CN101891782B - 朝鲜淫羊藿叶中淫羊藿次苷ⅰ单体的分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了朝鲜淫羊藿叶中淫羊藿次苷I单体的分离方法，用高速逆流色谱法从朝鲜淫羊藿叶的粗提物中分离淫羊藿次苷I的单体。首先选择预先平衡好的两相溶剂中的一相为固定相，并将其充满螺旋管柱，然后使螺旋管柱在一定的转速下高速旋转，同时以一定的流速将流动相泵入柱内。在体系达到流体动力学平衡后，将待分离的样品注入体系，其中组分将依据其在两相中分配系数的不同实现分离。通过用PLC检测，淫羊藿次苷I的纯度可以达到99％以上，方法简便且效率高。
Description
技术领域
本发明属于天然药物化学领域，涉及用高速逆流色谱法从朝鲜淫羊藿叶的粗提物中分离淫羊藿次苷I的单体的分离方法。
背景技术
淫羊藿是近几年天然药物研究的热点之一。其主要成分淫羊藿苷的体内过程有较充分的研究(YE L K，CHEN J M，L IU S H，et al1Pharmacokinetics of icariinin rats[J]1Chin Pharm J(中国药学杂志)，1999，34(1)：33-36，而淫羊藿次苷I的体内过程研究却未见报道。从现有的研究成果看来，淫羊藿次苷I在酶水平上有很好的活性，极有希望成为治疗***功能障碍的有效药物。
淫羊藿次苷I是淫羊藿苷的体内代谢产物之一，Lenoble等(LENOBLE R，RICHHEIMER S，BA ILEY D T，et al1 Compositions comprising icariside I andanhydroicaritin and methods formaking the same：PCT，WO 02/13842 A1[P]120022022211)报道了淫羊藿次苷I对PDE-25酶具有很好的抑制作用，IC50为0.133mg/L，显示了其在治疗***功能障碍方面的作用。
目前，国外有采用柱色谱法分离提取淫羊藿次苷I的报道(Lenoble，et al.″Compositions comprising icariside I and anhydroicaritin and methods formaking the same″Unit States Patent 2002(6399579))。柱色谱分离纯化黄酮类化合物存在由不可逆吸附导致产率低的缺点，而且分离过程十分耗时、耗力，不利于黄酮类化合物的大量分离提取。
目前无人用高速逆流色谱(HSCCC)技术分离淫羊藿次苷I。
发明内容
为了消除因为柱色谱分离纯化黄酮类化合物存在由不可逆吸附导致产率低，而且分离过程十分耗时、耗力，不利于黄酮类化合物的大量分离提取的缺点。本发明提供了朝鲜淫羊藿叶中淫羊藿次苷I单体的分离方法。
高速逆流色谱(HSCCC)与高效液相色谱(HPLC)最大的不同在于其柱分离***。高速逆流色谱包括储液罐、泵、螺旋管分离柱、检测器、色谱工作站或数据采集软件或记录仪以及馏分收集器等组成部分，其分离原理为液液萃取。
首先选择预先平衡好的两相溶剂中的一相为固定相，并将其充满螺旋管柱，然后使螺旋管柱在一定的转速下高速旋转，同时以一定的 流速将流动相泵入柱内。在体系达到流体动力学平衡后(即开始有流动相流出时)，将待分离的样品注入体系，其中组分将依据其在两相中分配系数的不同实现分离。分离效果与所选择的溶剂***、固定相和流动相的选择、洗脱方式、流动相的流速、仪器的旋转的方向和转速、样品浓度和进样方式以及柱温等都有密切关系。因而，在采用逆流色谱分离时，在操作方法和工作程序等方面都有许多独特之处。常用的检测器有紫外-可见光检测器(UV-VIS)，此外还有蒸发光散射检测器(ELSD)以及质谱检测器等。
高速逆流色谱(HSCCC)分离方法在植物药物活性成分分离中的优势主要体现在同一台仪器可用于不同极性的物质的分离，且制备量大，分离效率高，操作灵活。可以实现多种形式的梯度洗脱过程，如pH梯度、极性梯度等，还可以进行正向洗脱或反向洗脱，甚至可以使两相溶剂同时双向流动，实现真正连续的逆流色谱过程。
本发明提供了朝鲜淫羊藿叶中淫羊藿次苷I单体的分离方法，其方法和步骤如下：
a按体积比为3∶7∶3∶7～6∶4∶6∶4分别称量正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水于分液器中，充分震荡，静置，放置过夜；
b以澄清的上相为固定相，下相为流动相，以0.5～10mL/min的流速使固定相充满螺旋管柱，然后螺旋管柱以1300～1600rpm/min的速度旋转，稳定1～30min后，以0.5～5.0mL/min的速度泵入流动相，使体系达到流体动力学平衡；
c根据高速逆流色谱的进样***选择进样体积，以1.0～10mg/mL的溶液浓度进样，下相溶解淫羊藿次苷I的粗提物，检测器波长为272nm，温度为10～40℃；所述的下相体积不得少于3mL；
d第一个出现的大峰不是淫羊藿次苷I，第二个出现的峰为淫羊藿叶中提取的淫羊藿次苷I，溶液颜色呈荧黄色，经过冷冻干燥，得淫羊藿次苷I单体粉末；
步骤c中所述的淫羊藿次苷I粗提物是根据以下方法所得：
1)称量朝鲜淫羊藿叶100，用1500mL的体积浓度为70％乙醇回流4小时，滤出乙醇提取液，将回流过的药渣用1000mL的体积浓度为70％乙醇回流提取2小时，滤出乙醇提取液，合并两次滤液；
2)滤液在50℃下减压蒸出溶剂，得到的提取物，该提取物中所含的水分不多于其质量的5％；
3)将步骤2)中所得到的提取物用200mL无水乙醇溶解，加入浓盐酸，朝鲜淫羊藿叶质量克：浓盐酸体积mL为：0.1，在50℃水浴加热15小时，室温放置过夜，过滤；
4)滤液在50℃减压浓缩至原体积的20％，加入200mL蒸馏水析出沉淀，沉淀在50℃下用体积浓度为20％乙醇溶液洗涤，50℃下真空 干燥，得淫羊藿次苷I粗提物的粉末；称重为5.6760克。
有益效果：本发明提供的朝鲜淫羊藿叶中淫羊藿次苷I单体的分离方法，能够从朝鲜淫羊藿叶粗提物中分离出淫羊藿次苷I单体，方法简便且效率高。通过HPLC检测，淫羊藿次苷I的纯度可以达到99％以上，如附图5淫羊藿次苷I液相图和附图6淫羊藿次苷I的质谱图所示。
附图说明
图1为实施例1的高速逆流色谱以272nm检测，正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水的体积比为3∶7∶3∶7，进样溶液浓度7.0mg/mL，螺旋管分离柱转速为1300rpm/min时的峰形图。
图2为实施例2的高速逆流色谱以272nm检测，正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水的体积比为4∶6∶4∶6，进样溶液浓度10mg/mL，螺旋管分离柱转速为1550rpm/min时的峰形图。
图3为实施例3的高速逆流色谱以272nm检测，正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水的体积比为5∶5∶4.5∶5.5，进样溶液浓度8.0mg/mL，螺旋管分离柱转速为1600rpm/min时的峰形图。
图4为实施例4的高速逆流色谱以272nm检测，正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水的体积比为6∶4∶6∶4，进样溶液浓度1.0mg/mL，螺旋管分离柱转速为1300rpm/min时的峰形图。
图5为实施例5的高速逆流色谱中36-46min时所接溶液的高效液相色谱图。
图6为实施例6的高效液相色谱中36-46min时所接溶液的质谱图。
具体实施方式
实施例1
a按体积比为3∶7∶3∶7分别量取正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水于1000mL分液漏斗中，充分震荡，静置，放置过夜；
b以澄清的上相为固定相，下相为流动相，以10mL/min的流速使固定相充满螺旋管柱，然后螺旋管柱以1600rpm/min的速度旋转，稳定30min后，以5.0mL/min的速度泵入流动相，使体系达到流体动力学平衡；
c根据高速逆流色谱的进样***选择进样体积，以8.0mg/mL的溶液浓度进样，下相5mL溶解淫羊藿次苷I粗提物，检测器波长为272nm，温度为40℃。
d第一个出现的大峰不是淫羊藿次苷I，第二个出现的峰为朝鲜淫羊藿叶中提取的淫羊藿次苷I。溶液颜色呈荧黄色，经过冷冻干燥，得淫羊藿次苷I单体粉末。结果见图1。
步骤c中所述的淫羊藿次苷I粗提物是根据以下方法所得：
1)称量朝鲜淫羊藿叶100克，用1500mL的体积浓度为70％乙醇回流4小时，滤出乙醇提取液，将回流过的药渣用1000mL的体积浓度为70％乙醇回流提取2小时，滤出乙醇提取液，合并两次滤液；
2)滤液在50℃下减压蒸出溶剂，得到提取物，提取物中所含水分不多于其质量的5％；
3)将所述的粗提物用200mL无水乙醇溶解，加入浓盐酸，朝鲜淫羊藿叶质量克：浓盐酸体积mL为：0.1，在50℃水浴加热15小时，室温放置过夜，过滤；
4)滤液在50℃减压浓缩至原体积的20％，加入200mL蒸馏水析出沉淀，沉淀在50℃下用体积浓度为20％乙醇溶液洗涤，50℃下真空干燥，得淫羊藿次苷I粗提物粉末；称重5.6760克。
实施例2、3和4都是按照实施例1的步骤进行，条件如下表1所示：
表1
| 实施例 | 体积比 | 固定相流速(mL/min) | 转速(rpm) | 样品溶液浓度(mg/mL) | 稳定时间(min) | 进样体积(mL) | 温度 (℃) | 流动相流速(mL/min) | 结果 |
| 2 | 4∶6∶4∶6 | 8.0 | 1550 | 10.0 | 20 | 6.0 | 20 | 5.0 | 图2 |
| 3 | 5∶5∶4.5∶5.5 | 5.0 | 1600 | 9.0 | 30 | 5.0 | 30 | 2.0 | 图3 |
| 4 | 6∶4∶6∶4 | 0.5 | 1300 | 1.0 | 1 | 3.0 | 10 | 0.5 | 图4 |
注：体积比为正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水的体积比。
实施例5
将高速逆流色谱在36-46min时所接的溶液冷冻干燥，称量1.010mg粉末于5mL的容量瓶中，甲醇定溶。取5uL溶液所作的高效液相色谱图。结果如图5。
高效液相的条件：波长272nm，流速：1mL/min，柱温：30℃，色谱柱：Alltima HPC185μm(250×4.6mm)
梯度洗脱：
实施例6
将高速逆流色谱在36-46min时所接的溶液冷冻干燥，称量1.010mg粉末于5mL的容量瓶中，甲醇定溶。对上述溶液进行质谱检测，结果如图6。
质谱条件：Finnigan MAT LCQTM离子阱电喷雾质谱仪扫描范围为m/z 0-1000，喷雾电压5.0kV，金属毛细管温度设为200℃。
Claims (1)
1.朝鲜淫羊藿叶中淫羊藿次苷Ⅰ单体的分离方法，其特征在于，其步骤和条件如下：
a 按体积比为3∶7∶3∶7分别量取正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水于1000 mL分液漏斗中，充分震荡，静置，放置过夜；
b 以澄清的上相为固定相，下相为流动相，以10mL/min的流速使固定相充满螺旋管柱，然后螺旋管柱以1600rpm/min的速度旋转，稳定30min后，以5.0mL/min的速度泵入流动相，使体系达到流体动力学平衡；
c 根据高速逆流色谱的进样***选择进样体积，以8.0mg/mL的溶液浓度进样，下相5mL溶解淫羊藿次苷Ⅰ粗提物，检测器波长为272nm，温度为40℃；
d 第一个出现的大峰不是淫羊藿次苷Ⅰ，第二个出现的峰为朝鲜淫羊藿叶中提取的淫羊藿次苷Ⅰ，溶液颜色呈荧黄色，经过冷冻干燥，得淫羊藿次苷Ⅰ单体粉末；
步骤c中所述的淫羊藿次苷Ⅰ粗提物是根据以下方法所得：
1）称量朝鲜淫羊藿叶100克，用1500mL的体积浓度为70%乙醇回流4小时，滤出乙醇提取液，将回流过的药渣用1000mL的体积浓度为70%乙醇回流提取2小时，滤出乙醇提取液，合并两次滤液；
2）滤液在50℃下减压蒸出溶剂,得到提取物, 提取物中所含水分不多于其质量的5%；
3）将所述的粗提物用200mL无水乙醇溶解，加入浓盐酸，朝鲜淫羊藿叶质量克：浓盐酸体积mL为：0.1，在 50℃水浴加热15小时，室温放置过夜，过滤；
4）滤液在50℃减压浓缩至原体积的20%，加入200mL蒸馏水析出沉淀，沉淀在50℃下用体积浓度为20%乙醇溶液洗涤，50℃下真空干燥，得淫羊藿次苷Ⅰ粗提物粉末。
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