，表示所述方法和药物能够在患有高血压的动物中降低血压。
表1
Figure BPA00001177066100221
如表2所示，与用运载体治疗的动物相比较，使用本发明的方法或药物治疗的Nx大鼠显示随时间变化可预防收缩压上升，表示所述方法和药物在患有肾病的动物中可预防高血压的发展。
表2
这些结果显示，本发明的方法和药物可有效地降低与肾病有关的血压上升，特别是在高血压慢性肾病大鼠模型中的收缩压。此外，这些结果显示本发明的方法和药物可有效降低患有CKD的对象中的血压。这些结果进一步证明本发明的方法和药物可有效治疗或预防高血压。
实施例5：在患有CKD的人类对象中方法和药物对降低血压是有疗效的
高血压是患有慢性肾病的患者中的一种普遍情况(Agarwal等(2005)Hypertension 46：514-520.)。检验了本发明的化合物对患有晚期慢性肾病的贫血和非贫血对象中的血压的作用。所有研究对象均患有慢性肾病(CKD)，其定义为＜59ml/min的肾小球滤过率(GFR)。这些CKD对象中有的一些还患有贫血，其定义为具有＜11g/dL的血红蛋白(Hb)水平。对象以口服方式每周两或三次给药化合物A或安慰剂，为期四周。血压读数(如收缩压，舒张压和平均动脉压)在不同时间用血压计根据标准评价方式收集。
在一系列的实验中，在24小时内对本发明的方法和药物对患有晚期慢性肾病的贫血和非贫血对象中的血压的作用进行检验。对象以口服方式给药化合物A或安慰剂，在接受治疗后的1、2、3、4、6、12和24小时收集血压读数。无论是给药化合物A还是安慰剂，所有对象在给药后1和2小时均显示血压的微小上升(数据没有显示)。
下述的表3、表4和表5显示，对人类CKD对象以口服方式给药化合物X后，平均动脉压(MAP)、收缩压(SBP)和舒张压(DBP)的每小时的变化。如下表3所示，给药化合物A的CKD对象(贫血和非贫血的)在所有时间点上均显示出平均动脉压自基线水平的平均下降。相似地，使用化合物A治疗的CKD对象显示出收缩压和舒张压两者都有平均下降(参见表4和表5)。相比之下，给药安慰剂的对象通常显示血压(即MAP、SBP和DBP)自基线水平的平均上升。
表3
Figure BPA00001177066100241
表4
Figure BPA00001177066100242
表5
这些结果显示，本发明的方法和药物可有效地在患有慢性肾病的对象中降低平均动脉压，收缩压和舒张压。此外，这些结果显示，本发明的方法和药物可有效地在患有CKD的贫血和非贫血人类对象中降低血压。高血压在患有CKD的患者中是普遍的病症。这些结果证明，本发明的方法和药物可有效地降低这些病人中的血压；因此，这些结果显示，本发明的方法和药物可有效地在对象中治疗高血压。使用安慰剂治疗的CKD对象显示平均动脉压、收缩压和舒张压自基线上升，然而，使用本发明的方法和药物在CKD对象中预防了这种上升。因此，本发明的方法和药物可用于在CKD对象中预防平均动脉压，收缩压和舒张压的上升。这些结果进一步暗示了本发明的方法和药物应可用于在CKD对象中预防高血压。
实施例6：在患有CKD的人类对象中方法和药物对治疗高血压是有疗效的
在另一系列的实验中，在为期四周内检验本发明的药物对患有慢性肾病的贫血和非贫血对象的血压的作用。所有对象都以口服方式每周两或三次给药化合物A或安慰剂，为期四周。每周收集血压读数。
下述的表6、表7和表8显示在对人类CKD对象口服给药化合物A后，平均动脉压(MAP)、收缩压(SBP)和舒张压(DBP)每周的变化。如下表6所示，已给药化合物A的CKD对象(贫血和非贫血的)在所有时间点上均显示出平均动脉压自基线水平的平均下降。相似地，使用化合物A治疗的CKD对象显示出收缩压和舒张压两者均有平均下降(参见表7和表8)。相比之下，给药安慰剂的对象普遍显示血压(即MAP、SBP和DBP)自基线水平的平均上升。
表6
Figure BPA00001177066100261
表7
Figure BPA00001177066100271
表8
Figure BPA00001177066100272
这些结果显示，本发明的方法和药物能有效地在患有慢性肾病的人类对象中降低平均动脉压、收缩压和舒张压。此外，这些结果显示，本发明的方法和药物可有效地在患有慢性肾病的贫血和非贫血人类对象中对降低血压。高血压在患有CKD的患者中是普遍的病症。这些结果证明，本发明的方法和药物能有效地在这些患者中对降低血压；因此，这些结果显示本发明的方法和药物可有效地在对象中治疗高血压。使用安慰剂治疗的CKD对象普遍地显示平均动脉压、收缩压和舒张压自基线上升。然而，使用本发明的方法和药物在CKD对象中预防了这种上升。因此，本发明的方法和药物可以用于在CKD对象中预防平均动脉压、收缩压和舒张压的上升。这些结果进一步暗示了本发明的方法和药物应可用于在患有CKD的对象中预防高血压。
除了本文所述的那些实施例本发明的变体以外，根据上文描述，本发明的各种变体对于本领域的技术人员而言是显而易见的。所述变体应被视为处于所附的权利要求书的范围内。
所有在此引用的文献都全文援引加入本文。

Claims (23)

1.在患有肾病的对象中治疗或预防高血压或高血压前期的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的能够抑制低氧诱导因子(HIF)脯氨酰基羟化酶活性的化合物，从而在对象中治疗或预防高血压或高血压前期。
2.能够抑制HIF脯氨酰基羟化酶活性的化合物在制备用于在患有肾病的对象中治疗高血压或高血压前期的药物中的应用。
3.如权利要求1所述的方法或如权利要求2所述的应用，其中所述化合物是2-氧代戊二酸的结构模拟物，其能够与2-氧代戊二酸竞争性地抑制HIF脯氨酰基羟化酶和与铁非竞争性地抑制HIF脯氨酰基羟化酶。
4.如权利要求1-3之一所述的方法或应用，其中所述化合物是式A的化合物：
Figure FPA00001177066000011
其中，X是任选地被取代的杂环部分。
5.如权利要求1-4之一所述的方法或应用，其中所述化合物是式I的化合物或其药学上可接受的盐、酯、或前药：
Figure FPA00001177066000012
其中，
A选自苯或吡咯环；
q是1、2或3；
W选自由(C1-C3)-烷基、(C1-C3)-烷氧基或(C6-C10)-芳基氧基，其中每一个可以是未被取代的或被一个或多个卤素、(C1-C3)-烷基、(C1-C3)-烷氧基、或(C6-C10)-芳基取代；且
R选自氢、烷基、或氰基。
6.如前述权利要求之一所述的方法或应用，其中所述对象是哺乳动物对象。
7.如前述权利要求之一所述的方法或应用，其中所述对象是人类对象。
8.如前述权利要求之一所述的方法或应用，其中所述高血压是轻度高血压。
9.如权利要求1-7之一所述的方法或应用，其中所述高血压是中度高血压。
10.如权利要求1-7之一所述的方法或应用，其中所述高血压是严重高血压。
11.如权利要求1-7之一所述的方法或应用，其中所述高血压是极严重的高血压。
12.用于在对象中治疗或预防高血压或高血压前期的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的式I化合物或其药学上可接受的盐、酯、或前药：
Figure FPA00001177066000021
其中，
A选自苯或吡咯环；
q是1、2或3；
W选自(C1-C3)-烷基、(C1-C3)-烷氧基或(C6-C10)-芳基氧基，其中每一个可以是未被取代的或被一个或多个卤素、(C1-C3)-烷基、(C1-C3)-烷氧基、或(C6-C10)-芳基取代；且
R选自氢、烷基、或氰基。
13.化合物在制备用于在需要其的对象中治疗或预防高血压或高血压前期的药物中的应用，其中所述化合物选自式I的化合物或其药学上可接受的盐、酯、或其前药：
Figure FPA00001177066000031
其中，
A选自苯或吡咯环；
q是1、2或3；
每一个W独立地选自卤素、(C1-C3)-烷基、(C1-C3)-烷氧基或(C6-C10)-芳基氧基，其中每一个可以是未被取代的或被一个或多个卤素、(C1-C3)-烷基、(C1-C3)-烷氧基、或(C6-C10)-芳基取代；且
R选自氢、烷基、或氰基。
14.如权利要求12所述的方法或如权利要求13所述的应用，其中所述化合物选自式I(a)的化合物或其药学上可接受的盐、酯、或前药：
Figure FPA00001177066000032
其中W和R如上所定义。
15.如权利要求14所述的方法或应用，其中，
W选自(C1-C3)-烷氧基或(C6-C10)-芳基氧基，其中每一个可以是未被取代的或被选自以下组中的取代基所取代：(C1-C3)-烷基和(C1-C3)-烷氧基；且
R选自氢、烷基、或氰基；
或其药学上可接受的盐、酯、或前药。
16.如权利要求12所述的方法或如权利要求13所述的应用，其中所述化合物选自式I(b)的化合物或其药学上可接受的盐、酯、或前药：
Figure FPA00001177066000041
其中
W1选自(C1-C3)-烷基，其可以是未被取代的或被一个或多个(C1-C3)-烷氧基或(C6-C10)-芳基取代，；
W2和W3各自独立地选自卤素或(C1-C3)-烷基；且
R选自氢、烷基、或氰基。
17.如权利要求12所述的方法或如权利要求13所述的应用，其中所述化合物选自以下组中：{[4-羟基-7-(4-甲氧基-苯氧基)-异喹啉-3-羰基]-氨基}-乙酸、[(4-羟基-1-甲基-7-苯氧基-异喹啉-3-羰基)-氨基]-乙酸、[(1-氰基-4-羟基-5-苯氧基-异喹啉-3-羰基)-氨基]-乙酸、[(1-氰基-4-羟基-7-异丙氧基-异喹啉-3-羰基)-氨基]-乙酸、{[3-溴-7-氰基-4-羟基-1-(4-甲氧基-苯甲基)-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-5-羰基]-氨基}-乙酸、{[3-氯-7-氰基-4-羟基-1-(4-甲氧基-苯甲基)-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-5-羰基]-氨基}-乙酸、{[2，3-二氯-7-氰基-4-羟基-1-(4-甲氧基-苯甲基)-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-5-羰基]-氨基}-乙酸、{[1-氰基-7-(2，6-二甲基-苯氧基)-4-羟基-异喹啉-3-羰基]-氨基}-乙酸、{[7-氰基-1-(2-氟-苯甲基)-4-羟基-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-5-羰基]-氨基}-乙酸、{[7-氰基-4-羟基-1-(3-甲氧基-苯甲基)-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-5-羰基]-氨基}-乙酸、[(7-氰基-4-羟基-1-萘-2-基甲基-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-5-羰基)-氨基]-乙酸。
18.如权利要求12-17之一所述的方法或应用，其中所述对象是哺乳动物对象。
19.如权利要求12-17之一所述的方法或应用，其中所述对象是人类对象。
20.如权利要求12-19之一所述的方法或应用，其中所述高血压是轻度高血压。
21.如权利要求12-19之一所述的方法或应用，其中所述高血压是中度高血压。
22.如权利要求12-19之一所述的方法或应用，其中所述高血压是严重高血压。
23.如权利要求12-19之一所述的方法或应用，其中所述高血压是极严重的高血压。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016155358A1 (zh) * 2015-03-27 2016-10-06 沈阳三生制药有限责任公司 被芳基或杂芳基取代的5-羟基-1,7-萘啶化合物、其制备方法及其制药用途
CN109260204A (zh) * 2018-10-12 2019-01-25 南京市儿童医院 Fg4592在制备治疗高血压产品上的应用

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201102659D0 (en) 2011-02-15 2011-03-30 Isis Innovation Assay
GB201113101D0 (en) 2011-07-28 2011-09-14 Isis Innovation Assay
ES2786924T3 (es) 2013-06-06 2020-10-14 Fibrogen Inc Formulaciones farmacéuticas que comprenden un inhibidor de hidroxilasa del HIF
WO2016045125A1 (en) 2014-09-28 2016-03-31 Merck Sharp & Dohme Corp. Inhibitors of hif prolyl hydroxylase

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040146964A1 (en) * 2001-03-21 2004-07-29 Maxwell Patrick Henry Assays, methods and means
EP2324834B1 (en) * 2001-12-06 2019-05-08 Fibrogen, Inc. Methods of Increasing Endogenous Erythropoietin (EPO)
GB0206711D0 (en) * 2002-03-21 2002-05-01 Isis Innovation HIF Inhibitor
US8124582B2 (en) * 2002-12-06 2012-02-28 Fibrogen, Inc. Treatment of diabetes
DK1644336T3 (da) * 2003-06-06 2011-05-09 Fibrogen Inc Nitrogenholdige heteroarylforbindelser og deres anvendelse til forøgelse af endogent erythropoietin
ATE513833T1 (de) * 2005-03-02 2011-07-15 Fibrogen Inc Thienopyridinverbindungen und verfahren zu ihrer verwendung
WO2006133391A2 (en) * 2005-06-06 2006-12-14 Fibrogen, Inc. Improved treatment for anemia using a hif-alpha stabilising agent
WO2007070359A2 (en) * 2005-12-09 2007-06-21 Amgen Inc. Quinolone based compounds exhibiting prolyl hydroxylase inhibitory activity, and compositions, and uses thereof
EP2476669A1 (en) * 2006-01-27 2012-07-18 Fibrogen, Inc. Cyanoisoquinoline compounds and methods of use thereof
JP5111491B2 (ja) * 2006-04-04 2013-01-09 フィブロジェン， インコーポレイテッド ピロロ−およびピラゾロ−ピリミジン化合物、およびそれらの使用方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016155358A1 (zh) * 2015-03-27 2016-10-06 沈阳三生制药有限责任公司 被芳基或杂芳基取代的5-羟基-1,7-萘啶化合物、其制备方法及其制药用途
CN106146491A (zh) * 2015-03-27 2016-11-23 沈阳三生制药有限责任公司 被芳基或杂芳基取代的5-羟基-1,7-萘啶化合物、其制备方法及其制药用途
CN109260204A (zh) * 2018-10-12 2019-01-25 南京市儿童医院 Fg4592在制备治疗高血压产品上的应用

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