CN101863969A

CN101863969A - 分离的水稻雌性育性相关蛋白、其编码基因及其应用

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Publication number: CN101863969A
Application number: CN 201010194553
Authority: CN
Inventors: 李双成; 李平; 王世全; 邓其明; 王玲霞; 郑爱萍; 刘怀年; 朱军
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2010-06-04
Filing date: 2010-06-04
Publication date: 2010-10-20
Anticipated expiration: 2030-06-04
Also published as: CN101863969B

Abstract

本发明公开了一种分离的水稻雌性育性相关蛋白，其一级结构为如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；或所述SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的具有与其功能相同的衍生的蛋白；或与所述SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列至少有70％的同源性并具有与其功能相同的衍生的蛋白。本发明还提供了编码所述蛋白及其衍生物的基因。本发明提供的蛋白及其编码基因能够用于控制水稻雌性器官育性或控制水稻花粉管生长或鉴定水稻雌性育性。

Description

分离的水稻雌性育性相关蛋白、其编码基因及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程，特别是涉及一种分离的水稻雌性育性相关的蛋白、其编码基因及其应用。

背景技术

植物雌性不育现象在自然界广泛存在，已经在油松、大豆、玉米和水稻等植物上见诸报道。植物的雌性不育通常是由雌性器官的发育异常造成的，包括胚珠、胚囊、***的发育异常。根据被子植物生殖胚胎学，雌性不育可以分为三类，第一类为无雌性器官或不完整的雌性器官分化；第二类为雌性器官缺乏正常的胚囊，原因在于胚珠或大孢子发育受阻；第三类为胚囊发育正常，但受精后的胚胎发育异常。就水稻而言，研究得最多的是籼粳稻杂交后代产生的雌性不育现象，且绝大多数都是属于胚囊发育不正常的结构性败育。

目前，人们对植物雌性不育现象的研究主要集中在植物雌性不育的发生、细胞学、胚胎学方面。尽管已有一些植物雌性育性相关的基因被陆续克隆，但总体上植物雌性育性控制的分子机制还不明了。因此，植物雌性育性控制基因的克隆和功能研究，对于明确植物雌性育性控制的分子机理和不育特性在杂交稻生产中的应用具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种水稻雌性育性相关的蛋白、其编码基因、含有该编码基因的载体和细胞，及其应用。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：

发明人经过广泛的研究，应用图位克隆技术从水稻中获得一种雌性育性相关的基因，该基因的缺失导致水稻花粉管在花柱中异常生长，本发明人将之命名为花粉管生长受阻基因(PTB1)。该基因的表达是水稻雌性育性正常的基础，干扰该基因的表达或降低PTB1蛋白活性会导致水稻不育或结实率降低。因此该基因可以作为水稻雌性育性指标的分子标记，在水稻杂种优势利用中具有广泛的应用前景。

在此基础上，本发明提供一种分离的水稻雌性育性相关蛋白，其一级结构为如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；或为如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的具有与其功能相同的衍生的蛋白；或为与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少有70％的同源性并具有与其功能相同的衍生的蛋白。

同时，本发明提供一种分离的水稻雌性育性相关基因，所述基因的核苷酸序列为：编码上述蛋白的多聚核苷酸；或与编码上述蛋白的多聚核苷酸序列互补的多聚核苷酸；或与编码上述蛋白的多聚核苷酸中的连续100个核苷酸相同的衍生的多聚核苷酸。

本发明的其他方面由于本文公开的内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

本文中，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质分开，则为分离纯化的。

本文中，“分离的雌性育性蛋白”、“分离的PTB1蛋白”或“分离的PTB1多肽”是指PTB1蛋白基本上不含天然与其相关的其他蛋白、脂类、糖类或其他物质。本领域的普通技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化PTB1蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

本文中，术语“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由...构成”、“基本上由...构成”、和“由...构成”。

本文中，所述的“不育”的植物是指一种植物，其在适当的生长条件下生长至一定的阶段(如成熟阶段)时，比在相同条件下生长的同类植物的结实率显著降低(如降低40％；较佳地降低60％；更佳地降低80％；最佳地降低95％或更多)。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选的是重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或是使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括PTB1蛋白的片段、衍生物和类似物。本文中，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的PTB1蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(1)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守型氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(2)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(3)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(4)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白序列，或融合蛋白)。根据本文的定义，这些片段、衍生物和类似物属于本领域技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“PTB1蛋白”指具有SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括与SEQ ID NO.2序列的蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个或更少1-8个或1-5个)氨基酸的缺失、***和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域内，用性能相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个统称也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括PTB1蛋白的活性片段和活性衍生物。

多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨度条件下能与PTB1蛋白编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用PTB1蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。所述的同源序列是指具有与SEQ ID NO.2序列有至少50％，较佳地至少60％，70％，80％，更佳地至少85％，90％，95％相同性的多肽。本发明还提供了其他的多肽，如包含PTB1蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了PTB1蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有PTB1蛋白的至少约20个连续的氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约100个连续的氨基酸，最佳地至少约150个连续氨基酸。

本发明还提供PTB1蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然的PTB1蛋白的差异可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生的随机诱变，还可以通过定点诱变法或其他的已知的分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“PTB1蛋白保守性变异蛋白(多肽)”指与SEQ IDNO.2的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替代而形成的多肽，且保留与SEQ ID NO.2序列的蛋白相同的功能。

本发明还提供了编码本发明PTB1蛋白或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。

本发明的多聚核苷酸(基因)可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO.2所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO.2的蛋白质，但与SEQ ID NO.2所示的编码区序列有差别的核苷酸序列。

编码SEQ ID NO.2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和***变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，他可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或***，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，进一步较佳地至少80％，更佳地至少90％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低的离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(V/V)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在70％以上，较佳地至少80％以上，更佳地90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含有15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好地是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核算片段可用于核算的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码PTB1蛋白的多聚核苷酸。

本发明的PTB1蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得到有关的序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确的次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增值和的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可以利用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，先合成多个小片段，然后在进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可同过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸载体，以及用本发明的载体或PTB1蛋白编码序列经基因工程产生宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的DNA重组技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的PTB1蛋白。一般说来有以下步骤：

用本发明得的编码PTB1蛋白的多核苷酸或变异体，或用该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

在合适的培养基中培养宿主细胞；

从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

在本发明中，PTB1蛋白多核苷酸序列可***到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以使用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含PTB1蛋白编码DNA序列和合适的转录、翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中适当的启动子上，以指导mRNA的合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用二氢叶酸还原酶、新霉素抗性及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当的DNA序列以及适当启动子或者控制序列载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性的例子有：大肠杆菌，链霉菌属，农杆菌；真核细胞如酵母；植物细胞等。

本发明的提供的蛋白或其编码基因的用途，用于：

控制水稻雌性器官育性；

控制水稻花粉管生长；

鉴定雌性育性的分子标记。

本发明还涉及一种通过调节植物的育性改良植物的方法，该方法包括：调节所述植物中PTB1基因的表达或活性。促进还是抑制PTB1的表达活性主要取决于植物所需改良的性状而定。当需要增加植物的结实率时，可以通过提高所述植物中PTB1基因的表达或活性来实现；当需要降低植物的结实率，甚至使植物表现彻底不育时，可以通过降低所述植物中PTB1基因的表达或活性来实现。

增加PTB1基因的表达的方法是本领域周知的。例如，可通过转入携带PTB1编码基因的表达载体使植株过量表达PTB1；或可以通过强启动子驱动从而增强PTB1基因或其同源基因的表达；或者通过增强子(如水稻waxy基因第一内含子、Actin基因第一内含子)来增强该PTB1基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括但不限于：35S启动子、水稻的Actin1、Actin2启动子、玉米的Ubi启动子等。

抑制PTB1基因表达的方法也是本领域周知的，例如，可通过反义或RNA干扰(RNAi)或基因敲出来实现。

作为本发明的一种优选方式，获得PTB1基因高表达的植株的方法如下：

提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有所述的PTB1蛋白的编码序列；

将植物细胞、组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述PTB1蛋白编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

选择出转入所述PTB1蛋白编码序列的植物细胞、组织或器官；

将步骤(3)中的植物细胞、组织或器官再生成植株。

其中，可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件来实施此方法。

本发明还包括PTB1蛋白或其编码基因的拮抗剂或激动剂。由于PTB1的拮抗剂或激动剂可以调节PTB1的活性或表达，因此，所述的PTB1的拮抗剂或激动剂也可通过对PTB1的影响来调节植物的育性，从而达到植物性状改良的目的。

所述的PTB1的拮抗剂是指任何可降低PTB1蛋白的活性、降低PTB1基因或蛋白稳定性、下调PTB1蛋白的表达，减少PTB1蛋白有效作用时间、或抑制PTB1基因的转录和翻译的物质，这些物质均可以用于本发明，作为调节植物生长有用的物质。所述的PTB1的激动剂是指任何可提高PTB1蛋白的活性、维持PTB1基因或蛋白稳定性、上调PTB1蛋白的表达，提高PTB1蛋白有效作用时间、或促进PTB1基因的转录和翻译的物质，这些物质均可以用于本发明，作为调节植物生长有用的物质。

根据本发明的一个具体实施方式，提供了一种PTB1蛋白，其全长的开放阅读框(ORF)序列如SEQ ID NO.1所示，编码一个含有384个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO.2)。在野生型水稻和雌性不育突变体的序列分析表明，在突变体ORF中有252个核苷酸缺失，导致了一个提前的终止密码子，使得翻译提前终止表达蛋白截短，从而引起水稻不育的表型。通过转基因的方法，将正常的野生型基因PTB1导入到突变体中可恢复正常可育表型。

上述技术方案具有如下优点：

首次从水稻种发现水稻雌性育性控制基因(PTB1)，该基因的发现可以为揭示水稻雌性育性控制分子机理提供证据，也可以为水稻等植物的雌性育性控制改良提供新的技术途径。另外，考虑到育性控制在杂种优势利用中的重要性，PTB1基因在杂种优势利用特别是不育系繁殖方面具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为PTB1基因突变后的表型；

图2为野生型PTB1蛋白主要定位在细胞质中；

图3为野生型PTB1基因主要在雌蕊和维管束中表达；

图4为PTB1基因主要控制水稻育性。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非特别说明，否则百分比和分数按重量计算。

实施例1 PTB1基因的克隆

1、PTB1基因的图位克隆

在水稻恢复系202R中发现一个不育突变体，经细胞学和花粉管观察发现突变体表现为特异性雌性不育(图1A)，其不育的根本原因在于突变体花粉管在花柱中生长受阻(图1B)。利用G630等做母本与突变体杂交，构建分离群体，将基因定位，并通过精细定位和图位克隆技术克隆了该基因(PTB1)。

序列比较分析表明，在突变体ORF中有252个核苷酸缺失，导致了一个提前的终止密码子，使得翻译提前终止表达蛋白截短，从而引起水稻不育的表型。通过转基因的方法，将正常的野生型基因PTB1导入到突变体中可恢复正常可育表型。

野生型PTB1基因的序列如SEQ ID NO.1所示，编码一个全新的新蛋白，其序列如SEQ ID NO.2所示。进一步研究发现，在水稻基因组中没有PTB1的同源拷贝。PTB1基因的全长ORF长度为1155bp，编码384个氨基酸。

2、PTB1基因全长cDNA及启动子克隆

以正常野生型水稻日本晴品种的RNA为模板，合成第一链cDNA，用该PTB1基因ORF序列的5’和3’端的寡核苷酸作为PCR引物(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)，用高保真Taq酶Primerstar进行扩增，获得约1.5K的PTB1基因的全长cDNA扩增产物。将该扩增产物通过Bamh Ⅰ和Spe Ⅰ限制性酶切重组进载体pBluescript sk+的相应限制性内切酶多克隆位点，并对重组子进行测序验证。该重组的过渡质粒载体称为pBS-PTB1。

5’端的寡核苷酸序列为(SEQ ID NO.3)：

5’-GCCGGATCCATGGCGATGCGGGGGGTCGA-3’

3’端的寡核苷酸序列为(SEQ ID NO.4)：

5’-GGACTAGTGCGATCCGGCAGCTGATGC-3’

3、PTB1基因启动子克隆

在本实施例中，以正常野生型水稻日本晴品种的DNA为模板，以所述PTB1基因起始密码子前面约1.5K片段的5’和3’端的寡核苷酸作为PCR引物(SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6)，用高保真Taq酶KOD Plus进行扩增，获得约1.5K的PTB1基因的启动子扩增产物。将该扩增产物通过Pst Ⅰ和Bamh Ⅰ限制性酶切重组进载体pBluescriptsk+(商购)的相应限制性内切酶多克隆位点，并对重组子进行测序验证。该重组的过渡质粒载体称为pBS-PPTB1。

5’端的寡核苷酸序列为(SEQ ID NO.5)：

5’-AAACTGCAGAACATCTAATCTCATTAAATTTAAC-3’

3’端的寡核苷酸序列为(SEQ ID NO.6)：

5’-GCCGGATCCGGCCTGCTAGCTAGATCTGGC-3’

实施例2PTB 1基因的表达模式

在本实施例中，用Bamh Ⅰ和Spe Ⅰ限制性酶切pBS-PTB1和PA7-YFP，回收pBS-PTB1酶切消化后的约1.5K的PTB1基因全长cDNA片段，连入经酶切消化后的PA7-YFP的相同酶切位点，对重组子进行酶切和测序鉴定，构建细胞定位瞬时表达载体PA7-PT-YFP。利用基因枪轰击洋葱表皮细胞，同时瞬时转化拟南芥原生质体，用共聚焦显微镜观察荧光表达。结果如图显示，PTB1基因在细胞内主要在细胞质上表达(图2)。

本发明人还对该基因进行了组织表达定位的研究。用PstⅠ和BamhⅠ限制性酶切pBS-P_PTB1和P1300-GUS，回收pBS-P_PTB1酶切消化后的约1.5K的PTB1基因启动子片段，连入经酶切消化后的P1300-GUS的相同酶切位点，对重组子进行酶切和测序鉴定，构建组织定位表达载体P1300-P_PTB1-GUS。在该表达载体中GUS基因的表达有PTB1基因启动子驱动。用该载体转化拟南芥，发现GUS主要在雌蕊柱头中高效表达(图3A)，同时在雄蕊和维管束中也有较高表达(图3B)，证实所述PTB1基因和植物雌性育性相关。

实施例3PTB1基因水稻转基因试验

本实施例采用表达载体PHB(Mao等，2005，PNAS102：12270-12275，可商购)作为水稻转基因的载体。该载体编码一个细菌复制起点(ori)、卡那霉素抗性基因(Kan^r)、潮霉素抗性基因(Hyg^r)、除草剂抗性基因(Bar^r)、2×35S启动子、NOS基因终止信号序列以及用于连接目的片段的多克隆位点(MCS)。在限制性内切酶位点可***PTB1基因或其片段构建成转基因质粒。

1、PTB1基因互补表达载体构建

在本实施例中，首先用EcoR Ⅰ和Bamh Ⅰ限制性酶切pBS-P_PTB1和PHB，回收pBS-P_PTB1酶切消化后的约1.5K的PTB1基因的启动子片段，与回收的PHB经酶切消化后的约12K的载体骨架(去除掉2×35S启动子)连接，对重组子进行酶切和测序鉴定，构建中间载体PHB-P_PTB1。

用Bamh Ⅰ和Sac Ⅰ限制性酶切pBS-PTB1和PHB-P_PTB1，将pBS-PTB1消化后的约1.5K的全长cDNA片段连入PHB-P_PTB1的Bamh Ⅰ和Sac Ⅰ位点中，对重组子进行酶切和测序鉴定。这样成功构建PHB-P_PTB1-PTB1，其中PTB1基因的表达由自身启动子驱动。

2、PTB1基因过量表达载体构建

用HindⅢ和Sac Ⅰ限制性酶切pBS-PTB1和PHB，将pBS-PTB1消化后的约1.5K的全长cDNA片段连入PHB的HindⅢ和SacⅠ位点中，对重组子进行酶切和测序鉴定。这样成功构建PHB-PTB1，其中PTB1基因的表达由2×35S强启动子驱动。

3、PTB1基因干扰载体构建

在本实施例中，以正常野生型水稻日本晴品种的RNA为模板，合成第一链cDNA，用该PTB1基因ORF序列的5’端约500bp的片段末端寡核苷酸作为PCR引物(SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8)，用高保真Taq酶KOD Plus进行扩增，获得约500bp的PTB1基因的正向干扰片段扩增产物。同时用PCR引物(SEQ ID NO：9和SEQ IDNO：10)扩增获得反向干扰片段。将该正向扩增产物通过HindⅢ和EcoRⅠ限制性酶切重组进载体pBs-G(pBs的SmaⅠ已经***GUS内含子片段)的相应限制性内切酶多克隆位点，并对重组子进行测序验证。该重组的过渡质粒载体称为pBS-R1-G。将该反向扩增产物通过SpeⅠ和SacⅠ限制性酶切重组进载体pBS-R1-G的相应限制性内切酶多克隆位点，并对重组子进行测序验证。该重组的过渡质粒载体干扰结构中间载体pBS-R1-G-R2。最后用HindⅢ和SacⅠ限制性酶切pBS-R1-G-R2和PHB，将pBS-R1-G-R2消化后的约2K的干扰结构片段连入PHB的HindⅢ和SacⅠ位点中，对重组子进行酶切和测序鉴定。这样成功构建PHB-R1-G-R2，其中该干扰结构的表达由2×35S强启动子驱动。

5’端的寡核苷酸序列为(SEQ ID NO.7)：

5’-CCCAAAGCTTCTTCATCTTCCGCCTTCTCA-3’

3’端的寡核苷酸序列为(SEQ ID NO.8)：

5’-CGGAATTCTGCCTCAACTGCCTCTCTTT-3’

5’端的寡核苷酸序列为(SEQ ID NO.9)：

5’-CGGAGCTCCTTCATCTTCCGCCTTCTCA-3’

3’端的寡核苷酸序列为(SEQ ID NO.10)：

5’-GGACTAGTTGCCTCAACTGCCTCTCTTT-3’

4PTB1基因转化水稻试验

将上述PHB-P_PTB1-PTB1、PHB-PTB1和PHB-R1-G-R2通过冻融法导入农杆菌EHA105。从根癌土壤杆菌平板(4℃保存)挑取单菌落于YEP液体培养基(Km和Rif各50mg/L)中，28℃振荡培养12～18h，然后取1～5mL菌液接到100mL YEP液体培养基(含乙酰丁香酮100μmol/L)中，振荡培养4h后测OD值稀至相应浓度(OD＝0.5)。将新鲜菌液于8000rpm、4℃、5min收集菌体，并重悬于三分之一提及的AAM培养基中。加入放有生长旺盛的胚性愈伤组织的灭菌三角瓶中浸泡25min，再吹干表面菌液，将愈伤组织转接于共培养基上，28℃暗培养2～3d。共培养愈伤组织经无菌水和含Cef 500mg/L的无菌水漂洗后，在工作台上吹4h左右，转接于预培养基中28℃暗培养5～7d。将预培养的愈伤组织转接于含Hyg和Cef的筛选培养基上继续培养3～4周，再将抗性愈伤组织转接于仅含Hyg的筛选培养基上，筛选1～2次。取抗性愈伤组织转接于分化培养基上，28℃光照分化。分化小苗转接于生根培养基，28℃光照培养3～4周，开放培养炼苗7d左右，最后移栽到大田。

其中，PHB-P_PTB1-PTB1转化雌性不育突变体FS，PHB-PTB1和PHB-R1-G-R2转化正常野生型材料202R，PHB-PTB1也部分转化雌性不育突变体FS。雌性不育突变体愈伤组织获得采用幼穗培养，其余正常材料均为成熟胚来源组织培养诱导。

获得的再生植株移栽成活后用除草剂筛选转化植株；阳性植株提取叶片总DNA，经PCR进一步鉴定转化植株。用转基因T1代调查育性表型，验证PTB1基因功能。

实施例4PTB1基因功能分析

如实施例2所述的方法获得水稻PTB1互补表达的FS突变体转基因植株，用转基因T1代植株观察水稻育性。结果如图4A，转PTB1互补表达基因的植株的育性得到了恢复，变成正常可育，表明PTB1基因的表达是水稻维持正常育性所必须的。

如实施例2所述的方法获得水稻PTB1过量表达的转基因植株，用转基因T1代植株观察水稻育性。结果如图4C，转PTB1过量表达基因的FS植株的结实率较PTB1互补表达的FS植株有一定的提高。表明PTB1基因的高表达有利于提高水稻结实率。

如实施例2所述的方法获得水稻PTB1表达受干扰的转基因植株，用转基因T1代植株观察水稻育性。结果如图4B，PTB1基因表达下调的植株的结实率降低。同时，如图4D，在几乎检测不到PTB1基因表达的株系内，植株结实率接近突变体FS水平，表现不育。表明PTB1基因的下调表达会降低水稻结实率。

从上述分析可以看出，PTB1是水稻维持正常育性所必须的基因，缺失该基因会导致植株不育，上调该基因表达有利于植株结实率提高，下调该基因表达则降低植株的结实率。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>四川农业大学

<120>分离的水稻雌性育性相关蛋白、其编码基因及其应用

<130>KHP10112596.4

<160>10

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1155

<212>DNA

<213>PTB1

<400>1

atggcgatgc ggggggtcga tttcaagtgg tacgatggat tcttcctctc catgctcgcc 60

accagcctaa tcattgtctc catcaactgg aagaggtatc gtctctgcgc ccacccgttg 120

cacatatgga tcgtggtcga ctacaccacc gtcttcatct tccgccttct catgttcgtc 180

gataatggcc ttgccgccgg catgggattg gatcttggat ggcaacagag atatgctcgt 240

ttttgtggga gaattattgt cttgtcggtt cttgtgcttc ttctctatcc ctttctttgg 300

gtttggactg tgataggaac attgtggttt agcactgcaa gaggctgttt acccgaggaa 360

ggacaaaaat ggggcttcct tatatggctg cttttcagct actgtggtct cgcctgtatt 420

gcatgtgtgg ctgttggaaa gtggctaagc cgaaggcatg ctctccagca gagggcacaa 480

cagggaatac cagtctctga atatggggtt ttggttgaca tgatccgtgt gcctgattgg 540

gcatttgagg ccgttggctt ggaaatgaga ggaatgggcc aagatactgc atatcatcct 600

ggtctttatt taacagctgc tcaaagagag gcagttgagg cactgattca agaactcccg 660

aagttcagac tgaaagctgt tcctacagac tgcagtgagt gtccaatctg ccttgaagaa 720

ttccatgttg gcaacgaggt ccgtgggctc ccgtgcgcgc acaatttcca tgtggagtgc 780

atcgaccagt ggctccggct gaacgtcaag tgcccccgtt gccggtgctc cgtcttcccc 840

aacctcgacc tgagcgcgct caacaacctc cggccatcct ccgagccgga ccggccgtcg 900

gccagcgagg tgacagcggc gacgatggcg cggtacgtga ggtcgtcgca gccggctggg 960

cagagctacc tgctgcggct gcaggggctt ctgctgcggc aggtggtggt tcggcatggc 1020

ggcagcgacg acatggcgag cgccggcgct cttcatgtgg ccgccgcggt gactgcgccg 1080

gcgaccaccg gcggcgtgga gagcgagctg cctagcatag tggttgatgg tgggcatcag 1140

ctgccggatc gctga 1155

<210>2

<211>384

<212>PRT

<213>PTB1

<400>2

Met Ala Met Arg Gly Val Asp Phe Lys Trp Tyr Asp Gly Phe Phe Leu

1 5 10 15

Ser Met Leu Ala Thr Ser Leu Ile Ile Val Ser Ile Asn Trp Lys Arg

20 25 30

Tyr Arg Leu Cys Ala His Pro Leu His Ile Trp Ile Val Val Asp Tyr

35 40 45

Thr Thr Val Phe Ile Phe Arg Leu Leu Met Phe Val Asp Asn Gly Leu

50 55 60

Ala Ala Gly Met Gly Leu Asp Leu Gly Trp Gln Gln Arg Tyr Ala Arg

65 70 75 80

Phe Cys Gly Arg Ile Ile Val Leu Ser Val Leu Val Leu Leu Leu Tyr

85 90 95

Pro Phe Leu Trp Val Trp Thr Val Ile Gly Thr Leu Trp Phe Ser Thr

100 105 110

Ala Arg Gly Cys Leu Pro Glu Glu Gly Gln Lys Trp Gly Phe Leu Ile

115 120 125

Trp Leu Leu Phe Ser Tyr Cys Gly Leu Ala Cys Ile Ala Cys Val Ala

130 135 140

Val Gly Lys Trp Leu Ser Arg Arg His Ala Leu Gln Gln Arg Ala Gln

145 150 155 160

Gln Gly Ile Pro Val Ser Glu Tyr Gly Val Leu Val Asp Met Ile Arg

165 170 175

Val Pro Asp Trp Ala Phe Glu Ala Val Gly Leu Glu Met Arg Gly Met

180 185 190

Gly Gln Asp Thr Ala Tyr His Pro Gly Leu Tyr Leu Thr Ala Ala Gln

195 200 205

Arg Glu Ala Val Glu Ala Leu Ile Gln Glu Leu Pro Lys Phe Arg Leu

210 215 220

Lys Ala Val Pro Thr Asp Cys Ser Glu Cys Pro Ile Cys Leu Glu Glu

225 230 235 240

Phe His Val Gly Asn Glu Val Arg Gly Leu Pro Cys Ala His Asn Phe

245 250 255

His Val Glu Cys Ile Asp Gln Trp Leu Arg Leu Asn Val Lys Cys Pro

260 265 270

Arg Cys Arg Cys Ser Val Phe Pro Asn Leu Asp Leu Ser Ala Leu Asn

275 280 285

Asn Leu Arg Pro Ser Ser Glu Pro Asp Arg Pro Ser Ala Ser Glu Val

290 295 300

Thr Ala Ala Thr Met Ala Arg Tyr Val Arg Ser Ser Gln Pro Ala Gly

305 310 315 320

Gln Ser Tyr Leu Leu Arg Leu Gln Gly Leu Leu Leu Arg Gln Val Val

325 330 335

Val Arg His Gly Gly Ser Asp Asp Met Ala Ser Ala Gly Ala Leu His

340 345 350

Val Ala Ala Ala Val Thr Ala Pro Ala Thr Thr Gly Gly Val Glu Ser

355 360 365

Glu Leu Pro Ser Ile Val Val Asp Gly Gly His Gln Leu Pro Asp Arg

370 375 380

<210>3

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

gccggatcca tggcgatgcg gggggtcga 29

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

ggactagtgc gatccggcag ctgatgc 27

<210>5

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

aaactgcaga acatctaatc tcattaaatt taac 34

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

gccggatccg gcctgctagc tagatctggc 30

<210>7

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

cccaaagctt cttcatcttc cgccttctca 30

<210>8

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

cggaattctg cctcaactgc ctctcttt 28

<210>9

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

cggagctcct tcatcttccg ccttctca 28

<210>10

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

ggactagttg cctcaactgc ctctcttt 28

Claims

1.一种分离的水稻雌性育性相关蛋白，其特征在于，其一级结构为如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；或为如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的具有与其功能相同的衍生的蛋白；或为与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少有70％的同源性并具有与其功能相同的衍生的蛋白。

2.一种分离的水稻雌性育性相关基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列为：编码权利要求1所述蛋白的多聚核苷酸；或与编码权利要求1所述蛋白的多聚核苷酸序列互补的多聚核苷酸；或与编码权利要求1所述蛋白的多聚核苷酸中的连续100个核苷酸相同的衍生的多聚核苷酸。

3.如权利要求2所述的水稻雌性育性相关基因，其特征在于，其具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

4.含有权利要求2或3所述的基因的表达载体或重组载体。

5.含有权利要求4所述的载体或其基因组中整合有权利要求2或3所述的基因的宿主细胞。

6.权利要求2或3所述的基因在控制水稻雌性器官育性或控制水稻花粉管生长或鉴定水稻雌性育性中的应用。

7.一种调节水稻雌性育性的方法，其特征在于，提高或降低水稻中权利要求1所述蛋白的活性；或提高或降低权利要求2所述基因的表达。

8.一种促进或抑制权利要求1所述蛋白活性的激动剂或拮抗剂。

9.一种促进或抑制权利要求2所述基因表达的激动剂或拮抗剂。

10.权利要求8或9所述的激动剂或拮抗剂在控制水稻雌性器官育性或控制水稻花粉管生长或鉴定水稻雌性育性中的应用。