CN101871920B - 用于生物样本中多氯联苯类化合物快速前处理与纯化的多级改进柱 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于生物样本中多氯联苯类化合物快速前处理与纯化的多级改进柱。该多级改进柱包括洗脱流出部分、柱填料和进样品的压力部分，其特征在于：所述柱填料由四部分组成，其中，柱体中的Ⅰ部分属于中性层析部分，占整个柱体的20％，填料为中性硅胶；柱体中的Ⅱ部分属于中性脱脂部分，占整个柱体的20％，柱填料的选择根据具体的生物分子而定；柱体中的Ⅲ部分属于碱改性部分，占整个柱体的30％，柱填料为碱性氢氧化铝、佛罗里硅土或由氧化镁、氧化铝等混合组成的材料；柱体中的Ⅳ部分属于酸改性部分，占整个柱体的20-30％，主要指3-6N的强酸改性硅胶柱填料。本发明具有分离纯化效率高、低污染、对仪器设备要求低和成本低廉等优点，适合大面积推广和应用。

Description

用于生物样本中多氯联苯类化合物快速前处理与纯化的多级改进柱

技术领域

本发明涉及色谱技术领域，具体涉及一种由新型柱填料组成的改进柱，可用于复杂生物样本中多氯联苯类化合物的快速前处理与纯化。

背景技术

多氯联苯类有机污染物是常见的环境污染物之一。它们通常由化学工业合成，通过不同途径释放或进入不同的环境介质中，此类化合物大多为疏水性亲油物质，因而能够在生物体脂肪中大量富集。1968年，日本曾发生因PCB污染米糠油而造成的有名的公害病。虽然1973年以后各国陆续开始减少或停止生产，但它们在不同的环境介质中仍广泛存在，通过不同的暴露途径进入生物体，在人和动物体的脂肪组织和器官中蓄积，愈不易***，毒性就愈大。其毒性主要表现为：影响皮肤、神经、肝脏，破坏钙的代谢，导致骨骼、牙齿的损害，并有慢性致癌和致遗传变异等的可能性。因此，对生物体内多氯联苯类污染物的研究往往成为环境、食品与***门的工作内容，对此类化合物的分离、纯化将是影响其定量分析准确性的关键技术。

一般生物样本中多氯联苯的提取分离过程就是尽量使多氯联苯类化合物与其它成份分离开，从而在检测过程中避免干扰产生的背景或噪声过大等现象。经过提取的待测组分，提取物中通常含有与该组分结构相似的杂质，将待测组分与杂质分离的过程，此过程也称为“净化”。在生物样本的多氯联苯提取过程中，净化过程是样本前处理的技术难点，也是关系到检测结果的真实性及检测方法可靠性的重要步骤。常见净化过程的主要方法有固相萃取法、液-液分配法、化学处理法、扫集共蒸馏法、低温冷冻净化法、前置色谱柱净化法等。固相萃取法是目前应用最常见的净化方法之一，通过吸附柱、分配柱、凝胶渗透柱、薄层板等实现，其原理是样本的待测组分在层析柱中吸附剂上被吸附与被解吸的反复过程。常用的吸附剂有佛罗里硅土、氧化铝、活性炭、硅胶、氧化镁和纤维素等。液-液分配法也是一种十分常用的净化方法，其原理是利用待测组分在一组互不相溶的溶剂对内的分配系数不同，通过反复多次分配，使待测组分与杂质分离，以达到净化目的。常用的溶剂对有乙腈提取液的正己烷分配、乙腈提取液的三氯甲烷分配、丙酮提取液的石油醚分配、丙酮提取液的二氯甲烷分配等。

多氯联苯的前处理方法依据不同的研究介质而定，如研究生物样本中的多氯联苯含量，必须考虑复杂的脂类、大分子蛋白、有机酸或生物碱等的去除。比较常用的几种前处理方法，发现多氯联苯的液-液分配法与化学处理法通常具有一定的缺陷，它们通常比较消耗溶剂，对于色谱型溶剂而言，大量的液-液分配将增加一定的实验成本。另一方面，也容易造成待测样本的损失，造成回收率的误差较大，即使经过液-液分配后，一般也要经过后续的柱层析进行分离纯化。固相萃取法也是常见的一种方法，然而固相萃取柱一般成本比较高，在固相萃取柱上样前，一般要求待纯化的样本必须经过一定的前处理，如通过一定的预处理过程将有酸性基团(COOH等)或碱性基团(NH₂等)的有机干扰物除去，同时固相萃取法对样本的加载量有较严格的要求。

目前，尚未发现通过改变色谱柱填料的多级改性法来实现生物样本内多氯联苯类化合物的快速前处理与纯化方法。

发明内容

本发明提供了一种简单易行的用于生物样本中多氯联苯类化合物快速前处理与纯化的多级改进柱。

本发明所提供的多级改进柱，包括常规色谱柱的洗脱流出部分、柱填料部分和进样品的压力部分，所述柱填料部分由四部分组成，其中，柱体中的Ⅰ部分为中性层析部分，占整个柱体的20％，填料为中性硅胶；

柱体中的Ⅱ部分为中性脱脂部分，占整个柱体的20％，柱填料的选择根据具体的生物分子而定；

柱体中的Ⅲ部分为碱改性部分，占整个柱体的30％，柱填料为碱性氢氧化铝、佛罗里硅土或由氧化镁、氧化铝等混合组成的材料，此部分主要用于牢固地吸附有机酸类的化合物；

柱体中的Ⅳ部分为酸改性部分，占整个柱体的20-30％，主要指3-6N的强酸改性硅胶柱填料；

且，填料柱体中各部分之间设有分隔带，填料柱体中的Ⅳ部分与进样品的压力部分相连，填料柱体中的Ⅰ部分与所述洗脱流出部分相连。

所述多级改进柱柱体Ⅱ部分的填料的选择原则为去除高分子脂和小分子脂类的物质，具体可为：采用C-18的填料、活性碳填料和纤维素填料进行一定比例的混合等，推荐混合比例为C-18∶活性碳的填料为65％∶35％，或C-18∶纤维素为78％∶22％。

所述多级改进柱柱体Ⅲ部分的填料中的组成重量比可为二氧化硅(82％)∶氧化镁(12％)∶氧化铝(5.7％)∶硫酸钠(0.3％)。

所述多级改进柱柱体Ⅳ部分的填料中的强酸为盐酸或硫酸等，改性过程为：缓缓加入浓酸，以玻璃棒缓缓搅之，然后置于通风橱内抽干，时间为48小时以上。

所述多级改进柱的填料颗粒物大小均控制在统一的范围。对于不同尺寸的主体选用不同粒径的颗粒物，如在100-220目。装柱时推荐采用干法装柱。

所述柱填料的四部分之间还有分隔带，各个分隔带一般采用上下一致的中性硅胶，占整个柱体的5-10％，颗粒物大小必须与上下改性部分一致，误差控制在10％以内。

所述多级改进柱的柱管的材料为不锈钢、玻璃或有机玻璃类高分子聚合物等；尺寸可以改变，例如内径为28mm，长度为100mm。

本发明另一目的在于提供一种生物样本中多氯联苯类化合物检测快速前处理与纯化的方法。

本发明快速处理与纯化方法，主要使用前述多级改进柱，将生物样本从所述多级改进柱的压力部分进料，依序经过填料柱体中的Ⅳ部分、Ⅲ部分、Ⅱ部分和Ⅰ部分，通过洗脱流出部分接收经处理与纯化后的生物样本。

生物样本在用本发明的多级改进柱纯化前可以进行前处理，使与多种生物分子作用的多氯联苯释放出来，前处理的方法有酸解等技术，其中，酸解方法为：吸取2.5ml左右的血清于25ml左右的小烧杯中，缓缓加入2-3ml左右12N盐酸，缓缓振摇，待溶液中的气泡释放出来，然后加入80-100目的硅胶作为吸附剂，在低温下冷冻干燥浓缩，使生物分子及多氯联苯均匀地吸附在硅胶上。

所述进料时可采用溶剂加压***，先用溶剂洗脱后，然后再进样。

采用以上方案，本发明通过改性的多级柱填料，可实现多氯联苯类化合物的快速前处理与纯化。在某些生物样本的前处理过程中，可以替代液-液分配的过程，从而避免造成待测样本的损失与溶剂的消耗，使得样本前处理过程变得简单有效。本发明的多级改进柱在多氯联苯分离纯化过程中可达到如下目的：1)去除杂质对检测体系干扰；2)复杂环境中背景中酸的去除；3)复杂环境中背景中碱的去除；4)复杂环境中生物大分子蛋白的去除。本发明的用于多氯联苯类化合物快速前处理与纯化的多级改进柱明显优于现有技术，具有分离纯化效率高、低污染、对仪器设备要求低和成本低廉等优点，适合大面积推广和应用。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为本发明多级改进柱的剖面图

图2为小牛血清中多氯联苯PCB-118的加标回收实验结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例：用于生物样本中多氯联苯类化合物快速前处理与纯化的多级改进柱的构成与使用

一、多级改进柱的构成

如图1所示，以内径为28mm，长度为100mm的玻璃材料的色谱柱为例说明本发明多级改进柱的构成，它包括常规色谱柱的洗脱流出部分、柱填料部分和进样品的压力部分，所述柱填料部分的柱体内，包括依序装填不同填料的四部分，其中：

柱体中的Ⅰ部分属于中性层析部分，占整个柱体的20％，填料为200目的中性硅胶；

柱体中的Ⅱ部分属于中性脱脂部分，占整个柱体的20％，柱填料的选择根据具体的生物分子而定，选择原则为尽可能去除高分子脂和小分子脂类的物质，可以为C-18、活性碳和纤维素中的一种或多种的混合，推荐混合重量比为C-18∶活性碳的填料为65％∶35％，或C-18∶纤维素为78％∶22％。柱填料的粒径为200目左右；此部分主要用于脱去大分子脂蛋白和小分子的油脂类；

柱体中的Ⅲ部分属于碱改性部分，占整个柱体的30％，柱填料为碱性氢氧化铝、佛罗里硅土或由氧化镁、氧化铝等混合组成的材料，按填料的组成计算，重量比可为二氧化硅(82％)∶氧化镁(12％)∶氧化铝(5.7％)∶硫酸钠(0.3％)。该部分调料粒径为200目左右，此部分主要用于牢固地吸附有机酸类的化合物；

柱体中的Ⅳ部分属于酸改性部分，占整个柱体的20-30％，用6N的盐酸改性硅胶柱填料，粒径为200目左右；填料改性过程为：缓缓加入浓盐酸，以玻璃棒缓缓搅之，然后置于通风橱内抽干，时间为48小时以上。

所述柱填料的四部分之间还有分隔带，各个分隔带一般采用上下一致的中性硅胶，占整个柱体的5-10％，颗粒物大小为200目，须与相邻的上、下部分填料大小一致，误差控制在10％以内。

填料柱体中的Ⅳ部分与进样品的压力部分相连，填料柱体中的Ⅰ部分与所述洗脱流出部分相连。

采用真空法进行干法装柱。装柱的过程尽量保证均匀，密度一致。

由此，得到本发明的多级改进柱。

本发明的多级改进柱采用上述描述的结构构成，但其尺寸、填料体积和填料颗粒的大小可根据应用情况进行变化，不受上述描述的限制。例如，对多级改进柱(微柱)的填料体积控制范围：一般来讲3.0mL的微柱填料体积为0.6mL，5.0mL的微柱填料体积为1.0mL；对多级改进柱(微柱)的填料颗粒物大小控制范围：5.0-10mL的微柱建议使用200目的填料，小于3.0mL的微柱填料建议使用100-120目之内的填料；对多级改进柱(微柱)本身的尺寸，如果检测的样本≤2.5mL，建议用5.0-10mL的微柱，如果检测的样本≤1.0mL，建议用3.0mL的微柱。

二、多级改进柱的使用

检测小牛血清中多氯联苯PCB-118的加标回收实验，取2毫升的小牛血清，加入500μg/L的PCB-118，以GC-ECD法检测其中的含量，具体方法包括以下步骤：

1、前处理

生物样本(添加PCB-118的小牛血清)在用本发明的多级改进柱(本例使用内径为28mm，长度为100mm)纯化前需进行前处理，使与多种生物分子作用的多氯联苯释放出来，前处理的方法有酸解、热解等技术，本实例采用酸解处理：吸取2.5ml左右的血清于25ml左右的小烧杯中，缓缓加入2-3ml左右12N盐酸，缓缓振摇，待溶液中的气泡释放出来，然后加入80-100目的硅胶作为吸附剂，在低温下冷冻干燥浓缩，使生物分子及多氯联苯均匀地吸附在硅胶上。

2、检测

进料时采用溶剂加压***，先用溶剂洗脱后，然后再进样，即用色谱级正己烷进行洗脱，接收前段洗脱部分，接收体积为25mL，浓缩后，用气相色谱-电子俘获检测器进行检测。

主要仪器德国IKA_RV10旋转蒸发仪；Agilent Technologies GC-7890气相色谱仪(美国安捷伦公司)，7683B自动进样器；电子捕获检测器(ECD)；美国Dionex戴安公司加速溶剂萃取Accelerated Solvent Extractor(ASE300型)。

GC-ECD分析条件：

用带有电子捕获检测器的气相色谱仪(型号7890，Agilent technologies公司)，DB-XLB毛细管色谱柱测定PCBs化合物含量。GC-ECD分析条件：进样口温度250℃，不分流进样(不分流时间1min)，进样量1μl，恒压控制，载气(高纯N₂)压力105kPa，检测器ECD温度310℃，尾吹流量40mL·min-1。柱箱温度：程序升温，初始温度95℃，保留2min；以10℃·min^-1升至180℃，保留3min；以5℃·min^-1升至280℃，保持5分钟；以20℃·min^-1升至300℃，保持10.5分钟。

3、结果

色谱分析结果如图2所示，其中，处于保留时间3-12min峰的位置通常为生物样本中的脂肪等杂质部分，在本图中保留时间为15.737的位置是PCB-118的峰。如果采用其它处理方法，在保留时间3-12min峰的脂肪出峰位置基线会升高，杂峰的吸收信号与升高的基线混合在一起，将对待测样本产生较大的干扰。通过多级改进柱的处理，从图2中可以看出保留时间3-12min峰的脂肪出峰位置基线大大降低，多种杂质峰的吸收也明显下降并且得到较好的分离效果，表明本发明的多级改进柱能够用于生物样本中的多种杂质去除，检测PCB时能够得到较好的分离结果。同时，使用该多级改进柱测得PCB-118回收率在92％-101％范围内，说明该多级改进柱通过对样品快速前处理与纯化，能保持PCB较高的回收率。

本发明虽由前述实施例来描述，但因不同的多氯联苯因含氯原子数的不同可能具有不同的回收率，不同生物样本中含有脂类会有所不同，因此，可以不脱离本发明的精神下通过简单试验做一些变化而有针对性地去除干扰物，这些可能的变化内容也属于本发明。前述实验过程为本发明一个较合理的使用方法，仅为本发明可以具体实施的方式之一，但并不以此为限。

用本发明多级改进柱和其它用于生物样本中多氯联苯类化合物快速前处理与纯化方法进行比较，操作过程比较如表1所示：

表1不同方法过程比较

	吸附靶分子	流程	吸附剂	目标
					本发明多级改进柱	干扰分子	类似正相柱层析	多种经过改性后的复合吸附材料	去干扰/基质效应
固相萃取柱	待检分子	先吸附，后洗脱	单种	净化/浓缩
					液-液分配萃取法	无	多次萃取，液-液分配	无	净化/浓缩

从表中所列过程可以看出，其它方法中使用固相萃取柱成本高(如一支固相萃取柱价值80元至100元)，且只能使用一次，溶剂洗脱***要求相对比较苛刻，样本负载较小；而液-液分配萃取法往往操作繁琐，回收率较低等缺点。而使用本发明多级改进柱处理相对简单，处理、纯化过程一步完成，一些干扰物质，如大分子脂类等比较容易去除(参见图2)，具有分离纯化效率高、低污染、对仪器设备要求低和成本低廉等优点，适合大面积推广和应用。

Claims (9)

1.用于生物样本中多氯联苯类化合物快速前处理与纯化的多级改进柱，包括色谱柱依序连接的进样品的压力部分、柱填料部分和洗脱流出部分，其特征在于：所述柱填料部分的柱体内包括顺序的四部分，其中，

柱体中的I部分为中性层析部分，占整个柱体的20％，柱填料为中性硅胶；

柱体中的II部分为中性脱脂部分，占整个柱体的20％，柱填料为去除高分子脂及小分子脂类的物质，采用C-18、活性碳和纤维素任意两种或三种的混合填料；

柱体中的III部分为碱改性部分，占整个柱体的30％，柱填料按组成重量比为二氧化硅82％∶氧化镁12％∶氧化铝5.7％∶硫酸钠0.3％；

柱体中的IV部分为酸改性部分，占整个柱体的20-30％，柱填料为3-6N的强酸改性硅胶柱填料，改性过程为：向中性硅胶中缓缓加入强酸，以玻璃棒缓缓搅之，然后置于通风橱内抽干，时间为48小时以上；

且，柱体中的IV部分与进样品的压力部分相连，柱体中的I部分与所述洗脱流出部分相连。

2.根据权利要求1所述的多级改进柱，其特征在于：所述多级改进柱柱体中的

II部分的填料为C-18和活性碳按重量65％∶35％的混合，或C-18和纤维素按重量78％∶22％的混合。

3.根据权利要求1所述的多级改进柱，其特征在于：所述柱体中的IV部分中所指强酸为盐酸或硫酸。

4.根据权利要求1至3任一所述的多级改进柱，其特征在于：所述多级改进柱的柱体中的各部分的柱填料颗粒物大小均控制在较均一的范围；所用柱填料颗粒物大小在100-220目中的某数值；装柱采用干法装柱。

5.根据权利要求4所述的多级改进柱，其特征在于：所述柱体中的四部分相邻部分之间还有分隔带，各个分隔带采用上下一致的中性硅胶，占整个柱体的5-10％，中性硅胶颗粒物大小与上下部分的柱填料颗粒物大小一致，误差控制在10％以内。

6.根据权利要求5所述的多级改进柱，其特征在于：所述多级改进柱的柱管的材料为不锈钢或玻璃。

7.权利要求1-6任一项所述的多级改进柱在生物样本中多氯联苯类化合物检测快速前处理与纯化中的应用。

8.生物样本中多氯联苯类化合物检测快速前处理与纯化的方法，其特征在于，使用权利要求1-6任一项所述的多级改进柱，将生物样本从所述多级改进柱的压力部分进料，依序经过柱体中的IV部分、III部分、II部分和I部分，通过洗脱流出部分接收经处理与纯化后的生物样本。

9.根据权利要求8所述的快速前处理与纯化的方法，其特征在于，所述生物样本为血清，在进入所述多级改进柱纯化前经过酸解前处理，所述酸解前处理是将血清与浓酸混合待溶液中的气泡释放出来后，加入80-100目的硅胶，在低温下冷冻干燥浓缩，经该前处理后样本再从所述压力部分进料。

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