CN101907601A

CN101907601A - 重度妊娠期高血压生化标记物的质谱试剂盒及制备方法

Info

Publication number: CN101907601A
Application number: CN2009101469400A
Authority: CN
Inventors: 边旭明; 刘俊涛; 许洋
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2009-06-08
Filing date: 2009-06-08
Publication date: 2010-12-08

Abstract

本发明涉及重度妊娠期高血压生化标记物的质谱试剂盒及制备方法，属于蛋白质检测技术领域。由磁珠、粘合液、清洗液、洗提液、稳定剂等组成，从复杂生物样品中富集和纯化多肽和蛋白。试剂盒包括一小管粘合液；一小管磁珠；一小管清洗液；一小管洗提液；一小管能量吸收分子饱和溶液的稳定剂，上述各小管置于4℃冷藏盒中。本发明可用于体外样品检测和预后判断的质谱试剂盒。所述试剂盒对重度妊娠期高血压判断的几个特征蛋白峰为2771、3218、3887、4192、4210、5101和5689Da。本方法准确、方便且快捷。

Description

重度妊娠期高血压生化标记物的质谱试剂盒及制备方法

技术领域

本发明属于蛋白质检测技术领域，特别涉及基于质谱技术的用于对重度妊娠高血压生物样品中生化标记物分析的试剂盒制备方法，从复杂生物样品中富集和纯化重度妊娠高血压中的新型生化标记物。

背景技术

不论是细胞的正常功能还是病理特性都在一定程度上取决于细胞所表达的蛋白质功能。因此，鉴定人体内表达的蛋白质的区别，可用于体外疾病样本诊断及筛查，并最终用于药物开发和疾病治疗。而要进行蛋白质表达和功能的差异化分析，要求能够达到分辨细胞内分子的复杂混合物的程度。但细胞内许多物质往往以微量存在，目前用于分析蛋白的方法在上述各方面都有局限，用这些常规手段难以进行鉴定分析。用质谱联合可克服这一技术缺点。

妊娠高血压疾病妊娠是特有的，表现为妊娠20周后出现血压升高、尿蛋白及全身各脏器功能紊乱的疾病综合征。重度子痫前期的发病率：3-5％，是引起围产期母儿不良妊娠结局的主要疾病之一。近年来的新研究方法包括：蛋白组学、基因组学、脂质组学、mRNA微阵列技术等，从分子学水平，深入研究妊娠高血压疾病的发病机制，有望找到妊娠高血压疾病特异生化指标，成为早期诊断、监测病情及判断疾病预后的依据。蛋白质组学是研究基因组在不同时间和空间编码的全部蛋白质的组成及作用规律，在组织细胞的整体蛋白质水平上揭示生命活动的基本规律，获得对细胞生理、病理过程及调控网络的全面而深入的认识。应用的技术平台主要有二维凝胶电泳分离技术和质谱分析技术。前者主要用于分子量10-100kD蛋白质分离，对于疏水性、低丰度、低含量的蛋白质难以检出。而质谱仪可实现10kD以下小分子、低含量，尤其是组织细胞内的微量调控蛋白质的分离鉴定。蛋白质指纹图谱技术是一种新的蛋白质分离、鉴定方法。其原理是：利用激光脉冲辐射使蛋白质芯片池中的分析物解吸形成荷电离子，不同质荷比的离子在仪器场中飞行的时间长短不一，经软件处理后，精确的绘制出蛋白质谱图。其优点是：可直接从原始样品中进行捕获、检测与分析，灵敏度高，检测范围广(500～500000)，所需样品体积小(0.5～400μL)；检测简便，整个测定过程一般为30min，且敏感性和特异性高；同时不会破坏所测定的蛋白质；结果可靠，可重复性高。该技术不仅可筛选出与疾病相关的特异生物标志物，还可发现与疾病相关的不同方式组合的蛋白质指纹图谱，为疾病的临床早期诊断、药靶的发现、疗效判断和预后提供了依据。

目前在进行蛋白质质谱分析时还没有发现一个用于重度妊娠高血压生化标记物检测的标准化质谱试剂盒。

发明内容

本发明的目的是克服已有技术的不足之处，提出一种用于检测临床重度妊娠高血压生化标记物的质谱试剂盒及制备方法，该试剂盒为重度妊娠高血压的早期检测提供了新的途径，并为进一步发现新的重度妊娠高血压生物标志提供了基础。

本发明提出的用于检测重度妊娠高血压生物标志的质谱试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：

一小管粘合液，10～30μl；

一小管质谱标准化质控血清(浆)，10～30μl；

一小管MB-WCX磁珠或金属亲和表面(MB-IMAC Fe)磁珠30～50μl；

一小管清洗液300～500μl，该清洗液为50～100mM PBS或NaAc，pH值为4.0～5.0；

[清洗液pH值为3.0～6.0时，蛋白指纹检测发现，pH值为4.0～5.0清洗液时蛋白指纹检测最好(蛋白峰最多)]。

一小管洗提液10～50μl，该洗提液为1～5％三氟乙酸的水溶液；

一小管稳定剂5～10μl，该稳定剂由能量吸收分子溶解在含30～60％乙腈和0.5～1％三氟乙酸的水溶液中构成，该能量吸收分子可采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二羟基苯甲酸之中的任一种；上述各小管置于4℃冷藏盒中。

本发明提出的上述质谱试剂盒制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

1)含粘合液的质谱标准化质控血清(浆)的制备：将男性、女性等量的O型血清(浆)稀释在粘合液中制成质谱的标准化质控血清(浆)，加10％牛胰岛素(bovine insulin，5733Da)，并将该稀释的血清(浆)分装成10～30μl小管中；其中，血清(浆)∶粘合液＝1∶2，所述粘合液为9M Urea，2％CHAPS，50mM Tris-HCL，pH 7.0～9.0；

2)将购买的50～100mM PBS(Phosphate-Buffered Saline)或NaAc，pH值为4.0～5.0清洗液、1～5％三氟乙酸的洗提液分别分装成300～500μl小管和10～50μl小管；

3)将能量吸收分子溶解30～60％乙腈和0.5～1％三氟乙酸的水溶液中制成稳定剂，并分装成5～10μl小管，该能量吸收分子可采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二羟基苯甲酸之中的任一种；

4)将上述分装好的各小管置于4℃冷藏箱中。

本发明还提出所述的试剂盒对重度妊娠高血压生物标志的预后判断的应用。

所述试剂盒依据几个特征蛋白峰为2771、3218、3887、4192、4210、5101和5689Da(图1)，双盲测试重度妊娠高血压生物标志样品的敏感性100％，特异性为100％。

质谱试剂盒检测重度妊娠高血压生物标志的应用实验步骤包括：

1.将生物样品先用粘合液稀释30～50倍，将样品充分混匀；

2.将上述标本100μl加至已装好磁珠的PCR管中，置磁性处理器上，15～25℃孵育20～40分钟，除去液体；

3.加100μl清洗液至已装好磁珠的PCR管，置磁性处理器上孵育1～5分钟，除去液体，重复上述操作两次；

4.加10μl洗提液1～5分钟，洗脱标本至上清液；

5.取5μl上清液移至另一个PCR管中，加入5μl能量吸收分子饱和稳定剂充分混匀；

6.取1μl混合溶液加样至质谱专用金属片(有3x3mm圆孔)上，自然干燥金属片；

7.将上述金属片加入质谱仪中，就会生成质谱；

8.外部使用多肽分子质量标准来校正质量精确性，所有样本均进行双份检测以减少实验误差。

上述的生物标志是利用一台质谱仪来检测的。该设备的质量精确度约为+/-1％。

重度妊娠高血压生物标志首先能够被具有能与重度妊娠高血压生物标志结合的磁珠(Magnetic Bead，简称MB，如MB-WCX、MB-IMAC Fe等品名)吸附表面捕获，非吸附物能从磁珠上洗脱，吸附到磁珠底基的重度妊娠高血压生物标志在质谱仪中被检测。重度妊娠高血压生物标志通过离子发生源，如激光，被离子化，产生的离子被一个离子感受集合器收集，然后质量分析器分析那些通过的离子。之后，检测器将检测的离子信息转换为质荷比。定量性控制及质谱激光能量调控：每次测试前，用质谱的标准化质控血清，将标准化质控血清中用于定量的标准峰bovine insulin，5733Da强度调至50％质谱信号强度的最大值。重度妊娠高血压生物标志的检测明显地将与信号强度的检测有关。这样，重度妊娠高血压生物标志的数量与质量都可以被检测出来。

质谱对待分析物的分析生成飞行时间谱。该飞行时间谱的最终分析并不表示离子化能量攻击一个样本产生的单独的脉冲信号，而是一系列脉冲的信号之和。这样降低了干扰，并增加了动态范围。该飞行时间数据受数据处理软件的影响。软件中数据处理主要包括转换飞行时间与质荷比而产生质谱，降低基线而减少仪器的偏移量，和过滤高频噪音而减轻高频噪音。

通过对重度妊娠高血压生物标志体检测而产生的数据可利用计算机的数据分析程序进行分析。该计算机程序分析这些数据以显示检测出的重度妊娠高血压生物标志的数量，并显示信号的强度和确定被检测的每个重度妊娠高血压生物标志的分子量。数据分析还能包括一系列的确定重度妊娠高血压生物标志的信号强度和矫正数据对预定统计分布状态的偏离。例如，通过计算与某些参数相关的每个峰值的高度，可规范观测到的峰。该参数可能是由仪器和类似能量吸收分子等化学成分产生的不重要的干扰，这可以设置调零。

计算机可以将计算结果数据转换成各种形式来表现。其标准谱可以表示，但在一种形式中只有峰高和质量信息可以在谱带中保留，产生一个较清晰的图，并使具有几乎相同分子量的重度妊娠高血压生物标志更易显现。在另一种形式中，两个或更多的谱比较，便于突显独特的重度妊娠高血压生物标志和那些高于或低于校准样本的重度妊娠高血压生物标志。

分析一般包括展示从待分析物得到的信号的图谱中峰的鉴定。峰可以通过视图进行选择，软件是可用的，它可自动检测峰。一般情况下，该软件通过鉴定信号具有信噪比高于一个选择阈值并标记出在峰信号的质心处的峰的质量这样的方式操作。在一个有效的程序中，比较许多谱线以认定出现在质谱中某一选定范围内同样的一些峰。该软件的一个版本聚集所有出现在确定的质量范围内的各条光谱的峰，对所有在质量(质荷比)中值附近的峰指定一个质量(质荷比)簇。

发明中使用的重度妊娠高血压生物标志是磁珠所捕获。这些重度妊娠高血压生物标志是进一步通过质谱(mass spectrometry)测定其不同分子量来知道它们特定的身份。

重度妊娠高血压生物标志检测多肽蛋白筛选。通过Mann-Whitney U检验分析几百种磁珠(MB-WCX、MB-IMAC Fe)捕获的血清蛋白指纹峰，发现下述蛋白指纹或质谱图谱可以用于区分正常与重度妊娠高血压生物标志的血清。峰值CV＞30％或者p＜0.05为有显著性差异：

表一重度妊娠高血压(妊高)与正常血清蛋白质荷变化

从中筛选出几个特征蛋白峰，2771、3218、3887、4192、4210、5101和5689Da差异峰组成的检验模型对重度妊娠高血压患者和健康人群盲筛检验，用此分类法分析50份重度妊娠高血压样本的质谱结果，其中50份区分正确，0份区分错误，敏感性为100％；100份对照样品中100份区分正确，0份区分错误，特异性为100％。

利用金属亲和表面(MB-IMAC Fe)磁珠或芯片的实验结果与阴离子磁珠(MB-WCX)或芯片的实验结果一致。

本发明可用于体外细胞和非侵入性的体外重度妊娠高血压生物标志质谱检测方法的定量控制，如离体体液的重度妊娠高血压生物标志试剂盒用于临床质谱的重度妊娠高血压生物标志检测方法。可以检测多个重度妊娠高血压生物标志蛋白质生物标志群及质谱多肽图谱。

本发明中的试剂盒及方法与其他非侵入性的体外检测方法比较，具有以下的特点：

(1)准确

质谱直接分析有很强的精确性。因为蛋白质是由氨基酸组成的，而氨基酸的平均质量是已知的。质荷比(m/z)为2771、3218、3887、4192、4210、5101和5689的蛋白在发生重度妊娠高血压的患者中表达明显增高，对于重度妊娠高血压的发生具有良好的预测性。

(2)方便

支持基质的方法所用吸附剂的支持物是磁珠。用磁性分离器分离磁珠及样品，无需离心样品。

(3)快捷

用本发明提供的蛋白指纹法进行检测时，无需对蛋白质进行测序。

附图说明

图1重度妊娠高血压血清中上调的代表性蛋白指纹峰

具体实施方式

本发明将结合具体实施例作进一步说明，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。实施例1

本发明提出的重度妊娠高血压生物标志的质谱试剂盒实施例1，包括：

一小管粘合液，10～30μl；

一小管质谱标准化质控血清(浆)，10～30μl；

一小管MB-WCX磁珠或金属亲和表面(MB-IMAC Fe)磁珠(北京赛尔迪公司产品)30～50μl；

2)将购买的50～100mM PBS(Phosphate-Buffered Sal ine)或NaAc，pH值为4.0～5.0清洗液、1～5％三氟乙酸的洗提液分别分装成300～500μl小管和10～50μl小管；

4)将上述分装好的各小管置于4℃冷藏箱中。

本发明用于重度妊娠高血压生物标志检测多肽蛋白筛选实验

(1)实验方法

1.将生物样品先用粘合液稀释30～50倍，将样品充分混匀；

4.加10μl洗提液1～5分钟，洗脱标本至上清液；

7.将上述金属片加入质谱仪中，就会生成质谱；

表一重度妊娠高血压(妊高)与正常血清蛋白质荷变化

数据收集

将处理好的Au片置入MALDI-TOF-MS进行蛋白质谱分析。在读取数据前，用加有all-in-one标准蛋白质的芯片校正质谱仪，使分子量误差＜0.1％。本研究中阅读仪的主要参数设定为，最高检测分子量为50kDa，优化分子量范围1000～15000Da，最佳聚集中心8000Da，数据采集参数范围20～80，收集总数为130次。软件中设定读片程序，以读取数据。用血清中的内标峰校正原始数据中的蛋白指纹图谱，使分子量误差＜0.01％，从而获得的精确的蛋白指纹图谱。

统计学分析

应用软件分析处理所有峰谱，形成蛋白指纹图谱。所有的图谱都进行了标准化，统一到它们自己全部的离子总数(峰面积的总和)。将标准化质控血清中用于定量的标准峰强度调至40～50％信号强度的最大值，并且用最显著的峰进行了校正，而后又进行了“减少基线”，定义蛋白峰(s/n＞5，最小的峰强度＞1.6)。分析所有1～50kDa之间的蛋白峰，并且仔细检查了每个相应的峰，计算出峰的平均数，标准误差(SD)和变异系数(CV％)。用Mann-Whitney U检验比较配对样本的蛋白峰，计算p值。

重度妊娠高血压生物标志检测多肽蛋白筛选。通过Mann-Whitney U检验分析几百种磁珠捕获的血清蛋白指纹峰，发现下述蛋白指纹或质谱图谱可以用于区分正常与重度妊娠高血压生物标志的血清。峰值CV＞30％或者p＜0.05为有显著性差异(表一)。

参考文献：

[1]National High Blood Pressure Education Program Working Group.Am.J Obstet Gynecol.2000，183：S1-S2.

[2]Baumwell S，Karumanchi SA，Pre-eclampsia：clinical manifestations and molecular mechanisms.Nephron Clin Pract.2007.106：c72-c81.

[3]许洋.蛋白质指纹图谱技术在实验诊断与临床医学中的研究进展[J].基础医学与临床，2007，27(2)：134-142.

[4]Hayman R.A，Johnson W.I，Baker P.The preliminary characterization of a vasoactive circulating factor(s)in preeclampsia.American Journal of Obstetrics and Gynecology.2001，184：1196-1203.

[5]Jenny M，Maureen M，B.REED，N.Harris，et al.Use of proteomic patterns as a novel screening tool in pre-eclampsia.Journal of Obstetrics and Gynaecology.2004，24(8)：873-874.

[6]Li-zhou Sun，Na-na Yang，Wei De，Yun-shan Xiao.Proteomic Analysis of Proteins Differentially Expressed in Preeclamptic Trophoblasts.Gynecol Obstet Invest.2007，64：17-23.

在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式应当同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种检测重度妊娠期高血压生化标记物的质谱试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：

一小管粘合液，10～30μl；

一小管质谱标准化质控血清(浆)，10～30μl；

一小管MB-WCX磁珠或金属亲和表面(MB-IMAC Fe)磁珠30～50μl；

一小管清洗液300～500μl，为50～100mM PBS或NaAc，pH优化值为4.0～5.0；

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述能量吸收分子采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二羟基苯甲酸之中的任一种。

3.一种制备如权利要求1所述的质谱试剂盒的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

4)将上述分装好的各小管置于4℃冷藏箱中。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述能量吸收分子采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二羟基苯甲酸之中的任一种。

5.一种如权利要1所述试剂盒对重度妊娠期高血压判断的应用。

6.如权利要求5所述的应用，所述试剂盒对重度妊娠期高血压判断；该试剂盒依据几个特征蛋白峰为2771、3218、3887、4192、4210、5101和5689Da。