CN101899092B - 一种新型肽-链接基-缀合物及其固相合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型肽-链接基-寡聚核苷酸类化合物及其固相逐步合成方法，本发明所提供的肽-链接基-寡聚核苷酸类化合物具有通式(VIII)的结构，其中X为多肽结构部分，A为取代或未取代的苯环或碳原子，n为0、1、2、3、4或5。本发明的肽缀合寡聚核苷酸类化合物，具有结构简单、合成方便等特点，产物自身具有膜透性，可以作为研究反义寡核苷酸与小干扰RNA(siRNA)机理的分子生物学工具，也具有潜在的药物开发前景。本发明的固相逐步合成法避免了目前生物大分子缀合物的合成困难，简化了合成操作，便于实现高通量、多靶点的修饰寡聚核苷酸类化合物制备。
Description
技术领域
本发明属于多肽的固相合成方法及应用技术领域，具体涉及一种新型肽-链接基-缀合物及其固相合成方法。
背景技术
基于核酸的一些药物如反义寡核苷酸、肽核酸以及很有希望的小干扰RNA(siRNA)要想发展成为有用的治疗药物，提高其细胞通透性是必须解决的关键问题之一。很多技术已经被用来提高这类化合物的细胞内摄取，例如，高压静脉注射、脂质体和纳米聚合物等，但是这些方法都存在不同程度的副作用而限制其发展。
细胞透膜性肽是近些年来发展起来的新兴转运载体，已经广泛用于一些非细胞膜通透性大分子的细胞内转运。而将其用于核酸类药物细胞内转运来说，主要通过将透膜性肽与寡核苷酸共价缀合实现的。用化学方法实现缀合物生成主要有三种方法：固相逐步合成法、固相片段缩合法和液相片段缩合法。在这三种方法中，固相逐步合成法具有操作简便，底物用量少等优点。
从合成顺序上可将固相逐步合成法分成两类：1)peptide-first-oligo-next：即首先在固相上进行肽的合成，采用Boc或Fmoc策略，之后进行寡核苷酸的合成，最后进行切割及纯化；2)oligo-first-peptide-next：即首先进行寡核苷酸合成，之后进行肽的合成，多采用Fmoc策略，最后进行切割及纯化。
虽然全固相操作简单，但这两种策略都存在问题，即反应条件的兼容性问题，包括偶联条件，脱保护的条件及切割的条件。如果首先合成肽，则肽的侧链上的保护基必须在寡核苷酸合成的条件下稳定，即保证酸性稳定，没有氧化性；在寡核苷酸合成之后可以脱除，即保证碱性或Pd试剂脱除。首先这样的侧链保护基比较少，而且会对寡核苷酸合成产生影响，例如会影响偶联效率，常规的I2氧化须改为tBuOOH氧化。另一方面，如果先合成寡核苷酸，问题同样存在。寡核苷酸对酸性敏感，Boc策略不再使用，只能采用Fmoc策略，侧链的保护基只能选取用弱酸性或催化还原的方法脱除，不仅这种保护基较少，而且如此修饰的氨基酸还需要个别制备，也阻碍了这种方法的发展。
发明内容
为了克服上述现有技术中的缺陷，本发明的目的在于提供一系列肽-链接基-缀合物及其固相合成方法，并且提供用于缀合肽、链接基和缀合物的各种连接基团。
为了达到上述目的，本发明采用如下的技术方案：
本发明提供一系列肽-链接基-缀合物，由每端具有连接官能团的链接基缀合而成，所述链接基在一端与肽共价缀合，在另一端与缀合物共价缀合；
其中所述链接基为A为取代或未取代的苯环或碳原子，n为0、1、2、3、4或5；所述缀合物为寡核苷酸。
优选的，所述肽-链接基-缀合物具有通式(VIII)的结构
其中X为多肽序列，A为取代或未取代的苯环或碳原子，n为0、1、2、3、4或5。
所述肽是一种由氨基酸组成的合成肽。其中肽片段包括，但不限于以下序列：SEQ ID NO.：1，SEQ ID NO.：2，SEQ ID NO.：3，SEQ ID NO.：4，SEQ ID NO.：5，SEQ ID NO.：6，SEQ ID NO.：7，SEQ ID NO.：8，SEQ ID NO.：9，SEQ ID NO.：10，SEQ ID NO.：11。
根据本发明，肽片段可以是肽模拟物。
在本发明的一个优选实施方案中，肽具有透膜的性质。
所述寡核苷酸包括，但不限于：反义寡核苷酸、siRNA、miRNA，PNA，酶性核酸以及其他可以与mRNA或DNA结合的寡聚核苷酸类似物，最终发挥调节基因的翻译或转录作用。
所述反义寡核苷酸的靶基因包括，但不限于：肿瘤抑制基因的突变体(如p53、BRI、EIA和BRCAI)、致癌基因(如k-ras、c-myc和c-fos)、生长因子基因(如IGF 1、PDGF、酸性和碱性FGF，以及TGFβ)、编码与多药耐药性相关的蛋白的基因(如MDRI)。
本发明还提供一种固相合成方法，主要包括以下步骤：
A.使用式(I)的结构与式(II)的氨化CPG树脂合成延长链接臂的CPG树脂式(III)，其中m为0、1、2、3、4或5
B.在式(III)的CPG树脂上合成氨基酸受保护的肽基树脂式(IV)，其中X为多肽序列
C.将式(V)缀合于肽基树脂式(IV)，从而形成带有肽-链接基的肽-链接基树脂式(VI)，其中A为取代或未取代的苯环或碳原子，n为0、1、2、3、4或5
D.将肽-链接基树脂上合成目标缀合物，从而形成带有肽-链接基-缀合物的肽-链接基-缀合物树脂式(VII)
E.从肽-链接基-缀合物树脂的至少一个氨基酸上脱除至少一个侧链保护基；
F.从肽-链接基-缀合物树脂上裂解下肽-链接基-缀合物，从而形成肽-链接基-缀合物式(VIII)
本发明的有益效果在于：本发明的肽缀合寡聚核苷酸类化合物，具有结构简单、合成方便等特点；产物自身具有膜透性，可以作为研究反义寡核苷酸与小干扰RNA(siRNA)机理的分子生物学工具，也具有潜在的药物开发前景。本发明的固相逐步合成法避免了目前生物大分子缀合物的合成困难，简化了合成操作、合成期间产物损失最小化，便于实现高通量、多靶点的修饰寡聚核苷酸类化合物制备。
附图说明
图1为肽缀合寡核苷酸对HepG-2(左图)和MCF-7(右图)细胞增殖的抑制作用；Sense(▲)，antisense(○)，图中结果为平均值±S.D.(n＝5)。
图2为肽缀合寡核苷酸(义链和反义链)对HepG-2细胞中GLUT-1基因表达水平的Western blot分析结果；阴性对照(lane 1)；义链(lane 2)；反义链(lane3)。
图3为肽缀合反义寡核苷酸对HepG2细胞中hTERT表达的抑制作用的电泳结果图。
图4为肽缀合反义寡核苷酸对HepG2细胞中hTERT表达的抑制作用结果图；浓度1、2、3、4依次为0、0.2、2、20μM。
缩略语表
本文公开的本发明使用下列化学命名：
2-Br-Cbz 2-溴苄氧碳基
2-Br-Z 2-溴氧羰基
2-Cl-Cbz 2-氯苄氧碳基
2-Cl-Z 2-氯苄氧羰基
Abu 4-氨基丁酸
Ac 乙酰基
Acm 乙酰氨基甲基
Ac2O 乙酸酐
Boc 叔丁氧羰基
Bz 苯甲酰基
Bzl 苄基
Cbz 苄氧碳基
CPG 可控多孔玻璃珠
DCC 二环己基碳二亚胺
DCM 二氯甲烷
DDAB 溴化二甲胺
DIPEA N，N-二异丙基乙胺
DMAP 二甲基氨基吡啶
DME 乙二醇二甲醚
DMF N，N-二甲基甲酰胺
DMS 二甲硫
DMTr 二甲氧基三苯甲基
Fmoc 9-茐基甲氧羰基
For 甲酰基
HBTU 苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐
HOBt N-羟基苯并***
MBHA 4-甲基二苯甲基酰胺
MeCN 乙腈
MeOH 甲醇
Mmt 4-甲氧基三苯甲基
Mtr 4-甲氧基-2，3，6，-三-甲苯-磺酰基
Mts 均三甲苯-2-磺酰基
Mtt 4-甲基三苯甲基
NHS N-羟基丁二酰亚胺
Pbf 2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-磺酰基
pMeoBzl 对甲氧基苄基
Pmc 2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基
SPPS 固相肽合成
Su 丁二酰亚胺
TCP 2，4，5-三氯苯基
TFA 三氟乙酸
THF 四氢呋喃
TEA 三乙胺
TFA 三氟乙酸
TFE 三氯乙醇
TFMSA 三氟甲磺酸
Tf 三氟甲磺酰基
Tfa 三氟乙酰基
THP 四氢吡喃基
Tos 甲苯磺酰基
Trt 三苯甲基
tBu 叔丁基
tButhio 叔丁基硫
Z 苄氧碳基
具体实施方式
I.制备肽-链接基-缀合物的固相合成方法
根据本发明，制备肽-链接基-缀合物的固相合成方法，其特征主要包括以下步骤：
A.使用式(I)的结构与式(II)的氨化CPG树脂合成延长链接臂的CPG树脂式(III)，其中m为0、1、2、3、4或5
B.在式(III)的CPG树脂上合成氨基酸受保护的肽基树脂式(IV)，其中X为多肽序列
C.将式(V)缀合于肽基树脂式(IV)，从而形成带有肽-链接基的肽-链接基树脂式(VI)，其中A为取代或未取代的苯环或碳原子，n为0、1、2、3、4或5
D.将肽-链接基树脂上合成目标缀合物，从而形成带有肽-链接基-缀合物的肽-链接基-缀合物树脂式(VII)
E.从肽-链接基-缀合物树脂的至少一个氨基酸上脱除至少一个侧链保护基；
F.从肽-链接基-缀合物树脂上裂解下肽-链接基-缀合物，从而形成肽-链接基-缀合物式(VIII)
优选的，其中当式V为时，
合成的目标缀合物VIII为
(1)延长链接臂的CPG树脂的固相合成
根据本发明，延长链接臂通过包括下列步骤的方法实现：(a)在有机溶剂中用偶联试剂偶联链接臂；(b)反应完成后用洗涤溶液进行洗涤步骤；(c)用封闭液封闭未反应的氨基；(d)反应完成后用洗涤溶液进行洗涤步骤。可以用Kaiser试验(Kaise等，Anal Biochem.，1970，34，595-598)来确定偶联反应是否完成。当试验呈“阴性”时终止偶联反应。在预期的偶联完成之后，在所得的延长链接臂的CPG树脂上进行肽序列合成。
根据本发明，偶联试剂可以选自用于肽键形成的试剂。这些偶联试剂的实例包括，但不限于：二环己基碳二亚胺(DCC)、N-羟基苯并***(HOBt)、N，N-二异丙基乙胺(DIEA，DIPEA)、苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、二甲基氨基吡啶(DMAP)。偶联试剂优选的实施方案是HBTU/HOBt和DIPEA。
根据本发明，用于氨基封闭的试剂可以是乙酸酐(Ac2O)。
根据本发明，用于DMTr保护基的脱保护试剂可以是三氟乙酸(TFA)。
根据本发明，用于封闭、脱保护、偶联和洗涤的主要溶剂包括，但不限于：吡啶(Py)、二氯甲烷(DCM)、乙腈(MeCN)、甲醇(MeOH)和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)。
根据本发明，树脂如果用于缀合寡聚核苷酸，主要是氨基化的CPG树脂。也可以是本领域公知的任何固相合成树脂。适于Fmoc固相肽合成(SPPS)的树脂包括，但不限于：羟甲基树脂、王氏树脂(Wang resin)、2-氯三苯甲基氯树脂和Rink酰胺树脂。适于Boc SPPS的树脂包括，但不限于：Merrifield树脂、4-甲基二苯甲基酰胺(MBHA)树脂和肟树脂。在Fmoc化学中，王氏树脂和羟甲基树脂可以用于合成在C-端带有羧基(-COOH)、烷基酰胺基(-C(O)NHR)、二(烷基)酰胺基(-C(O)NR1R2)，或者酯基(-C(O)OR)肽。在Fmoc化学中，Rink酰胺树脂可以用于合成在C-端带有酰胺基(-C(O)NH2)的肽。在Fmoc化学中，2-氯三苯甲基树脂可以用于合成在C-端带有羧酸、胺，或者羟基官能团的肽。在Boc化学中，Merrified树脂可以用于合成在C-端带有羧酸或酯的肽。在Boc化学中，MBHA树脂可以用于合成在C-端带有酰胺的肽。在Boc化学中，肟树脂可以用于合成在C-端带有烷基酰胺或者酯的肽。
在本发明的一个优选实施方案中，肽-链接基-缀合物的合成通过使用Boc化学中的CPG树脂来进行。
(2)氨基酸残基受保护的肽基树脂的固相合成
本发明的肽基树脂可以通过本领域公知的任何固相合成技术制备。相关技术如Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，85，2149(1963)，Stewart，Solid Phase PeptideSynthesis(固相肽合成)(Freeman和Co.，San Francisco，(1969))，Stewart等，SolidPhase Peptide Synthesis(固相肽合成)(Pierce Chemical Company，Rockford，(1984))，以及Atherton等，Solid Phase Peptide Synthesis：A Practical Approach(固相肽合成：实用方法)(IRL Press，Oxford(1989))引入本文作参考。
根据本发明，Fmoc和Boc固相肽合成(SPPS)方法是制备肽基树脂的优选方法。Boc SPPS使用对酸不稳定的Boc(1-丁氧羰基)基团作为α-氨基的保护基，而Fmoc SPPS使用对碱不稳定的Fmoc(9-茐基甲氧羰基)作为α-氨基的保护基。Fmoc和Boc SPPS都是本领域公知的方法，例如Stewart等，Solid Phase PeptideSynthesis(固相肽合成)Pierce Chemcal Compny，Rockford(1984)，以及Chan和Whiite，Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis：A Practical Approach(Fmoc固相肽合成：实用方法)，Oxford University Press，Oxford(2000)。
在初始连接后，用洗涤溶液去除过量的试剂和副产品。随后加入氨基酸，通过包括下列步骤的方法延长肽链：(a)用脱保护试剂使α-氨基保护基脱保护；以及(b)在有机溶剂中用偶联试剂偶联氨基酸基酸；(c)在每步脱保护和偶联之后用洗涤溶液进行洗涤步骤；(d)用封闭液封闭未反应的氨基。可以用Kaiser试验(Kaise等，Anal Biochem.，1970，34，595-598)来确定偶联反应是否完成。当试验呈“阴性”时终止偶联反应。在预期的肽完成之后，将所得肽基树脂与链接基缀合。
根据本发明，偶联试剂可以选自用于肽键形成的试剂。这些偶联试剂的实例包括，但不限于：二环己基碳二亚胺(DCC)、N-羟基苯并***(HOBt)、N，N-二异丙基乙胺(DIEA，DIPEA)、苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、二甲基氨基吡啶(DMAP)。偶联试剂优选的实施方案是HBTU/HOBt和DIPEA。
根据本发明，用于氨基封闭的试剂可以是乙酸酐(Ac2O)。
根据本发明，用于叔丁氧碳基(Boc)保护基的脱保护试剂可以是三氟乙酸(TFA)，而用于9-茐基甲氧碳基(Fmoc)保护基的脱保护试剂可以是哌啶。
根据本发明，用于封闭、脱保护、偶联和洗涤的主要溶剂包括，但不限于，吡啶(Py)、二氯甲烷(DCM)、乙腈(MeCN)、甲醇(MeOH)和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)。
氨基保护基
根据本发明，用于肽链延长的氨基酸中的氨基可以在氨基酸偶联成延长肽的期间进行保护。在偶联反应后，为了进行下一个氨基受保护的氨基酸偶联，将保护基脱除。
根据本发明，适当的保护基包括，但不限于：酰基类保护基如甲酰基、三氟乙酰基和乙酰基；芳族脲烷类保护基如Fmoc、苄氧羰基(Cbz)和取代的Cbz；脂肪族脲烷类保护基如叔丁氧羰基(Boc)、异丙氧羰基和环己基氧羰基；以及烷基类保护基，如苄基和三苯甲基。但是，优选的保护基是Fmoc和Boc。
侧链保护基
根据本发明，侧链保护基是指能够连接于氨基酸侧链从而在化学反应中保护侧链，但是在所需反应完成后又能容易脱除的基团。适当的氨基侧链保护基包括，但不限于：乙酰基(Ac)、Boc、Cbz、2-氯苄氧羰基(2-Cl-Cbz)、2-溴苄氧羰基(2-Br-Cbz)、4-甲基三苯甲基(Mtt)、苄氧羰基(Cbz)、Fmoc、1(4，4-二甲基-2，6-二氧亚环己-1-基)乙基(Dde)和三氯乙酰基(Tfa)。适当的羟基侧链保护基包括，但不限于：苄基(Bzl)、叔丁基(tBu)和三苯甲基(Trt)。适当的巯基侧链保护基包括，但不限于：乙酰氨基甲基(Acm)、Bzl、tBu、叔丁基硫(tButhio)、对甲氧苄基(pMeoBzl)和4-甲氧基三苯甲基(Mmt)。适当的酚羟基侧链保护基包括，但不限于：四氢吡喃基、tBu、Trt、Bzl、Cbz、2-Br-Cbz和2，5-二氯苄基。适当的咪唑基侧链保护基包括，但不限于：Boc、Mtt、甲苯磺酰基(Tos)和Trt。适当的吲跺侧链保护基包括，但不限于：Boc。适当的羧酸侧链保护基包括，但不限于：苄基、2，6-二氯苄基等基、tBu和环己基。适当的胍基侧链保护基包括，但不限于：4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯-磺酰基(Mtr)、均三甲苯-2-磺酰基(Mts)、2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-磺酰基(Pbf)，2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基(Pmc)和Tos。
(3)带有链接基的肽-链接基树脂的固相合成
通常，通过在适当的溶剂中将端基官能化或活化的链接基(式V)偶联到肽基树脂上，并在约0℃到90℃的温度范围内振荡直到Kaiser试验呈试验呈“阴性”为止而进行连接反应。在反应已经完成后，用洗涤溶液去除过量的试剂和副产品，用封闭液封闭未反应的氨基，然后将肽基树脂用于缀合物合成。
偶联反应的适当溶剂可以选自基本上由下列溶剂组成的组：DCM、氯仿、MeCN、DMF、四氢呋喃(THF)以及它们不同比例的混合物。
洗涤溶液可以选自基本上由下列溶剂和溶液组成的组：DCM、氯仿、MeOH、DMF、THF、MeCN、水、缓冲液以及它们不同比例的混合物。
在本发明的一个优选实施方案中，所述链接基的连接官能团是酰胺键。在酰胺键偶联反应中，反应中羧基的活化剂选自基本上由肽键形成中使用的试剂成的组，如二环己基碳二亚胺(DCC)、N-羟基苯并***(HOBt)、N，N-二异丙基乙胺(DIEA，DIPEA)、苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、二甲基氨基吡啶(DMAP)。偶联反应的适当溶剂选自基本上由DCM、氯仿、MeCN、DMF、Py、THF以及它们不同比例的混合物组成的组。洗涤溶液选自基本上由DCM、氯仿、MeOH、DMF、THF、MeCN、水、缓冲液以及它们不同比例的混合物组成的组。反应温度在约-10℃到约90℃的范围内。羧基的优选的活化剂是DIPEA/HOBt，而且溶剂选自基本上由DCM、氯仿和DMF组成的组。优选的洗涤溶液选自基本上由氯仿、MeOH、MeCN、水、DMF、缓冲液(pH 3.0～11.0)以及它们不同比例的混合物组成的组。优选的反应温度在约20℃到约60℃的范围内。
(4)缀合物在肽-链接基树脂上的固相合成
根据本发明，缀合物通过上述连接官能团缀合于间隔基-肽基树脂。通常，通过DNA合成仪自动合成。
(5)从树脂上裂解肽-链接基-缀合物
根据本发明，通过振荡肽-链接基-缀合物树脂和裂解试剂来实现肽-链接基-缀合物从树脂上裂解。一般而言，本发明中使用的裂解试剂和程序与SPPS领域中使用的处理相同。
当使用王氏树脂、2-氯三苯甲基氯树脂和Merrified树脂来合成C-端带有羧基的肽-链接基-缀合物时，肽-链接基-缀合物树脂可以通过裂解试剂(至少一种酸、清除剂和溶剂的混合物)来裂解。
酸可以选自基本上由TFA、氟化氢(HF)和三氟甲磺酸(TFMSA)组成的组。清除剂可以选自基本上由下列试剂组成的组：茴香硫醚、茴香醚、乙烷二硫醇(EDT)、二甲硫(DMS)、乙基甲基硫醚、三氟乙醇(TFE)、4-甲巯基苯酚、苄基硫醇、三乙基甲硅烷和水。用于裂解肽-链接基-缀合物的适当溶剂包括，但不限于：DCM、氯仿、MeCN、DMF、THF以及它们不同比例的混合物。将肽-链接基-缀合物从树脂上裂解需要强酸，如在Boc化学中为HF或者TFMSA，以及在Fmoc化学中为TFA。DCM和DMF是用于裂解的主要溶剂。
当使用羟甲基树脂或王氏树脂来合成肽-链接基-缀合物的低级烷基酰胺C-端时，将肽-链接基-缀合物从树脂上裂解可以优选地在烷基胺、氯化铝和DCM的混合物下进行。裂解程序在本领域中是公知的，如C.R.McArthur等(1982)，Can.J.Chem.，60，1836，该文献引入本文作参考。当使用羟甲基树脂或王氏树脂来合成肽-链接基-缀合物的低级烷基化的羧基C-端时，将肽-链接基-缀合物从树脂上裂解可以优选地在烷基醇、TEA、***和苯的混合物下进行。裂解程序在本领域中是公知的，如Moon等(1994)，Tetrahedron Lett.，35，8915，该文献引入本文作参考。当使用Rink酰胺树脂来合成肽-链接基-缀合物的酰胺化羧基C-端时，将肽-链接基-缀合物从树脂上裂解可以优选地在TFA、清除剂和DCM的混合物下进行。当使用MBHA树脂来合成肽-链接基-缀合物的酰胺化羧基C-端时，将肽-链接基-缀合物从树脂上裂解可以优选地在HF和清除剂的混合物下进行。当使用肟树脂来合成肽-链接基-缀合物的烷基酰胺C-端时，使用的裂解试剂优选是RNH2。当使用肟树脂来合成肽-链接基-缀合物的烷基酯C-端时，使用的裂解试剂优选是烷基醇和TFE。
(6)侧链保护基的脱除
一般而言，本发明中的侧链保护基通过SPPS领域中使用的相同方法脱除。大多数侧链保护基，如氨基酸的t-Bu、Boo、Mts、Mmt、Pbf、Pmc、Tos、Trt可以在将肽-链接基-缀合物从树脂上裂解期间由TFA或HF脱除。其它的侧链保护基可以由适当的脱保护试剂选择性地脱除。优选的脱除Acm的脱保护试剂包括，但不限于：Hg(II)、Ag(I)、TI(III)和I2。优选的脱除Bzl、Z、2-溴苄氧羰基(2-Br-Z)、2-氯苄氧羰基(2-Cl-Z)的脱保护试剂是活性炭负载的钯催化剂(Pd-C)/H2。优选的脱除叔丁巯基的脱保护试剂包括硫(thio)和三丁基膦。优选的脱除Fmoc的脱保护试剂是哌啶。
(7)肽-链接基-缀合物的纯化
根据本发明，肽-链接基-缀合物的纯化方法包括，但不限于，柱色谱法、膜渗析法以及它们的组合。
在本发明的一个实施方案中，肽-链接基-缀合物可以通过使用凝胶过滤介质的柱色谱法纯化。凝胶过滤介质包括，但不限于：交联葡萄糖G(Sephadex G)和LH系列、琼脂糖(Sepharose)系列，以及Sephacryl系列和Superose系列。
在本发明的另一个实施方案中，肽-链接基-缀合物还可以通过使用反相色谱柱的柱色谱法纯化。反相色谱包括，但不限于：C8、C12、C15和C18系列色谱。
在本发明的另一个实施方案中，肽-链接基-缀合物的聚集形式可以通过膜渗析从含有不需要的成分，如肽-链接基、肽和其它游离小分子的混合物中分离出来。优选渗析膜具有分子量截留小于100000道尔顿的孔径。
II.肽-链接基-缀合物
根据本发明，肽-链接基-缀合物由本发明的方法合成，而且由每端具有连接官能团的链接基缀合而成，所述链接基在一端与肽共价缀合，在另一端与寡核苷酸共价缀合。可以将所述的肽-链接基-寡核苷酸缀合物转运入细胞。
(1)肽
根据本发明，肽是一种由氨基酸组成的合成肽。其中肽片段包括，但不限于以下序列：
| SEQ ID NO.：1 | H-Leu-Ala-Leu-Leu-Ala-Lys-OH |
| SEQ ID NO.：2 | H-Leu-Ala-Leu-Leu-Lys-Lys-OH |
| SEQ ID NO.：3 | H-Leu-Lys-Lys-Ala-Ala-Lys-OH |
| SEQ ID NO.：4 | H-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-OH |
| SEQ ID NO.：5 | H-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-OH |
| SEQ ID NO.：6 | H-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-OH |
| SEQ ID NO.：7 | H-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-OH |
| SEQ ID NO.：8 | HO-Leu-Ala-Leu-Leu-Ala-Lys-H |
| SEQ ID NO.：9 | HO-Leu-Ala-Leu-Leu-Lys-Lys-H |
| SEQ ID NO.：10 | HO-Leu-Lys-Lys-Ala-Ala-Lys-H |
| SEQ ID NO.：11 | HO-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-H |
根据本发明，肽片段可以是肽模拟物，该模拟物是包括下面一种或更多修饰的如上定义的肽配体的类似物：
1)肽中的氨基酸被非天然氨基酸所取代；
2)肽中的氨基酸被D型天然氨基酸所取代；
3)肽的C-端羧基被修饰成酰胺、低级烷基酰胺、二(低级烷基)酰胺、低级酯衍生物、羟基或者低级烷氧基；以及
4)肽被环化。
在本发明的一个优选实施方案中，肽具有透膜的性质。
根据本发明，氨基酸定义为含有至少一个羧酸基和一个氨基的有机化合物。优选的氨基酸包括D或L型的天然氨基酸和非天然氨基酸。
天然氨基酸包括20种α-氨基酸，其中氨基羧基与同一个碳相连。含有非极或疏水侧链的天然氨基酸包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸；含有酸性侧链的天然氨基酸，包括天冬氨酸和谷氨酸；含有碱性侧链的天然氨基酸，包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸；以及含有不带电亲水性侧链的天然氨基酸，包括天门冬酰胺、谷氨酰胺、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和半胱氨酸。
本发明的非天然氨基酸包括侧链修饰的氨基酸、非α-氨基酸和N-甲基氨基酸。
例链修饰的氨基酸是α-氨基酸，其中每个氨基酸的侧链都是非天然的或是从天然氨基酸修饰来的。侧链修饰的氨基酸实例包括，但不限于，2-氨基丁酸、1-氨基环丙烷-1-羧酸、α-氨基异丁酸、二苯丙氨酸、对苯甲酰苯丙氨酸、α-叔丁基甘氨酸、3-环己基丙氨酸、α-环己基甘氨酸、(S)-2，3-二氨基丙酸、(S)-2，3-二氨基丁酸、2-氨基-4-苯基丁酸、高丝氨酸、高酪氨酸、(S)-(-)-二氢吲哚-2-羧酸、β-2-萘基丙氨酸、3-(1-萘基)-丙氨酸、3-(2-萘基)-丙氨酸、八氢吲哚-2羧酸、青霉胺、对氨基苯丙氨酸、4-溴苯丙氨酸、2-氯苯丙氨酸、3-氯苯丙氨酸、3，4-二氯苯丙氨酸、3，4-二氟苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、5-羟基色氨酸、4-碘苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、5-氟苯丙氨酸、2-哌啶酸、炔丙基甘氨酸、四氢噻唑-4-羧酸、1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸、3，5-二碘酪氨酸、3-碘酪氨酸、3-硝基酪氨酸、O-磷酸酪氨酸、二乙基甘氨酸、二正丙基甘氨酸、二正丁基甘氨酸、1-氨基-1-环丙烷羧酸、1-氨基-1-环戊烷-1-羧酸、1-氨基-1-环己烷-1-羧酸和4-羟基脯氨酸。
非α-氨基酸是指那些氨基和羧基没有连接在同一个碳上的氨基酸。非α-氨基酸的实例包括，但不限于，2-氨基苯甲酸、3-氨基苯甲酸、4-氨基苯甲酸、4-(氨甲基)苯甲酸、4-(氨甲基)环己烷、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、5-氨基戊酸、6-氨基己酸、8-氨基辛酸、9-氨基壬酸、10-氨基癸酸、11-氨基十一酸、12-氨基月桂酸、六氢异烟酸(isonipecotic acid)、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、4-氨基-5-环己基-3-羟基戊酸和4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸。
N-烷基氨基酸是指其中α-氨基被单烷基化的氨基酸。烷基包括，但不限于，甲基、乙基和丙基。
(2)链接基部分
本发明所述的链接基具有式V的结构
其中A为取代或未取代的苯环或碳原子。所述的取代可以是被一个或多个低级烷基、烯基、炔基、卤素、氨基、硝基等取代。
所述n可以为0、1、2、3、4或5，优选n为1。
优选的，所述链接基具有但不限于如下的结构
(3)寡核苷酸部分
寡核苷酸包括，但不限于：反义寡核苷酸、siRNA、miRNA，PNA，酶性核酸以及其他可以与mRNA或DNA结合的寡聚核苷酸类似物，最终发挥调节基因的翻译或转录作用。
其中，反义寡核苷酸的靶基因包括，但不限于：肿瘤抑制基因的突变体(如p53、BRI、EIA和BRCAI)、致癌基因(如k-ras、c-myc和c-fos)、生长因子基因(如IGF 1、PDGF、酸性和碱性FGF，以及TGFβ)、编码与多药耐药性相关的蛋白的基因(如MDRI)。
优选的，所述寡核苷酸序列包括但不限于以下序列
SEQ ID NO.：12 3’-TCAGACTCCGGACTCACTCA-5’
SEQ ID NO.：13 3’-GATTGGGATTGAC-5’
为了更好地理解本发明，通过实施例进行说明。
实施例1
1)式(I)与CPG的连接：
将2-8当量的式(I)、HOBt和HBTU，溶于3mLDMF中，加入2-8当量的DIPEA，活化15分钟后，加入到500mg的氨化CPG中，室温振荡反应1小时。滤除反应液，用DMF、甲醇和DCM各5mL依次洗涤树脂三次，充分干燥。茚三酮检测反应完成，用醋酸酐封闭未反应的氨基，用DMF、甲醇和DCM各5mL依次洗涤树脂三次，充分干燥。取1-3mgCPG，加入5mL10％对甲苯磺酸的乙腈溶液，定容后测定507nm的吸光值计算为180μmol/g(即每克树脂中所含式(I)的量)。
2)在衍生化CPG上合成肽
将步骤1)中衍生化的CPG用5％三氯乙酸处理3分钟脱去DMT，用甲醇，DCM冲洗，干燥。由序列(KALLAL)，按照Fmoc或者Boc方法，用脱除DMT的上述树脂合成目标多肽序列，并用适当试剂脱除序列末端氨基上的保护基。以Boc法为例：
将2-8当量的侧链氨基Fmoc保护的Boc-Lys(Fmoc)-OH、HOBt和HBTU，溶于4mLDMF中，加入2-8当量的DIPEA，活化15分钟后，加入到一定量1)所得到CPG中，室温振荡反应1小时。滤除反应液，用DMF、甲醇和DCM各5mL依次洗涤树脂三次，充分干燥。取1-3mgCPG，加入适量20％哌啶/DMF溶液，定容后测定304nm的吸光值计算为80μmol/g(即每克树脂中所含式(I)的量)。达到目标值后，用33％TFA的二氯甲烷溶液脱除Boc保护基，用DMF、甲醇和DCM依次洗涤树脂，充分干燥。进行下一个氨基酸偶联，用茚三酮检测反应完成，用醋酸酐封闭未反应的氨基，用DMF、甲醇和DCM各5mL依次洗涤树脂三次，充分干燥。重复操作直到氨基酸序列合成完毕。用33％TFA的二氯甲烷溶液脱除Boc保护基，用DMF、甲醇和DCM依次洗涤树脂，充分干燥。
3)链接基偶联到肽基树脂上
将2-8当量的式(V)、HOBt和HBTU，溶于5mLDMF中，加入2-8当量的DIPEA，活化15分钟后，加入到步骤2)所得到的CPG中，室温振荡反应1小时。滤除反应液，用DMF、甲醇和DCM依次洗涤树脂，充分干燥。茚三酮检测反应完成，用醋酸酐封闭未反应的氨基，用DMF、甲醇和DCM依次洗涤树脂，充分干燥。取1-3mg树脂，用5％二氯乙酸的DCM溶液脱除DMT测定载量。达到寡核苷酸合成载量要求即可。取5-10mg上述CPG树脂，用5％TFA的二氯甲烷溶液脱除DMT保护，可加入适量浓氨水，55℃进行切割、脱保护10小时，浓缩后HPLC纯化，收集产物峰，冷冻干燥。
用ESI-MS确定目标肽分子(HO-LysAlaLeuLeuAlaLeu-NHCOC-(CH3)2CH2OH)的分子量为(MW+1)728.49，计算值为728.61。
4)缀合物的合成
步骤3)得到的已连接上肽序列的CPG，在ABI 381A型DNA合成仪上用标准亚磷酰胺法合成指定的寡聚核苷酸序列(3’-TCAGACTCCGGACTCACTCA-5’)。
合成规模为1μM，得到DMT-ON序列，合成序列为：
KALLAL-3’-TCAGACTCCGGACTCACTCA-5’。经DMT检测，每步偶联效率在98％以上。合成结束后，取出CPG，置于耐压小瓶中，用浓氨水切割及脱保护(55℃，10h)，得到的DMT-ON缀合物用OPC(Applied Biosystem)纯化，浓缩后HPLC纯化。纯化的DMT-ON缀合物用OPC柱脱DMT。脱DMT的缀合物的质量用HPLC进行控制，纯度大于95％。KALLAL-3’-TCAGACTCCGGACTCACTCA-5’用MALDI-TOF-MS测定的分子量为：6800.00，计算值为6803.67。
实施例2
1)式(I)与CPG的连接同实施例1。
2)将步骤1)中衍生化的CPG用5％三氯乙酸处理3分钟脱去DMT，用甲醇，DCM冲洗，干燥。由序列(KLLKKL)，按照Fmoc或者Boc方法，用脱除DMT的上述树脂合成目标多肽序列，并用适当试剂脱除序列末端氨基上的保护基。以Boc法为例：
将2-8当量的侧链氨基Fmoc保护的Boc-Lys(Fmoc)-OH、HOBt和HBTU，溶于4mLDMF中，加入2-8当量的DIPEA，活化15分钟后，加入到一定量1)所得到CPG中，室温振荡反应1小时。滤除反应液，用DMF、甲醇和DCM各5mL依次洗涤树脂三次，充分干燥。取1-3mgCPG，加入适量20％哌啶/DMF溶液，定容后测定304nm的吸光值计算为80μmol/g(即每克树脂中所含式(I)的量)。达到目标值后，用33％TFA的二氯甲烷溶液脱除Boc保护基，用DMF、甲醇和DCM依次洗涤树脂，充分干燥。进行下一个氨基酸偶联，用茚三酮检测反应完成，用醋酸酐封闭未反应的氨基，用DMF、甲醇和DCM各5mL依次洗涤树脂三次，充分干燥。重复操作直到氨基酸序列合成完毕。用33％TFA的二氯甲烷溶液脱除Boc保护基，用DMF、甲醇和DCM依次洗涤树脂，充分干燥。
3)将2-8当量的式(V)、HOBt和HBTU，溶于5mLDMF中，加入2-8当量的DIPEA，活化15分钟后，加入到步骤2)所得到的CPG中，室温振荡反应1小时。滤除反应液，用DMF、甲醇和DCM依次洗涤树脂，充分干燥。茚三酮检测反应完成，用醋酸酐封闭未反应的氨基，用DMF、甲醇和DCM依次洗涤树脂，充分干燥。取1-3mg树脂，用5％二氯乙酸的DCM溶液脱除DMT测定载量。达到寡核苷酸合成载量要求即可。取5-10mg上述CPG树脂，用5％TFA的二氯甲烷溶液脱除DMT保护，可加入适量浓氨水，55℃进行切割、脱保护10小时，浓缩后HPLC纯化，收集产物峰，冷冻干燥。
用ESI-MS确定目标肽分子(HO-LysLeuLeuLysLysLeu-NHCOC-(CH3)2CH2OH)的分子量为(MW+1)842.61，计算值为841.60。
4)缀合物的合成
步骤3)得到的已连接上肽序列的CPG，在ABI 381A型DNA合成仪上用标准亚磷酰胺法合成指定的寡聚核苷酸序列(3’-GATTGGGATTGAC-5’)。合成规模为1μM，得到DMT-ON序列，合成序列为：KLLKKL-3’-GATTGGGATTGAC-5’。经DMT检测，每步偶联效率在98％以上。合成结束后，取出CPG，置于耐压小瓶中，用浓氨水切割及脱保护(55℃，10h)，得到的DMT-ON缀合物用OPC(Applied Biosystem)纯化，浓缩后HPLC纯化。纯化的DMT-ON缀合物用OPC柱脱DMT。脱DMT的缀合物的质量用HPLC进行控制，纯度大于95％。
KLLKKL-3’-GATTGGGATTGAC-5’用MALDI-TOF-MS测定的分子量为：4931.29，计算值为4932.41。
实施例3
1)式(I)与CPG的连接同实施例1。
2)将步骤1)中衍生化的CPG用5％三氯乙酸处理3分钟脱去DMT，用甲醇，DCM冲洗，干燥。由序列(KKLLAL)，按照Fmoc或者Boc方法，用脱除DMT的上述树脂合成目标多肽序列，并用适当试剂脱除序列末端氨基上的保护基。以Boc法为例：
将2-8当量的侧链氨基Fmoc保护的Boc-Lys(Fmoc)-OH、HOBt和HBTU，溶于4mLDMF中，加入2-8当量的DIPEA，活化15分钟后，加入到一定量1)所得到CPG中，室温振荡反应1小时。滤除反应液，用DMF、甲醇和DCM各5mL依次洗涤树脂三次，充分干燥。取1-3mgCPG，加入适量20％哌啶/DMF溶液，定容后测定304nm的吸光值计算为80μmol/g(即每克树脂中所含式(I)的量)。达到目标值后，用33％TFA的二氯甲烷溶液脱除Boc保护基，用DMF、甲醇和DCM依次洗涤树脂，充分干燥。进行下一个氨基酸偶联，用茚三酮检测反应完成，用醋酸酐封闭未反应的氨基，用DMF、甲醇和DCM各5mL依次洗涤树脂三次，充分干燥。重复操作直到氨基酸序列合成完毕。用33％TFA的二氯甲烷溶液脱除Boc保护基，用DMF、甲醇和DCM依次洗涤树脂，充分干燥。
3)将2-8当量的的式(V)、HOBt和HBTU，溶于5mLDMF中，加入2-8当量的DIPEA，活化15分钟后，加入到步骤2)所得到的CPG中，室温振荡反应1小时。滤除反应液，用DMF、甲醇和DCM依次洗涤树脂，充分干燥。茚三酮检测反应完成，用醋酸酐封闭未反应的氨基，用DMF、甲醇和DCM依次洗涤树脂，充分干燥。取1-3mg树脂，用5％二氯乙酸的DCM溶液脱除DMT测定载量。达到寡核苷酸合成载量要求即可。取5-10mg上述CPG树脂，用5％TFA的二氯甲烷溶液脱除DMT保护，可加入适量浓氨水，55℃进行切割、脱保护10小时，浓缩后HPLC纯化，收集产物峰，冷冻干燥。
用ESI-MS确定目标肽分子(HO-LysLysLeuLeuAlaLeu-NHCOC-(CH3)2CH2OH)的分子量为(MW+1)784.58，计算值为784.54。
4)缀合物的合成
步骤3)得到的已连接上肽序列的CPG，在ABI 381A型DNA合成仪上用标准亚磷酰胺法合成指定的寡聚核苷酸序列(3’-GATTGGGATTGAC-5’)。合成规模为1μM，得到DMT-ON序列，合成序列为：KKLLAL-3’-GATTGGGATTGAC-5’。经DMT检测，每步偶联效率在98％以上。合成结束后，取出CPG，置于耐压小瓶中，用浓氨水切割及脱保护(55℃，10h)，得到的DMT-ON缀合物用OPC(Applied Biosystem)纯化，浓缩后HPLC纯化。纯化的DMT-ON缀合物用OPC柱脱DMT。脱DMT的缀合物的质量用HPLC进行控制，纯度大于95％。
KKLLAL-3’-GATTGGGATTGAC-5’用MALDI-TOF-MS测定的分子量为：4865.54，计算值为4876.41。
试验例1以GLUT1为靶对肽缀合反义寡核苷酸的生物活性进行研究
肽序列由KALLAL组成，利用计算机辅助设计软件(InsightII/Discover)进行模拟发现这一序列具有很高的形成α-螺旋能力。与对照序列(义链)缀合物相比，设计的肽缀合反义寡核苷酸对HepG-2和MCF-7细胞增殖的抑制率(图1)及对GLUT1mRNA和相应蛋白表达的抑制(图2)可达50％。用不与肽缀合的硫代寡核苷酸对HL-60细胞增殖的抑制率仅为25％，因此可以认为，这种提高的生物活性是由于与肽缀合后提高了寡核苷酸穿透细胞膜的能力引起的。试验例2以端粒酶mRAN为靶对肽缀合反义寡核苷酸对端粒酶蛋白表达的抑制作用进行研究
用Western blot技术考察了合成的KALLAL缀合反义寡核苷酸(KALLAL-3’-TCAGACTCCGGACTCACTCA-5’)对端粒酶蛋白表达的影响。初步结果见图3，图4是用肽缀合反义寡核苷酸对HepG2细胞中hTERT表达的抑制作用结果。
以上结果表明，KALLAL序列与反义寡核苷酸缀合后，可以透过细胞膜发挥反义作用。
本文显示并详细描述的信息足以实现本发明的上述目的，因此本发明的优选实施方案代表本发明的主题，该主题为本发明所广泛涵盖。本发明的范围完全涵盖其它对本领域技术人员来说显而易见的实施方案，因此，本发明的范围不被除所附权利要求之外的任何内容所限制，其中除了明确说明外，所用元素的单数形式并不是指“一个和唯一”，而是指“一个或更多”。对本领域一般技术人员来说，所有公知的上述优选的实施方案和附加实施方案部分的结构、组成和功能上的等价物因此引入本文作参考，而且试图被本发明的权利要求所涵盖。
此外，不需要某种设备或方法来表达本发明所解决的每个问题，因为它们都已包括在本发明的权利要求之内。另外，无论本发明公开事实中的所有部分、成分，或者方法步骤是否在权利要求中被明确叙述，它们都没有贡献给公众。但是，对本领域普通技术人员来说，很明显在不背离如所附权利要求中所阐明的本发明的实质和范围的前提下，可以在形式、试剂和合成细节上做出各种改变和修饰。
序列表
<110>北京大学
<120>一种新型肽-链接基-缀合物及其固相合成方法
<130>KLPI090
<160>13
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>6
<212>PRT
<213>人工合成
<400>1
Leu Ala Leu Leu Ala Lys
1 5
<210>2
<211>6
<212>PRT
<213>人工合成
<400>2
Leu Ala Leu Leu Lys Lys
1 5
<210>3
<211>6
<212>PRT
<213>人工合成
<400>3
Leu Lys Lys Ala Ala Lys
1 5
<210>4
<211>6
<212>PRT
<213>人工合成
<400>4
Leu Lys Lys Leu Leu Lys
1 5
<210>5
<211>6
<212>PRT
<213>人工合成
<400>5
Lys Lys Lys Lys Lys Lys
1 5
<210>6
<211>6
<212>PRT
<213>人工合成
<400>6
Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5
<210>7
<211>9
<212>PRT
<213>人工合成
<400>7
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5
<210>8
<211>6
<212>PRT
<213>人工合成
<400>8
Lys Ala Leu Leu Ala Leu
1 5
<210>9
<211>6
<212>PRT
<213>人工合成
<400>9
Lys Lys Leu leu Ala Leu
1 5
<210>10
<211>6
<212>PRT
<213>人工合成
<400>10
Lys Ala Ala Lys Lys Leu
1 5
<210>11
<211>6
<212>PRT
<213>人工合成
<400>11
Lys Leu Leu Lys Lys Leu
1 5
<210>12
<211>20
<212>RNA
<213>人工合成
<400>12
actcactcag gcctcagact 20
<210>13
<211>13
<212>RNA
<213>人工合成
<400>13
cagttagggt tag 13
Claims (4)
1.肽-链接基-缀合物，由每端具有连接官能团的链接基缀合而成，所述链接基在一端与肽共价缀合，在另一端与缀合物共价缀合；
其特征在于所述链接基为
所述肽-链接基-缀合物的结构如通式(VIII)所示：
其中X为多肽序列，A为碳原子，n为0、1、2、3、4或5；所述缀合物为寡核苷酸；
其中所述肽是一种由氨基酸组成的合成肽，其中肽片段的序列为SEQ IDNO:1所示；
其中所述的寡核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。
2.权利要求1所述的肽-链接基-缀合物的固相合成方法，其特征在于包括以下步骤：
A.使用式(I)的结构与式(II)的氨化CPG树脂合成延长链接臂的CPG树脂式(III)，其中m为0、1、2、3、4或5
B.在式(III)的CPG树脂上合成氨基酸受保护的肽基树脂式(IV)，其中X为多肽序列
C.将式(V)缀合于肽基树脂式(IV)，从而形成带有肽-链接基的肽-链接基树脂式(VI)，其中n为0、1、2、3、4或5，A为碳原子
D.将肽-链接基树脂上合成目标缀合物，从而形成带有肽-链接基-缀合物的肽-链接基-缀合物树脂（VII）
E.从肽-链接基-缀合物树脂的至少一个氨基酸上脱除至少一个侧链保护基；
F.从肽-链接基-缀合物树脂上裂解下肽-链接基-缀合物，从而形成式(VIII)的肽-链接基-缀合物
3.根据权利要求2所述的肽-链接基-缀合物的固相合成方法，其特征在于包括以下步骤：
A.式(I)与CPG的连接：
将2-8当量的式(I)、HOBt和HBTU，溶于3mLDMF中，加入2-8当量的DIPEA，活化15分钟后，加入到500mg的氨化CPG中，室温振荡反应1小时；滤除反应液，用DMF、甲醇和DCM各5mL依次洗涤树脂三次，充分干燥；茚三酮检测反应完成，用醋酸酐封闭未反应的氨基，用DMF、甲醇和DCM各5mL依次洗涤树脂三次，充分干燥；取1-3mgCPG，加入5mL10%对甲苯磺酸的乙腈溶液，定容后测定507nm的吸光值；
B.在衍生化CPG上合成肽
将步骤A中衍生化的CPG用5%三氯乙酸处理3分钟脱去DMT，用甲醇，DCM冲洗，干燥；按照Fmoc或者Boc方法，用脱除DMT的上述树脂合成目标多肽序列，并用适当试剂脱除序列末端氨基上的保护基；
C.链接基偶联到肽基树脂上
将2-8当量的式(V)、HOBt和HBTU，溶于5mLDMF中，加入2-8当量的DIPEA，活化15分钟后，加入到步骤B所得到的CPG中，室温振荡反应1小时；滤除反应液，用DMF、甲醇和DCM依次洗涤树脂，充分干燥；茚三酮检测反应完成，用醋酸酐封闭未反应的氨基，用DMF、甲醇和DCM依次洗涤树脂，充分干燥；取1-3mg树脂，用5%二氯乙酸的DCM溶液脱除DMT测定载量；达到寡核苷酸合成载量要求即可；取5-10mg上述CPG树脂，用5%TFA的二氯甲烷溶液脱除DMT保护，可加入适量浓氨水，55°C进行切割、脱保护10小时，浓缩后HPLC纯化，收集产物峰，冷冻干燥；
D.缀合物的合成
步骤C得到的已连接上肽序列的CPG，在ABI 381A型DNA合成仪上用标准亚磷酰胺法合成指定的寡聚核苷酸序列；合成规模为1μM，得到DMT-ON序列，合成序列；经DMT检测，每步偶联效率在98%以上；合成结束后，取出CPG，置于耐压小瓶中，55℃下用浓氨水切割及脱保护10h，得到的DMT-ON缀合物用OPC(Applied Biosystem)纯化，浓缩后HPLC纯化；纯化的DMT-ON缀合物用OPC柱脱DMT；脱DMT的缀合物的质量用HPLC进行控制，纯度大于95%。
4.权利要求1所述的肽-链接基-缀合物作为研究反义寡核苷酸与小干扰RNA机理的分子生物学工具的应用。
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