CN101848939A - G蛋白-寡核苷酸偶联物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及G蛋白偶联物，其通过将N-末端半胱氨酸标记的G蛋白变体与寡核苷酸通过连接物相连接而制备。所述偶联物以定向方式结合于生物芯片和生物传感器表面，由此提供具有改进的抗体固定化能力的生物芯片和生物传感器。

Description

G蛋白-寡核苷酸偶联物
技术领域
本发明涉及G蛋白偶联物(gA-G)，其通过使用连接物将N-末端半胱氨酸标记的G蛋白变体与寡核苷酸相连接而制备，本发明还涉及制备所述G蛋白偶联物的方法，以及通过使用所述偶联物制造的生物芯片和生物传感器。
背景技术
抗体因其具有特异性结合抗原的能力而被广泛用于涉及疾病诊断和治疗的医学研究以及生物学分析中(Curr.Opin.Biotechnol.12(2001)65-69，Curr.Opin.Chem.Biol.5(2001)40-45)。最近，已经开发出了免疫传感器作为免疫测定法，所述免疫传感器需要将抗体固定化于固相支持物，以便测量电流、阻抗和质量、光学特性等等的改变(Affinity Biosensors.vol.7：Techniques and protocols)。其中已经被商品化的是利用光学特性的基于表面等离子共振的免疫传感器。所述基于表面等离子共振的生物传感器可提供定性信息(两种分子彼此是否特异性结合)和定量信息(反应动力学和平衡常数)，还可在不使用标记的情况下进行实时感应，因此对于测量抗原一抗体结合而言特别有用(J.Mol.Recognit.1999，12，390-408)。
在免疫传感器中，将抗体选择性地并稳定地固定化于固相支持物非常重要。固定化抗体的技术分为两类，即物理固定化和化学固定化。物理固定化技术(Trends Anal.Chem.200019，530-540)已经极少使用，因为其导致蛋白质变性，且结果的可重复性较低。相反，化学固定化技术(Langumur，1997，13，6485-6490)则因表现出良好的可重复性和广泛的用途而被广泛使用，这是因为其使得蛋白质通过形成共价键而牢固结合。不过，当使用化学固定化技术固定化抗体时，作为非对称性大分子的抗体通常会失去其定向和结合抗原的活性(Analyst 121，29R-32R)。
为了增强抗体结合抗原的能力，可在抗体被连接至固相基材之前使用支持物，而使用G蛋白作为支持物的技术是已知的。不过，问题是G蛋白结合于支持物时其本身也失去定向及其结合抗体的能力。
因此，为了解决这一问题，已经提出了各种各样的方法。例如，使用2-亚氨基硫烷(2-iminothiolane)处理链球菌G蛋白以使得蛋白质的氨基酸基团硫醇化，然后将硫醇化的链球菌G蛋白固定化于表面。不过，这一方法涉及对具有氨基的氨基酸(Arg，Asn，Gln，Lys)的氨基进行硫醇化，而不是对任何特异性位点进行硫醇化，因此该方法的特异性较低，并在化学处理后需要额外的纯化处理(Biosensors and Bioelectronics，2005，21，103-110)。
DNA指导的固定化方法已经用于固定化蛋白质。已知DNA表面稳定，且相对于蛋白质芯片而言易于制备。对于蛋白质固定化，需要考虑以下因素，例如长期储存、不稳定蛋白质的固定化、或在不稳定条件下储存蛋白质。DNA指导的抗体固定化方法也已经有报道，例如，使用链霉抗生物素-DNA偶联物固定化生物素酰化抗体的方法，或直接将DNA连接于抗体。不过，这两种方法的缺点均在于必须将小分子或DNA连接于抗体，因此可导致其失去定向或抗原结合位点发生化学修饰。
发明内容
技术问题
本发明的目的在于解决以下问题，即抗体在结合免疫传感器后失去其定向的问题，并提供通过使用熟知的DNA表面以恒定的定向将抗体容易地固定化于各种各样的固相支持物上的技术。
技术方案
此前，本发明人已经制备了N-末端半胱氨酸标记的G蛋白变体(韩国专利申请10-2007-0052560)，并通过实验证实了其有效性，以解决抗体在结合免疫传感器后失去其定向的问题。同样，基于此发明，本发明人已经通过使用与胺基和硫醇基均能够发生选择性反应的连接物将具有胺基的寡核苷酸(gA)与半胱氨酸标记的G蛋白变体相连接而制备了G蛋白偶联物(gA-G)。本发明人发现，使用所述G蛋白偶联物，能够以恒定的定向将抗体容易地固定化于各种各样的固相支持物和表面的所需区域上，由此完成了本发明。
附图说明
图1显示了链球菌G蛋白与抗体结合的结合结构域(B1和B2)。
图2显示了用于本发明的G蛋白变体的结构和B2的氨基酸序列，后者是与抗体结合的结构域之一。
图3是蛋白电泳(SDS-PAGE)的照片，显示了用图2所示的表达载体转化的大肠杆菌(E.coli)内半胱氨酸标记的G蛋白变体的表达模式。
图4显示了生物传感器或生物芯片，其通过将具有寡核苷酸(gA)的G蛋白偶联物(gA-G)固定化于具有互补寡核苷酸(cA)的金薄膜表面上、然后固定化抗体而制备。
图5是分析G蛋白偶联物(gA-G)的蛋白电泳(SDS-PAGE)的照片。
图6显示了表面等离子共振信号的改变，其用于测量G蛋白偶联物(gA-G)、互补寡核苷酸(gA)、和非互补对照寡核苷酸(gB)与金薄膜表面上的寡核苷酸(cA)的反应。
图7显示了表面等离子共振信号的改变，其用于检测100nM PSA与G蛋白偶联物(gA-G)固定化的生物传感器中的抗体的反应。
图8是荧光扫描仪所获得的照片，其中将寡核苷酸(cA)连接于玻璃表面上的环氧基，然后使用DNA阵列仪制造阵列来固定化寡核苷酸(cA或cB)，然后以G蛋白偶联物(gA-G)和标记了荧光标记物Cy3的Cy3-小鼠IgG1(1nM)来处理所述表面。
图9是用于分析抗体固定化的金纳米粒子的形成的琼脂糖凝胶电泳的照片，其中(A)是连接了寡核苷酸(cA)的金纳米粒子(AuNP-cA)与互补寡核苷酸(gA)、G蛋白偶联物(gA-G)、非互补对照寡核苷酸(gB)、和非互补寡核苷酸(gB)-G蛋白变体(gB-G)反应之后的琼脂糖凝胶照片，(B)是G蛋白偶联物(gA-G)与具有两种不同数量的寡核苷酸(cA)的金纳米粒子(AuNP-cA-I，AuNP-cA-II)反应并去除未反应的G蛋白偶联物(gA-G)之后的用于分析抗体固定化的琼脂糖凝胶照片，(C)是显示IgG标记的AuNP-cA-I和AuNP-cA-II的示意图。
最佳实施方式
本发明的目的在于提供G蛋白偶联物(gA-G)，其通过使用与胺基和硫醇基均能够发生选择性反应的连接物连接N-末端半胱氨酸标记的G蛋白变体与包含胺基的寡核苷酸(gA)而制备。
本发明的另一个目的在于提供制备G蛋白偶联物(gA-G偶联物)的方法，其步骤包括使用与胺基和硫醇基均能够发生选择性反应的连接物以化学方法将G蛋白变体与包含胺基的寡核苷酸(gA)的相连接。
本发明的另一个目的在于提供通过将G蛋白偶联物(gA-G偶联物)附着于固相支持物的表面而制造的生物传感器以及制造生物芯片和生物传感器的方法，其特征在于将G蛋白偶联物连接于固相支持物，所述固相支持物的表面连接了具有与所述包含胺基的寡核苷酸(gA)互补的DNA序列的寡核苷酸(cA)。
本发明的另一个目的在于提供使用所述生物芯片或生物传感器来分析抗原的方法。
在实现本发明的目的的一个实施方式中，本发明涉及G蛋白偶联物(gA-G偶联物)，其通过使用与胺基和硫醇基均能够发生选择性反应的连接物连接N-末端半胱氨酸标记的G蛋白变体与包含胺基的寡核苷酸(gA)而制备。
本发明使用的N-末端半胱氨酸标记的G蛋白变体具有如下结构：
Ax-Cys-Ly-G蛋白-Qz
(其中A是氨基酸连接物，L是连接G蛋白与半胱氨酸标签的连接物，Q是蛋白质纯化标签，x是0至2，而y或z分别是0或1)。
G蛋白是分离自G组链球菌的细菌细胞壁蛋白质，并已知其结合哺乳动物抗体的Fc和Fab区域(J.Immuunol.Methods 1988，112，113-120)。不过，已知G蛋白结合Fc区域的亲和力比结合Fab区域的亲和力高大约10倍。天然G蛋白的DNA序列已经被分析并公开。链球菌G蛋白和葡萄球菌蛋白A是在***中发现的多种与细胞表面相互作用相关的蛋白质中的两种，具有结合免疫球蛋白抗体的特性。其中，链球菌G蛋白变体比葡萄球菌蛋白A更加有用，因为链球菌G蛋白变体能够结合更加广泛的哺乳动物抗体，因此可用作合适的抗体受体。
对本发明使用的G蛋白的来源没有特别限定，适合本发明使用的可以是天然G蛋白，其氨基酸序列可通过缺失、添加、取代等方式进行修饰，条件是其保持结合抗体的能力。在本发明的一个实施方式中，仅仅使用了链球菌G蛋白的抗体结合结构域(B1，B2)。
G蛋白-B1结构域由3个β-片层和1个α-螺旋组成，位于其C端的第三个β-片层与α-螺旋残余结合抗体Fc区域。B1结构域由SEQ ID NO.1代表，B2结构域由SEQ ID NO.2代表。将B1与B2结构域的氨基酸序列相互比较时，这4个序列中存在差异，但它们的结构却几乎没有差异。在本发明的一个实施方式中，使用了其中N端的10个氨基酸被缺失的B1结构域(图1)。已经有报道指出，即便使用N端缺失10个氨基酸残基形式的B1结构域，对其与抗体结合的功能也没有影响(Biochem.J.(1990)267，171-177，J.Mol.Biol(1994)243，906-918，Biochemistry(2000)39，6564-6571)。
在本申请中，术语“半胱氨酸标签(Cys)”指的是融合于G蛋白N端的半胱氨酸。优选的半胱氨酸标签由一个半胱氨酸组成。
在本发明的G蛋白变体中，半胱氨酸标签可通过共价键直接连接于G蛋白，或者可通过连接物(L)连接于G蛋白。连接物是具有任何序列的肽，其***G蛋白和半胱氨酸之间。连接物可以是由2至10个氨基酸组成的肽。在本发明的实施方式中，使用了由5个氨基酸组成的连接物。本发明的半胱氨酸标签不***G蛋白氨基酸序列的内部，并且其使得G蛋白附着于固相支持物后具有方向性。连接物附着后，硫醇基容易地向外侧暴露。因此，G蛋白可更有效地具有方向性地结合于生物传感器。
此外，可将0至2个氨基酸连接于本发明所使用的G蛋白变体的半胱氨酸标签。优选的氨基酸是甲硫氨酸。
为了容易地分离本发明的G蛋白变体，可在其C端进一步引入用于蛋白质纯化的标签(Q)。在本发明的实施方式中，其C端标记了六组氨酸，但对于蛋白质纯化用的标签而言，本发明可使用任何已知的标签，对此无特别限制。本发明的变体可含有甲硫氨酸，其充当原核细胞内的起始密码子，也可不含甲硫氨酸。在本发明的一个实施方式中，本发明人制备了一个半胱氨酸标记的变体。
可通过任何已知的方法制备本发明的G蛋白变体，例如肽合成法，特别是可通过遗传工程方法高效制备。遗传工程方法是通过基因操控而在宿主细胞例如大肠杆菌中表达大量所需蛋白质的方法，相关的技术可详见公开的文献(Molecular Biotechnology：Principle and Application of RecombinantDNA；ASM Press：1994，J.chem.Technol.Biotechnol.1993，56，3-13)。采用已知技术，可将编码用于本发明的G蛋白变体的核酸序列置于合适的表达载体中，并使用所述表达载体转化合适的宿主细胞，并培养所述细胞以制备所述G蛋白变体。制备用于本发明的G蛋白变体的方法详细记载于本发明人的韩国专利申请10-2007-0052560中，在此通过引用将该申请的全部内容并入本申请。
在本发明的一个实施方式中，按照图2所示制备了包含编码N-末端半胱氨酸标记的链球菌G蛋白变体的碱基序列的表达载体(pET-cys1-L-proteinG)。
半胱氨酸是具有硫醇基的氨基酸，已知将其***蛋白质内可特异性地固定化该蛋白质(FEBS Lett.1990，270，41-44，Biotechnol.Lett.1993，15，29-34)。其所公开的是用于结合位于链球菌G蛋白C端的半胱氨酸的方法。但在本发明中，具有硫醇基的半胱氨酸被用于标记N端，而N端远离链球菌G蛋白变体的活性结构域。链球菌G蛋白的结合抗体的活性结构域位于其C端(第三β-片层和α-螺旋)。因此，半胱氨酸不是用于标记G蛋白变体的内部，而是其N端，由此将抗体结合能力的丢失降至最低，而以半胱氨酸残基标记C端可出现抗体结合能力的丢失。
在本发明的实施方式中，制备了半胱氨酸标记的链球菌G蛋白变体(实施例1)。如上所述，通过基因操控将基因***蛋白质表达载体以表达所述蛋白质，然后通过蛋白电泳分离G蛋白变体。
在本申请中，寡核苷酸(引导寡核苷酸，下文也称gA)是长度为18至30个nt的寡聚物，可包括DNA、RNA、PNA和LNA，优选地为寡DNA。根据具体的目的，本领域人员可容易地选择任何序列，并采用已知的方法来制备，或可使用商品化的序列，例如，定制的寡核苷酸(Bioneer或IDT制造)。制备寡聚物的方法是本领域已知的。此外，用于本发明的寡核苷酸(gA)包含胺基，用于通过连接物结合G蛋白，所述胺基可位于碱基序列的5’-端、3’-端或内部。为了将胺基引入寡核苷酸(gA)，可通过本领域已知的方法使用胺基修饰寡核苷酸(gA)的特定区域。优选的寡核苷酸(gA)是其5’-端以胺基修饰的寡核苷酸。寡核苷酸的胺基通过连接物连接于G蛋白变体。
此外，用于本发明的寡核苷酸(gA)具有与一连接于生物传感器表面的寡核苷酸(下文称为cA)互补的碱基序列。
在本发明中，使用能够与胺基和硫醇基均发生反应的连接物(C)通过将寡核苷酸(gA)连接于G蛋白变体来制备G蛋白偶联物。本发明的连接物用于将包含胺基的寡核苷酸(gA)与G蛋白变体相连接，其实例为Sulfo-SMCC(硫代琥珀酰亚胺基-4-(氮-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(Sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate))、BMPS(N-马来酰亚胺基丙氧基琥珀酰亚胺酯(N-[Maleimidopropyloxy]succinimideester))、GMBS(N-马来酰亚胺基丁酰氧基琥珀酰亚胺酯(N-[Maleimidobutyryloxy]succinimide ester))和SMPB(酸琥珀酰亚胺基4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(Succinimidyl 4-[p-maleimidophenyl]butyrate))，但也可使用任何连接物，并无特殊限制，条件是其具有选择性地与胺基和硫醇基均发生反应的特性优选的连接物是Sulfo-SMCC。
通过连接物(C)将末端以胺基修饰的寡核苷酸(gA)与G蛋白变体相互连接，以制备G蛋白偶联物(gA-G)。为此，本发明的G蛋白变体和寡核苷酸(gA)分别具有一个硫醇基和一个胺基。因此，在形成偶联物后，寡核苷酸(gA)与G蛋白变体彼此依次相连。
本发明的G蛋白偶联物(gA-G)通过互补结合以定向的方式结合于生物传感器固相支持物表面上的寡核苷酸(cA)，由此可高效地结合抗体。因此，G蛋白偶联物可令人满意地用于利用抗原-抗体反应的生物芯片和生物传感器。
在另一实施方式中，本发明涉及制备所述G蛋白偶联物(gA-G)的方法，其步骤包括将G蛋白变体与末端以胺基修饰的寡核苷酸(gA)经由共价键连接于与胺基和硫醇基均能够发生反应的连接物。
如上所述的本发明的用于制备G蛋白偶联物(gA-G)的方法，该方法步骤包括：将G蛋白变体与末端以胺基修饰的寡核苷酸(gA)经由共价键连接于与胺基和硫醇基均能够发生反应的连接物，其中G蛋白变体和寡核苷酸(gA)中的任一个可先与连接物连接，然后再与另一个连接。
在一个优选的实施方式中，本发明的制备方法可进一步包括在偶联物形成之后分离和纯化所述G蛋白偶联物(gA-G)的步骤。在所述分离/纯化步骤中，本领域人员可合适地选择一或多种已知的蛋白质分离/纯化方法。
在一个具体的实施方式中，本发明人使用以阴离子交换Excellulose填充的柱和以IDA Excellulose填充的柱通过层析法分离了通过将5’-端以胺基修饰的寡核苷酸(gA)与标记有一个半胱氨酸的链球菌G蛋白变体连接于Sulfo-SMCC而制备的G蛋白偶联物(gA-G)。
在另一实施方式中，本发明涉及通过将G蛋白偶联物(gA-G)连接于固相支持物的表面上而制造的生物芯片或生物传感器，并涉及制造所述生物芯片或生物传感器的方法，其步骤包括：
a)将寡核苷酸(cA)连接于固相支持物的表面，所述寡核苷酸(cA)具有与G蛋白偶联物(gA-G)的寡核苷酸(gA)互补的碱基序列；
b)将固相支持物的表面上的寡核苷酸(cA)与G蛋白偶联物(gA-G)的寡核苷酸(gA)连接；和
c)将抗体与固定化于固相支持物上的G蛋白偶联物(gA-G)连接。
如以下表1所示，固相支持物的实例包括金属、膜、陶瓷、玻璃、聚合物表面或硅氧烷。优选的固相支持物是金薄膜或金纳米粒子。
[表1]用于自组装单层形成具有半胱氨酸基团的蛋白质的底物
Figure G2008800251801D00081
Figure G2008800251801D00091
此外，将具有与本发明的G蛋白偶联物(gA-G)的寡核苷酸(gA)互补的碱基序列的寡核苷酸(互补寡核苷酸，下文也称为cA)连接在固相支持物的表面上。根据生物芯片和生物传感器的固相支持物的结构，本领域人员可选择已知的方法将寡核苷酸连接于固相支持物的表面上。例如，对于玻片而言，可将以胺基修饰的互补寡核苷酸(cA)连接在用环氧基活化的玻片上，而对于金表面而言，其上可连接以硫醇基修饰的互补寡DNA(cA)，但并不局限于此。
在本发明的生物芯片和生物传感器中，构成本发明的G蛋白偶联物(gA-G)的寡核苷酸(gA)通过与固相支持物表面上的寡核苷酸(cA)互补结合而连接于固相支持物上，而连接于所述固相支持物的G蛋白偶联物与抗体结合。可通过将G蛋白偶联物和抗体与固相支持物接触而容易地制造本发明的生物芯片和生物传感器。
在另一实施方式中，本发明涉及使用生物芯片或生物传感器分析抗原的方法。本发明的生物芯片或生物传感器是一类免疫传感器，且可使用所述免疫传感器通过任何本领域熟知的方法进行抗原分析。优选地，可使用基于表面等离子共振的方法分析抗原。
下文将参照实施例详细描述本发明。不过，这些实施例仅是示例性的，本发明不限于这些实施例。
实施例
实施例1：半胱氨酸标记的链球菌G蛋白变体的蛋白表达分析
<1-1>半胱氨酸标记的链球菌G蛋白变体的基因制备
制备两种引物以便在N端标记上半胱氨酸。在5’-引物的碱基序列中，起始密码子(ATG)之后是GAT(Asp密码子)和TGC(半胱氨酸密码子)，为了与G蛋白连接，纳入了GGC GGC GGC GGC AGC(4个Gly密码子和1个Ser密码子)。此外，为了将基因***表达载体pET21a(Novagen)，在N端引物引入NdeI限制性位点，在C端引物引入XhoI限制性位点。获得链球菌基因组基因，使用上述引物进行聚合酶链反应(PCR)。由此，仅获得了已知为抗体所结合的结构域的氨基酸区域(B1[10个起始氨基酸残基被切割的形式]，B2)。使用与引入每一引物内的位点相同的限制性酶切割所获得的片段。然后将切割后的片段***以NdeI和XhoI限制性酶切割的pET21a载体，以制备pET-cys1-L-proteinG载体。该表达载体在N端表达Met。
5’引物1：有义(SEQ ID NO.1)
5-GGGAATTCCATATGGATTGCGGCGGCGGCGGCAGCAAAGGCGAAACAACTACTGAAGCT-3
3’引物2：反义(SEQ ID NO.2)
5-GAGCTCGAGTTCAGTTACCGTAAAGGTCTTAGTC-3
<1-2>蛋白电泳of半胱氨酸标记的链球菌G蛋白变体
以所制备的pET-cys1-L-proteinG转化大肠杆菌BL21细胞，在37℃摇瓶中培养，直至O.D.(光密度，A600nm)达到0.6。然后向其中加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，总浓度为1mM)，以便在25℃诱导蛋白质表达。14小时后离心大肠杆菌细胞，超声破裂所获得的细胞沉淀(Branson，Sonifier450，3KHz，3W，5min)，得到总蛋白溶液。通过离心将所述总蛋白溶液分离为可溶性蛋白质成分溶液和不溶性蛋白质成分溶液。为了纯化所述蛋白质溶液，将其中表达与六组氨酸偶联的重组基因的破裂细胞的溶液加载至填充了IDA Excellulose的柱上。使用洗脱液(50mM Tris-Cl，0.5M咪唑，0.5M NaCl，pH 8.0)洗脱出偶联了组氨酸的重组蛋白质。为了再一次纯化所获得的蛋白质溶液，将所述溶液加载至填充了Q纤维素的柱上，并以1MNaCl洗脱。然后以PBS(磷酸缓冲盐，pH 7.4)缓冲液透析所洗脱出的蛋白质溶液。
为进行蛋白电泳，将如上所述获得的蛋白质溶液与缓冲液(12mMTris-Cl，pH 6.8，5％甘油，2.88mM巯基乙醇，0.4％SDS，0.02％溴酚蓝)混合，在100℃加热5min，然后将所得物加载至聚丙烯酰胺凝胶上，后者为覆盖了5％浓缩胶(pH 6.8，宽度10cm，长度12.0cm)的1mm厚的15％分离胶(pH8.8，宽度20cm，长度10cm)。随后在200至100V和25mA条件下电泳1小时，然后以考马斯染液对凝胶染色以证实重组蛋白。
图3中的泳道如下：
泳道1：蛋白质分子量标准，
泳道2：以质粒pET-cys1-L-proteinG转化的大肠杆菌的总蛋白，
泳道3：以质粒pET-cys1-L-proteinG转化的大肠杆菌的可溶性蛋白质成分，
泳道4：通过IDA柱纯化的蛋白质，
泳道5：通过Q纤维素柱纯化的蛋白质。
实施例2：制备G蛋白偶联物(gA-G)
使用Sulfo-SMCC(硫代琥珀酰亚胺基-4-(氮-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯)将以胺基修饰的寡核苷酸(gA)与标记有一个半胱氨酸的链球菌G蛋白变体通过化学方法彼此连接，以便制备G蛋白偶联物(gA-G)。
具体地，60nmol的5’-端以胺基进行修饰的寡DNA(gA)溶解于400微升的0.25M磷酸缓冲液中，然后与溶解于75微升DMF溶液中的1.5mg的Sulfo-SMCC(3400nmol)反应。混合物在常温下反应1小时，然后使用结合缓冲液(20mM Tris，50mM NaCl，1mM EDTA pH7.0)通过Sephadex G25凝胶过滤将活化的寡DNA(gA)与过量的未反应Sulfo-SMCC分离。在进行寡DNA活化时，半胱氨酸标记的G蛋白变体与20mM DTT反应以便完全还原，随后凝胶过滤去除DTT。随后将所获得的半胱氨酸标记的G蛋白变体与活化的寡DNA(gA)在常温下立即反应2小时。
使用His-标记的亲和柱(IDA柱)将未连接于G蛋白的残余寡DNA(gA)与G蛋白变体和半胱氨酸标记的G蛋白偶联物(gA-G)分离。然后，使用离子交换柱纯化G蛋白偶联物(gA-G)以去除未结合的G蛋白变体。
通过以两个柱(填充IDA Excellulose的柱和填充阴离子交换Q纤维素的柱)进行层析来分离G蛋白偶联物(gA-G)，然后通过蛋白电泳(天然胶，SDS-PAGE)分析G蛋白偶联物(gA-G)。蛋白电泳之后将凝胶以凝胶红和考马斯染色，它们分别是DNA和蛋白质特异性染色试剂。结果发现，在天然胶中，G蛋白变体-DNA偶联物(gA-G)特异性地结合于具有互补DNA序列的寡聚物(cA)，导致其迁移的不同(泳道2与泳道3相比)。此外，仅在DNA染色中发现条带的强度增加。由此可见，G蛋白偶联物(gA-G)与互补寡聚物(cA)特异性地反应。
以上结果说明，在所制备的G蛋白偶联物(gA-G)中，G蛋白变体(G)与寡聚物(gA)彼此依次相连(图5)。
实施例3：制造G蛋白偶联物(gA-G)-固定化的生物传感器和生物芯片
将寡DNA(gA)化学连接于一个半胱氨酸标记的链球菌G蛋白变体，然后与金薄膜表面(其上连接有与寡DNA(gA)互补的寡DNA(cA))反应，以制造G蛋白偶联物(gA-G)-固定化的生物传感器和生物芯片。
具体地，将寡DNA(cA)与金薄膜的表面反应，然后通过基于表面等离子共振(SPR)的生物传感器测量表面等离子共振信号的变化，以实时检测互补寡DNA(gA)、G蛋白偶联物(gA-G)、和非互补对照寡DNA(gB)的固定化反应。
结果是，当注入非互补对照寡DNA(gB)时，表面等离子共振信号几乎没有改变。当注入互补寡DNA(gA，7.5kDa)时，表面等离子共振信号增加231RU。当注入寡DNA(gA)-G蛋白偶联物(gA-G，21.5kDa)时，表面等离子共振信号增加564RU，说明寡DNA(gA，7.5kDa)和G蛋白偶联物(gA-G，21.5kDa)特异性地连接于寡DNA(cA)-固定化的金薄膜表面上。
此外，还计算了所述表面(mm2)上连接的寡DNA(gA，7.5kDa)和G蛋白偶联物(gA-G，21.5kDa)的数量。寡DNA(gA，7.5kDa)的数量是1.8×1010分子/mm2。G蛋白偶联物(gA-G，21.5kDa)的数量是1.6×1010分子/mm2，其密度略低于寡DNA(gA，7.5kDa)。该结果说明G蛋白变体对寡DNA的互补反应略有干扰。
不过，表面等离子共振信号的改变是在表面与不同抗体反应后通过基于表面等离子共振(SPR)的生物传感器测量的，以便检测G蛋白偶联物(gA-G)高效结合抗体的能力(图6)。
实施例4：使用G蛋白偶联物(gA-G)-固定化的生物传感器检测抗原
使用生物传感器进行抗原检测，所述生物传感器经由通过寡DNA互补反应而固定化的链球菌G蛋白偶联物而与抗体结合。
具体地，将50nM G蛋白偶联物(gA-G)固定化于互补寡DNA(cA)-固定化的金薄膜表面，固定化时间为10分钟和7分钟，然后通过基于表面等离子共振的生物传感器测量表面等离子共振信号的变化，以检测抗体(抗人激肽释放酶3/PSA抗体，R&D systems，100nM)与其抗原(重组人激肽释放酶3/PSA，100nM)之间的反应。
结果是，当G蛋白偶联物(gA-G)反应10分钟时，表面等离子共振信号增加775RU。当G蛋白偶联物(gA-G)反应7分钟时，表面等离子共振信号增加297RU。当抗体与775RU的gA-G固定化的表面反应时，表面等离子共振信号增加2440RU。当抗体与297RU的gA-G固定化的表面反应时，表面等离子共振信号增加1296RU。当抗原与2440RU的抗体在775RU的gA-G固定化的表面上反应时，表面等离子共振信号增加435RU。当抗原与1296RU的抗体在297RU的gA-G固定化的表面上反应时，表面等离子共振信号增加231RU(图7)。
实施例5：使用连接于DNA阵列的G蛋白偶联物固定化抗体
在金薄膜表面之外的其他表面上制造DNA阵列，然后使用连接于DNA(gA，21.5kDa)的G蛋白偶联物固定化抗体。
具体地，将具有胺基的寡核苷酸(cA和cB)连接于玻璃表面上的环氧基，使用DNA阵列仪制造阵列，然后以BSA阻断非特异性反应。然后用G蛋白偶联物(gA-G)与标记有荧光标记物的抗体(单克隆小鼠IgG-Cy3(150nM))的混合溶液与所述表面反应，并使用荧光扫描仪测量荧光信号。
结果是，由于结合抗体的G蛋白偶联物(gA-G)与互补寡核苷酸cA结合，在寡核苷酸cB中没有观察到荧光，而在互补寡核苷酸cA中观察到荧光，说明可使用DNA阵列将抗体容易地固定化，而无非特异性反应(图8)。
实施例6：通过G蛋白偶联物(gA-G)制造抗体固定化的金纳米粒子
使用G蛋白偶联物(gA-G)制造了抗体固定化的金纳米粒子。
具体地，当互补寡核苷酸cA-连接的金纳米粒子连接于gA-G(21.5KDa)和gA(7.5KDa)时，gA-G(21.5KDa)-连接的条带(其是位于相对上方的条带)与阴性胶中的gA(7.5KDa)-连接的条带相比迁移较少。此外，为了将G蛋白偶联物(gA-G)充分连接于cA，将两个不同数量的互补寡核苷酸(cA)连接于金纳米粒子(允许与平均数量为21或9.5个gA连接)，将G蛋白偶联物(gA-G)与之连接，然后连接抗体(人IgG)。
结果发现，更多数量的G蛋白偶联物(gA-G)和抗体被连接至能够结合平均数量为21个gA的金纳米粒子上。
在本实验中，使用离心机回收连接于gA-G(21.5KDa)的金纳米粒子-cA，然后使用标记在蛋白质变体上的六组氨酸除去未反应的抗体。基于上述结果，G蛋白偶联物(gA-G)对于将抗体固定化于金纳米粒子上是非常有用的(图9)。
工业实用性
本发明的通过将N-末端半胱氨酸标记的G蛋白变体经由连接物与寡核苷酸相连接而制备的G蛋白偶联物(gA-G)以定向方式结合于生物传感器固相支持物的表面上的寡核苷酸(cA)，且因此高效地结合抗体，由此可满意地用于利用抗原抗体反应的生物芯片和生物传感器中。
序列表
<110>韩国生命工学研究院
 
<120>G蛋白-寡核苷酸偶联物
 
<130>PA9705-0306/KR
 
<160>2
 
<170>KopatentIn 1.71
 
<210>1
<211>59
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
 
<220>
<223>5’primer 1：sense
 
<400>1
gggaattcca tatggattgc ggcggcggcg gcagcaaagg cgaaacaact actgaagct          59
 
<210>2
<211>34
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
 
<220>
<223>3’primer：antisense
 
<400>2
gagctcgagt tcagttaccg taaaggtctt agtc                                     34

Claims (20)

1.G蛋白偶联物(gA-G偶联物)，其通过使用与胺基和硫醇基均能够发生选择性反应的连接物连接N-末端半胱氨酸标记的G蛋白变体与包含胺基的寡核苷酸(gA)而制备，所述N-末端半胱氨酸标记的G蛋白变体由下式代表：
Ax-Cys-Ly-G蛋白-Qz
(其中A是氨基酸连接物，L是连接G蛋白与半胱氨酸标签的连接物，Q是蛋白质纯化标签，x是0至2，而y或z分别是0或1)。
2.权利要求1的G蛋白偶联物，其中所述寡核苷酸(gA)选自如下一组：寡DNA、RNA、PNA(肽核酸)和LNA(锁定核酸)。
3.权利要求2的G蛋白偶联物，其中所述寡核苷酸(gA)是寡DNA。
4.权利要求1的G蛋白偶联物，其中所述包含胺基的寡核苷酸(gA)在其5’-端被胺基修饰。
5.权利要求1的G蛋白偶联物，其中所述与胺基和硫醇基均能够发生反应的连接物选自如下一组：Sulfo-SMCC(硫代琥珀酰亚胺基-4-(氮-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯)、BMPS(N-马来酰亚胺基丙氧基琥珀酰亚胺酯)、GMBS(N-马来酰亚胺基丁酰氧基琥珀酰亚胺酯)和SMPB(酸琥珀酰亚胺基4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸酯)。
6.权利要求1的G蛋白偶联物，其中所述寡核苷酸(gA)的长度为18至30nt。
7.权利要求1的G蛋白偶联物，其中所述G蛋白变体与寡核苷酸(gA)彼此依次相连。
8.权利要求1的G蛋白偶联物，其中连接G蛋白和半胱氨酸标签的所述连接物(L)是由2至10个氨基酸组成的肽。
9.权利要求8的G蛋白偶联物，其中连接G蛋白和半胱氨酸标签的所述连接物(L)的氨基酸序列为DDDDK(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)。
10.制备权利要求1至9中任一项的G蛋白偶联物的方法，其包括以下步骤：将N-末端半胱氨酸标记的G蛋白变体和包含胺基的寡核苷酸(gA)通过共价键连接于与胺基和硫醇基均能够发生反应的连接物，所述N-末端半胱氨酸标记的G蛋白变体由下式代表：
Ax-Cys-Ly-G蛋白-Qz
(其中A是氨基酸连接物，L是连接G蛋白与半胱氨酸标签的连接物，Q是蛋白质纯化标签，x是0至2，而y或z分别是0或1)。
11.权利要求10的制备G蛋白偶联物的方法，还包括在偶联物形成后分离并纯化所述G蛋白偶联物的步骤。
12.生物芯片或生物传感器，其通过将权利要求1至9中任一项的G蛋白偶联物连接到固相支持物的表面上而制造。
13.权利要求12的生物芯片或生物传感器，其中固相支持物的表面上连接了具有与所述G蛋白偶联物的寡核苷酸(gA)互补的碱基序列的寡核苷酸(cA)。
14.权利要求12的生物芯片或生物传感器，其中固相支持物选自如下一组：陶瓷、玻璃、聚合物、硅氧烷和金属。
15.权利要求14的生物芯片或生物传感器，其中所述生物芯片或生物传感器是金薄膜或金纳米粒子。
16.权利要求12的生物芯片或生物传感器，其中所述G蛋白偶联物连接了抗体。
17.制造生物芯片或生物传感器的方法，包括以下步骤：
a)将寡核苷酸(cA)连接到固相支持物的表面上，所述寡核苷酸(cA)具有与权利要求1至9中任一项的G蛋白偶联物的寡核苷酸(gA)互补的碱基序列；
b)将固相支持物的表面上的寡核苷酸(cA)与所述G蛋白偶联物的寡核苷酸(gA)连接；和
c)将抗体与固定化于固相支持物上的G蛋白偶联物连接。
18.权利要求17的方法，其中固相支持物选自如下一组：陶瓷、玻璃、聚合物、硅氧烷和金属。
19.权利要求18的生物芯片或生物传感器，其中所述生物芯片或生物传感器是金薄膜或金纳米粒子。
20.使用权利要求12的生物芯片或生物传感器分析抗原的方法。
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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