CN101912046A - 猪源植物乳杆菌微胶囊及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明“猪源植物乳杆菌微胶囊及其应用”，属于畜牧业微生物制剂。猪源植物乳杆菌微胶囊，其制备方法如下：(1)将猪源植物乳杆菌的菌泥与保护剂均匀混合制成菌悬液，然后与海藻酸钠溶液混合均匀得到微胶囊基质；(2)制备微胶囊前体；(3)将步骤(2)制得的微胶囊前体置于2～5％(W/W)的氯化钙溶液中固定；(4)步骤(3)固定得到的微胶囊颗粒真空冻干24h得到微胶囊产品。该微胶囊制剂具有良好的耐酸、耐胆盐及耐贮存能力，微胶囊制剂中的活菌数≥2.0×1010cfu/g，将本发明的微胶囊制剂添加到保育猪饲料中，结果证明该制剂能够提高保育猪抗氧化能力和免疫力，具有提高保育猪日增重和饲料转化率、降低腹泻率的作用。
Description
技术领域
本发明涉及畜牧业微生物制剂，特别涉及一种猪源植物乳杆菌微胶囊及其应用。
背景技术
近年来，随着人们对抗生素诸多弊端的逐步认识，以及世界各国相继禁止抗生素在饲料中的使用，益生菌制剂作为一种新型的绿色饲料添加剂正在越来越多地受到人们的重视，也有着良好的发展前景，其中，尤以乳酸菌应用最多、最为广泛。众所周知，乳酸菌是人和动物肠道内的正常菌群，与动物的健康息息相关。目前已有大量研究认为乳酸菌制剂具有良好的生物学功能，并被证实在临床上能够治疗和预防动物的某些肠道疾病或者起保健作用，也已在饲料业中被广泛应用。
然而，乳酸菌制剂的传统生产方法是将保存菌种活化后进行液体发酵扩大培养，而后应用于生产中。此方法制备的乳酸菌产品稳定性稍差、有效活菌含量稍低。这是由于：一方面，乳酸菌在生长过程中，不能形成芽孢，抗性较差，加之在其生命活动过程中还会产生一些危及自身正常生长繁殖的乳酸和乙酸等代谢产物，故在液体条件下难以长期保存；另一方面，乳酸菌在进入动物消化道后，低pH的胃液以及肠液中的胆盐对它也会造成损伤，使其难以有足够的活菌数量到达并定居于肠道来更好地发挥益生作用。
微胶囊包被技术是保护其菌体活力的一种有效方法，该技术采用安全特殊的壁材，将核心菌体物质包覆，起到保护菌体的作用。相对于传统的乳酸菌制备方法，乳酸菌微胶囊包被技术的主要优点有：(1)可增加菌体对不良环境(胃液、胆盐等)的抵抗力，有利于其顺利到达肠道以发挥益生作用；(2)采用安全的胃不溶、肠溶性壁材，使菌体不会受胃液的破坏，菌体到达肠道后释放出来，真正起到保健和治疗的作用；(3)利于储存、加工和运输，可延长贮存期，提高稳定性。
目前，乳酸菌微胶囊包被的方法有多种，所适用的壁材也各不相同，并且大多都是应用在酸奶、乳酪等人类食品的生产中。而作为动物饲用的乳酸菌微胶囊产品还很少，这主要是由于其生产过程所要求的技术较复杂、生产设备要求较严格，这些因素限制了它的发展。因此，根据畜牧生产的需要，通过严格的科学试验，找到一种高效、实用的饲用乳酸菌微胶囊制备方法，是目前亟待解决的科技问题，有着广阔的应用前景。
发明内容
本发明根据上述领域的空白和需求，提供一种猪源植物乳杆菌微胶囊，该微胶囊能够提高保育猪抗氧化能力和免疫力，具有提高保育猪日增重、降低料肉比、降低腹泻率的作用。
猪源植物乳杆菌微胶囊，其制备步骤如下：
(1)将猪源植物乳杆菌的菌泥与保护剂均匀混合制成菌悬液，然后与海藻酸钠溶液混合均匀得到微胶囊基质；
(2)制备微胶囊前体；
(3)将步骤(2)制得的微胶囊前体置于2～5％(W/W)的氯化钙溶液中固定；
(4)步骤(3)固定得到的微胶囊颗粒真空冻干24h得到微胶囊产品。
在微胶囊基质中海藻酸钠的终浓度为1.5％(W/W)。
所述氯化钙溶液的浓度为2％(W/W)。
所述保护剂的材料及其重量百分比为：蔗糖3～10％、乳糖2～5％、脱脂乳2～5％、葡萄糖0～2％、甘油0～2％、糊精0～10％、滑石粉0～10％，其余为水。
所述保护剂的材料及其重量百分比为蔗糖3％、乳糖5％、脱脂乳5％、糊精5％、滑石粉10％，其余为水。
所述微胶囊产品中活菌数浓度达到2.5×1010cfu/g。
所述制粒采用油相分离法或挤压法。
所述制粒采用挤压法。
上述猪源植物乳杆菌微胶囊在饲养家畜中的应用。
所述家畜指猪。
本发明提供的猪源植物乳杆菌微胶囊，在主要制备步骤上与现有微胶囊机制步骤没有明显差别，主要包括先与保护剂混合，然后与囊壁材料混合得到微胶囊基质，微胶囊基质转入到制粒设备中制粒，最后将得到的微粒进行固定等步骤。其特点在于，本发明制备的微胶囊主要用于家畜，制备的微胶囊适合家畜的肠胃特点及生长特性。本发明从微胶囊的相对硬度、韧性、菌存活时间以及对菌体的释放性能方面评价，通过对菌泥与保护剂的比例的筛选，囊壁材料的比例筛选以及固定剂浓度的筛选获得了专适于制备猪源植物乳杆菌的微胶囊制剂。如：囊壁材料选择1.5～2.5％的海藻酸钠，1.5～2％海藻酸钠形成的微胶囊颗粒硬度合适，弹性好，不易破裂，低于其浓度(如1％)所形成的微胶囊较软，容易破裂，而高于其浓度(如2.5％)所形成的微胶囊颗粒硬，弹性好，但成粒慢，不利于微胶囊的制作(见表2)。固定剂采用2～5％(W/W)的氯化钙溶液，氯化钙2％时，植物乳杆菌微胶囊释放性最佳，释放率为59.8％，其中活菌数没有显著区别(见表3)。菌泥与保护剂混合均匀，制成菌悬液，本领域技术人员可以根据应用需要调整菌泥与保护剂的比例以便于获得所需的活菌浓度。
本发明的实施方式中公开了囊壁材料海藻酸钠的最佳比例、固定剂的最佳浓度、保护剂的最适成分以及最优选的制粒方法，各个因素产生的积极技术效果见具体实施中。
本发明的具体实施方式还记录了本发明的猪源植物乳杆菌微胶囊在饲喂家畜中的应用及其所能够产生的积极效果，说明本发明的猪源植物乳杆菌微胶囊可作为一种优良的饲料添加剂。
附图说明
图1植物乳杆菌两种剂型在人工胃液中存活率比较
图2植物乳杆菌两种剂型在猪胆盐中存活率比较
图3室温下贮存对微胶囊化乳酸菌活菌数的影响
图4植物乳杆菌微胶囊制剂对保育猪抗氧化能力的影响
图5植物乳杆菌微胶囊制剂对保育猪免疫力的影响
具体实施方法
实施例1植物乳杆菌微胶囊制剂的制备
1.1材料
植物乳杆菌，由北京市农林科学院畜牧兽医研究所动物营养与繁育研究室保存，从60日龄断奶仔猪盲肠黏膜分离得到，由中国工业微生物菌种保藏管理中心鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。
海藻酸钠作为微胶囊囊壁材料，氯化钙作为微胶囊固定材料，蔗糖、脱脂乳、糊精、滑石粉等作为保护剂，研究室自制微胶囊生成器进行制粒。
1.2方法
微胶囊的制备方法：菌种活化后进行发酵扩大培养，而后经6000rpm离心10min，将菌泥与保护剂充分混合均匀，制成菌悬液再与海藻酸钠溶液混合后得到微胶囊基质，菌泥与保护剂按比例混合使获得的微胶囊基质中活菌浓度达到109cfu/mL，海藻酸钠占微胶囊基质的比例见表2，制备微胶囊前体，获得的微胶囊前体在氯化钙溶液(浓度见表3)中固定，过滤，真空冷冻干燥24h获得微胶囊产品，微胶囊产品中活菌浓度达到1010cfu/g。
1.2.1植物乳杆菌微胶囊最佳方法的确定
将菌株活化后，接种于MRS液体培养基中37℃下培养20h，6000rpm离心10min取菌泥，将菌泥重新悬浮在保护剂中，使最终活菌浓度达到109cfu/mL，制成细菌悬浮液，备用。分别采用油相分离法、水相分离法和挤压法制备微胶囊，观察微胶囊形状、粒径、包埋产率、包埋效率，根据结果确定最佳制备方法。
油相分离法具体步骤为：将细菌悬浮液与海藻酸钠溶液混合均匀后，加入0.5％大豆色拉油中，用磁力搅拌器搅拌形成无明显水相的W/O均匀浑浊乳状液，然后快速加入2％氯化钙水溶液，直至W/O乳状液被破坏，形成海藻酸钙胶粒。胶粒通过低速离心收集，洗涤三次，得到微胶囊产品。
水相分离法具体步骤：将5％的明胶溶液和5％***胶溶液等体积混合，在可加热磁力搅拌器上搅拌，加入细菌悬浮液，再加入2倍体积的30～40℃的温水，用10％的醋酸水溶液将混合液pH调至4.0左右，继续搅拌5min后停止加热。按原胶液的1％缓慢加入***，搅拌0.5h，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.0～7.5，再搅拌2h，最后离心取沉淀物即为微胶囊产品。
挤压法具体步骤：将细菌悬浮液与海藻酸钠溶液混合均匀后，用注射器挤入2％氯化钙溶液中，固化20min，过滤取得微胶囊产品。
由结果可知，挤压法得到的微胶囊颗粒较好，因此，确定挤压法为最佳微胶囊制备方法。
表1几种乳酸菌微胶囊制备方法的比较
1.2.2不同浓度海藻酸钠对植物乳杆菌微胶囊硬度的影响
分别采用1％、1.5％、2％、2.5％浓度的海藻酸钠制备微胶囊颗粒，将所得颗粒低于2％氯化钙内固化20min，用小勺挤压微胶囊判断微胶囊硬度。由表2可知，1.5％和2％海藻酸钠形成的微胶囊颗粒均相对较硬，弹性好，不易破裂，低于其浓度(如1％)所形成的微胶囊较软，容易破裂，而高于其浓度(如2.5％)所形成的微胶囊颗粒硬，弹性好，但成粒慢，不利于微胶囊的制作，另外，从成本出发，选择1.5％为最佳海藻酸钠浓度。
表2不同浓度海藻酸钠对微胶囊硬度的影响
1.2.3不同氯化钙浓度对植物乳杆菌微胶囊释放性的影响
分别采用2％、3％、4％、5％浓度的氯化钙，固定20min后，进行真空冷冻干燥。冻干后准确称取1g微胶囊，溶于人工肠液中，37℃保温2h后测定活菌数，对照组将微胶囊粉碎后测定活菌数，计算微胶囊释放性，确定最佳氯化钙浓度。结果发现，氯化钙2％时，植物乳杆菌微胶囊释放性最佳，释放率为59.8％。
表3不同浓度氯化钙对微胶囊释放性的影响
1.2.4不同保护剂浓度对植物乳杆菌微胶囊成粒性、制备速率及产品性状的影响
将菌株活化后，离心取菌泥，加入不同的保护剂，测定活菌数，并观察微胶囊成粒性、制备速率及冻干后性状。由结果可知，1、2、4组不添加糊精或添加5％糊精后，植物乳杆菌微胶囊颗粒均较空，不利用保存，而3组添加10％糊精后，虽然微胶囊颗粒较实，但微胶囊化速度慢，不利用批量生产，5、6组在前几组基础上添加了不同比例的滑石粉，结果较好，从提高产量考虑，选择6组为最佳保护剂。
表4不同保护剂对微胶囊工艺和特性的影响
1.2.5植物乳杆菌微胶囊制剂中活菌数测定
将挤压的微胶囊颗粒真空冷冻干燥后，取1g产品置于人工肠液中，待其完全释放后，测定活菌数。测得活菌数为2.5×1010cfu/g。
1.2.6植物乳杆菌微胶囊制剂的抗逆性试验
1.2.6.1植物乳杆菌微胶囊制剂的耐酸性试验
取1g微胶囊，置于pH＝2.0的人工胃液中37℃保温0、1、2、3h，计算存活率；同时，将活化菌株按5％接种量接种于人工胃液中处理相同时间，测定液体制剂存活率，比较植物乳杆菌两种剂型在人工胃液中的存活情况，见图1。由表5可知，与未经微胶囊包被的植物乳杆菌相比，微胶囊包被后能够提高该菌在pH＝2.0的人工胃液中的存活率，在人工胃液中放置3h，其存活率仍可达62.37％。
表5植物乳杆菌两种剂型在人工胃液中存活率比较
1.2.6.2植物乳杆菌微胶囊制剂的耐胆盐试验
准确称取1g微胶囊，置于含有0.3％猪胆盐的液体MRS培养基中，37℃保温0、1、3、6h，计算存活率。同时，将活化菌株按5％接种量接种于含有0.3％猪胆盐的液体MRS培养基中处理相同时间，测定液体制剂存活率，比较植物乳杆菌两种剂型在猪胆盐中的存活情况，如图2。由表6可知，经过微胶囊包被能够提高植物乳杆菌在猪胆盐中的存活率，在0.3％浓度的猪胆盐放置6h，仍有84.36％的存活率。
表6植物乳杆菌两种剂型在猪胆盐中存活率比较
1.2.6.3植物乳杆菌微胶囊稳定性试验
将植物乳杆菌微胶囊产品置于自封袋中常温保存，分别在0、7、15、23、30、45、60d取适量测定活菌数，计算存活率。由图3可知，植物乳杆菌经过微胶囊包被后，常温状态贮存60d，活菌数仍可达1.88×1010cfu/g。
表7室温下贮存对微胶囊化乳酸菌活菌数的影响
实施例2植物乳杆菌微胶囊制剂对保育猪生产性能、抗氧化能力以及免疫力的影响
2.1试验动物与分组
选取健康的35日龄断奶的保育猪64头(杜×长×大三元杂交猪)，根据“日龄相近、体重相当”的原则，随机分成两组，分别为对照组和试验组，每组设两个重复，每个重复16头断奶仔猪。对照组饲喂基础日粮+抗生素(每100kg全价料添加粘杆菌素0.98g、杆菌肽锌4g、洛克沙胂5g)；试验组饲喂基础日粮+0.1％植物乳杆菌微胶囊。预饲期5d，正式试验期为30d。试验在封闭式猪舍内进行，水泥地面，网床圈养，自由采食，以鸭嘴式饮水器提供充足清洁饮水。免疫、驱虫和消毒按猪场规程进行。
2.2试验饲粮设计
供饲日粮参照我国《猪饲养标准》配制，日粮配方及营养水平见表8。
表8基础日粮配方和营养水平
注：每千克日粮提供：维生素A13500IU；维生素D32850IU；维生素E64mg；维生素K32.4mg；维生素B12.4mg；维生素B26.6mg；维生素B63mg；维生素B120.045mg；烟酰胺25.5mg；泛酸13.5mg；生物素0.12mg；铜12mg；铁150mg；锌155mg；锰55mg；碘.5mg；硒0.3mg。
2.3方法
试验开始和结束时，早饲前个体空腹称重，计算平均日增重、采食量和料肉比；每日清晨观察和记录保育猪腹泻情况；试验结束后，从每个组随机挑选8头保育猪，前腔静脉采血5mL，获取血清测定丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶SOD、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、白介素-2(IL-2)和结合珠蛋白(Hp)。数据统计采用SAS9.0统计软件进行单因素方差分析，结果以平均值±标准差表示。
2.4结果与分析
2.4.1植物乳杆菌微胶囊制剂对保育猪生产性能的影响
由表9可知，饲喂植物乳杆菌微胶囊制剂后保育猪平均日增重达578.74g/d，比对照组提高了12.04％，饲料转化率1.87∶1，比对照组提高了13.02％。由此可见，植物乳杆菌微胶囊制剂能够促进保育猪生长，提高其饲料利用率。
表9植物乳杆菌微胶囊对保育猪生产性能的影响
注：同肩标注不同代表差异显著，大写字母不同表示差异极显著(P＜0.01)，小写字母不同表示差异显著(P＜0.05)。
2.4.2植物乳杆菌微胶囊制剂对保育猪腹泻情况的影响
整个试验期间，对照组和对照组全期腹泻头次、腹泻频率见表10。腹泻频率＝腹泻头数/(供试猪头数×试验天数)。
由表10可知，在整个试验期间，对照组腹泻猪达59头次，由腹泻造成的死亡数为3头，而试验组添加植物乳杆菌微胶囊后，腹泻猪为24头次，腹泻频率比对照组降低了7.29％。由此可见，饲喂植物乳杆菌微胶囊制剂能够降低保育猪腹泻率和死亡率。这主要是由于植物乳杆菌到达动物肠道后能够增加有益菌的数量，减少有害菌的生长和繁殖，起到调节肠道微生态平衡的作用，从而减少猪体腹泻。
表10植物乳杆菌微胶囊对保育猪腹泻情况的影响
2.4.3植物乳杆菌微胶囊制剂对保育猪抗氧化能力的影响
丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)均为机体重要的抗氧化指标，其中，降低MDA含量可减轻机体组织细胞的脂质过氧化程度，而提高SOD和GSH-PX的活性则可以增强机体清除氧自由基的能力，从而起到保护机体细胞结构和功能完整性的作用，以提高机体的抗氧化能力。本试验中，试验组保育猪血清中MDA含量比对照组降低了34.1％，而SOD和GSH-PX含量则分别比对照组提高了4％和13.8％。因此证明了植物乳杆菌微胶囊制剂具有提高猪体抗氧化能力的作用，见图4。
表11植物乳杆菌微胶囊制剂对保育猪抗氧化能力的影响
注：1.同肩标注不同代表差异显著，大写字母不同表示差异极显著(P＜0.01)，小写字母不同表示差异显著(P＜0.05)。
2.酶活力：规定每0.1ml血清在37℃反应5分钟，扣除非酶促反应作用，使反应体系中GSH浓度降低1μmol/L为一个酶活力单位。
2.4.4植物乳杆菌微胶囊制剂对保育猪免疫力的影响
植物乳杆菌微胶囊制剂对保育猪血清中白介素2(IL-2)结合珠蛋白(Hp)的影响见表12、。由结果可知，试验组保育猪血清中IL-2含量比对照组提高了1.6倍，而Hp含量比对照组降低了19.3％，见图5。
IL-2和Hp是机体非特异性免疫的两个重要指标。其中，IL-2是体内重要的免疫增强因子，可诱导多种杀伤细胞和B细胞的分化以及效应功能，并能诱导杀伤细胞产生多种细胞因子。Hp是一种存在于血清中的急性期蛋白，其含量会随着机体感染、炎症和损伤而增加。本试验结果发现，日粮中添加植物乳杆菌微胶囊制剂能够增加保育猪血清中IL-2含量，降低Hp含量，因此，从本试验结果可知，该胶囊制剂对于增强保育猪机体的非特异性免疫力具有积极的作用。
表12植物乳杆菌微胶囊制剂对保育猪抗氧化能力的影响
Claims (10)
1.猪源植物乳杆菌微胶囊，其制备步骤如下：
(1)将猪源植物乳杆菌的菌泥与保护剂均匀混合制成菌悬液，然后与海藻酸钠溶液混合均匀得到微胶囊基质；
(2)制备微胶囊前体；
(3)将步骤(2)制得的微胶囊前体置于2～5％(W/W)的氯化钙溶液中固定；
(4).步骤(3)固定得到的微胶囊颗粒真空冻干24h得到微胶囊产品。
2.根据权利要求1所述的猪源植物乳杆菌微胶囊，在微胶囊基质中海藻酸钠的终浓度为1.5％(W/W)。
3.根据权利要求1所述的猪源植物乳杆菌微胶囊，所述氯化钙溶液的浓度为2％(W/W)。
4.根据权利要求1所述的猪源植物乳杆菌微胶囊，所述保护剂的材料及其重量百分比为：蔗糖3～10％、乳糖2～5％、脱脂乳2～5％、葡萄糖0～2％、甘油0～2％、糊精0～10％、滑石粉0～10％，其余为水。
5.根据权利要求4所述的猪源植物乳杆菌微胶囊，所述保护剂的材料及其重量百分比为：蔗糖3％、乳糖5％、脱脂乳5％、糊精5％、滑石粉10％，其余为水。
6.根据权利要求1所述的猪源植物乳杆菌微胶囊，所述微胶囊产品中活菌数浓度达到2.5×1010cfu/g。
7.根据权利要求1所述的猪源植物乳杆菌微胶囊，所述制粒采用油相分离法或挤压法。
8.根据权利要求7所述的猪源植物乳杆菌微胶囊，所述制粒采用挤压法。
9.根据权利要求1所述的猪源植物乳杆菌微胶囊，上述猪源植物乳杆菌微胶囊在饲养家畜中的应用。
10.根据权利要求9所述的猪源植物乳杆菌微胶囊，所述家畜指猪。
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