CN101864488A

CN101864488A - 一种用于微生物采油过程优势菌群监测的方法

Info

Publication number: CN101864488A
Application number: CN 201010199656
Authority: CN
Inventors: 黄永红; 魏利; 任国领; 伍晓林; 宋考平; 侯兆伟; 卞立红
Original assignee: Daqing Petroleum Administration Bureau
Current assignee: Daqing Petroleum Administration Bureau
Priority date: 2010-05-30
Filing date: 2010-05-30
Publication date: 2010-10-20
Anticipated expiration: 2030-05-30
Also published as: CN101864488B

Abstract

本发明涉及一种用于微生物采油过程优势菌群监测的方法。该方法包括下列步骤：(1)首先对微生物采油整个过程中代表性的样品在厌氧条件下取样，采用改良的DNA提取方法对总DNA进行提取；(2)筛选合适的PCR-DGGE引物，通过对已知的用于PCR-DGGE的引物，进行筛选；(3)筛选引物的PCR扩增体系的优化；(4)变性梯度凝胶电泳(DGGE)优化；(5)优势条带的胶回收测序；(6)优势条带的网络比对和分析。该方法能准确反映油藏微生物真实数量，能够准确而且快速地解析采油微生物在油藏中分布、迁移和变化，为提高石油采收率提供重要的理论指导。

Description

一种用于微生物采油过程优势菌群监测的方法

技术领域：

本发明涉及油田采油领域中一种用于微生物采油过程优势菌群监测的方法。

背景技术：

随着三次采油技术的发展，大庆油田进入高含水开发后期，对于低渗透油田而言，微生物采油技术具有较好的应用前景。对于维持油田的高产稳产，以及可持续发展具有重要的意义。

油藏微生物群落的解析和认知是开发和应用微生物采油技术的基础。传统上采用纯培养的方法来研究和认识油藏微生物群落，由于传统培养的方法存在着：(1)没有充分考虑和模拟环境条件，导致只有极少数的微生物(0.01％～1％)能够在人工培养条件下成活和被培养；(2)人工培养条件对微生物具有不同的选择性和富集效果，因而所检测到的微生物在种类、数量和功能上的相对情况是通过选择和富集后的结果，并不能完全准确地反映油藏中的真实情况；(3)无法准确地研究和了解油藏中微生物生态***的规律；(4)无法指导人们科学地调控油藏微生物群落达到提高采收率目的等问题。所以利用传统培养方法对油藏微生物群落的认知与实际情况存在较大的偏差，从而导致无法对油藏微生物群落进行准确、有效地调控，也无法高效地提高原油采收率。

目前，通过纯培养技术分离到的微生物仅占自然界的0.1％～15％左右，随着分子生物学和***发育分析方法的发展，尤其是基于16SrRNA基因的PCR扩增和探针杂交技术，能使我们更准确全面地认识特定生态***中的微生物种群多样性，通过分子生物学的方法对油藏微生物生态***的研究报道还比较少。其中Orphan等通过对样品总DNA建立了16S rDNA克隆文库分析了高温油田微生物群落结构的组成；Watanabel等通过荧光原位杂交(FISH)、构建文库、对原油储坑地层水中微生物群落进行了研究，并通过竞争PCR(cPCR)对其中优势菌群进行定量分析。所有研究结果表明原油储层存在很高的微生物多样性，这些结果使人们进一步了解了原油储层微生物生态***。

发明内容：

为了克服背景技术中存在的不足，本发明提供一种用于微生物采油过程优势菌群监测的方法，该方法能准确反映油藏微生物真实数量，能够准确而且快速地解析采油微生物在油藏中分布、迁移和变化，为提高石油采收率提供重要的理论指导。

本发明的技术方案是：本发明的方法包括下列步骤：

(1)、首先取油井采出液为样品，对样品中微生物的总DNA进行提取；

(2)、筛选合适的PCR-DGGE引物，通过对已知的用于PCR-DGGE的引物，进行筛选；

(3)、筛选引物的PCR扩增体系的优化；

(4)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)优化；

(5)、优势条带的胶回收测序；

(6)、优势条带的网络比对和分析。

上述方案中总DNA的提取：①将1mL油井采液振荡5min，然后3000r/min离心，留上清液；②加入2倍体积的10×PBS进行洗涤，振荡5min，然后12000r/min离心5min，去掉上清液；③加入10×PBS缓冲液100μL，然后超声40s；④用华舜“DNA小量细菌提取试剂盒”，进行后续的DNA提取，然后保存在-20℃冰箱中；

上述方案中筛选适合步骤(1)提取的DNA的PCR-DGGE引物，确定的引物为，DQF338：5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGG CACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’；DQR534：5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’；

上述方案中引物的PCR扩增体系：PCR反应体系(20μL)如下：10×buffer 2.0μL，2.0mmol/L dNTP 2μL，10pmol/L引物各1μL，TaqDNA酶0.3μL；PCR扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性1min，52℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环，72℃延伸20min。

上述方案中变性梯度凝胶电泳(DGGE)条件：①变性梯度胶的制备：使用梯度混合装置，制备6％(w/w)和8％(w/w)的聚丙烯酰胺凝胶，变性剂浓度从40％到60％，100％的变性剂为7mol/L的尿素和40％(w/w)的去离子甲酰胺的混合物，其中变性剂和丙烯酰胺的浓度从胶的上方向下方依次递增；②PCR样品的加样：待变性梯度胶完全聚合后，将胶板放入装有电泳缓冲液的电泳槽中，取PCR样品5μl和5μl的10×加样缓冲液混合后加入上样孔；③电泳及染色：引物扩增片断，在130V的电压下，60℃电泳7h；引物电泳结束后，将凝胶进行银染；④胶图扫描：将染色后的凝胶用UMAX PowerLook 1000透射扫描仪扫描后获取胶图。

上述方案中优势条带的胶回收测序：用胶回收试剂盒切胶回收，后与pGEM-T载体连接，转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞；LB固体培养基中加入氨苄青霉素Amp(5μg/mL)和X-gal，蓝白斑筛选转化子；提取质粒，用载体引物T7：5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’和SP6：5’-ATTTAG GTGACACTATAGAAT-3’检测；然后去测序。

上述方案中优势条带的网络比对和分析：所测定的序列与GenBank数据库中的已知序列进行相似性比较分析，确定是否为采油菌种和优势菌种。

本发明具有如下有益效果：本发明以微生物DNA、RNA为研究对象的“微生物分子生态学”非纯培养技术，不受微生物可培养性的限制，也克服了选择性培养不能准确反映油藏微生物真实数量的缺点，能够更准确、直接和全面地反映群落的结构及多样性。能够准确而且快速地解析采油微生物在油藏中分布、迁移和变化，这不仅对微生物驱油过程中微生物群落结构的研究和调控具有重要的指导意义，而且还为更有效的获得各种油藏微生物资源、调控油藏微生物群落，提高石油采收率提供重要的理论指导。

附图说明：

图1是微生物采油前、中、后单口油井的16S rRNA V3～V6区DGGE图谱；

图2是PCR-DGGE克隆序列与它们在GenBank中最相似的序列的***进化树；

图3微生物采油前、中、后的16S rRNA V3～V6区DGGE图谱；

图4PCR-DGGE克隆序列与它们在GenBank中最相似的序列的***进化树。

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明作进一步说明：

实施例1、北2-4-P49单井微生物采油种群动态变化监测方法，该方法包括下列步骤：

(1)、在厌氧条件下取油井采出水，对水样进行总DNA进行提取：①将1mL采出水振荡5min，然后3000r/min离心，留上清液；②加入2倍体积的10×PBS进行洗涤，振荡5min，然后12000r/min离心5min，去掉上清液；③加入10×PBS缓冲液100μL，然后超声细胞破碎仪(S-450D)超声40s；④用华舜是“DNA小量细菌提取试剂盒”，进行后续的DNA提取，然后保存在-20℃冰箱中；应用PBS缓冲液对油藏样品的洗涤有效地消除较高的背景值，有利于后续的试剂盒的提取；样品中的细菌的充分的裂解是DNA提取的另一个重要的前提。

(2)、筛选合适的PCR-DGGE引物，通过对已知的用于PCR-DGGE的引物，确定的引物为：DQF338：5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’；DQR534：5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’。

(3)、筛选引物的PCR扩增体系的优化，引物的PCR扩增体系：PCR反应体系(20μL)如下：10×buffer 2.0μL，2.0mmol/L dNTP 2μL，10pmol/L引物各1μL，Taq DNA酶0.3μL。PCR扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性1min，52℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环，72℃延伸20min。

(4)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)优化，变性梯度凝胶电泳(DGGE)电泳条件：①变性梯度胶的制备：使用梯度混合装置，制备6％和8％的聚丙烯酰胺凝胶，聚丙烯酰胺分子量300-900万，变性剂浓度从40％(w/w)到60％(w/w)(100％的变性剂为7mol/L的尿素和40％(w/w)的去离子甲酰胺的混合物)，其中变性剂和丙烯酰胺的浓度从胶的上方向下方依次递增。②PCR样品的加样：待变性梯度胶完全聚合后，将胶板放入装有电泳缓冲液的电泳槽中，取PCR样品5μl和5μl的10×加样缓冲液混合后加入上样孔。③电泳及染色：引物扩增片断，在130V的电压下，60℃电泳7h。引物电泳结束后，将凝胶进行银染其结果见图1。④胶图扫描：将染色后的凝胶用UMAX PowerLook 1000透射扫描仪扫描后获取胶图。

(5)、优势条带的胶回收测序：用胶回收试剂盒切胶回收后与pGEM-T载体(从Promega公司购买)连接，转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞(由天为时代公司购买)。LB固体培养基中加入氨苄青霉素Amp(5μg/mL)和X-gal，蓝白斑筛选转化子。提取质粒，用载体引物T7：5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’和SP6：5’-ATTTAGGTGACACTATAGAAT-3’检测。然后去测序。

(6)、优势条带的网络比对和分析：所测定的序列与GenBank数据库中的已知序列进行相似性比较分析，结果如图2，主要的优势种群为Pseudomonas sp.、Acinetobacter sp.、Clostridia bacterium、Thermomicrobium sp.、Agrobacterium sp.、Firmicutes bacterium、candidate division，同时还有许多的未知的菌种。采油菌种为Clostridiabacterium，表明在微生物采油过程中该菌株变得不再是优势菌株，有力的解释了微生物采油效果一般的问题。需要采油工艺进一步的改进。

实施例2、北2-4-P47单井微生物采油种群动态变化监测方法，步骤同实施例1。

实验针对不同的条带进行胶回收和克隆测序，见图3和图4。主要的优势种群为Acinetobacter johnsonii、Pseudomonasfluorescens.、Pseudomonas sp.、Bosea sp.、Syntrophothermuslipocalidus、Aeromonas media。

Claims

1.一种用于微生物采油过程优势菌群监测的方法，该方法包括下列步骤：

(3)、筛选引物的PCR扩增体系的优化；

(4)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)优化；

(5)、优势条带的胶回收测序；

(6)、优势条带的网络比对和分析。

2.根据权利要求1所述的用于微生物采油过程优势菌群监测的方法，其特征在于：总DNA的提取：①将1mL油井采出液振荡5min，然后3000r/min离心，留上清液；②加入2倍体积的10×PBS进行洗涤，振荡5min，然后12000r/min离心5min，去掉上清液；③加入10×PBS缓冲液100μL，然后超声40s；④用“DNA小量细菌提取试剂盒”，进行后续的DNA提取，然后保存在-20℃冰箱中；

3.根据权利要求1所述的用于微生物采油过程优势菌群监测的方法，其特征在于：筛选适合步骤(1)提取的DNA的PCR-DGGE引物，确定的引物为，DQF338：5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’；DQR534：5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’；

4.根据权利要求1所述的用于微生物采油过程优势菌群监测的方法，其特征在于：引物的PCR扩增体系：PCR反应体系(20μL)如下：10×buffer 2.0μL，2.0mmol/L dNTP 2μL，10pmol/L引物各1μL，Taq DNA酶0.3μL；PCR扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性1min，52℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环，72℃延伸20min。

5.根据权利要求1所述的用于微生物采油过程优势菌群监测的方法，其特征在于：变性梯度凝胶电泳(DGGE)条件：①变性梯度胶的制备：使用梯度混合装置，制备6％(w/w)和8％(w/w)的聚丙烯酰胺凝胶，变性剂浓度从40％到60％，100％的变性剂为7mol/L的尿素和40％(w/w)的去离子甲酰胺的混合物，其中变性剂和丙烯酰胺的浓度从胶的上方向下方依次递增；②PCR样品的加样：待变性梯度胶完全聚合后，将胶板放入装有电泳缓冲液的电泳槽中，取PCR样品5μl和5μl的10×加样缓冲液混合后加入上样孔；③电泳及染色：引物扩增片断，在130V的电压下，60℃电泳7h；引物电泳结束后，将凝胶进行银染；④胶图扫描：将染色后的凝胶用UMAX PowerLook 1000透射扫描仪扫描后获取胶图。

6.根据权利要求1所述的用于微生物采油过程优势菌群监测的方法，其特征在于：优势条带的胶回收测序：用胶回收试剂盒切胶回收，后与pGEM-T载体连接，转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞；LB固体培养基中加入氨苄青霉素Amp(5μg/mL)和X-gal，蓝白斑筛选转化子；提取质粒，用载体引物T7：5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’和SP6：5’-ATTTAG GTGACACTATAGAAT-3’检测；然后去测序。

7.根据权利要求1所述的用于微生物采油过程优势菌群监测的方法，其特征在于：优势条带的网络比对和分析：所测定的序列与GenBank数据库中的已知序列进行相似性比较分析，确定是否为采油菌种和优势菌种。