CN101897293A - 一种利用分子标记进行国兰杂交育种的方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用分子标记进行国兰杂交育种的方法，属于生物育种技术领域。其特点是按以下步骤实施杂交育种：采用CTAB法提取国兰DNA基因组，筛选引物，选定杂交亲本，培育所选择亲本着花，取亲本花药粉，进行人工授粉，培育授粉后的亲本至发育的果荚成熟。其积极效果是：为人工选育国兰的品种创造出崭新途径；而不必要再从野生植株中选择。本方法可以大大提高亲本选择效率，加快育种进程，促进国兰种质资源的创新。本发明的ISSR标记技术具有多态性水平高，操作简单，重复性好和稳定性高等特点，能够检测出丰富的遗传多样性，且可以在分子水平上，比较直观的选择遗传距离合适，表现型良好的杂交亲本，以提高杂交的成功率。
Description
技术领域
属于生物育种技术领域，确切地说是涉及一种利用分子标记进行国兰杂交育种的方法。
背景技术
兰属(Cymbidium)是兰科(Orchidaceae)植物中最早引入栽培的属之一。国兰狭义地指兰属中的五种地生种：春兰Spring Orchid(C.goeringii)、建兰AutumnOrchid(C.ensifolium)、寒兰Winter Orchid(C.hanran)、墨兰Dark Orchid(C.sinense)和惠兰Fragrant Orchid(C.faberi)，其香气馥郁、色泽淡雅，花姿秀美，叶态飘逸。
我国具有非常丰富的国兰原生种和栽培品种，其种质资源相当丰富，蕴藏有极为丰富的优良基因，但在新品种培育中尚未得到开发利用。目前，对于国兰的研究主要集中在快速繁殖方面，利用茎尖、茎段、花梗、叶片、花瓣、根段等作为外植体进行组织培养的研究有较多的文献资料，而杂交育种工作国内的报告很少，几乎没有开展。目前，国兰的品种培育仍然主要依靠从野生植株中选择的传统观念和做法，兰花的人工新品种培育工作一直没能得到应有的重视，人工培育的具有经济价值的新品种则少之又少，在花卉新品种的培育中(包括农林园艺的其它作物)很少有像国兰这样仍从野生变异中选择品种的做法，国兰新品种培育的道路应当是宽广的。
杂交育种是培育兰花新品种最重要的方法，兰花在种内或种间，甚至与其他兰属植物进行杂交都可能获得杂交后代。传统国兰在花色、瓣型、香味方面具有极大的优势，通过杂交将这些优良基因转入到国兰的新品种中来，必定能培育出优秀的国兰新品种。从长远来看，兰属内的广泛杂交育种必然会出现。
发明内容
本发明的目的是提供可以大大提高亲本选择效率，加快育种进程，促进国兰种质资源创新的一种利用分子标记进行国兰杂交育种的方法。
本发明采取的技术方案：
按以下步骤实施杂交育种：
(1)采用CTAB法提取国兰DNA基因组；
(2)筛选国兰ISSR引物；
(3)用筛选出的引物由PCR扩增国兰杂交亲本；
(4)待选杂交亲本亲缘关系聚类分析；
(5)结合待选杂交亲本形态表现和亲缘关系选定杂交亲本，制定杂交策略；
(6)培育亲本着花，采收父本花粉，与母本人工授粉；
(7)培育授粉后的胚珠至发育的果荚成熟。
实施本发明后的积极效果是：
为人工选育国兰的品种创造出崭新途径；而不必要再从野生植株中选择。本方法可以大大提高亲本选择效率，加快育种进程，促进国兰种质资源的创新。本发明的ISSR标记技术具有多态性水平高，操作简单，重复性好和稳定性高等特点，能够检测出丰富的遗传多样性。且可以在分子水平上，比较直观的选择遗传距离合适，表现型良好的杂交亲本，以提高杂交的成功率。
具体实施方式
现对本发明作进一步说明
按以下步骤实施杂交育种：
(1)采用CTAB法提取国兰DNA基因组；
(2)筛选国兰ISSR引物；
(3)用筛选出的引物由PCR扩增国兰杂交亲本；
(4)待选杂交亲本亲缘关系聚类分析；
(5)结合待选杂交亲本形态表现和亲缘关系选定杂交亲本，制定杂交策略；
(6)培育亲本着花，采收父本花粉，与母本人工授粉；
(7)培育授粉后的胚珠至发育的果荚成熟。
1.所述的CTAB(Cetyltrimrthyl ammonium-bromide，十六烷基三甲基溴化铵)法提取国兰DNA基因组，其步骤是：
1)称取供试国兰幼嫩叶片50mg，在液氮中研磨三至四次，将粉末放入2ml离心管，加入800μl 2×CTAB提取缓冲液于其中，65℃水浴约1小时，每隔15分钟颠倒混匀数次，以使其充***解；
2)待样品冷却到室温加入氯仿∶异戊醇为24∶1的溶液800μl，颠倒混匀，12000rpm离心15min；
3)取上清液到新的2ml离心管中，加入等体积的氯仿∶异戊醇为24∶1的溶液，上下颠倒混匀，12000rpm离心15min；
4)第二次取上清液到新的2ml离心管中，加入等体积的异戊醇，颠倒混匀后，-20℃静置，沉淀30min；12000rmp离心15min，去上清液；
5)500μl75％乙醇洗涤沉淀，12000rmp离心10min，洗涤两次；
6)去上清液，室温晾干，无残留乙醇，加入约100μl灭菌水溶解DNA；
7)0.8％琼脂糖电泳检测。
2、所述的由PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)扩增国兰杂交亲本是在PCR仪上进行PCR扩增反应，反应体系共20μl，包括10×Buffer(含20mmol mg2+)2μl、1.0mmol/LdNTP、1.2U Taq polymerase、1.5μmol/LISSR引物、模版100ng，用ddH2O补齐20μl；所述的PCR扩增反应是由PCR扩增程序实现，所述的PCR扩增程序是：94℃预变性360s，然后94℃变性70s，52℃退火复性50s，72℃延伸70s，40个循环；72℃延伸420s，4℃终止反应；PCR产物在含有0.5μg/mL EB的2.0％琼脂糖凝胶中电泳1h，通过凝胶成像***获取电泳凝胶图像，进行拍照分析；引物807、811、812、825、827、835、840、862、866、880用于上述反应体系，扩增出的条带清晰，多态性高。
3、所述的待选杂交亲本亲缘关系聚类分析，是利用ISSR(Inter-Simple SequenceRepeat)分子标记结果，分析亲本之间的亲缘关系，采用人工读带，同一引物、同一位点按其扩增产物的有表示为(1)，无表示为(0)得到二元资料，形成0、1矩阵，利用NTSYS统计软件的UPGMA法构建不同种之间的分子***树，并计算种间的遗传相似系数；根据杂交亲本的形态表现及育种目标，选定抗逆性强、观赏性高、适应性广且亲缘关系较近的品种作为亲本。
4、所述的培育所选择亲本着花，是在新生苗的终止叶出现后但尚未完全展开之前，将氮∶磷∶钾(N∶P∶K)比例为7∶9∶16的花宝一号按照1∶1000比例溶于水，从兰花根部施浇，每周一次，并在兰花耐受范围之内，在白天保证足够的光照并增加昼夜温差，促进花芽分化。
花芽分化后，将氮∶磷∶钾(N∶P∶K)比例为25∶5∶20的花宝四号按照1∶1000比例溶于水之后，从兰花根部施浇，每周一次直至着花。
5、所述的与母本人工授粉，起步骤是：所选亲本开花后1-2天，在晴天上午进行，轻轻拨掉药帽，再用干净镊子将雄花花粉块送入雌花合蕊柱分泌粘液的药腔内。
实施案例：
实验材料：供试材料为收集到的野生春兰、寒兰、建兰、墨兰和寒兰五种国兰，共38个品种，并分别编号。
1.国兰总DNA的提取
采用CTAB法按照以下步骤提取国兰DNA基因组并进行电泳检测，称取38种供试国兰幼嫩叶片各50mg，在液氮中研磨三至四次，将粉末放入2ml离心管，加入800μl 2×CTAB提取缓冲液于其中，65℃水浴约1小时，其间混匀数次，以使其充***解；待样品冷却到室温加入氯仿∶异戊醇为24∶1的溶液800μl，颠倒混匀，12000rpm离心15min；取上清液到新的2ml离心管中，加入等体积的氯仿∶异戊醇为24∶1的溶液，上下颠倒混匀，12000rpm离心15min；第二次取上清液到新的2ml离心管中，加入等体积的异戊醇，颠倒混匀后，-20℃静置、沉淀30min；12000rmp离心15min，去上清液；500μl75％乙醇洗涤沉淀，12000rmp离心10min，洗涤两次；去上清液，室温晾干，无残留乙醇，加入约100μl灭菌水溶解DNA。
2.ISSR引物筛选
选择2种国兰DNA，对100种ISSR引物进行扩增筛选，反应体系共20μl，包括10×Buffer(含20mmol mg2+)2μl、1.0mmol/LdNTP、1.2U Taq polymerase、1.5μmol/LISSR引物、模版100ng，用ddH2O补齐20μl。
PCR扩增程序是：94℃预变性360s，然后94℃变性70s，52℃退火复性50s，72℃延伸70s，40个循环；72℃延伸420s，4℃终止反应；PCR产物在含有0.5μg/mL EB的2.0％琼脂糖凝胶中电泳1h，通过凝胶成像***获取电泳凝胶图像，进行拍照分析。
引物807、811、812、825、827、835、840、862、866、880用于上述ISSR-PCR体系，扩增出的条带清晰，多态性高。
3.38种国兰杂交亲本的PCR扩增
用筛选出的10条ISSR引物对38种国兰进行扩增，PCR反应产物在含有0.5μg/mL EB的2.0％琼脂糖凝胶中电泳1h，电泳缓冲液为1×TAE，用DGL2000DNA Marker做分子量标记，通过FR-200A全自动紫外与可见分析装置获取电泳凝胶图像，进行拍照分析。
4.国兰杂交亲本的亲缘关系聚类分析
对待选杂交亲本亲缘关系进行聚类分析，是利用ISSR分子标记结果，分析亲本之间的亲缘关系，采用人工读带，同一引物、同一位点按其扩增产物的有表示为(1)，无表示为(0)得到二元资料，形成0、1矩阵，利用NTSYS统计软件的UPGMA法构建不同种之间的分子***树，并计算种间的遗传相似系数。
5.杂交策略的制定
根据聚类结果，来自浙江的下山春兰(与来自福建的下山墨兰在遗传相似系数为0.67处聚在一起，说明两者亲缘关系较近，理论上推测两者杂交获得优势植株的潜力较大。浙江下山春兰花萼片宽大，花朵呈荷瓣型，香气馥郁，福建的下山墨兰的花序上生长12朵花，如果以它们作为亲本杂交，可以定向培育花大且花多的新品种。
6.培育待选亲本着花
在新生苗的终止叶出现后但尚未完全展开之前，将氮∶磷∶钾比例为7∶9∶16的花宝一号按照1∶1000比例溶于水，从兰花根部施浇，每周一次，并在兰花耐受范围之内，在白天保证足够的光照并增加昼夜温差，促进花芽分化；
花芽分化后，将氮∶磷∶钾比例为25∶5∶20的花宝四号按照1∶1000比例溶于水之后，从兰花根部施浇，每周一次直至着花。
7.人工授粉，培育受精胚珠至果荚成熟
所选亲本开花后1-2天，在晴天上午进行，轻轻拨掉药帽，再用干净镊子将雄花花粉块送入雌花合蕊柱分泌粘液的药腔内。
经过几个月的栽培管理，已经获得了杂交果实。采用ISSR分子标记进行国兰杂交育种，可以避免杂交亲本选择的盲目性，提高了杂交的成功率，提高了获得优势植株的可能性，同时可以避免盲目的杂交行为，从而大大减少了杂交亲本的选择的时间以及杂交后代优势植株筛选过程中的人力物力。
Claims (6)
1.一种利用分子标记进行国兰杂交育种的方法，其特征是：
按以下步骤实施杂交育种：
(1)采用CTAB法提取国兰DNA基因组；
(2)筛选国兰ISSR引物；
(3)用筛选出的引物由PCR扩增国兰杂交亲本；
(4)待选杂交亲本亲缘关系聚类分析；
(5)结合待选杂交亲本形态表现和亲缘关系选定杂交亲本，制定杂交策略；
(6)培育亲本着花，采收父本花粉，与母本人工授粉；
(7)培育授粉后的胚珠至发育的果荚成熟。
2.根据权利要求1所述的一种利用分子标记进行国兰杂交育种的方法，其特征是：所述的CTAB法提取国兰DNA基因组，其步骤是：
1)称取供试国兰幼嫩叶片50mg，在液氮中研磨三至四次，将粉末放入2ml离心管，加入800μl 2×CTAB提取缓冲液于其中，65℃水浴约1小时，每隔15分种颠倒混匀数次；
2)待样品冷却到室温加入氯仿∶异戊醇为24∶1的溶液800μl，颠倒混匀，12000rpm离心15min；
3)取上清液到新的2ml离心管中，加入等体积的氯仿∶异戊醇为24∶1的溶液，上下颠倒混匀，12000rpm离心15min；
4)第二次取上清液到新的2ml离心管中，加入等体积的异戊醇，颠倒混匀后，-20℃静置，沉淀30min；12000rmp离心15min，去上清液；
5)500μl75％乙醇洗涤沉淀，12000rmp离心10min，洗涤两次；
6)去上清液，室温晾干，无残留乙醇，加入约100μl灭菌水溶解DNA；
7)0.8％琼脂糖电泳检测。
3.根据权利要求1所述的一种利用分子标记进行国兰杂交育种的方法，其特征是：
所述的由PCR扩增国兰杂交亲本是在PCR仪上进行PCR扩增反应，反应体系共20μl，包括10×Buffer 2μl、1.0mmol/L dNTP、1.2U Taq polymerase、1.5μmol/LISSR引物、模版100ng，用ddH2O补齐20μl；所述的PCR扩增反应是由PCR扩增程序实现，所述的PCR扩增程序是：94℃预变性360s，然后94℃变性70s，52℃退火复性50s，72℃延伸70s，40个循环；72℃延伸420s，4℃终止反应；PCR产物在含有0.5μg/mL EB的2.0％琼脂糖凝胶中电泳1h，通过凝胶成像***获取电泳凝胶图像，进行拍照分析；引物807、811、812、825、827、835、840、862、866、880用于上述ISSR-PCR体系，扩增出的条带清晰，多态性高。
4.根据权利要求1所述的一种利用分子标记进行国兰杂交育种的方法，其特征是：
所述的待选杂交亲本亲缘关系聚类分析，是利用ISSR分子标记结果，分析亲本之间的亲缘关系，采用人工读带，同一引物、同一位点按其扩增产物的有表示为(1)，无表示为(0)得到二元资料，形成0、1矩阵，利用NTSYS统计软件的UPGMA法构建不同种之间的分子***树，并计算种间的遗传相似系数；根据杂交亲本的形态表现及育种目标，选定抗逆性强、观赏性高、适应性广且亲缘关系较近的品种作为亲本。
5.根据权利要求1所述的一种利用分子标记进行国兰杂交育种的方法，其特征是：
所述的培育亲本着花，是在新生苗的终止叶出现后但尚未完全展开之前，将氮∶磷∶钾比例为7∶9∶16的花肥按照1∶1000比例溶于水，从兰花根部施浇，每周一次，并在兰花耐受范围之内，在白天保证足够的光照并增加昼夜温差，促进花芽分化；
花芽分化后，将氮∶磷∶钾比例为25∶5∶20的花肥按照1∶1000比例溶于水之后，从兰花根部施浇，每周一次直至着花。
6.根据权利要求1所述的一种利用分子标记进行国兰杂交育种的方法，其特征是：
所述的与母本人工授粉，其步骤是：所选亲本开花后1-2天，在晴天上午进行，轻轻拨掉药帽，再用干净镊子将雄花花粉块送入雌花合蕊柱分泌粘液的药腔内。
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