CN101914476B - 一种深海弹性蛋白酶基因及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种深海弹性蛋白酶基因及其制备方法与应用，属于生物技术技术领域。本发明涉及适冷菌CF6-2及由其提取出的适冷弹性蛋白酶基因和该基因表达翻译的深海弹性蛋白酶。本发明所述的适冷弹性蛋白酶来源于深海低温高盐环境，与其它的弹性蛋白酶相比，适冷弹性蛋白酶在0～30℃海水中具有很高的弹性蛋白降解效率，常温下就可以发挥作用。而且40℃以上极不稳定，中温就可以使酶失活，从而确保了其安全性；它对多种革兰氏阳性菌具有裂解活性，除了可以应用于医疗，日化等方面以外，对海洋生物医药、水产品加工等方面也具有巨大的应用潜力。

Description

一种深海弹性蛋白酶基因及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种深海弹性蛋白酶基因及其制备方法与应用，属于生物技术技术领域。

背景技术

弹性蛋白酶(Elastase)是一种以水解不溶性弹性蛋白(elastin)为特征的蛋白水解酶，在多个蛋白酶类群，如丝氨酸蛋白酶，半胱氨酸蛋白酶和金属蛋白酶中均有存在。其中金属蛋白酶中的弹性蛋白酶分布最多，在M4，M9，M10和M23家族中均有弹性蛋白酶存在。目前，弹性蛋白酶主要作为治疗高脂血症、防治动脉粥样硬化症的生化药物，治疗确切，安全可靠。另外，弹性蛋白酶还可用于食品工业。许多动、植物蛋白质，特别是一些难以处理和食用的韧带、大动脉血管、筋腱等蛋白质废料都可被其降解，因此在农副产品深加工、高蛋白质食品的制作、罐头加工等方面将会得到广泛应用。在日用化学工业方面，弹性蛋白酶主要用于化妆品的生产。国外近年有报道将弹性蛋白酶加入化妆品，可增进、改善皮肤血液循环，并改善皮肤脂质代谢，增强皮肤、毛发的弹性、柔性，延缓皮肤老化，减少皱纹及色素沉着，还能促进头发生长，防止脱发等。

M23家族蛋白酶都含有一个锌离子，其活性位点位于HXXXD和HXH这两个与锌离子相互作用的基序中。此家族中的蛋白结构都是由两个相叠的半β桶组成，其活性部位位于其C端的较大的半β桶型结构。目前报道的M23家族的蛋白酶都对Gly-X肽键具有明显的活性。因弹性蛋白中含有33％的Gly，因此M23家族蛋白酶都对弹性蛋白具有降解作用。另外，由于革兰氏阳性菌细胞壁中含大量肽聚糖，且肽聚糖中的肽桥含有很多Gly，特别是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的肽桥中5个氨基酸都是Gly，因此M23家族蛋白酶对革兰氏阳性菌具有裂解作用。

目前M23家族已鉴定的蛋白酶只有9个，全部是由陆地细菌产生。这些酶在低温下活性较低，在中高温下酶较稳定不宜失活而影响了其安全性，这些缺点严重限制了M23家族蛋白酶的应用。来源于深海细菌的M23家族弹性蛋白酶由于经过对低温和高盐环境长期的适应和进化，具有在低温下活性高，在高温下宜失活的独特优点，另外深海蛋白酶由于环境独特也可能具有新的弹性蛋白降解机制。这些优点可能使海洋来源的弹性蛋白酶在医药、食品和化妆品等领域具有广阔的应用前景。但是，由于采样和培养等困难，目前海洋来源的弹性蛋白酶还很少研究，尚没有来源于深海的M23家族弹性蛋白酶的报道。

发明内容：

本发明针对现有技术的不足，提供一种深海弹性蛋白酶的基因(pseudoalterin)及其制备方法与应用。该弹性蛋白酶可用于对弹性蛋白进行酶解，也可用于治疗由葡萄球菌等细菌引起的炎症。该酶在低温下酶活高，中高温下极不稳定，中温就可以使其完全失活，从而保证了其安全性。本发明还提供该弹性蛋白酶的产生菌-适冷菌Pseudoalteromonas sp.CF6-2。

术语解释：

1.PCR技术：链式聚合酶反应，利用DNA聚合酶，模板，引物以及dNTP进行体外扩增特定DNA片段的技术。

2.Tail PCR技术：热不对称链式聚合酶反应，使用两种不同长度的引物，从而使两种引物的退火温度不同。长引物是以已知序列设计的三个嵌套引物，退火温度58-63℃，短引物是任意简并引物，可与DNA随机结合，退火温度47-48℃。PCR温度循环的每一个循环包括：两个高温退火反应，这时只有长引物退火并延伸；一次低温退火反应，这时两种引物同时退火并扩增。

3.CDD分析软件：NCBI网站上提供的一种用来推测和分析特定氨基酸序列形成的结构域信息的软件。

本发明技术方案如下：

一株适冷菌(Pseudoalteromonas sp.)CF6-2，该菌株2010年7月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，其菌种保藏编号为CCTCC NO：M2010189。

由上述适冷菌(Pseudoalteromonas sp.)CF6-2提取出的适冷弹性蛋白酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种含有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的表达载体。

一种含有上述表达载体的重组细胞。

由上述适冷弹性蛋白酶基因表达翻译的深海弹性蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明适冷菌(Pseudoalteromonas sp.)CF6-2是从南海沉积物中分离得到的。适冷弹性蛋白酶基因(pseudoalterin)是从适冷菌(Pseudoalteromonas sp.)CF6-2中提取的基因组DNA。首先分离纯化了适冷菌CF6-2所产的适冷弹性蛋白酶(pseudoalterin)，测定了该酶的N端序列。根据其N端序列和M23家族蛋白酶保守基因序列设计引物，利用PCR和Tail PCR技术从适冷菌CF6-2的基因组DNA中克隆了编码适冷弹性蛋白酶的基因。对该基因的核酸序列进行了测定。该基因DNA片段共1240bp，其中含有一个1212bp的开放阅读框架编码适冷弹性蛋白酶，起始密码子位于1bp，终止密码子位于1210bp，共编码403个氨基酸。因此，适冷弹性蛋白酶的前体是一个含有403个氨基酸的多肽，它包括信号肽、前导肽和催化结构域三部分。成熟弹性蛋白酶含有173个氨基酸，是金属蛋白酶M23家族中的一个尚未报道的具有新的序列的弹性蛋白酶。

上述深海弹性蛋白酶在制备低温高盐环境中防腐剂、消炎杀菌药品及日用化妆品中的应用。

本发明的有益效果如下：

(1)本发明所述的适冷弹性蛋白酶Pseudoalterin来源于深海低温高盐环境，与其它的弹性蛋白酶相比，适冷弹性蛋白酶在0～30℃海水中具有很高的弹性蛋白降解效率，常温下就可以发挥作用。而且40℃以上极不稳定，中温就可以使酶失活，从而确保了其安全性。

(2)本发明所述的适冷弹性蛋白酶Pseudoalterin对多种革兰氏阳性菌具有裂解活性，除了可以应用于医疗，日化等方面以外，对海洋生物医药、水产品加工等方面也具有巨大的应用潜力。

附图说明：

图1、提取的适冷菌CF6-2的基因组DNA的电泳图；

其中：1、适冷菌CF6-2的基因组DNA；2、DNA分子量marker。

图2、通过PCR和Tail PCR扩增克隆的编码适冷弹性蛋白酶的基因片段的电泳图；

A、普通PCR扩增结果；其中：1、DNA分子量marker；2、扩增的DNA片段(300bp)；

B、Tail PCR扩增结果；其中：1、DNA分子量marker；2、N端方向第三轮PCR产物(800bp)；3、C端方向第三轮PCR产物(250bp)；

C、适冷弹性蛋白酶全基因电泳结果；其中：1、DNA分子量marker；2、适冷弹性蛋白酶基因。

图3、纯化的适冷弹性蛋白酶电泳图；

其中：M、marker；1、纯化的适冷弹性蛋白酶；2、适冷菌CF6-2发酵液。

图4、利用液质联分析出的适冷弹性蛋白酶在弹性蛋白上的水解位点；

其中：黑色箭头为M23家族中其他蛋白酶和适冷弹性蛋白酶都可以水解的位点；红色箭头为新发现的只有适冷弹性蛋白酶可以水解的位点。

图5、温度对适冷弹性蛋白酶酶活的影响曲线图。

图6、pH值对适冷弹性蛋白酶酶活的影响曲线图。

图7、弹性蛋白酶的完整基因序列及其编码的氨基酸序列对应关系图；

其中：箭头为信号肽和前导肽切割位点；星号为活性位点；三角形为与锌离子作用位点。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

实施例中适冷菌(Pseudoalteromonas sp.)CF6-2，该菌株2010年7月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，其菌种保藏编号为CCTCC NO：M2010189。

实施例1：适冷弹性蛋白酶编码基因的克隆

1、适冷菌(Pseudoalteromonas sp.)CF6-2基因组DNA的提取。

提取方法按如下步骤并参照百泰克公司基因组提取试剂盒说明书进行：

(1)取1ml适冷菌(Pseudoalteromonas sp.)CF6-2，10000rpm离心30sec，弃上清，收集菌体；

(2)加入200μl缓冲液KB重悬洗涤细胞，10000rpm离心30sec，弃上清后将细胞震荡或者吹打重悬于200μl缓冲液KB中；

(3)加入200μl结合液CB，充分混匀，再加入20μl蛋白酶K(20mg/ml)溶液，充分混匀，70℃放置10min；

(4)冷却后加入100μl异丙醇，充分混匀，得混合溶液；

(5)将步骤(4)制得的混合溶液加入吸附柱AC中，10000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液；

(6)加入500μl抑制物去除液IR，12000rpm离心30sec，弃废液；

(7)加入700μl漂洗液WB，12000rpm离心30sec，弃掉废液；

(8)加500μl漂洗液WB，12000rpm离心30sec，弃掉废液；

(9)将吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm离心2min，除去漂洗液；

(10)取出吸附柱AC放入离心管中，在吸附膜的中间部位添加在65～70℃水浴中预热后的洗脱缓冲液EB100μl，室温放置3～5min，12000rpm离心1min；将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min；取离心得到的溶液即为适冷菌(Pseudoalteromonas sp.)CF6-2基因组DNA溶液；

(11)适冷菌(Pseudoalteromonas sp.)CF6-2基因组DNA溶液置于4℃冰箱保存待用。

2、引物的设计与合成

根据适冷弹性蛋白酶的成熟酶N端序列ATFTMNLP和M23家族保守区序列TGPHLHFSL，设计两条兼并引物M1：GCNACNTTYACNATGAAYYTNCC(SEQ ID NO.3)，M2：NSWRAARTGNARRTGNGGNCCNGT(SEQ ID NO.4)，上述引物均由上海生工生物技术公司合成。

3、利用PCR进行适冷弹性蛋白酶编码基因部分序列扩增

(1)以M1和M2为引物，以基因组DNA为模板，进行PCR扩增；PCR反应条件为：95℃，5分钟；然后95℃，1分钟；55℃，1分钟；72℃，2分钟，30个循环后；72℃，延伸10分钟；

(2)对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果获得一条约300bp的DNA片段，然后用Omega公司的DNA回收试剂盒按照其使用说明书回收扩增DNA片段。

(3)DNA片段与克隆载体连接

将回收得到的扩增DNA片段连接到Promega公司的pGEMT载体上，步骤可参考pGEMT载体使用说明书。连接反应体系：

连接酶Buffer         1μl

载体pGEMT            1μl

外源DNA片段          3μl

T4连接酶             1μl

补加ddH₂O            至10μl

混匀样品，在离心机上离心2sec，把样品集中在管底，16℃水浴中连接过夜。

(4)按《分子克隆实验指南》(科学出版社，ISBN：7030103386，出版日期：2005-3-1)制备大肠杆菌感受态的方法制备大肠杆菌DH5α感受态。

(5)按《分子克隆实验指南》上的热激转化方法将连接好的重组pGEMT载体转至大肠杆菌DH5α感受态。

(6)转化的大肠杆菌DH5α涂于含50μg/L氨苄青霉素的麦康凯培养基(购自挚诚生物技术公司)，37℃过夜培养，挑选白色转化子作为模板，用M1和M2作为引物，通过菌落PCR验证白色转化子中质粒是否含有PCR扩增的DNA片段。

(7)将质粒含有PCR扩增的DNA片段的转化子送上海生工生物技术有限公司测序，获得一段303bp的序列。

4.Tail PCR继续进行适冷弹性蛋白酶编码基因全序列扩增

根据3中获得的303bp序列设计三轮嵌套引物：

N-1：CACCAGAACCATTGTTAAAGTC(SEQ ID NO.5)，

N-2：AAGTCTAATGAAGAATAAGGATAAC(SEQ ID NO.6)，

N-3：GGATAACCTGAGCCAGTGTTTGAA(SEQ ID NO.7)；

C-1：ACTTACAATACAATAATGGTGACACTG(SEQ ID NO.8)，

C-2：GCCAGGAACGTTGCTAGGTC(SEQ ID NO.9)，

C-3：AGGTCGTTATGCGAATAGTTA(SEQ ID NO.10)。

再设计两条随机兼并引物N：AAKYRTATG；C：GCAGCGTTA。

对于已得片段N端方向的未知序列，先以N-1和N为引物，以基因组为模板，进行第一轮PCR，条件为：94℃，30秒钟；53℃，1分钟；72℃，2分钟；5个循环。然后94℃，30秒钟；28℃，3分钟；72℃，2分钟；94℃，20秒钟；40℃，1分钟；72℃，2分钟；10个循环。然后94℃，20秒钟；53℃，1分钟；72℃，2分钟；94℃，20秒钟；53℃，1分钟；72℃，2分钟；94℃，30秒钟；40℃，1分钟；72℃，2分钟；12个循环。然后72℃延伸10分钟。

再将所得PCR产物作为模板以N-2和N为引物进行第二轮PCR，条件为：94℃，20秒钟；55℃，1分钟；72℃，2分钟；94℃，20秒钟；55℃，1分钟；72℃，2分钟；94℃，20秒钟；40℃，1.5分钟；72℃，2分钟，16个循环。然后72℃，延伸10分钟。

再以第二轮PCR产物为模板，以N-3和N为模板进行第三轮PCR，条件为：94℃，30秒钟；55℃，1分钟；72℃，2分钟，25个循环。然后72℃，延伸10分钟。

对第三轮PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，获得一条800bp左右的DNA片段。对已知序列C端方向的未知序列用相同方法进行PCR扩增。结果出现一条250bp左右的DNA片段。

然后用本实施例3中相同方法对这两个DNA片段进行测序。根据这两条片段的序列，将它们和3中获得DNA片段拼接成一条DNA片段。对拼接DNA片段的序列通过NCBI网站的blastX软件分析发现其中含有一个1212bp的编码弹性蛋白酶Pseudoalterin的开放阅读框架。起始密码子位于1bp，终止密码子位于1210bp，共编码403个氨基酸。弹性蛋白酶的完整基因序列及其编码的氨基酸序列如图7所示。

实施例2：适冷菌CF6-2分泌的适冷弹性蛋白酶的纯化

适冷菌CF6-2接种于发酵培养基(人工海水(按照青岛海之盐水族科技有限公司的海水素配制方法配制)中含0.2wt％酵母粉，0.3wt％弹性蛋白(购自sigma公司)，0.5mMCaCl₂和0.5mM Na₂HPO₄，pH 8.0)，在15℃培养48h。发酵液在5℃10000g离心10min。上清液用50mM Tris-HCl缓冲液(pH 9.5)透析过夜后于5℃10000g离心15min。上清液以2.5min/ml速度穿过DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱后用0～0.3M NaCl进行梯度洗脱。洗脱下的蛋白酶用12.5％SDS-PAGE检测纯度(结果如图3所示)。

实施例3：适冷弹性蛋白酶的性质测定

1、适冷弹性蛋白酶对不同种类细菌的裂解能力

将测试菌体10000rpm离心1min后弃去上清液，用50mM Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)清洗菌体。清洗完的菌体再用50mM Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)重悬煮沸20min。煮后样品用相同的缓冲液稀释到在595nm处吸光值为0.8，取180μl菌液加入浓度为10μg/ml适冷弹性蛋白酶酶液20μl，混匀后25℃保温半小时后测定其595nm处吸光值变化，对照样品用Tris-HCl缓冲液代替酶液。吸光值降低率作为相对裂菌活性(结果如表1所示)。

表1

2、用液质联分析适冷弹性蛋白酶在弹性蛋白上的酶切位点

称取10mg弹性蛋白加入1ml含5微克适冷弹性蛋白酶的50mM Tris-HCl(pH 9.0)缓冲液中，混匀后在25℃下震荡保温2h。酶解样品经10000rpm离心5min后取上清2μl进行液质联用技术分析(可参见Agilent Ion Trap 6340技术操作说明)。结果表明适冷弹性蛋白酶可以从多个位点降解弹性蛋白(结果如图4所示)。

3、最适酶活温度

分别在0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50℃条件下测定弹性蛋白酶的酶活，以确定酶的最适反应温度。测定酶活的具体方法为：

称取5mg的弹性蛋白衍生物(购自sigma公司)加入250μL浓度为10μg/ml的适冷弹性蛋白酶酶液，不同温度下反应60分钟，10000rpm离心10min终止反应。取上清于595nm处测定吸光值。结果表明该酶的最适酶活温度25℃(结果如图5所示)。

4、最适pH

分别在pH 6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0条件下测定适冷弹性蛋白酶的酶活，以确定该酶的最适pH。缓冲体系(50mmol/L)：pH 6.5-8.0，Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液；pH 7.5-9.5，巴比妥钠-HCl缓冲液；pH 9.5-11.0，NaHCO₃-NaOH缓冲液。

具体方法是用上述缓冲液配制不同pH的缓冲液，然后按照本实施例3中的方法在25℃下测定适冷弹性蛋白酶在不同pH条件下的酶活。结果表明该酶的最适pH为9.5(结果如图6所示)。

Claims (3)

1.一株适冷菌Pseudoalteromonas sp.CF6-2，该菌株2010年7月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，其菌种保藏编号为CCTCC NO：M2010189。

2.一种由权利要求1所述适冷菌Pseudoalteromonas sp.CF6-2提取出的适冷弹性蛋白酶，通过如下方法制得：

适冷菌CF6-2接种于发酵培养基，在15℃培养48h，发酵液在5℃10000g离心10min，上清液用50mM、pH 9.5的Tris-HCl缓冲液透析过夜后于5℃10000g离心15min，上清液以2.5min/ml速度穿过DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱后用0～0.3M NaCl进行梯度洗脱；

所述发酵培养基为人工海水中含0.2wt％酵母粉、0.3wt％购自sigma公司的弹性蛋白、0.5mM CaCl₂和0.5mM Na₂HPO₄，pH 8.0；人工海水按照青岛海之盐水族科技有限公司的海水素配制方法配制。

3.权利要求2所述深海弹性蛋白酶在制备低温高盐环境中防腐剂、消炎杀菌药品及日用化妆品中的应用。

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