CN101892226A - 一种抑制人脂肪细胞ACC基因表达的siRNA及其表达载体和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抑制人脂肪细胞ACC基因表达的siRNA及其表达载体和应用，其中公开了五个具有特异沉默人脂肪细胞的ACC基因表达的siRNA，并提供了能够表达产生所述siRNA的含脂肪细胞特异启动子的载体及其构建方法，并公开了所述siRNA在制备减肥药物中的应用和所述载体作为减肥药物的应用。由于所述载体能够特异性在人脂肪细胞中表达siRNA，从而抑制人脂肪细胞ACC基因的表达，并且对脂肪细胞有一定的凋亡效果，可以起到一定的减肥作用；并且使用该siRNA制备的减肥药物，具有高效快速、特异性强等特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种抑制人脂肪细胞ACC基因表达的siRNA，还涉及一种能够产生抑制人脂肪细胞ACC基因表达的siRNA的载体及其构建方法，同时还涉及所述siRNA在制备减肥药物中的应用和所述载体作为减肥药物的应用。
背景技术
过度肥胖不仅影响形体美，给生活带来不便，而且会引起一系列的疾病，减肥是当今社会过度肥胖患者的强烈需求。当前的减肥药物主要是一些化学合成的物质，或者从植物中提取的天然物质，效果都不是十分理想。
RNA干涉（RNA interference）技术是近几年发展起来的一种抑制基因表达的最有力的工具之一。此技术采用19-23个碱基或发夹状不同长度的双链RNA可使不同类型细胞的靶向基因表达明显降低，因此，RNAi技术可使基因敲除（knock-down）或使基因沉默（gene silencing）。这是一种典型的转录后基因调控方法，又称转录后基因沉默(PTGS，post-transcriptional gene silencing)。这种新兴的生物技术为疾病分子水平的治疗提供了新的技术和方法，在哺乳动物细胞中建立RNA干涉技术，可以用于研究某些特定基因的功能，从而可以解决某些疾病的发病机制，同时对疾病尤其是对肿瘤的治疗也有一定的应用价值，并且RNA干涉技术所使用的剂量仅为反义寡核苷酸剂量的万分之一左右。另一方面，若小双链RNA中改变1个核苷酸，就可使该RNAi靶向基因沉默作用消失，这样，就有可能将这一技术用于抑制某些过度表达基因的表达，而不影响正常基因的表达，因此，利用RNA干扰技术制备基因药物将是一种有效的途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抑制人脂肪细胞ACC基因表达的siRNA。
本发明的目的还在于提供一种能够产生抑制人脂肪细胞ACC基因表达的siRNA的载体，以及所述载体的构建方法。
本发明的目的还在于提供一种抑制人脂肪细胞ACC基因表达的siRNA在制备减肥药物中的应用。
本发明的目的还在于提供一种能够产生抑制人脂肪细胞ACC基因表达的siRNA的载体作为减肥药物的应用。
本发明的技术方案如下：
一种抑制人脂肪细胞ACC基因表达的siRNA，所述的siRNA为小双链RNA，其正义链序列为序列表中SEQ NO.1、SEQ NO.2、SEQ NO.3、SEQ NO.4和SEQ NO.5中任意一个所对应的序列。
一种能够产生抑制人脂肪细胞ACC基因表达的siRNA的载体，所述载体能够表达产生双链的siRNA，并且在载体中引入了脂肪细胞特异启动子序列；所述的siRNA为小双链RNA，其正义链序列为序列表中SEQ NO.1、SEQ NO.2、SEQ NO.3、SEQ NO.4和SEQ NO.5中任意一个所对应的序列；所述的脂肪细胞特异启动子为过氧化物酶体增殖物激活受体γ2基因启动子。
一种能够产生抑制人脂肪细胞ACC基因表达的siRNA的载体的构建方法包括以下步骤
（1）脂肪细胞特异启动子序列的克隆
根据脂肪细胞特异启动子序列设计一对引物PP1和PP2，以人脂肪细胞提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物经凝胶电泳初步鉴定后，克隆至pMD18-T载体，并转化感受态细胞，将筛选得到阳性菌落提取质粒，使用特异引物和/或pMD18-T载体的通用引物进行PCR鉴定，PCR鉴定为阳性的重组质粒进一步测序验证，经验证正确的重组质粒即包含脂肪细胞特异启动子；所述的引物序列为
PP1：5ˊ-AGGAATTCAGCGCTGCATGCTGATACCAACGT-3ˊ;
PP2：5ˊ-CGGGATCCAACAGCATGGA ATA GGGGTTTGC-3ˊ；
（2）pSilencer 4.1- PPARγ2P-neo载体的构建
将验证正确的脂肪细胞特异启动子的PCR扩增产物双酶切，并用同样的酶双酶切pSilencer 4.1-CMV-neo 载体，回收目的片段，然后将回收的启动子序列与载体连接，并转化感受态细胞，将筛选得到阳性菌落提取质粒，进行双酶切验证，酶切验证为阳性的重组质粒进一步测序验证，将经验证正确的重组质粒命名为pSilencer 4.1- PPARγ2P-neo 载体；
（3）siRNA对应的DNA序列的合成
根据序列表中任何一个siRNA的正义链序列，设计其对应的DNA序列，序列两端引入酶切位点，所述DNA序列为两条单链，并且两条单链是一对互补序列，设计好的序列经合成后，通过退火形成双链DNA，退火反应采用常规方法即可；
（4）pSilencer 4.1- PPARγ2P-neo-DsiRNA载体的构建
将pSilencer 4.1- PPARγ2P-neo载体进行双酶切，所使用的两个酶与步骤（3）中双链DNA设计酶切位点时选用的酶相同，回收目的片段，然后将回收的载体与步骤（3）中形成的双链DNA序列连接，并转化感受态细胞，将筛选得到阳性菌落提取质粒，进行双酶切验证， 酶切验证为阳性的重组质粒进一步测序验证，将经验证正确的重组质粒命名为pSilencer 4.1- PPARγ2P-neo-DsiRNA 载体。
所述的siRNA对应的DNA序列如下
①正义链为SEQ NO.1的siRNA对应的DNA序列
正向序列为序列表中SEQ NO.6对应的序列，反向序列为序列表中SEQ NO.7对应的序列；
②正义链为SEQ NO.2的siRNA对应的DNA序列
正向序列为序列表中SEQ NO.8对应的序列，反向序列为序列表中SEQ NO.9对应的序列；
③正义链为SEQ NO.3的siRNA对应的DNA序列
正向序列为序列表中SEQ NO.10对应的序列，反向序列为序列表中SEQ NO.11对应的序列；
④正义链为SEQ NO.4的siRNA对应的DNA序列
正向序列为序列表中SEQ NO.12对应的序列，反向序列为序列表中SEQ NO.13对应的序列；
⑤正义链为SEQ NO.5的siRNA对应的DNA序列
正向序列为序列表中SEQ NO.14对应的序列，反向序列为序列表中SEQ NO.15对应的序列。
本发明的技术方案还在于采用了一种抑制人脂肪细胞ACC基因表达的siRNA在制备减肥药物中的应用，以及一种能够产生抑制人脂肪细胞ACC基因表达的siRNA的载体作为减肥药物的应用。
本发明的优势在于：本发明提供的siRNA能够抑制人脂肪细胞ACC基因的表达，并最终导致脂肪细胞的凋亡，对脂肪细胞有一定的凋亡效果，可以起到很好的减肥作用；本发明的载体含有脂肪细胞特异启动子，可以专一性地仅在脂肪细胞中发挥作用，且siRNA在基因沉默中也具有其特异性，因此采用特异的在脂肪细胞中表达siRNA的载体制备减肥药物，具有高效快速、特异性强等特点。
附图说明
图1为载体pSilencer 4.1-CMV-neo 的物理图谱；
图2为载体pSilencer 4.1- PPARγ2P-neo的物理图谱；
图3为载体pSilencer 4.1- PPARγ2P-neo-DsiRNA的物理图谱；
图4为siRNA表达载体对肥胖大鼠体重影响情况的折线图。
具体实施方式
下述实施例中所涉及的siRNA适用于5对针对ACC所设计的siRNA中的任意一对。本发明说明书中所举实例只是为了帮助理解本发明，它们不具有任何限制作用，即本发明除说明书所举实例外，还可以有其它实施方式，因此，凡是采用等同替换或等效变换形式形成的任何技术方案均在本发明要求的保护范围中。
本发明所使用的质粒载体pMD18-T购自宝生物（大连）工程公司，载体pSilencer 4.1-CMV-neo Vector（载体图谱如图1所示）购自Ambion（美国）公司，所使用的菌株E.coli DH5α购自天根生化科技(北京)有限公司，人前脂肪细胞（HPA-v）购自ScienCell Research Laboratories，人皮肤表皮细胞(HaCat)购自中南大学湘雅中心实验室，SD大鼠由新乡医学院动物中心提供，所使用的试剂均为市售商品。
实施例1
本实施例构建pSilencer 4.1- PPARγ2P-neo-DsiRNA-4载体的方法包括以下步骤：
（1）脂肪细胞特异启动子序列的克隆
根据过氧化物酶体增殖物激活受体γ2基因启动子序列 (NT_022517.18)（详见祝骥,马文丽,毛向明等.绿色荧光蛋白基因在脂肪细胞分化研究中的应用[J].第一军医大学学报, 2005,25(9): 1119-1123.）设计一对引物PP1和PP2，其中上游引物PP1引入EcoRI酶切位点，下游引物PP2引入BamHI酶切位点，引物序列如下：
PP1：5ˊ-AGGAATTCAGCGCTGCATGCTGATACCAACGT-3ˊ;
PP2：5ˊ-CGGGATCCAACAGCATGGA ATA GGGGTTTGC-3ˊ；
以人脂肪细胞提取的基因组DNA为模板进行常规PCR扩增，扩增产物长度为611bp，经凝胶电泳初步鉴定后，通过常规的酶切、连接方法克隆至pMD18-T载体，并转化E.coli DH5α菌株的感受态细胞，将筛选得到的阳性菌落提取质粒，使用特异引物（PP1和PP2）和pMD18-T载体的通用引物（SO100和SO101）进行PCR鉴定，PCR鉴定为阳性的重组质粒进一步测序验证，经验证正确的重组质粒即包含过氧化物酶体增殖物激活受体γ2基因启动子PPARγ2P；
（2）pSilencer 4.1- PPARγ2P-neo载体的构建
将验证正确的启动子PPARγ2P的PCR扩增产物使用EcoRI和BamHI进行双酶切，同时用EcoRI和BamHI双酶切pSilencer 4.1-CMV-neo 载体，回收目的片段，然后将回收的启动子序列与载体使用常规的连接体系和反应条件进行连接，并转化E.coli DH5α菌株的感受态细胞，将氨苄青霉素筛选得到的阳性菌落提取质粒，进行双酶切验证，酶切验证为阳性的重组质粒进一步测序验证，将经验证正确的重组质粒命名为pSilencer 4.1- PPARγ2P-neo 载体（质粒图谱如图2所示）；
（3）siRNA对应的DNA序列的合成
根据序列表中SEQ NO.4所述的siRNA正义链的序列，设计该siRNA对应的DNA序列如下：正向序列为序列表中SEQ NO.12对应的序列，反向序列为序列表中SEQ NO.13对应的序列，上述序列由生工生物工程（上海）有限公司合成；所述的DNA序列具有以下特点：正反向序列是一对互补序列，这一对互补序列所形成的双链DNA的两端分别为BamHⅠ和HindⅢ的酶切位点的可结合形式，即可与经BamHⅠ和HindⅢ酶切后的片段直接进行连接；在正向序列的末端设计有保护性碱基，每段序列的中间有9个碱基的连接序列；
序列合成后须采用通过退火形成双链DNA，具体方法如下：
首先将合成的单链DNA配成50μΜ的溶液，然后按照20μl的反应体系进行，即每个单链DNA取2μl，并加入16μl的退火缓冲液（annealing Buffer），然后在PCR仪上进行退火反应，反应程序为95℃保温4分钟，70℃保温10分钟；关机后冷却至室温，4℃存放或-20℃保存备用；
（4）pSilencer 4.1- PPARγ2P-neo-DsiRNA-4载体的构建
将pSilencer 4.1- PPARγ2P-neo载体用BamHI和Hind Ⅲ进行双酶切，回收目的片段，然后将回收的载体与步骤（3）中形成的双链DNA连接，使用常规的连接体系和反应条件进行连接，并转化E.coli DH5α菌株的感受态细胞，将抗性筛选得到的阳性菌落提取质粒，进行双酶切验证，酶切验证为阳性的重组质粒进一步测序验证，将经验证正确的重组质粒命名为pSilencer 4.1- PPARγ2P-neo-DsiRNA-4载体。
此实施例是以SEQ NO.4序列为例进行的载体构建，其他四个序列及阴性对照的载体构建与上述构建方法的区别在于步骤（3）中合成的序列不同，简单替换即可。将所有siRNA表达载体统一命名为pSilencer 4.1- PPARγ2P-neo-DsiRNA（质粒图谱如图3所示），若指代某一个特定siRNA表达载体时可在pSilencer 4.1- PPARγ2P-neo-DsiRNA的基础上加上siRNA的序列编号，siRNA及其对应的DNA序列和表达载体的对应关系如表1所示：
表1 siRNA与和其对应的DNA序列及所构建的载体的对应关系
实施例2
本实施例siRNA表达载体对人脂肪细胞中ACC基因mRNA表达量的影响情况分析
对人前脂肪细胞（HPA-v）进行培养诱导，待分化为成熟的脂肪细胞，即可进行干扰试验；每一个siRNA表达载体的干扰试验均包括四组，实验组的设置情况如表2所示，转染过程如下：将成熟的人脂肪细胞和HaCat细胞接种于6孔培养板培养24小时，然后使用Lipofectamine 2000转染试剂按照试剂盒操作指南及各个实验组的设置情况进行转染试验，即将pSilencer 4.1- PPARγ2P-neo-DsiRNA载体和阴性对照载体pSilencer 4.1- PPARγ2P-neo-NosiRNA转染到脂肪细胞，将pSilencer 4.1- PPARγ2P-neo-DsiRNA载体转染到HaCat细胞，另外一组人脂肪细胞不进行转染试验，其中所述的pSilencer 4.1- PPARγ2P-neo-DsiRNA载体可以指代5个siRNA表达载体中的任意一个。
表2 实验组设置情况
表中的pSilencer 4.1- PPARγ2P-neo-DsiRNA载体可以指代5个siRNA表达载体中的任意一个。
收集转染后继续培养24小时的脂肪细胞，按照Trizol法进行总RNA的抽提，并测定RNA的含量和纯度，按照试剂盒说明书合成cDNA；根据人ACC基因的cDNA序列（GenBank登录号为：NM_198834.1）设计引物，引物序列如下：
上游引物：5ˊ-CACATAAGGTCCAGCAT-3ˊ，
下游引物：5ˊ-TTCATAAGACCACCTACGG-3ˊ；
以β-Actin作为内参，根据β-Actin cDNA序列（GenBank登录号为：NM_001101.3）设计引物，引物序列如下：
上游引物：5ˊ-CGTACCACTGGCATCGTGAT-3ˊ，
下游引物：5ˊ-GTGTTGGCGTACAGGTCTTTG-3ˊ；
分别使用上述两对引物，以所合成的cDNA为模板进行PCR反应，反应结束后，取5μl PCR产物于12 g/L的琼脂糖凝胶进行电泳，使用Alpha Imager3400型凝胶成像分析***对凝胶电泳结果进行扫描，用自带分析软件测得电泳图谱上每条基因条带的灰度值，计算ACC的强度与β-Actin内参强度的比值，数据采用SPSS13.0统计分析软件进行处理；每个siRNA的4个试验组的数据如表3所示。
表3 各实验组ACC基因mRNA的相对表达量
结果显示siRNA表达载体对脂肪细胞ACC基因mRNA的抑制率在75%以上，而各对照组之间无明显差异，结果表明siRNA表达载体对脂肪细胞ACC基因mRNA的抑制作用明显，而且具有组织的特异性。
实施例3
本实施例siRNA表达载体对脂肪细胞凋亡的影响情况分析
对人前脂肪细胞（HPA-v）进行培养诱导，待分化为成熟的脂肪细胞，即可进行细胞凋亡试验；每一个siRNA表达载体的干扰试验均包括四组，实验组的设置情况如表2所示，转染方法同实施例2中转染方法，转染后的细胞继续培养48h后，收集细胞，按照凋亡检测试剂盒说明书操作，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，每个siRNA的4个试验组的数据统计如表4所示。
表4 各实验组的细胞凋亡率
结果显示实验组2即阳性siRNA干扰组细胞凋亡明显增加，阴性对照组、无干扰对照组和HaCat 细胞干扰组之间细胞凋亡无明显差异，表明siRNA表达载体对脂肪细胞具有一定的凋亡效果，而且具有组织的特异性。
实施例4
本实施例siRNA表达载体对大鼠体重的影响分析
（1）肥胖大鼠群体的建立
选取健康雄性SD大鼠280只，要求体重180±10g，清洁级，所选大鼠经适应饲养1周后，给予大鼠高脂饲料，自由饮水与摄食；两周后，将体重增长居中的30只大鼠转为正常对照组，给予基础饲料；其余大鼠继续喂饲高脂饲料，每周称量体重1次；在第10周时，按照体重增长再次排序，体重增长靠前的70只大鼠作为肥胖易感大鼠。
（2）siRNA表达载体对大鼠体重的影响分析
将上述筛选出的肥胖大鼠分为A、B、C、D、E、F、G七组，每组10只，A-E组采用纯化的siRNA表达载体质粒溶液（用量为2.5mg/kg，纯化质粒用磷酸盐缓冲液PBS稀释至10ml，A-E组分别对应pSilencer 4.1- PPARγ2P-neo-DsiRNA-1至pSilencer 4.1- PPARγ2P-neo-DsiRNA-5的siRNA载体）尾静脉注射入大鼠体内，F组采用PBS尾静脉注射入大鼠体内，每个个体的注射时间控制在20s内，G组不进行任何处理；每周对A-G组大鼠重量分别进行测定，连续测定6周，结果如图4所示。
结果显示，在第1周和第2周时，各组小鼠重量差异不大；第3周时，A-E组大鼠重量开始下降，F组和G组大鼠重量无显著变化；第4周时，A-E组大鼠重量下降较明显，F组和G组大鼠重量仍无显著变化，第5周和第6周时，各组大鼠的重量与第4周时的重量相比差异不明显；说明siRNA表达载体对体重的干扰作用在第4周时达到了高峰，各个处理阶段，F组和G组大鼠体重无显著差异，说明PBS对体重没有太大的影响。
实施例5
本实施例siRNA表达载体作为减肥药物的应用
取构建的siRNA表达载体的纯品配制成针剂或口服胶囊，用于治疗肥胖。减少脂肪的表达，或促使脂肪细胞的凋亡。本发明的siRNA及其含脂肪组织特异启动子的表达载体可以对脂肪组织起到特异的抑制效果，用于治疗各种原因引起的肥胖，没有毒副作用。
核苷酸序列表
<110> 新乡医学院
<120>一种抑制人脂肪细胞ACC基因表达的siRNA及其应用
<160> 5
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400>
auugaggcugagggaacug 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400>
guggauaucuacucagaca 19
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400>
ccuggugaaguuggaccua 19
<210> 4
<211> 19
<212> RNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400>
auaaagugauugagaaggu 19
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400>
caauggcauugcagcagug 19
<210> 6
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>
gatccattgaggctgagggaactgttcaagagacagttccctcagcctcaattttaca 58
<210> 7
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>
agcttgtaaaattgaggctgagggaactgtctcttgaacagttccctcagcctcaatg 58
<210> 8
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>
gatccgtggatatctactcagacattcaagagatgtctgagtagatatccactttaca 58
<210> 9
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>
agcttgtaaagtggatatctactcagacatctcttgaatgtctgagtagatatccacg 58
<210> 10
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>
gatcccctggtgaagttggacctattcaagagataggtccaacttcaccaggtttaca 58
<210> 11
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>
agcttgtaaacctggtgaagttggacctatctcttgaataggtccaacttcaccaggg 58
<210> 12
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
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gatccataaagtgattgagaaggtttcaagagaaccttctcaatcactttattttaca 58
<210> 13
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>
agcttgtaaaataaagtgattgagaaggttctcttgaaaccttctcaatcactttatg 58
<210> 14
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
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gatcccaatggcattgcagcagtgttcaagagacactgctgcaatgccattgtttaca 58
<210> 15
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>
agcttgtaaacaatggcattgcagcagtgtctcttgaacactgctgcaatgccattgg 58
<210> 16
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>
gatccttctccgaacgtgtcacgtttcaagagaacgtgacacgttcggagaatttaca 58
<210> 17
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>
agcttgtaaattctccgaacgtgtcacgttctcttgaaacgtgacacgttcggagaag 58
Claims (8)
1.一种抑制人脂肪细胞ACC基因表达的siRNA，其特征在于：所述的siRNA为小双链RNA，其正义链序列为序列表中SEQ NO.1、SEQ NO.2、SEQ NO.3、SEQ NO.4和SEQ NO.5中任意一个所对应的序列。
2.一种能够产生抑制人脂肪细胞ACC基因表达的siRNA的载体，其特征在于：所述载体含有脂肪细胞特异启动子序列，并且能够产生特异性抑制人脂肪细胞ACC基因表达的小双链RNA；所述的小双链RNA的正义链序列为序列表中SEQ NO.1、SEQ NO.2、SEQ NO.3、SEQ NO.4和SEQ NO.5中任意一个所对应的序列。
3.根据权利要求2所述的一种能够产生抑制人脂肪细胞ACC基因表达的siRNA的载体，其特征在于：所述的脂肪细胞特异启动子为过氧化物酶体增殖物激活受体γ2基因启动子。
4.一种如权利要求2所述的能够产生抑制人脂肪细胞ACC基因表达的siRNA的载体的构建方法，其特征在于：所述构建方法包括以下步骤
（1） 脂肪细胞特异启动子序列的克隆
根据脂肪细胞特异启动子序列设计一对引物PP1和PP2，以人脂肪细胞提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物经凝胶电泳初步鉴定后，克隆至pMD18-T载体，并转化感受态细胞，将筛选得到阳性菌落提取质粒，使用特异引物和/或pMD18-T载体的通用引物进行PCR鉴定，PCR鉴定为阳性的重组质粒进一步测序验证，经验证正确的重组质粒即包含脂肪细胞特异启动子；
（2）pSilencer 4.1- PPARγ2P-neo载体的构建
将验证正确的脂肪细胞特异启动子的PCR扩增产物双酶切，并用同样的酶双酶切pSilencer 4.1-CMV-neo 载体，回收目的片段，然后将回收的启动子序列和载体连接，并转化感受态细胞，将筛选得到阳性菌落提取质粒，进行双酶切验证，酶切验证为阳性的重组质粒进一步测序验证，将经验证正确的重组质粒命名为pSilencer 4.1- PPARγ2P-neo 载体；
（3）siRNA对应的DNA序列的合成
根据序列表中任何一个siRNA的正义链序列，设计其对应的DNA序列，序列两端引入酶切位点，所述DNA序列为两条单链，并且两条单链是一对互补序列，设计好的序列经合成后，通过退火形成双链DNA，退火反应采用常规方法即可；
（4）pSilencer 4.1- PPARγ2P-neo-DsiRNA载体的构建
将pSilencer 4.1- PPARγ2P-neo载体进行双酶切，所使用的两个酶与步骤（3）中双链DNA设计酶切位点时选用的酶相同，回收目的片段，然后将回收的载体与步骤（3）中形成的双链DNA序列连接，并转化感受态细胞，将筛选得到阳性菌落提取质粒，进行双酶切验证， 酶切验证为阳性的重组质粒进一步测序验证，将经验证正确的重组质粒命名为pSilencer 4.1- PPARγ2P-neo-DsiRNA 载体。
5.根据权利要求4所述的一种能够产生抑制人脂肪细胞ACC基因表达的siRNA的载体的构建方法，其特征在于：所述的引物PP1和PP2的序列如下
PP1：5ˊ-AGGAATTCAGCGCTGCATGCTGATACCAACGT-3ˊ;
PP2：5ˊ-CGGGATCCAACAGCATGGA ATA GGGGTTTGC-3ˊ。
6.根据权利要求4所述的一种能够产生抑制人脂肪细胞ACC基因表达的siRNA的载体的构建方法，其特征在于：所述的siRNA对应的DNA序列如下
①正义链为SEQ NO.1的siRNA对应的DNA序列
正向序列为序列表中SEQ NO.6对应的序列，反向序列为序列表中SEQ NO.7对应的序列；
②正义链为SEQ NO.2的siRNA对应的DNA序列
正向序列为序列表中SEQ NO.8对应的序列，反向序列为序列表中SEQ NO.9对应的序列；
③正义链为SEQ NO.3的siRNA对应的DNA序列
正向序列为序列表中SEQ NO.10对应的序列，反向序列为序列表中SEQ NO.11对应的序列；
④正义链为SEQ NO.4的siRNA对应的DNA序列
正向序列为序列表中SEQ NO.12对应的序列，反向序列为序列表中SEQ NO.13对应的序列；
⑤正义链为SEQ NO.5的siRNA对应的DNA序列
正向序列为序列表中SEQ NO.14对应的序列，反向序列为序列表中SEQ NO.15对应的序列。
7.一种抑制人脂肪细胞ACC基因表达的siRNA在制备减肥药物中的应用。
8.一种能够产生抑制人脂肪细胞ACC基因表达的siRNA的载体作为减肥药物的应用。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| WO2014206219A1 (zh) * | 2013-06-27 | 2014-12-31 | 昆山彭济凯丰生物科技有限公司 | 一种rna片段及其制备方法和用途 |
| CN105255943A (zh) * | 2015-10-21 | 2016-01-20 | 浙江大学 | 猪PPARγ小干扰RNA表达载体的构建方法及用途 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101353657A (zh) * | 2008-09-02 | 2009-01-28 | 浙江大学 | 猪Sirtl小干扰RNA表达载体的构建方法及用途 |
| US20090137513A1 (en) * | 2002-02-20 | 2009-05-28 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA Interference Mediated Inhibition of Acetyl-CoA-Carboxylase Gene Expression Using Short Interfering Nucleic Acid (siNA) |
| US20090239830A1 (en) * | 2007-06-01 | 2009-09-24 | Josh Munger | Treatment of viral infections by modulation of host cell metabolic pathways |
-
2010
- 2010-03-11 CN CN 201010122228 patent/CN101892226A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090137513A1 (en) * | 2002-02-20 | 2009-05-28 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA Interference Mediated Inhibition of Acetyl-CoA-Carboxylase Gene Expression Using Short Interfering Nucleic Acid (siNA) |
| US20090239830A1 (en) * | 2007-06-01 | 2009-09-24 | Josh Munger | Treatment of viral infections by modulation of host cell metabolic pathways |
| CN101353657A (zh) * | 2008-09-02 | 2009-01-28 | 浙江大学 | 猪Sirtl小干扰RNA表达载体的构建方法及用途 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 《生命的化学》 20070415 李亮 等 乙酰辅酶A羧化酶在治疗肥胖中的潜在作用 第27卷, 第2期 2 * |
| 《第一军医大学学报》 20050920 祝骥 等 绿色荧光蛋白基因在脂肪细胞分化研究中的应用 1119-1123 第25卷, 第9期 2 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014206219A1 (zh) * | 2013-06-27 | 2014-12-31 | 昆山彭济凯丰生物科技有限公司 | 一种rna片段及其制备方法和用途 |
| CN105255943A (zh) * | 2015-10-21 | 2016-01-20 | 浙江大学 | 猪PPARγ小干扰RNA表达载体的构建方法及用途 |
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