CN101892308B - 用于检测苹果褐斑病菌的特异扩增引物及检测方法 - Google Patents

用于检测苹果褐斑病菌的特异扩增引物及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测苹果褐斑病的特异扩增引物，利用特异性引物快速获取苹果褐斑病基因片段的方法，避免了病原菌分离困难给实际研究带来的障碍。还公开了利用该特异扩增引物对苹果褐斑病菌快速分子检测方法：先采集田间发病叶片，用灭过菌的昆虫针将苹果褐斑病分生孢子盘挑置于白色纸片；再配制PCR反应体系；然后将分生孢子盘转至装有PCR反应体系的PCR扩增小管中，离心，使分生孢子盘完全浸没于配制的PCR反应体系中；最后进行PCR扩增并对扩增物进行检测。本发明通过改变PCR扩增反应体系和扩增程序，就可以达到直接对病原菌目标片段的扩增目的。避免了对病原菌的分离及DNA的另外提取，缩短了实验流程，提高了检测效率。

Description

用于检测苹果褐斑病菌的特异扩增引物及检测方法
技术领域
本发明属于分子生物技术领域，涉及一种用于检测苹果褐斑病菌的特异扩增引物，还涉及利用该特异扩增引物对苹果褐斑病菌的快速分子检测方法。
背景技术
苹果褐斑病Marssonina coronaria (Ellis & J.J. Davis) J. J. Davis，异名 M. mali (Henn.) S. Ito（有性世代Diplocarpon mali Harada & Sawamura）是引起苹果树早期落叶的主要病害之一。苹果褐斑病不但危害叶片、叶柄，还引起贮藏期苹果果实发病，进而对苹果的产量和品质造成严重影响。近几年，此病害有逐年加重趋势，越来越多的受到人们的重视。
准确掌握病原的生物学特点，通过分子生物学方法揭示病原菌的遗传特性，对探索合理有效的防治方法显得尤为重要。快速检测区分苹果褐斑病病菌并对其深入研究也是重要的一方面，一般病菌分子检测主要经过样本的采集、目标菌的分离培养、提取菌体DNA、然后用引物对提取的DNA进行扩增检测并测序比对。此方法历时较长，并且检测程序复杂，有时利用试剂盒提取DNA费用也较高。另外，由于苹果褐斑病病原菌分离物在一般人工培养基上生长极其缓慢，生长过程极易受到杂菌污染，分离极其困难，这给进行分子生物学特性的研究造成了很大的阻碍，所以导致目前这方面的研究还处于探索阶段。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测苹果褐斑病的特异扩增引物，利用特异性引物快速获取苹果褐斑病基因片段的方法，避免由于病原菌分离困难给实际研究带来的障碍。
本发明的另一个目的是提供一种利用该特异扩增引物对苹果褐斑病菌进行快速分子检测的方法，解决了现有技术检测病菌流程长、检测效率低，检测成本高的问题。
本发明所采用的技术方案是，一种用于检测苹果褐斑病菌的特异扩增引物，其特征在于：
上游引物P1：5ˊ- TCCCTGTTGGTTTCTTTTCCTCC -3ˊ，
下游引物P2：5ˊ- ACTCTTTGTGTGAATAACGTGATGT -3ˊ；
本发明所采用的另一个技术方案是，利用上述特异扩增引物对苹果褐斑病菌快速分子检测方法，包括以下操作步骤：
步骤1，
采集田间发病叶片，清洗晾干后，用灭过菌的昆虫针将苹果褐斑病分生孢子盘挑置于白色纸片备用；
步骤2，配制PCR反应体系： 
10×Taq Buffer          6μL 
DNTP                 0.2mM
P1                    1μM
P2                    1μM
Taq DNA聚合酶       1U
Mg2+ 浓度              1.75mM
DTT浓度             1.25mM
加灭菌超纯水将反应体系补至50μL；
其中，P1 和P2是根据苹果褐斑病病原菌DNA的序列设计的一对特异扩增引物，上游引物P1：5ˊ- TCCCTGTTGGTTTCTTTTCCTCC -3ˊ，下游引物P2：5ˊ- ACTCTTTGTGTGAATAACGTGATGT -3ˊ；
步骤3，模板的加入：
用灭过菌的昆虫针将纸片上的分生孢子盘转至装有PCR反应体系的PCR扩增小管中，每管保证1～2个分生孢子盘；将加入分生孢子盘的PCR管离心，使分生孢子盘完全浸没于配制的PCR反应体系中；
步骤4，进行PCR扩增：
反应程序设置为：94℃预变性5min；接下来94℃预变性1min、48℃变性1min、72℃退火延伸1min，如此进行5个循环；然后94℃预变性1min、53℃变性1min、72℃退火延伸1min，如此进行35个循环；最后在72℃延伸8min，并于4℃保存扩增样品；
步骤5，PCR扩增产物的检测：
先将PCR扩增产物进行电泳检测，再将电泳结束的胶块染色、显色，最后照相，分析结果。 
其中，步骤5中PCR扩增产物是以浓度为6%的聚丙烯酰胺电泳检测的。
其中，步骤5中将电泳结束的胶块经浓度为1%硝酸银溶液染色20min，再经过显影液显色反应辨识条带情况，然后通过凝胶成像仪照相，如果出现400bp的条带，通过对扩增产物测序，将测序结果序列和已提交的基因库序列进行比对，判断是否为苹果褐斑病基因序列。
本发明的有益效果是，通过改变PCR扩增反应体系和扩增程序，将微量菌体直接加入PCR反应体系代替提取的DNA模板的方法，就可以达到直接对病原菌目标片段的扩增目的。此技术避免了对病原菌的分离及DNA的另外提取，大大缩短了实验流程，提高了检测效率，节约了成本。并且直接利用田间发病叶片上的病原菌扩增出病菌目标片段的方法，避免了因病原菌分离困难给实际研究带来的限制。另外，利用特异引物对苹果褐斑病病原菌直接进行PCR扩增，大大提高了对病原菌的鉴定效率，也为进一步研究其分子生物学特性提供了便利。通过专门设计的特异引物，可以完成对苹果叶片褐斑病病原菌与月季、杨树褐斑病病原菌及苹果常见病害的鉴定区分，并利用微量菌体快速扩增出苹果褐斑病菌的目标片段。
附图说明
图1是实施例1中PCR扩增产物通过电泳染色后的图像；
图2是实施例2中PCR扩增产物通过电泳染色后的图像；
图3是实施例3中PCR扩增产物通过电泳染色后的图像。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
实施例1
2007年7月份对陕西白水县苹果褐斑病采集标本进行扩增，具体操作步骤如下：
步骤1
选取果园发病叶片，清洗晾干后，用灭过菌的昆虫针在体式显微镜下挑取分生孢子盘并分别转至经过灭菌处理的白色纸片备用；
步骤2，按照如下体系配制4份PCR反应体系：
10×Taq Buffer          6μL 
DNTP                 0.2mM
P1                    1μM
P2                    1μM
Taq DNA聚合酶       1U
Mg2+ 浓度              1.75mM
DTT浓度             1.25mM
加灭菌超纯水将反应体系补至50μL；
其中，P1 和P2是根据苹果褐斑病病原菌DNA的序列，利用primer5.0软件设计针对该病菌的一对特异扩增引物，
上游引物P1：5ˊ- TCCCTGTTGGTTTCTTTTCCTCC -3ˊ，
下游引物P2：5ˊ- ACTCTTTGTGTGAATAACGTGATGT -3ˊ；
步骤3，模板的加入：
将4份PCR反应体系分别装至4个PCR扩增小管中，用灭过菌的昆虫针将纸片上的分生孢子盘分别转至其中3支PCR扩增小管中，另外1支小管作为对照，并做好标记；每管保证1～2个分生孢子盘。将加入分生孢子盘的PCR管在12000rpm条件下离心10秒，以便于分生孢子盘完全浸没于PCR反应体系中；
步骤4，按照如下程序进行PCR扩增，扩增仪为S1000TM Thermal cycler，反应程序设置为：
先  ① 94℃预变性5min；
再  ② 94℃预变性1min，
③ 48℃变性1min，
④ 72℃退火延伸1min，
重复②、③、④步骤进行5个循环；
然后⑤ 94℃预变性1min，
⑥ 53℃变性1min，
⑦ 72℃退火延伸1min，
重复⑤、⑥、⑦步骤进行35个循环；
最后在72℃延伸8min，并于4℃保存扩增样品。
    步骤5，PCR扩增产物检测：
先将PCR扩增产物以45mL浓度为6%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，再将电泳结束的胶块经浓度为1%硝酸银溶液染色20min，将胶块用双蒸水清洗两次后，放入400mL显影液中，显色反应辨识条带情况，然后通过凝胶成像仪照相，如图1所示：其中，1道为Marker2000，2道为对照，3、4、5道为采集不同地点苹果褐斑病标本样。
其中，45mL浓度为6%的聚丙烯酰胺胶液由以下组份配制：9mL体积浓度为30%的聚丙烯酰胺，4.5mL的10×TBE Buffer电泳缓冲液，0.6mL体积浓度为10%的过硫酸铵，0.055mL的TEMEP，31.5mL的ddH2O；
9mL 体积浓度为30%的聚丙烯酰胺按照丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺按照体积比为29：1进行配制的；
10×TBE Buffer 电解缓冲液由108.0g 的Tris．base、9.3g 的EDTA-Na2、55g的硼酸充分溶解并定容至1L于4℃保存。
400mL显影液为NaOH与甲醛的混合溶液，其中NaOH的质量浓度为1.5%，甲醛的体积浓度为0.2%，溶剂为双蒸水。 
根据扩增检测结果可知，在400bp出现一明显主带，证明设计的特异性引物对苹果褐斑病病原菌具有扩增功能，达到对目的片段快速扩增目的。
实施例2
2008年8月份对陕西杨凌采集的苹果、月季、杨树褐斑病病菌扩增，具体步骤如下：
步骤1
采集的苹果、月季、杨树发病叶片，清洗晾干后，用灭过菌的昆虫针在体式显微镜下挑取分生孢子盘并分别转至经过灭菌处理的白色纸片备用；
步骤2，配制13份PCR反应体系：
10×Taq Buffer          6μL 
DNTP                 0.2mM
P1                    1μM
P2                    1μM
Taq DNA聚合酶       1U
Mg2+ 浓度              1.75mM
DTT浓度             1.25mM
加灭菌超纯水将反应体系补至50μL；
其中，P1 和P2是根据苹果褐斑病病原菌DNA的序列设计的一对特异扩增引物，上游引物P1：5ˊ- TCCCTGTTGGTTTCTTTTCCTCC -3ˊ，下游引物P2：5ˊ- ACTCTTTGTGTGAATAACGTGATGT -3ˊ；
步骤3，模板的加入：
将13份PCR反应体系分别装至13个PCR扩增小管中；用灭过菌的昆虫针将纸片上的分生孢子盘分别转至其中12支PCR扩增小管中，每种病菌类别设四个重复，做好标记；另外1支小管作为对照，做好标记；每管保证1～2个分生孢子盘，将加入分生孢子盘的PCR管在12000rpm条件下离心10秒，以便于分生孢子盘完全浸没于PCR反应体系中。
步骤4，进行PCR扩增：
先  ① 94℃预变性5min；
再  ② 94℃预变性1min，
③ 48℃变性1min，
④ 72℃退火延伸1min，
重复②、③、④步骤进行5个循环；
然后⑤ 94℃预变性1min，
⑥ 53℃变性1min，
⑦ 72℃退火延伸1min，
重复⑤、⑥、⑦步骤进行35个循环；
最后在72℃延伸8min，并于4℃保存扩增样品。
步骤5，PCR扩增产物检测：
先将PCR扩增产物以45mL浓度为6%聚丙烯酰胺电泳检测，再将电泳结束的胶块经浓度为1%硝酸银溶液染色20 min，再经过400mL 显影液，显色反应辨识条带情况，最后通过凝胶成像仪照相，如图2所示：其中1道为Marker2000，2道为对照，3—6道为苹果褐斑病，7—10道为杨树褐斑病，11—14道为月季褐斑病；
其中，45mL浓度为6%的聚丙烯酰胺胶液由以下组份配制：9mL体积浓度为30%的聚丙烯酰胺，4.5mL的10×TBE Buffer电泳缓冲液，0.6mL体积浓度为10%的过硫酸铵，0.055mL的TEMEP，31.5mL的ddH2O；
9mL 体积浓度为30%的聚丙烯酰胺按照丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺按照体积比为29：1进行配制的；
10×TBE Buffer电解缓冲液由108.0g 的Tris．base、9.3g 的EDTA-Na2、55g的硼酸充分溶解并定容至1L于4℃保存。
400mL显影液为NaOH与甲醛的混合溶液，其中NaOH的质量浓度为1.5%，甲醛的体积浓度为0.2%，溶剂为双蒸水。 
结论：通过对苹果褐斑病、杨树褐斑病、月季褐斑病病菌的扩增表明，在400bp出现一明显主带，证明设计的特异性引物能够有效对苹果褐斑病病菌进行扩增，达到快速准确的鉴别与对目标片段扩增的目的。
实施例3
选取苹果褐斑病、轮纹、炭疽、斑点病这些苹果常见病害病菌作扩增比较具体步骤如下：
 步骤1，
选取采集的苹果褐斑病叶片、苹果轮纹病害、苹果炭疽病病害、苹果斑点落叶病这些苹果常见病害标本，用灭过菌的昆虫针在体式显微镜下挑取病害部位菌体并分别转至经过灭菌处理的白色纸片备用。
步骤2，配制13份PCR反应体系：
10×Taq Buffer          6μL 
DNTP                 0.2mM
P1                    1μM
P2                    1μM
Taq DNA聚合酶       1U
Mg2+ 浓度              1.75mM
DTT浓度             1.25mM
加灭菌超纯水将反应体系补至50μL；
其中，P1 和P2是根据苹果褐斑病病原菌DNA的序列设计的一对特异扩增引物，上游引物P1：5ˊ- TCCCTGTTGGTTTCTTTTCCTCC -3ˊ，下游引物P2：5ˊ- ACTCTTTGTGTGAATAACGTGATGT -3ˊ；
步骤3，模板的加入：
将13份PCR反应体系分别装至13个PCR扩增小管中；用灭过菌的昆虫针将纸片上的分生孢子盘分别转至其中12支PCR扩增小管中，每种病菌类别设三个重复，做好标记；另外1支小管作为对照，做好标记；每管保证1～2个分生孢子盘，将加入分生孢子盘的PCR管在12000rpm条件下离心10秒，以便于分生孢子盘完全浸没于PCR反应体系中。
步骤4，进行PCR扩增：
先  ① 94℃预变性5min；
再  ② 94℃预变性1min，
③ 48℃变性1min，
④ 72℃退火延伸1min，
重复②、③、④步骤进行5个循环；
然后⑤ 94℃预变性1min，
⑥ 53℃变性1min，
⑦ 72℃退火延伸1min，
重复⑤、⑥、⑦步骤进行35个循环；
最后在72℃延伸8min，并于4℃保存扩增样品。
步骤5，PCR扩增产物检测：
先将PCR扩增产物以45mL浓度为6%聚丙烯酰胺电泳检测，再将电泳结束的胶块经浓度为1%硝酸银溶液染色20 min，再经过400mL显影液显色反应辨识条带情况，然后通过凝胶成像仪照相，如图3所示：1道为Marker2000，2道为对照，3、4、5道为苹果炭疽病，6、7、8道为苹果褐斑病，9、10、11道为苹果轮纹病，12、13、14道为苹果斑点落叶病。
其中，45mL浓度为6%的聚丙烯酰胺胶液由以下组份配制：9mL体积浓度为30%的聚丙烯酰胺，4.5mL的10×TBE Buffer电泳缓冲液，0.6mL体积浓度为10%的过硫酸铵，0.055mL的TEMEP，31.5mL的ddH2O。
9mL 体积浓度为30%的聚丙烯酰胺按照丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺按照体积比为29：1进行配制的。
10×TBE Buffer 电解缓冲液由108.0g 的Tris．base、9.3g 的EDTA-Na2、55g的硼酸充分溶解并定容至1L于4℃保存。
400mL显影液为NaOH与甲醛的混合溶液，其中NaOH的质量浓度为1.5%，甲醛的体积浓度为0.2%，溶剂为双蒸水。 
结论：通过对苹果常见病害的扩增结果表明，在400bp出现一明显主带，证明设计的特异性引物能够有效区分苹果褐斑病与苹果其他常见病害，达到对目标片段快速扩增的目的。 
SEQUENCE  LISTING
<110>  西北农林科技大学
<120>  用于检测苹果褐斑病菌的特异扩增引物及检测方法
<130>  无
<160>  2     
<170>  PatentIn  version 3.3
<210>  1
<211>  23
<212>  DNA
<213>  苹果盘二孢(Marssonina  coronaria)
<400>  1
tccctgttgg  tttcttttcc  tcc             23
<210>  2
<211>  25
<212>  DNA
<213>  苹果盘二孢(Marssonina coronaria)
<400>  2
actctttgtg  tgaataacgt  gatgt          25

Claims (4)

1.一种用于检测苹果褐斑病菌的特异扩增引物，其特征在于：
上游引物P1：5ˊ- TCCCTGTTGGTTTCTTTTCCTCC -3ˊ，
下游引物P2：5ˊ- ACTCTTTGTGTGAATAACGTGATGT -3ˊ。
2.一种利用权利要求1所述特异扩增引物对苹果褐斑病菌进行检测的方法，其特征在于：包括以下操作步骤：
步骤1，
采集田间发病叶片，清洗晾干后，用灭过菌的昆虫针将苹果褐斑病分生孢子盘挑置于白色纸片备用；
步骤2，配制PCR反应体系： 
10×Taq Buffer           6μL 
dNTP                      0.2mM
P1                          1μM
P2                          1μM
Taq DNA聚合酶       1U
Mg2+ 浓度                1.75mM
DTT浓度                1.25mM
加灭菌超纯水将反应体系补至50μL；
其中，P1 和P2是根据苹果褐斑病病原菌DNA的序列设计的一对特异扩增引物，上游引物P1：5ˊ- TCCCTGTTGGTTTCTTTTCCTCC -3ˊ，下游引物P2：5ˊ- ACTCTTTGTGTGAATAACGTGATGT -3ˊ；
步骤3，模板的加入：
用灭过菌的昆虫针将纸片上的分生孢子盘转至装有PCR反应体系的PCR扩增小管中，每管保证1～2个分生孢子盘；将加入分生孢子盘的PCR管离心，使分生孢子盘完全浸没于配制的PCR反应体系中；
步骤4，进行PCR扩增：
反应程序设置为：94℃预变性5min；接下来94℃预变性1min、48℃变性1min、72℃退火延伸1min，如此进行5个循环；然后94℃预变性1min、53℃变性1min、72℃退火延伸1min，如此进行35个循环；最后在72℃延伸8min，并于4℃保存扩增样品；
步骤5，PCR扩增产物的检测：
先将PCR扩增产物进行电泳检测，再将电泳结束的胶块染色、显色，最后照相，分析结果。 
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述步骤5中PCR扩增产物是以浓度为6%的聚丙烯酰胺电泳检测的。
4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述步骤5中将电泳结束的胶块经浓度为1%硝酸银溶液染色20min，再经过显影液显色反应辨识条带情况，然后通过凝胶成像仪照相，如果出现400bp的条带，通过对扩增产物测序，将测序结果序列和已提交的基因库序列进行比对，判断是否为苹果褐斑病基因序列。
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