CN101848938A - 经修饰的植物防卫素 - Google Patents

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Abstract

在此，本发明包括用于减少或消除在宿主植物中转基因防卫素表达的毒性效应的一般方法。本发明还包括用于修饰编码防卫素的核酸的方法，由此修饰的核酸，和由经修饰的核酸序列编码的经修饰的防卫素。本发明还包括包含并表达经修饰的编码防卫素的核酸序列的转基因植物，所述植物展现出相比于在其他方面相当的表达未修饰的防卫素的转基因植物而言减少或消除的防卫素毒性效应。该经修饰的防卫素被称为嵌合防卫素，所述嵌合防卫素具有与第二植物防卫素或液泡易位肽的C-末端前肽结构域相组合的第一植物防卫素的成熟防卫素结构域。

Description

经修饰的植物防卫素
发明背景
植物以组成性或诱导型的方式产生各种化学化合物，以保护其自身免于环境胁迫、创伤或微生物侵袭。
在由植物精心制作的化学防御中，防御相关蛋白质的从头合成具有关键重要性(参见Lay，F.T.等人(2005)，Curr.Protein Pept.Sci.6：85-101以及其中所引用的参考文献)。一套防御相关蛋白质可以组成性地表达和/或由于食草动物或微生物侵袭造成创伤而被诱导。如此，这些蛋白质分别形成感染前和感染后防御屏障。这些蛋白质的例子包括酶抑制剂例如α-淀粉酶和蛋白酶抑制剂，水解酶例如1，3-β-葡聚糖酶和壳多糖酶，以及其他低分子量、富含半胱氨酸的抗微生物蛋白质。抗微生物化合物例如氧化酚类、单宁类和其他低分子量次生代谢物(例如植物抗毒素)的积累也在植物的化学防御策略中发挥重要作用。
在迄今已表征的植物抗微生物蛋白质中，大部分共享共同特征。它们一般是小的(＜10kDa)、高度碱性的蛋白质，并且常常包含偶数数目的半胱氨酸残基(通常为4、6或8个)。这些半胱氨酸全都参与分子内二硫键，并且给所述蛋白质提供了结构和热力学稳定性(Broekaert，W.F.等人(1997)Crit.Rev.Plant Sci.16：297-323)。基于氨基酸序列同一性(主要关于半胱氨酸残基的数目和间隔)，已定义了许多不同的家族。它们包括植物防卫素(Broekaert等人(1997)同上；Broekaert，W.F.等人(1995)PlantPhysiol.108：1353-1358；Lay，F.T.等人(2003)Plant Physiol.131：1283-1293)、硫素(Bohlmann，H.(1994)Crit.Rev.Plant Sci.13：1-16)、脂质转移蛋白(Kader，J.C.(1997)Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Mol.Biol.47：627-654；Kader，J.C.(1997)TrendsPlant Sci.2：66-70)、橡胶蛋白(Broekaert，W.F.等人(1992)Biochemistry 32：4308-4314)和knottin-类型蛋白质(Cammue，B.P.等人(1992)J.Biol.Chem.267：2228-2233)、以及来自全缘叶澳洲坚果(Macadamia integrifolia)(Marcus，J.P.等人(1997)Eur.J.Biochem.244：743-749；McManus，A.M.等人(1999)J.Mol.Biol.293：629-638)和凤仙花(Impatiens balsamina)(Tailor，R.H.等人(1997)J.Biol.Chem.272：24480-24487；Patel，S.U.等人(1998)Biochemistry 37：983-990)的抗微生物蛋白质(表1)。所有这些抗微生物蛋白质看起来在靶微生物的质膜水平上发挥其活性，尽管可能不同的蛋白质家族经由不同的机制起作用(Broekaert等人(1997)同上)。大环寡肽(cyclotide)是小的、富含半胱氨酸的植物肽的一个新家族，其在茜草科(Rubiaceae)和堇菜科(Violaceae)的成员中常见(在Craik，D.J.等人(1999)J.Mol.Biol.294：1327-1336；Craik，D.J.(2001)Toxicon 39：1809：1813；Craik，D.J.等人(2004)Curr.Prot.Pept.Sci.5：297-315中进行了综述)。已将这些不寻常的环状肽(表1)归结于各种生物学活性，包括抗菌(Tam，J.P.等人(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96：8913-8918)、抗-HIV(Gustafson，K.R.等人(1994)J.Am.Chem.Soc.116：9337-9338)和杀昆虫(Jenning s，C.等人(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98：10614-10619)性质。
表1
植物中的小的、富含半胱氨酸的抗微生物蛋白质
Figure G2008800195411D00021
显示了植物抗微生物蛋白质的代表性成员的成熟蛋白质的大小和半胱氨酸残基的间隔。共有序列中的数目代表了高度保守的半胱氨酸残基之间的氨基酸数目。二硫化物连接状况通过连接线给出。大环寡肽的环状主链通过虚线来描绘。(来自Lay和Anderson 2005)
植物防卫素是小的(～5kDa，45至54个氨基酸)、碱性的、富含半胱氨酸的(通常为8个半胱氨酸残基)蛋白质。这个家族的第一批成员分离自大麦(Mendez，E.等人(1990)Eur.J.Biochem.，194：533-539)和小麦(Colilla，F.J.等人(1990)FEBS Lett.270：191-194)的胚乳，并且被提出形成了硫素家族的新亚类(γ-硫素)，其不同于α-和β-亚类(Bohlmann等人(1994)同上)。因此，这些大麦和小麦蛋白质分别被称为γ1-大麦硫素(γ1-hordothionin)(γ1-H)以及γ1-和γ2-嘌呤硫素(γ1-P和γ2-P)(Mendez等人(1990)同上；Colilla等人(1990)同上)。它们最初被分配为硫素家族的γ-硫素亚类是基于在大小、电荷和半胱氨酸含量方面与α-和β-硫素的相似性，然而，半胱氨酸的间隔显著不同(Bohlmann(1994)同上；Mendez等人(1990)同上；Colilla等人(1990)同上)(表1，图1)。
在随后数年中，鉴定出了众多其他γ-硫素样蛋白质，作为纯化的蛋白质，或者从单子叶和双子叶植物的cDNA推导出的蛋白质(在Broekaert等人(1997)和(1995)(同上)中进行了综述)。“植物防卫素”这一名称在1995年由Terras及同事创造出，他们从萝卜种子中分离出了两种抗真菌蛋白质(Rs-AFP1和Rs-AFP2)，并且注意到这些蛋白质在一级和三维结构水平上与昆虫防卫素比与植物硫素更相关(Terras，F.R.G.等人(1995)Plant Cell 7：573-588)。
植物防卫素具有遍及植物界的广泛分布，并且可能存在于大多数(如果不是全部)植物中(Broekaert(1997)和(1995)同上；Osborn，R.W.等人(1995)FEBS Lett.368：257-262；Osborn，R.W.等人(1999)Seed proteins(Shewry，P.R.和Casey，R.编辑)第727-751页，Kluwer Academic Publishers，Dordrecht；Shewry，P.R.等人(1997)Adv.Bot.Res.26：135-192)。大多数植物防卫素已从丰富地含有它们的种子中分离出来，并且已在分子、生物化学和结构水平上进行了表征(Broekaert等人(1995)同上；Thomma，B.P.H.J.等人(2003)Curr.Drug.Targets-Infect.Dis.3：1-8)。还已在其他组织中鉴定出了防卫素，包括叶(Terras等人(1995)同上；Kragh，K.M.等人(1995)Mol.Plant-Microbe Interact.8：424-434；Yamada S.等人(1997)Plant Physiol.115：314；Komori，T.等人(1997)PlantPhysiol.115；314；Segura，A.等人(1998)FEBS Lett.435：159-162)、荚果(Chiang，C.C.等人(1991)Mol.Plant-MicrobeInteract.4：324-331)、块茎(Moreno，M.等人(1994)Eur.J.Biochem 223：135-139)、果实(Meyer，B.等人(1996)Plant Physiol.112：615-622；Aluru，M.等人(1999)Plant Physiol.120：633；Wisniewski，M.E.等人(2003)Physiol.Plant.119：563-572)、根(Sharma，P.等人(1996)Plant Mol.Biol 31：707-712)、树皮(Wisniewski等人(2003)同上)和花组织(Lay等人2003同上；Moreno等人(1994)同上；Gu，Q.等人(1992)Mol.Gen.Genet.234：89-96；Milligan，S.B.等人(1995)Plant Mol.Biol.28：691-711；Karunanandaa，B.等人(1994)Plant Mol.Biol.26：459-464；Li，H.-Y.等人(1999)Plant Physiol.120：633；Urdangarin，M.C.等人(2000)Plant Physiol.Biochem.38：253-258；van den Heuvel，K.J.P.T.等人(2001)J.Exp.Bot.52：1427-1436；Park，C.H.等人(2001)Plant Mol.Biol.50：59-69)。
Lay等人(2005)(同上)发表了几种鉴定出的防卫素(作为纯化的蛋白质或从cDNA推导出的蛋白质)的氨基酸序列比对。其他植物防卫素公开在于2003年6月28日授权的美国专利6,911,577；于2000年3月2日公布的国际公开WO 00/11196；和于2005年2月15日授权的美国专利6,855,865中。植物防卫素展现出清楚的(虽然相对有限的)序列保守。严格保守的是8个半胱氨酸残基(相对于Rs-AFP2进行编号)。在大多数情况下，两个甘氨酸(位置13和34)、丝氨酸(位置8)、芳香族残基(位置11)和谷氨酸(位置29)也是保守的。
两类植物防卫素
根据从cDNA克隆预测的前体蛋白质的结构，可以将植物防卫素分成两个主要类别(Lay等人2003同上)(图2A-2B)。在第一个且最大的类别中，前体蛋白质由内质网(ER)信号序列和成熟防卫素结构域组成。这些蛋白质进入分泌途径，并且不具有明显的用于翻译后修饰或亚细胞靶向的信号(图2A)。
第二类防卫素作为具有长度为约33个氨基酸的C-末端前结构域或前肽(CTPP)的更大的前体而产生(图2B)。大多数这些防卫素已在茄科物种中得到鉴定，在这些茄科物种中它们在花组织(Lay等人2003同上；Gu等人(1992)同上；Milligan，S.B.等人(1995)PlantMol.Biol.28：691-711；Brandstadter，J.等人(1996)Mol.Gen.Genet.252：146-154)和果实(Aluru等人(1999)同上)中组成性地表达。此外，也可以在某些烟草属(Nicotiana)物种的叶中通过盐胁迫来诱导防卫素表达(Yamada等人(1997)同上；Komori等人(1997)同上)。来自花烟草(Nicotiana alata)(NaD1)和碧冬茄(Petunia hybrida)(PhD1和PhD2)的茄科防卫素的前结构域在成熟过程中通过蛋白水解而被去除(Lay等人2003同上)。
在茄科防卫素上的C-末端前结构域具有不寻常地高含量的酸性和疏水性氨基酸(参考图3A-3D)。有趣的是，在中性pH下，前结构域的负电荷平衡防卫素结构域的正电荷(图3C)。这个特征令人想起哺乳动物防卫素(Michaelson，D.等人(1992)J.Leucoc.Biol.51：634-639；Yount，N.Y.等人(1995)J.Immunol.155：4476-4484)和昆虫防卫素(Lowenberger，C.A.等人(1999)Insect Mol.Biol.8：107-118)，以及植物硫素(Bohlmann(1994)同上；Romero，A.等人(1997)Eur.J.Biochem.243：202-208)上存在的前结构域(也称为前片或前区段)。然而，一个差异是哺乳动物和昆虫防卫素中的前结构域位于防卫素结构域的N-末端侧上。尽管具有C-末端前结构域的防卫素在茄科中最常见，但它们并不限于这个植物科。来自玉蜀黍(Zea mays)(禾本科(Poaceae))的ZmESR-6编码具有长度为28个氨基酸的C-末端结构域的防卫素，该C-末端结构域富含疏水和酸性氨基酸并且是潜在的液泡靶向信号(图3B，图3D)。还鉴定了向日葵(菊科(Asteraceae))防卫素Ha-DEF1，其编码具有C-末端前结构域的前体蛋白质(de Zélicourt A.等人(2007)Planta 226：591-600)。有趣的是，它的长度为30个氨基酸的C-末端结构域携带不寻常的总体正电荷。蛋白质和DNA数据库也描述了相应于另一个类别的嵌合防卫素蛋白质的序列(图3D)。这些嵌合防卫素具有长度为50个氨基酸或更多个氨基酸的C-末端结构域，其富含脯氨酸并且不类似于液泡靶向信号(图3D)。
已提出了C-末端前结构域的几种可能的作用。一种假设是，它可能充当靶向序列以用于亚细胞分选。对于人嗜中性粒细胞α-防卫素1(HNP-1)的前结构域提出了此种功能，在其中它可能对于正常的亚细胞运输和翻译后蛋白水解加工是重要的[Liu，L.等人(1995)Blood85：1095-1103]。类似地，植物硫素上的前结构域看起来在液泡靶向和加工中具有作用(Romero等人(1997)同上)。
在对花烟草花药和子房的超薄切片施行的免疫金电子显微镜术实验中，Lay及同事(Lay等人2003同上)证明，NaD1特异地位于液泡中。这与经充分研究的缺乏前结构域的种子防卫素例如Rs-AFP2(萝卜)和alfAFP(苜蓿)的细胞外定位明显不同(Terras等人(1995)同上；Gao，A.G.等人(2000)Nat.Biotechnol.18：1307-1310)。此外，尽管不存在定义C-末端液泡分选决定簇的共有序列(Nielsen，K.J.等人(1996)Biochemistry 35：369-378；Neuhaus，J.-M.(1996)Plant Physiol.Biochem.34：217-221)，但在茄科防卫素的前结构域中酸性和疏水性氨基酸的高含量与其他植物液泡分选决定簇相一致(Lay等人2003同上)(图4)。此外，前结构域包含具有4个氨基酸的基序(在图4中带阴影的)，这些基序也存在于来自大麦凝集素(barley lectin)和小麦胚凝集素(wheat germ agglutinin)的液泡靶向序列中。在烟草防卫素以及大麦凝集素和小麦胚凝集素上的液泡靶向基序之间的相似性暗示，来自茄科防卫素的C-末端前肽在单子叶以及双子叶植物中充当液泡靶向信号。已知大麦凝集素中的VFAE(SEQ ID NO：43)序列(图4)对于液泡靶向来说是足够的(Bednarek，S.Y.和Raikhel，N.V.(1992)Plant Mol Biol.20：133-150)。已描述了其他负责液泡靶向的C-末端序列(Shinshi等人，Plant Molec.Biol.14：357-368(1990))。
另一方面，在与防卫素和前结构域相关的静电电荷方面的不同暗示，前结构域可以通过用作分子内立体分子伴侣和/或通过阻止在经由分泌途径的易位过程中防卫素和其他细胞蛋白质或脂质膜之间的有害相互作用来帮助防卫素成熟。已对于哺乳动物α-防卫素、昆虫防卫素和硫素提出了这些假设(Bohlmann(1994)同上；Michaelson等人(1992)同上；Liu等人(1995)同上；Florack，D.E.A.等人(1994)Plant Mol.Biol.26：25-37；Florack，D.E.等人(1994)Plant Mol.Biol.24：83-96)。
防卫素作为多基因家族进行表达
如同许多其他植物防御相关蛋白质一样，植物防卫素由多基因家族编码。这在拟南芥(Arabidopsis thaliana)和截形苜蓿(Medicagotruncatula)中特别充分地进行了阐明，其中公众可得的序列数据库的比较序列分析揭示出，存在有在这些植物中单独存在的几百种防卫素样(DEFL)基因(Silverstein，K.A.等人(2005)Plant Physiol.138：600-610；Fedorova，M.J.等人(2002)Plant Physiol.130：519-537；Graham，M.A.等人(2004)Plant Physiol.135：1179-1197；Mergaert，P.K.等人(2003)Plant Physiol.132：161-173)。
使用几种拟南芥属防卫素来进行的表达研究揭示出，这些基因展示出不同的器官特异性表达模式(Epple，P.等人(1997)FEBS Lett.400：168-172；Thomma，B.P.H.J.等人(1998a)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95：15107-15111；Thomma，B.P.H.J.等人(1998b)PlantPhysiol.Biochem.36：553-537)。某些是组成性表达的，而其他在病原体感染后在叶中被上调(Epple等人(1997)同上；Thomma等人(1998-A)同上；Thomma等人(1998-B)同上)。因此，大多数植物组织组成性地表达两种或更多种防卫素基因，这暗示独个防卫素在特定环境下或在特定位点处表达。
防卫素的纯化
在最近的20年，已纯化出了众多植物防卫素，特别是从相对丰富地含有这些蛋白质的种子中(Osborn等人(1995)同上；Terras，F.R.G.等人(1992)J.Biol.Chem.267：15301-15309)。尽管关于防卫素纯化已报道了几种不同的方法，但这些方法中的许多依赖于该蛋白质的固有物理-生物化学性质，例如它们的小尺寸、总体净正电荷、对酸和有机溶剂的耐受性、以及其热稳定性。类似地，其他小的、碱性的、富含半胱氨酸的蛋白质例如硫素(Bohlmann(1994)同上)和植物大环寡肽(Craik等人(1999)同上)的纯化也利用了这些性质。这反映于在最初的提取中使用弱酸(例如50mM硫酸)(Lay等人2003同上；Ozaki，Y.等人(1980)J.Biochem.I87：549-555；Zhang，N.Y.等人(1997-A)Cereal Chem.74：119-122；Zhang，Y.和Lewis，K.(1997-B)FEMS Microbiol.Lett.149：59-64)或有机溶剂(Craik等人(1999)同上)，加热样品以去除热不稳定的蛋白质(Lay等人2003同上；Terras等人(1992)同上；Saitoh，H.等人(2001)Mol.Plant-Microbe Interact.14：111-115)，以及各种色谱法步骤的组合，包括凝胶(大小排阻)过滤、离子交换和反相高效液相色谱法(Lay等人2003同上；Terras等人(1992)同上；Zhang等人(1997a)同上；Zhang和Lewis(1997-B)同上)。
已使用异源表达***来大量地产生防卫素。Vilas Alves，A.L.等人(1994)FEBS Lett.348：228-232在酿酒酵母(S.cerevisiae)中产生了功能性Rs-AFP2，而Kristensen，A.K.等人(1999)ProteinExpr.Purif.16：377-387，Almeida，M.S.等人(2001)Arch.Biochem.Biophys.395：199-207和Wisniewski，M.E.等人(2003)Physiol.Plant.119：563-572分别在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达了甜菜(AX2)、豌豆(Psd1)和桃(PpDfn1)防卫素。在更加新型的方法中，Saitoh等人(同上)通过用携带WTI cDNA的马铃薯X病毒载体感染植物而在本氏烟草(Nicotiana benthamiana)的叶中产生了山嵛菜(wasabi)防卫素(WT1)。在2002年，Chen及同事使用基于内含肽的***来在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达绿豆防卫素(VrCRP)(Chen，K.C.等人(2002)J.Agric.Food Chem.50：7258-7263)。
植物防卫素的生物学活性
已将广泛多样的生物学活性归因于植物防卫素，包括对广泛范围的真菌(Broekaert等人(1997)同上；Lay等人2003同上；Osborn等人(1995)同上；Terras等人(1993)FEBS Lett.316：233-240)，以及革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌(Segura等人(1998)同上；Moreno等人(1994)同上；Zhang等人(1997-B)同上)的生长抑制效应。某些防卫素还是消化酶例如α-淀粉酶(Zhang等人(1997a)同上；Bloch C.Jr.等人(1991)FEBS Lett.279：101-104)和丝氨酸蛋白酶(Wijaya，R.等人(2000)Plant Sci.159：243-2555；Melo，F.R.等人(2002)Proteins 48：311-319)的有效抑制剂，这两种功能与在保护免于昆虫取食中的作用相一致。这得到了下述观察结果的支持：当以0.2％(w/w)掺入到人工饮食中时，由细菌表达的绿豆防卫素VrCRP对于绿豆象(Callosobruchus chinensis)是致命的(Chen等人(2002)同上)。某些防卫素还抑制蛋白质翻译(Mendez等人(1990)同上；Colilla等人(1990)同上；Mendez，E.等人(1996)Eur.J.Biochem.239：67-73)或者与离子通道结合(Kushmerick，C.等人(1998)FEBS Lett.440-302-306)(表2)。来自叶芽拟南芥(Arabidopsis halleri)的防卫素还赋予锌耐受性，这暗示了在胁迫适应中的作用(Mirouze，M.J.等人(2007)Plant J.47：329-342)。更新近地，向日葵防卫素显示出在列当属(Orobanche)寄生植物中诱导细胞死亡(de Zélicourt等人(2007)同上)。引人兴趣的是，独个防卫素展现出这些性质中的一种或两种，但并非这些性质中的全部。
抗真菌活性
植物防卫素的经最佳表征的活性是它们以各不相同的效力抑制大量真菌物种的能力(例如，参见Broekaert等人(1997)同上；Lay等人2003同上；Osborn等人(1995)同上)。例如，Rs-AFP2在1μg/mL时抑制甜菜茎点霉(Phoma betae)的生长，但在100μg/mL时针对核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)是无效的(Terras等人(1992)同上)。基于它们对于真菌黄色镰孢(Fusarium culmorum)的生长和形态的影响，可以区分出两组防卫素。“形态发生”植物防卫素引起减少的菌丝延长，伴随着菌丝分支的增加，而“非形态发生”植物防卫素减少菌丝延长的速率，但不诱导显著的形态变形(Osborn等人(1995)同上)。
许多防卫素展示出抗真菌活性，但仅对于四种防卫素阐述了关于此种活性的分子基础。DmAMP1和RsAFP2防卫素与真菌膜中的不同鞘脂靶标结合，并因而显示出不同的针对这些真菌的特异性。编码肌醇磷酸转移酶的基因(IPT1)被鉴定为在酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中决定了对于DmAMP1的敏感性。这种酶催化鞘脂甘露糖基二肌醇磷酸神经酰胺(M(IP)2C)的生物合成的最后一个步骤。缺乏功能性IPT1基因的突变株在其质膜中缺少M(IP)2C，结合相比于野生型菌株而言更少的DmAMP1，并且变得对于由DmAMP1介导的抑制具有高度的抗性。对于RsAFP2，巴斯德毕赤酵母中决定敏感性的基因是GCS，其编码葡糖神经酰胺合酶，这是一种牵涉葡糖神经酰胺的合成的酶。参见Lay，F.T.等人(2005)同上；Thevissen，K.等人(2003)FEBS Microbiol.Lett.226：169-173；Thevissen K.等人(2004)J.Biol.Chem.279：3900-3905。
更新近地，已显示，豌豆防卫素Psd1被吸收入细胞中，并且进入粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)的细胞核，在那里它与牵涉细胞周期控制的核细胞周期蛋白样蛋白质相互作用(Lobo，D.S.等人(2007)Biochemistry46：987-96)。对于MsDef1(来自苜蓿的防卫素)，两个促***原活化蛋白(MAP)激酶信号传导级联在调节对于禾谷镰孢(Fusarium graminearum)的MsDef1活性中具有主要作用(Ramamoorthy，V.等人(2007)Cell Microbiol.9：1491-506)。
在转基因植物中利用植物防卫素
迄今，已用植物防卫素基因转化了几种植物。这些基因、其接纳体植物和靶病原体的列表呈现于表2中。萝卜防卫素(Rs-AFP2)的组成性表达增强了烟草植物对于真菌叶病原体长柄链格孢(Alternarialongipes)的抗性，和类似地在番茄中增强了对于马铃薯早疫病链格孢(A.solani)的抗性(Ohtani，S.等人(1977)J.Biochem.(Tokyo)82：753-7657)。组成性地表达豌豆防卫素的卡诺拉油菜(canola)(欧洲油菜(Brassica napus))具有略微增强的针对黑胫病(斑点小球腔菌(Leptosphaeria maculans))的抗性(Wang，Y.等人(1999)Mol.Plant-Microbe Interact.12：410-418)。然而，防卫素在转基因农作物中的潜力的最深入的研究和最佳的例子来自Gao及同事关于马铃薯中的苜蓿防卫素(alfAFP)的工作(Gao等人(2000)同上)。
表2
转基因植物中的植物防卫素
转基因   来源植物 接纳体植物 启动子   增加的针对测试生物的抗性
Rs-AFP2 萝卜 烟草   花椰菜花叶病毒(CaMV)35S 长柄链格孢
转基因   来源植物 接纳体植物 启动子   增加的针对测试生物的抗性
Rs-AFP2 萝卜 番茄，油菜 CaMV 35S   马铃薯早疫病链格孢，尖镰孢(Fusariumoxysporum)，致病疫霉(Phytophthorainfestans)，立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)，大丽花轮枝孢(Verticillium dahliae)
AlfAFP 苜蓿 马铃薯   玄参花叶病毒35S 大丽花轮枝孢
Spi1 挪威云杉 烟草，挪威云杉胚胎培养物 CaMV 35S   胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)，多年异担子菌(Heterobasidionannosum)
  DRR230-a   豌豆   卡诺拉油菜   CaMV 35S   斑点小球腔菌
DRR230-aDRR230-c 豌豆 烟草 双重CaMV 35S   尖镰孢，豆类壳二孢(Ascochyta pinodes)，里氏木霉(Trichodermareesei)，兵豆壳二孢(Ascochyta lentis)，腐皮镰孢(F.solani)，斑点小球腔菌，豌豆壳二孢(Ascochyta pisi)，链格孢(Alternariaalternata)
  BSD1   白菜   烟草   CaMV 35S   寄生疫霉(P.parasitica)
  WT1   山嵛菜   稻   玉蜀黍泛素-1   Magnaporthe grisea
转基因   来源植物 接纳体植物 启动子   增加的针对测试生物的抗性
WTI 山嵛菜   蝴蝶兰属(Phalaenopsis)兰花 CaMV 35S 胡萝卜软腐欧文氏菌
WTI 山嵛菜 马铃薯 CaMV 35S   灰葡萄孢(Botrytiscinerea)
DmAMP1 大丽花 茄子 CaMV 35S   灰葡萄孢，黑白轮枝孢(Verticilliumalbo-atrum)
DmAMP1 大丽花 番木瓜 CaMV 35S   棕榈疫霉(Phytophthorapalmivora)
Lay和Anderson(2005)Current Protein and Peptide Science 6：85-101.Sjahrill R，Chin DP，Khan RS，Yamamura S，Nakamura I，Amemiya Y，Mii1 M(2006)Plant Biotechnology 23：191-194.
Khan RS，Nishihara M，Yamamura S，Nakamura I，Mii M(2006)PlantBiotechnology 23：179-183.
Turrini A，Sbrana C，Pitto L，Ruffini Castiglione M，Giorgetti L，Briganti R，Bracci T，Evangelista M，Nuti MP，Giovannetti M(2004)New Phytologist 163：393-403.
Zhu YJ，Agbayani R，Moore PH(2007)Planta 226：87-97.
Gao及同事(Gao等人(2000)同上)证明，alfAFP(也称为MsDef1)在马铃薯中的组成性表达提供了强的针对农艺学上重要的真菌大丽花轮枝孢的抗性。与未转化的植物相比较，在经转化的植物中的真菌水平减少至大约1/6。由alfAFP转基因所赋予的保护不仅在温室条件下得到维持，而且还在田间并且在不同地理位置处在数年内得到维持(Gao等人(2000)同上)。此外，在转基因植物中的轮枝孢性萎蔫病(Verticillium wilt)抗性的水平等于或大于用在经烟熏的、未侵染的土壤中生长的非转基因植物获得的抗性水平(Gao等人(2000)同上)。
美国专利7,041,877(其通过提及而合并入本文，至与此相一致的程度)报道了全长NaD1在棉花和烟草中的转基因表达。将所得的经转化的植物的叶饲喂给棉铃虫(Helicoverpa armigera)和细点突夜蛾(H.punctigera)幼虫，导致相比于以对照饮食进行饲喂的幼虫而言出现生长抑制。美国专利7,041,877还报道了，纯化的NaD1(减去了C-末端前结构域)在体外抑制石竹尖镰孢(Fusarium oxysporum f.sp.dianthi)Race 2和灰葡萄孢的生长。
附图简述
图1是基于Lay和Anderson 2005的植物防卫素的通有序列。
图2A和图2B图解说明了两类植物防卫素。图2A：所有植物防卫素如此产生，其中除了成熟防卫素结构域外还具有ER信号序列。图 2B：在某些植物中，特别是来自茄科(Solanaceae)的那些植物，分离出了编码具有另外的C-末端前结构域的植物防卫素的cDNA克隆。在防卫素结构域中4个强烈保守的二硫键通过连接线来图示。
图3A-3D提供具有和不具有C-末端前结构域的防卫素前体蛋白质的预测的氨基酸序列的比较。图3A：ER信号序列的预测的切割位点用箭头来标明，并且防卫素和C-末端前结构域(当适用时)之间的连接用三角形来标示。已引入了间隔以使比对最大化。在某些或大多数序列中相似或相同的残基分别带有灰色和黑色阴影。使用BioEdit序列比对编辑器(版本5.0.9)软件来产生该比对(Hall，T.A.(1999)Nucl.Acids Symp.41：95-98)。关于蛋白质序列的参考文献为NaD1(SEQ IDNO：1)、PhD1(SEQ ID NO：2)和PhD2(SEQ ID NO：3)(Lay，F.T.等人(2003)Plant Physiol.131：1283-1293)，FST(SEQ ID NO：4)(Gu Q.等人(1992)Mol Gen Genet 234：89-96)，NaThio1(SEQ IDNO：5)(Lou，Y.和Baldwin，I.T.(2004)Plant Physiol.135：496-506)，NeThio2(SEQ ID NO：6)(Yamada，S.等人(1997)Plant Physiol.115：314)，NpThiol(SEQ ID NO：7)(Komori，T.等人(1997)Plant Physiol.115：314)，TPP3(SEQ ID NO：8)(Milligan，S.B.和Gasser，C.S.(1995)Plant Mol Biol.28：691-711)，CcD1(SEQ ID NO：9)(AF128239，Aluru，M.等人(1999)Plant Physiol.120：633)，Nt-硫素(SEQ ID NO：10)(登录号BAA95697)，NTS13(SEQ ID NO：11)(X99403)(Li，H.Y.和Gray，J.E.(1999)Plant Physiol.120：663)，TGAS118(SEQ ID NO：12)(Van den Heuvel，K.J.P.T.等人(2001)J Expt.Biol.52：1427-1436)，PPT(SEQ ID NO：13)(Karunanandaa，B.等人(1994)Plant Mol Biol.26：459-464)，J1-1(SEQ ID NO：14)和J1-2(SEQID NO：15)(Meyer，B.等人(1996)Plant Physiol.112：615-622)，Rs-AFP1(SEQ ID NO：16)和Rs-AFP2(SEQ ID NO：17)(Terras，F.R.G.等人(1992)J.Biol.Chem.267：15301-15309)。NaD2相应于SEQ IDNO：33。
图3B：茄科防卫素NaD1(SEQ ID NO：1)与ZmESR-6(SEQ ID NO：18)(来自玉蜀黍的具有C-末端前肽的防卫素原(prodefensin))的氨基酸序列的比较(Balandin等人，(2005)Plant Mol Biol.58：269-282)。箭头标示了成熟防卫素结构域的N-末端，并且三角形标明了关于所比对的序列的C-末端前肽的N-末端。
图3C：在中性pH下，在茄科和玉蜀黍防卫素的防卫素和C-末端前结构域中带电荷的氨基酸的分布(从Lay和Anderson 2005修改的)。NaD1、ZmESR-6、Art v1和SF18的部分来自SEQ ID NO：1、18、19和20。
图3D：NaD1和ZmESR-6的成熟防卫素(SEQ ID NO：1，残基26-72；SEQ ID NO：18，残基24-78)和C-末端结构域(SEQ ID NO：1，残基73-105；SEQ ID NO：18，残基79-106)分别与艾蒿花粉的主要变应原Art v1(SEQ ID NO：19，残基1-53，成熟防卫素)(AF493943，Himly，M.等人(2003)FASEB J 17：106-108)和来自向日葵的防卫素样蛋白质SF18(SEQ ID NO：20，残基1-57，成熟防卫素)(X53375，Domon，C.等人(1990)Plant Mol Biol 15：643-646)的比对。Art v1(SEQ ID NO：19)和SF18(SEQ ID NO：20)具有长的富含脯氨酸的C-末端结构域(SEQ ID NO：19，残基53-108；SEQ ID NO：20，残基58-152)。
图4提供了来自茄科防卫素NaD1(SEQ ID NO：1，残基73-105)、PhD1(SEQ ID NO：2，残基73-103)和PhD2(SEQ ID NO：3，残基75-101)的C-末端前结构域与来自其他植物蛋白质的对于液泡靶向必需的C-末端前结构域(SEQ ID NO：21-31、35、40和41)的比较。带阴影的序列突出显示了在来自NaD1的C-末端前肽中以及在来自大麦凝集素和小麦胚凝集素的那些中存在的基序。来自大麦凝集素的四氨基酸肽VFAE(SEQ ID NO：24的氨基酸1-4)对于液泡靶向是足够的(Bednarek，S.Y.和Raikhel，N.V.(1992)Plant Mol.Biol.20：133-150)。
关于图1-4中显示的序列的参考文献为Bednarek，S.等人(1990)Plant Cell 2：1145-1155；Bol，J.F.等人(1990)Annu RevPhytopathol 28：113-138；Cervelli，M.等人(2004)Plant J40：410-418；DeLoose，M.等人(1988)Gene 70：13-23；Frigerio，L.等人(2001)J Plant Physiol.158：499-503；Lay，F.T.等人(2003)Plant Physiol 131：1283-1293；Lou，Y.和Baldwin，I.P.(2004)Plant Physiol.136：496-506；Melchers，L.S.等人(1993)PlantMol Biol 21：583-593；Miller，E.A.等人(1999)Plant Cell11：1499-1508；Neuhaus，J.-M.等人(1991)Proc Natl Acad Sci USA88：10362-10366；Nishizawa，K.等人(2003)Plant J 34：647-659；Ponstein，A.S.等人(1994)Plant Physiol 104：109-118；Raikhel，N.和Wilkins，T.(1987)Proc Natl Acad Sci USA 84：6745-6749；Saalbach，G.等人(1996)Plant Physiol 112：975-985；Saint-Jore-Dupas，C.等人(2005)Plant Cell Physiol46：1603-1612；Wilkins，T.和Raikhel，N.(1989)Plant Cell1：541-549。
图5是pHEX22构建体的图示。(实施例1)将DNA***到二元载体pBIN19的左和右边界之间(Bevan M.(1984，Nucleic AcidsResearch 12：8711-8721))。从C-末端去除NaD1基因的99bp，从而产生编码SEQ ID NO：1的残基1-72的NaD1m(SMΔT)基因。缩写按顺时针顺序为：
oriV：植物复制起点；
ColE1 ori：源自大肠菌素E1的复制起点；
TDNA RB：根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefacious)TDNA的右边界；
Nos启动子：胭脂碱合酶Nos基因的启动子；
NPTII：编码新霉素磷酸转移酶II的遗传序列；
Nos终止子：Nos基因的终止子序列；
破裂的(disrupted)lacZ：编码β-半乳糖苷酶的部分序列的DNA区段；
CaMV 35S启动子：花椰菜花叶病毒(CaMV)35S蛋白的启动子；
SNaD1：编码缺乏CTPP的NaD1(SMΔT)的DNA；
CaMV 35S终止子：编码CaMV 35S蛋白的基因的终止子序列；
M13 ori：M13病毒复制起点；
TDNA LB：TDNA左边界；
所有箭头标明了转录方向。
图6显示了用pHEX22转化的原初(primary)转基因植物83.23.2(A)和83.96.2(B)的照片。(实施例1)植物83.96.2具有更高水平的NaD1表达，并且展示出有着扭曲的叶和短的节间的更加异常的表型。
图7是条形图，其显示了在用pHEX22转化的品系78.131.1的T2代的叶中通过ELISA测定的相对NaD1水平。植物b和l是无效分离子。(实施例1)在横轴上的编号是指原初转基因植物78.131.1的子代。在490nm处的吸光度是指在实施例1中所描述的ELISA测定法数据。
图8是描绘了在图7中所分析的品系78.131.1 T2植物中的某些植物的表型的照片。道1：植物a；道2：植物c；道3：植物d；道4：植物e(所有植物表达减去了CTPP的NaD1，SMΔT)(SEQ ID NO：1，残基1-72)；道5：植物b(无效分离子)。(实施例1)。图8B。经Vcl1消化的来自78.131.1 T1植物的基因组DNA的Southern印迹，其显示了与NaD1 DNA探针杂交的单个DNA片段的存在。
图9描绘了从来自用pHEX22转化的棉花植物的叶中提取的总可溶性蛋白质的免疫印迹。(实施例1)在10-20％NovexTM(Invitrogen，Carlsbad，CA 92008)Tricine SDS凝胶上分开蛋白质，并且转移到0.22微米硝酸纤维素膜上。泳道1：SeeBlue Plus2TM(Invitrogen，Carlsbad，CA 92008)蛋白质标准；在纵轴上的数字标明了以千道尔顿(kD)表示的蛋白质分子量；泳道2：50ng成熟NaD1(M)(SEQ IDNO：1，残基26-72)；泳道3：150ng成熟NaD1(M)；泳道4：35.125.1(纯合T4代)；泳道5：78.131.1(T2代)；泳道6：83.68.2(T2代)；泳道7：83.68.2(T2代)；泳道8：未转化的Coker 315(Departmentof Primary Industries和Fisheries，Queensland)。在泳道4、5、6和7中检测出成熟NaD1(M，SEQ ID NO：1，残基26-72)(箭头)。在泳道4(35.125.1)中检测出具有C-末端前肽的NaD1(MT，SEQ IDNO：1，残基26-105)(箭头)。
图10A-10D是显微照片，其显示了在表达来自构建体的NaD1的稳定转化的棉花植物中NaD1的亚细胞定位，所述构建体编码具有(pHEX3)和不具有(pHEX22)NaD1CTPP(T)的NaD1。(实施例1)使用在经石蜡包埋的叶切片上的免疫荧光(用抗NaD1抗体)来测定NaD1定位。A和B：来自品系35.125.1(pHEX3，SMT)的叶切片。A.抗NaD1抗体，其显示出NaD1定位在液泡中。B.免疫前抗体对照。C和D：来自品系78.131.1(pHEX22，SMΔT)的叶切片。C.抗NaD1抗体，其显示出NaD1不在液泡中而是可以在细胞质和细胞外空间中检测到(箭头所示的)。D.免疫前抗体对照。
图11描绘了从花烟草的未成熟芽(泳道1)和转基因棉花品系35.125的叶(泳道2)中提取的蛋白质的免疫印迹。泳道3包含50ng成熟NaD1(M)(SEQ ID NO：1，残基26-72)。(实施例2)在10-20％NovexTM(Invitrogen，Carlsbad，CA 92008)Tricine SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分开蛋白质，并且转移到0.22微米硝酸纤维素膜上。A：用NaD1 CTPP(T)抗体探测的印迹；B：用NaD1(M)抗体探测的印迹。在泳道1和2中检测出具有NaD1CTPP(T)的NaD1(MT，SEQ ID NO：1残基26-105)(箭头)。在泳道1和3(图版B)中检测出成熟NaD1(M，SEQ ID NO：1，残基26-72)(箭头)。纵轴描绘了分子量标准的条带位置。
图12是在温室生物测定法中，针对播种后天数进行作图的用蚀脉尖镰孢(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)(Fov)感染的棉花植物的存活百分比(纵轴)的图。(实施例3)Coker：未转化的Coker 315；品系D1：转基因品系35.125.1(用pHEX3，SMT转化的Coker 315)；Siokra 1-4(Cotton Seed Distributors Limited，WeeWaa，NSW Australia 2388)：对于Fov易感的棉花品种；Sicot 189TM(Cotton Seed Distributors Limited，Wee Waa，NSW Australia2388)：对于Fov较不易感的品种，澳大利亚工业标准。
图13是关于表达NaD1的转基因棉花的田间试验结果(实施例3)的图。将用蚀脉尖镰孢(Fov)感染的棉花植物的存活百分比(纵轴)针对在田间播种后天数进行作图。Coker：未转化的Coker 315；品系D1：用pHEX3，SMT转化的转基因品系35.125.1 Coker 315；Sicot 189：对于Fov较不易感的品种，澳大利亚工业标准。
图14A-14E图解说明了由NaD1成熟结构域和来自番茄防卫素的CTPP组成的嵌合防卫素的表达(实施例4)。A：pHEX98构建体的图示。将编码具有NaD1 ER信号序列(S)和来自番茄防卫素TPP3(图3)的CTPP(T″)的成熟NaD1(M)的DNA***到CaMV 35S启动子和终止子之间，并且连接在二元载体pBIN19的左和右边界之间(Bevan M.(1984，Nucleic Acids Research 12：8711-8721))；其他缩写如对于图5所描述的。B：pHEX98蛋白质产物的图示。C：通过ELISA测定的在番茄幼苗的叶中在pHEX43(SMT)和pHEX98(SMT″)的瞬时表达期间产生的NaD1的相对水平。在ELISA中使用来自3个叶样品的提取物(1∶20，鲜重：缓冲液)。D：通过ELISA测定的在棉花子叶中在pHEX98(SMT″)；pHEX43(SMT)；pHEX80(S′MT′)和pHEX89(SMT′)的瞬时表达期间产生的NaD1的相对水平。关于pHEX构建体列表，可参见表10。E：蛋白质免疫印迹，其显示了在棉花中在pHEX构建体的稳定或瞬时表达期间产生的NaD1(M)和NaD1(MT)。
图15A-15D图解说明了由NaD1成熟结构域和来自多结构域蛋白酶抑制剂NaPI的CTPP组成的嵌合防卫素的表达(实施例5)。A：pHEX89构建体的图示，该构建体在二元载体中包含编码具有NaD1 ER信号序列(S)和来自NaPI的CTPP(T′)的成熟NaD1(M)的DNA；其他缩写如在图5中所详述的。B：pHEX89蛋白质产物。C：pHEX80的图示，其在二元载体中包含具有来自NaPI的ER信号序列(S′)和CTPP(T′)的NaD1(M)结构域；其他缩写如在图5中所详述的。D：pHEX80蛋白质产物。
图16A和16B图示了研究的基因构建体(A)和显微照片(B)，所述显微照片显示了在各种GFP-CTPP嵌合体的瞬时表达后绿色荧光蛋白(GFP)在本氏烟草细胞中的定位。(实施例5)A：基因构建体的图示，所述基因构建体编码一系列GFP-CTPP嵌合体以评估所述CTPP序列是否足以将蛋白质导向植物液泡。将所述构建体***到二元载体pBIN19中以用于在植物细胞中表达。B：显微照片，其显示了在本氏烟草的叶中于在A中所显示的构建体的瞬时表达期间产生的GFP的定位。左手图版：叶肉细胞的微分干涉相差(DIC)图像。右手图版：相同切片的绿色波长分析(505-530nm)以鉴定GFP荧光。
图17A-17E图解说明了由NaD1成熟结构域(M)和截短的NaD1 CTPP(T′)组成的嵌合防卫素的表达(实施例6)。A：pHEX44构建体的图示，该构建体在二元载体中包含编码具有NaD1ER信号序列(S)和来自NaD1 CTPP的前4个氨基酸的成熟NaD1(M)的DNA；其他缩写如在图5中所给出的。B：pHEX44蛋白质产物的图示。C：通过ELISA测定的在棉花子叶中在pHEX44(SMT′)和pHEX43(SMT)的瞬时表达期间产生的NaD1的相对水平。在ELISA中使用来自3株幼苗的提取物(1∶100)。D：蛋白质免疫印迹，其显示了在本氏烟草叶中在瞬时表达期间从pHEX43和44产生的NaD1(M)和NaD1(MT)。关于pHEX构建体列表，可参见表10。E：通过ELISA测定的在用pHEX44稳定转化的棉花中产生的NaD1的相对水平。在用NaD1抗体的ELISA中使用来自处于组织培养中的5株植物的叶提取物(1∶500)。将从来自pHEX3纯合子35.125.1的花和叶提取物中纯化出的NaD1用作阳性对照。
图18图解说明了将NaD1 CTPP添加至NaD2(不含内源CTPP的防卫素)的影响(实施例7)。A：pHEX92构建体图示，该构建体在二元载体中包含编码具有NaD2ER信号序列(S)和来自NaD1的CTPP(T)的成熟NaD2(M)的DNA；其他缩写如对于图5所给出的。B：pHEX91构建体，其与pHEX92相同，除了不存在编码来自NaD1的CTPP(T)的DNA外。C：由pHEX92和91编码的蛋白质的图示。D：通过ELISA测定的在棉花子叶中在pHEX92和91的瞬时表达期间产生的NaD2的相对水平。在ELISA中使用来自3株幼苗的提取物(1∶100)，所述ELISA使用NaD2抗体以及作为阳性对照的从花烟草的花中纯化出的NaD2。E：使用NaD2抗体的蛋白质免疫印迹，其显示了在瞬时表达期间从pHEX92和91构建体产生的NaD2(箭头所示的)的相对水平。
图19提供了NaD2的核酸(编码)和氨基酸序列(分别为SEQ IDNO：32和SEQ ID NO：33)。从分离自观赏性烟草(花烟草)的花的mRNA产生编码NaD2的cDNA。作为具有内质网信号序列和成熟防卫素结构域的蛋白质原而产生NaD2。它不具有天然的C-末端前肽。ER信号和防卫素结构域之间的连接由箭头标明。
图20A-20C图解说明了由萝卜防卫素RsAFP2(M)和来自NaD1的CTPP组成的嵌合防卫素的表达(实施例8)。A：pHEX76构建体的图示，该构建体在二元载体中包含编码具有RsAFP2 ER信号序列(S′)和来自NaD1的CTPP(T)的RsAFP2(M)的DNA；其他缩写如对于图5所示的。B：pHEX76蛋白质产物。C：用针对来自NaD1的CTPP的抗体的蛋白质免疫印迹，通过ELISA测定。从瞬时表达pHEX76和pHEX43的棉花子叶中以及从用pHEX3稳定转化的棉花的叶中制备提取物。关于pHEX构建体列表，可参见表10。
图21A-21E图解说明了由NaD1成熟结构域(M)和来自大麦凝集素的CTPP组成的嵌合防卫素的表达(实施例9)。A：pHEX63构建体的图示，该构建体在二元载体中包含编码具有NaD1 ER信号序列(S)和来自大麦凝集素前体的CTPP(T′)的成熟NaD1(M)的DNA；其他缩写如对于图5所示的。B：pHEX63蛋白质产物的图示。C：通过ELISA测定的在棉花子叶中在pHEX63、pHEX62(编码NaD1[M]+Zm ESR-6CTPP[T″])和pHEX43的瞬时表达期间产生的NaD1的相对水平。在用NaD1抗体的ELISA中使用来自2株幼苗的提取物(1∶100)。D：在本氏烟草的叶中从相同构建体中的NaD1的瞬时表达。在ELISA中使用来自2片叶的提取物(1∶500)。E：蛋白质免疫印迹，其显示了在本氏烟草中在瞬时表达期间从pHEX43、62和63产生的NaD1(M)和NaD1(MT)。关于pHEX构建体列表，可参见表10。
图22A-C图解说明了由NaD1防卫素(M)和来自玉蜀黍防卫素ZmESR-6的CTPP(T″)组成的嵌合防卫素。A：pHEX62构建体的图示，该构建体在二元载体中包含编码具有NaD1 ER信号序列(S)和来自ZmESR-6防卫素的CTPP(T″)的NaD1(M)的DNA；其他缩写如对于图5所示的。B：pHEX62蛋白质产物。C：通过用NaD1抗体的ELISA测定的在用pHEX62稳定转化的棉花中产生的NaD1的相对水平。叶提取物进行1∶500稀释。
发明概述
尽管公开有关于在某些特定的转基因植物中成功表达某些特定的功能性植物防卫素的报告，但现在本发明人发现，当以转基因方式表达时，某些防卫素具有毒性效应。此外，本发明人在此了解到，所述毒性效应与防卫素表达水平相关。在此，本发明包括用于减少或消除在宿主植物中转基因防卫素表达的毒性效应的一般方法。本发明还包括用于修饰编码防卫素的核酸的方法，由此修饰的核酸，和由经修饰的核酸序列编码的经修饰的防卫素。本发明还包括包含并表达经修饰的编码防卫素的核酸序列的转基因植物，所述植物展现出相比于在其他方面相当的表达未修饰的防卫素的转基因植物而言减少或消除的防卫素毒性效应。该经修饰的防卫素被称为嵌合防卫素，所述嵌合防卫素具有与第二植物防卫素或非防卫素植物液泡易位肽(VTP)的C-末端前肽结构域相组合的第一植物防卫素的成熟防卫素结构域。SEQ IDNO的完整列表显示在表11中。
发明详述
术语“结构域”在本文和本领域中用于指肽的一部分，所述部分具有明确且可识别的功能，并且常常通过翻译后加工而与所述肽的其他部分分开。为了避免含糊不清，本文中采用了确定的术语。如上文所指出的，大多数已知的植物防卫素由编码内质网信号序列(在下文中缩写为“S”)和成熟防卫素结构域(在下文中缩写为“M”)的DNA编码。此类防卫素在文献中也称为“种子防卫素”，但它们可以获自除种子外的其他植物来源。这些在本文中被称为SM类型防卫素。少数已知的防卫素由这样的DNA区段编码，所述DNA区段编码另外的C-末端前结构域/前肽(CTPP)，有时也称为“酸性尾”(在下文中缩写为“T”)。此类防卫素(有时叫作“花防卫素”)被称为SMT类型防卫素。名称“SM”和“SMT”自始至终用于指天然存在的防卫素。术语“嵌合防卫素”在本文中用于指本发明的防卫素。嵌合防卫素可以具有5种一般类别：(1)与外源来源的T相组合的SM类型防卫素(SMT′)；(2)SMT类型防卫素，其中不同SMT-类型防卫素或其他非防卫素植物VTP的外源T取代了天然存在的T(SMT″)；(3)SM或SMT类型防卫素，其具有外源的取代的S区段(S′MT)。类似地，可以构建(4)S′MT′和(5)S′MT″嵌合防卫素，如本领域中将会理解的。本文还描述了其中表达缺失了T的SMT防卫素的情形。这些通过在防卫素名称后加上得儿塔(Δ)符号来命名。例如，当以无尾或缺失了T的形式进行表达时，NaD1(SMT防卫素)被命名为NaD1ΔT。
根据本发明，待在转基因植物中表达的防卫素编码序列通过添加C-末端前结构域(CTPP)作为天然编码序列的C-末端延伸来进行修饰，(SMT′或SMT″)。CTPP(T′或T″)使得嵌合防卫素能够在转基因细胞内易位至液泡。作为嵌合防卫素进行表达保护了细胞免受SM或ΔT防卫素在宿主细胞中可能发挥的任何毒性效应的影响。该方法可以使用各种已知的CTPP编码核酸区段中的任何一种来进行，例如但不限于，在某些SMT防卫素中发现的酸性结构域的编码区段(图4)。
作为N-末端肽区段存在的液泡易位肽(VTP)也是已知的。本文中用于N-末端VTP的缩写是“X”。具有N-末端VTP的嵌合防卫素具有一般结构SXM，其中S和M具有其先前定义的含义。在此处有用的N-末端VTP的例子显示在表3中。
表3
液泡植物蛋白质的N-末端前肽(VTP)的例子
  蛋白质   N-末端序列   参考文献
  甘薯sporamin   HSRFNPIRLPTTHEPA(SEQ ID NO：36)   Matsuoka，K.和Nakamura，K.(1991)PNAS 88：834-838
  马铃薯22kDa蛋白   FTSENPIVLPTTCHDDN(SEQ ID NO：37)   Chrispeels，M.J.和Raikhel，N.V.(1992)Cell 68：613-616
  大麦aleurain   SSSSFADSNPIR(SEQ ID NO：38)   Holwerda等人，(1992)Plant Cell4：307-318.
  马铃薯组织蛋白酶D抑制剂   FTSQNLIDLPS(SEQ ID NO：39)   Chrispeels和Raikhel(1992)
根据本发明的一个方面，产生了具有在本文中称为SMT′、SMT″或SXM类型的新型嵌合防卫素。N-末端信号肽(S)的存在致使蛋白质进入分泌途径，在那里信号肽被去除。信号序列S的去除暴露了在N-末端处的X，并且允许XM与高尔基体中的受体结合，从而最终导致转运至液泡。本发明的新型嵌合防卫素对于在转基因植物中的表达是有利的，在所述转基因植物中它们允许相比于表达未修饰的防卫素或缺失了尾的防卫素的转基因植物而言更高水平的防卫素表达，并且伴随着减少的对于宿主植物的毒性效应。
本发明在其最广泛的方面包括S′、T′和X结构域的靶向使用，以优化成熟防卫素在转基因植物中的功效。可以通过使用嵌合防卫素S′M来在转基因宿主物种的细胞中优化内部细胞转运和输出，其中M结构域(就其活性进行选择)与信号肽S(其与宿主细胞种类相容)相组合。当所选择的SM类型防卫素在转基因宿主中弱表达或者有毒性时，可以提供嵌合SMT′或SXM防卫素以为了在转基因宿主中的最佳防卫素功效。其他嵌合组合(包括S′MT′、S′MT″、S″MT、S′XM等)在某些特定情况下将会被认为是有用的，如本领域技术人员将会理解的。
超过60种植物防卫素已得到了鉴定并且通过氨基酸序列进行了表征(Lay和Anderson 2005 Current Protein and Peptide Science6：85-101，其通过提及而合并入本文，至与此不相矛盾的程度)。全部都被表达为具有N-末端信号肽的前防卫素(pre-defensin)。绝大多数已知的植物防卫素以没有CTPP的形式进行表达(SM类型)。罕见地，主要是在茄科物种的花组织中，某些特定的防卫素被表达为除了信号肽外还具有CTPP的前防卫素原(pre-prodefensin)(SMT类型)。
在进行翻译后加工之后，成熟防卫素(M)的长度为45-54个氨基酸。全部都具有至少8个形成特征性的二硫键模式的半胱氨酸残基。如果从N-末端到C-末端对这8个C残基依次进行编号，那么植物防卫素的二硫键模式可以表征为1-8、2-5、3-6和4-7(参见上文的表1)。已在至少两种植物防卫素中鉴定出了第5个二硫键(Lay和Anderson2005)。在前述的结构框架内，极少的氨基酸是保守的，除了所述C残基外，特别是G34，其为在位置11处的芳香族氨基酸，随后为G13、S8和E29(参见图1中的通有序列)。所有具有所描述的对于植物防卫素而言特征性的C-残基的布置和交联模式的M结构域肽在本文中均被定义为植物防卫素，无论是从自然界中分离的，还是通过合成或组合方法获得的。
在本文所描述的某些实施例中，CTPP由花烟草的花防卫素NaD1的33个氨基酸(SEQ ID NO：1，残基73-105)的C-末端延伸来代表。本文中的其他实施例通过证明来自番茄(西红柿(Solanumlycopersicon))防卫素TPP3、玉米(玉蜀黍)的防卫素ZmESR-6、大麦凝集素、和从花烟草中分离的蛋白酶抑制剂NaPI的CTPP的VTP功能，而阐明了本发明的突破。其他此类C-末端结构域是已知的，包括来自碧冬茄的2种，即PhD1(SEQ ID NO：2，残基73-103)和PhD2(SEQ ID NO：3，残基75-101)。本发明人现在已证实了，这些延伸(也称为酸性结构域或尾)充当在细胞内将转运靶向至贮存液泡的前结构域。许多其他液泡易位肽(VTP)已被鉴定为C-或N-末端前结构域(CTPP和NTPP)，其在除防卫素外的其他蛋白质的液泡易位中起作用(图4；SEQ ID NO：21-31、35和40-45)。
一般而言，已知的C-末端前肽(CTPP)倾向于具有高比例的酸性氨基酸和疏水性氨基酸。可以在本发明中使用任何已知的CTPP或其部分。合适的CTPP的选择将依赖于对于在预期宿主细胞内的使用而言的适宜性。
将SM或SMΔT防卫素的编码序列与编码CTPP或者C-或N-末端VTP的序列相组合导致获得嵌合防卫素原。应当理解，在转基因宿主中表达的防卫素对于宿主发挥各不相同的水平的毒性，从无毒到极毒，这依赖于防卫素的功能活性和宿主的性质。毒性效应可以以本领域技术人员所认识的许多方式来表现。所述效应可以包括例如细胞生长减少、再生效率降低、再生出的转基因植物的能育性降低以及再生出的植物的异常形态。毒性程度也可以响应于防卫素表达水平、表达的组织特异性、当表达发生时宿主植物的发育阶段等而发生改变。在观察到表达防卫素的毒性效应的任何情况下，可以通过修饰防卫素(经由添加CTPP)来减少或消除毒性效应。所述经修饰的防卫素在本文中称为嵌合防卫素。当在本文中使用该术语时，嵌合防卫素(SMT′、SMT″或SXM)区别于在自然界中存在的具有CTPP的防卫素(SMT类型)。装备有在自然界中不与之相连接的CTPP的任何防卫素，SMT′、SMT″或SXM，被认为是嵌合防卫素并且构成了本发明的一部分。
关于嵌合防卫素的表达减少或消除未修饰的防卫素表达的毒性效应所经由的运作方式，申请人未进行陈述。尽管申请人已观察到了作为防卫素原进行表达、减少或消除的毒性和所表达的防卫素原易位至贮存液泡之间的相关性，以及缺乏CTPP、增加的毒性和缺乏液泡贮存之间的逆相关性，但本领域技术人员将会意识到，由CTPP的存在所赋予的其他活性也可以减少毒性。
嵌合防卫素转运到贮存液泡中可以赋予其他优点。一旦它转运到液泡中，所表达的嵌合防卫素就可能被阻止在细胞内发挥毒性效应。宿主细胞可以耐受比未修饰的防卫素更高水平的嵌合防卫素表达。然而，当昆虫或侵袭性真菌引起细胞的破坏、释放出防卫素并且病原体暴露于防卫素时，嵌合防卫素的表达为宿主植物提供了针对致病体的作用的保护效应。备选地，可以从宿主植物细胞中收获嵌合防卫素，以在植物外使用，例如作为抗真菌剂，或者用于利用防卫素的生物学活性的其他目的。
待表达的防卫素的选择依赖于所希望的生物学活性和待表达的防卫素的已知性质。防卫素活性可以通过用于在对于防卫素结构和功能来说不是必需的任意氨基酸位置处引入单个或多个氨基酸替代的组合方法(combinatorial method)来进行优化，只要关于防卫素活性的定量测定法是可得的。
待与所选择的防卫素相组合的CTPP的选择受宿主植物物种的影响。源自第一植物物种的CTPP可以在第二植物物种中可比较地起作用。例如，来自烟草属(Nicotiana)物种的CTPP已显示在转基因棉属(Gossypium)物种中提供了有效的细胞内转运和减少的毒性。可以通过使用在其中发生重组防卫素原的表达的宿主物种的CTPP，或者通过使用与所希望的宿主相关的物种的CTPP，来优化功效。例如，编码从来自玉蜀黍的防卫素预测出的CTPP(图3B和3D；SEQ ID NO：18，残基80-107)的ZmESR-6cDNA可以在表达NaD1的转基因玉米中提供最佳保护，以增加那种农作物中的真菌抗性。
可以通过本领域已知的方法常规地产生双子叶和单子叶转基因植物。可以在掺入到植物转化载体中后，在植物或植物细胞中表达嵌合防卫素。许多植物转化载体是本领域技术人员众所周知且可得的，例如BIN19(Bevan，(1984)Nucl.Acid Res.12：8711-8721)、pBI 121(Chen，P-Y等人，(2003)Molecular Breeding 11：287-293)、pHEX22(美国专利7,041,877)以及本文中所例示的载体。此类载体是本领域众所周知的，由于其在细菌例如根瘤土壤杆菌(Agrobacterimtumefaciens)中和在植物细胞中复制的能力而通常称为“二元”载体。典型的植物转化载体，例如本文中所例示的，包括用于在待转化的植物细胞中具有活性的合适的启动子和终止子序列(下文中称为“植物活性”启动子或终止子)的控制下表达选择标记例如NPTII的遗传元件，用于***目的基因(包括在合适的植物活性启动子和植物活性终止子序列的表达控制下的嵌合防卫素基因)的位点，以及位于防卫素和选择标记侧翼的T-DNA边界(以将基因整合到植物基因组中)。
使用根瘤土壤杆菌的菌株，通常是可广泛获得的菌株LBA4404，来转化植物。在构建出携带编码所需蛋白质的DNA区段的植物转化载体后，将该载体用于转化根瘤土壤杆菌菌株例如LBA4404。然后，将经转化的LBA4404用于转化所希望的植物细胞，其中使用适合于待转化的植物物种的本领域已知的方案。采用用于选择经转化的植物细胞以及所选细胞的增殖和再生的标准和本领域认可的方案，以获得转基因植物。本文中的实施例进一步公开了用于棉花植物的转化和再生的方法和材料，以及被各种天然和嵌合防卫素转化并表达各种天然和嵌合防卫素的转基因棉花植物。除本文中所例示的那些外，还可以通过几种已知方法中的任何一种，将所希望的DNA区段转移到植物细胞中。众所周知的方法的例子包括微粒轰击、电穿孔以及其他生物学载体(包括其他细菌或病毒)。
可以在任何单子叶或双子叶植物中表达嵌合防卫素。特别地，有用的植物是食物作物例如玉米(玉蜀黍)、小麦、稻、大麦、大豆、番茄、马铃薯和甘蔗，以及油籽作物例如向日葵和油菜。特别有用的非食物常见作物包括棉花、亚麻和其他纤维作物。花和观赏性作物包括玫瑰、康乃馨、碧冬茄、洋桔梗(lisianthus)、百合、鸢尾、郁金香、香雪兰、翠雀花、补血草和天竺葵。
用于将载体、嵌合遗传构建体等引入细胞中的技术包括但不限于，使用CaCl2的转化及其变化形式、直接的向原生质体中的DNA摄入、PEG介导的向原生质体中的摄入、微粒轰击、电穿孔、DNA的显微注射、组织外植体或细胞的微粒轰击、核酸对组织的真空-渗透(vacuum-infiltration)、以及T-DNA介导的从土壤杆菌向植物组织的转移。
关于细胞的微粒轰击，将微粒推进到细胞中以产生经转化的细胞。任何合适的射弹细胞转化方法和装置可以用于施行本发明。示例性的操作程序公开于Sanford和Wolf(美国专利号4,945,050、5,036,006、5,100,792、5,371,015)中。当使用射弹转化操作程序时，遗传构建体可以掺入能够在待转化的细胞中复制的质粒。
适合于在此类***中使用的微粒的例子包括0.1-10μm，和更特别地10.5-5μm的钨或金球体。可以通过任何合适的技术，例如通过沉淀，来将DNA构建体沉积在微粒上。
如本文中所例示的，可以用本发明的天然或嵌合防卫素基因来转化能够随后进行克隆繁殖(无论是通过器官发生，还是通过胚胎发生)的植物组织，并由此产生出全植物。取决于对于被转化的具体物种而言可获得并且最适合的克隆繁殖***，所选择的具体组织将会发生变化。组织靶的例子包括叶盘、花粉、胚胎、子叶、下胚轴、雌配子、愈伤组织、现有的分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)、以及诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。
可以通过各种方法，例如通过克隆繁殖或常规育种技术，来繁殖再生出的经转化的植物。例如，第一代(或T1)经转化的植物可以进行自交以产生纯合的第二代(或T2)转化体，和T2植物通过常规育种技术进一步进行繁殖。
因此，在其涉及植物的范围内，本发明的这个方面进一步延伸至经改造从而表达本发明的嵌合防卫素的核酸的植物的子代，以及所述植物的营养、繁殖和生殖部分，例如花(包括切割或切断的花)，植株的部分，来自植物(例如，棉花)的纤维材料，和生殖部分(包括插条、花粉、种子和愈伤组织)。
本发明的另一个方面提供了经遗传修饰的植物细胞或多细胞植物或其子代或者经遗传修饰的植物的部分，其能够产生由本文所描述的嵌合防卫素基因编码的蛋白质或肽，其中所述转基因植物已获得与所述蛋白质或肽的表达相关的新型表型性状。
实施例
实施例1：表达成熟NaD1(减去尾)(SEQ ID NO：31，残基26-72)的转基因棉花植物的产生和表征
1.转基因植物的产生
使用基因构建体pHEX22(图5)，由转化实验产生转基因棉花植物。pHEX22包含缺乏编码C-末端前结构域的序列的抗真菌NaD1基因(SMΔT)。
进行了两个棉花转化实验(CT 78和CT 83，表4)。使用标准方案(Umbeck P.(1991)Genetic engineering of cotton plants andlines.美国专利5,004,863)，通过土壤杆菌介导的转化来产生转基因棉花品系。通过电穿孔将二元载体pHEX22转移到根瘤土壤杆菌菌株LBA4404中，并且通过凝胶电泳来证实该质粒的存在。将土壤杆菌的培养物用于感染棉花栽培种Coker 315的下胚轴切片。在35mg/L的抗生素卡那霉素上选择胚胎发生愈伤组织，并且使用用于棉花的标准方案来使胚胎萌发。将小植株转移至土壤，并且通过免疫印迹分析和ELISA(使用特异性抗血清)来测定从编码SMΔT的DNA上的NaD1(SEQID NO：1，残基26-72)的表达。
表4
使用pHEX22构建体的两个棉花转化实验的概括
  CT 78   CT 83
  下胚轴外植体的数目   558   550
  小植株的数目   17   43
  表达NaD1的植物的数目   1   9
2.检测在转基因叶组织中的NaD1和植物表型
用于NaD1 M结构域的ELISA测定法的方法
ELISA平板(Nunc MaxisorpTM(In Vitro，Noble Park VIC 3174)#442404)用100μL/孔的在PBS中的一抗(50ng/孔的NaD1抗体(通过标准方法针对成熟NaD1结构域(M，SEQ ID NO：1，残基26-72)而产生的经A蛋白纯化的多克隆兔抗体))进行包被，并且在潮湿的盒中于4℃温育过夜。
第二天，用PBS/0.05％(v/v)Tween 20洗涤平板，2分钟×4。然后，平板用200μL/孔的在PBS中的3％(w/v)BSA(Sigma A(CastleHill，NSW Australia 1765)-7030：98％ELISA级别)进行封闭，并且于25℃温育2小时，随后用PBS/0.05％(v/v)Tween 20进行洗涤，2分钟×4。
关于叶样品的制备，使用混合式磨机(mixer mil1)以频率30将100mg冷冻的棉花叶组织在液氮中研磨2×10秒。向每个样品中添加1mL 2％(w/v)不溶性PVP(Polyclar)/PBS/0.05％(v/v)Tween20并且使混合物涡旋，离心10分钟，并收集上清液。在PBS/0.05％(v/v)Tween 20中制备棉花蛋白质提取物的稀释物，施加至每个孔(100μL/孔)，并且于25℃温育2小时。
用PBS/0.05％(v/v)Tween 20洗涤平板，2分钟×4。将在PBS中的二抗(50ng/孔的经生物素标记的抗NaD1，其针对成熟防卫素结构域而产生)以100μL/孔施加至每个孔，并且于25℃温育1小时。
用PBS/0.05％(v/v)Tween 20洗涤平板，2分钟×4。将在PBS中的NeutriAvidin HRP-缀合物(Pierce，Rockford，Il 61105)#31001；1∶1000稀释；0.1μL/孔)以100μL/孔施加至每个孔，并且于25℃温育1小时。
平板用PBS/0.05％Tween 20进行洗涤，2分钟×4，随后用H2O进行洗涤，2分钟×2。通过下列方式来制备新鲜的底物：将1片ImmunoPure OPD(过氧化物酶底物)(Pierce，Rockford，Il 61105#34006)溶解在9mL水中，然后添加1mL稳定的过氧化物缓冲液(10x，Pierce，Rockford，Il 61105#34062)。向每个孔中添加底物(100μL/孔)，并且于25℃进行温育。用50μL 2.5M硫酸来终止反应，并且在平板阅读器中测量在490nm处的吸光度。
用于Southern印迹分析的方法
根据制造商的指导，使用Qiagen DNeasyTM植物小型试剂盒(cat#69104)来提取棉花基因组DNA，用30个单位的限制酶Bcl 1(Promega，cat#R6651)于37℃对基因组DNA(10μg)消化过夜。将经消化的基因组DNA以35V在0.8％琼脂糖凝胶(在1XTBE中)上电泳16小时。在转移至膜前，凝胶在0.2M HCl中处理10分钟，在1.5M NaCl、0.5M NaOH中处理30分钟，和在1M Tris-HCL pH 7.5、1.5M NaCl中处理30分钟。在室温下在10XSSC中通过毛细管转移使DNA向尼龙膜(Hybond N+，Amersham Biosciences，cat#RPN203B)转移过夜。使用1200μJ的UV光(Hoefer UV crosslinker)，将DNA交联至膜。使膜于42℃在50％v/v甲酰胺、5XSSPE、5X Denhardt’s溶液、0.5％SDS w/v和0.1mg/mL酸降解的鲱精DNA的溶液中预杂交6小时。使用Prim-a-gene标记***，用经P32标记的dCTP(Promegia，cat#U1100)制备放射性探针。将膜与探针一起于42℃温育过夜。将膜于42℃在2XSSC和0.1％SDS的溶液中洗涤两次30分钟，以去除未结合的探针。在显影前，于-80℃使印迹暴露于X-RAY胶片(Fuji，cat#10335)5天。
结果
通过ELISA对原初转基因植物进行筛选导致鉴定出表达可检测水平的成熟NaD1的10株植物(1株植物来自CT 78，而9株植物来自CT 83)。成熟NaD1(SEQ ID NO：1，残基26-72)的水平在植物中是变化的(表4)。除品系83.68.2外，表达成熟NaD1的所有植物具有扭曲的或小的叶，常常伴随有短的节间(图6)。10个原初转化体中的7个是不育的，而其他3个品系产生具有数目减少了的种子的棉铃(78.131.1、83.102、83.68.2)。这些结果暗示，成熟NaD1(M结构域)(SEQ ID NO：1，残基26-72)的存在直接影响了转基因植物的生长和发育。
让ELISA阴性的(即，无NaD1表达)来自用pHEX22进行的转化实验的11株植物继续在温室中生长。这些植物中的9株(82％)具有正常表型，而其他2株具有轻微扭曲的叶(18％)。这个结果类似于用棉花进行的其他转化实验。例如，始终存在低数目的具有不寻常的表型的植物(小于20％)，这明显是由于所使用的棉花胚胎发生再生方法。改变的表型归因于通过组织培养的细胞传代。
应当指出，我们先前已产生了表达编码具有尾的NaD1(SEQ ID NO：1，残基1-105)的DNA的转基因棉花(实验CT 35，美国专利7,041,877；还可参见实施例3)。在这个实验中产生的11株小植株中，2株植物(18％)具有不寻常的表型。这两株植物均没有被发现表达NaD1。重要的是，来自实验CT 35的3株最高表达NaD1(加上CTPP)(SEQ IDNO：1，残基1-105)的植物(35.9.1、35.105.1和35.125.1)(参见实施例3)具有正常表型并且是能育的。
基于分开的ELISA的估计暗示，在具有防卫素加上尾(SMT)的植物中NaD1M结构域的水平显著高于在表达NaD1减去尾(SMΔT)的植物中的水平。一个例外可能是品系78.131.1，其表达非常高水平的成熟NaD1(SMΔT)。这株植物具有扭曲的叶和小的棉铃。图6显示了2株原初转基因植物：82.23.2(A)和83.96.2(B)。植物83.96.2具有更高水平的NaD1表达(参见表5)并且展示出更严重的表型变异。这两株植物都是不育的。
表5
在实验CT 78和CT 83中产生的表达SMΔT的原初转基因植物的表征。
将ELISA结果评定为从+(低表达)到++++(最高表达)的等级。
  转基因植物  ELISA得分   表型
  78.131.1  ++++   扭曲的叶，正常的节间。具有减少的种子的小的棉铃。
  83.23.2  ++   叶轻微扭曲，正常的节间，不育
  83.54.1  +++   扭曲的叶，短的节间，不育
  83.67.1  +   扭曲的叶，短的节间，不育
  83.68.2  ++   正常的叶和节间，能育。具有数目减少了的种子的棉铃。
  83.96.2  +++   扭曲的叶，丛生，短的节间，不育
  83.102.1  +++   小的叶，正常的节间，能育。具有数目减少了的种子的小的棉铃。
  83.111.3  ++   正常的叶，短的节间，不育。
  83.166.1  +   扭曲的叶，短的节间，不育
  83.182.1  +++   扭曲的叶，细长的植物。不育。
分离T2植物的评估
使原初转基因品系78.131.1进行自花传粉，并且对子代植物进行评估以测定异常表型是否与防卫素基因分离。通过ELISA来测定NaD1(M结构域)的表达(表6)。代表性的ELISA显示在图7中。
表6
在来自原初转基因品系78.131.1的子代植物中NaD1的表达
  转基因棉花品系   78.131.1
  幼苗(原初转基因品系的子代)的数目   75
  通过ELISA测定的表达NaD1的植物的数目   58(77％)
  通过ELI SA测定的不表达NaD1的植物的数目   17(23％)
所有表达NaPI(M结构域)的子代植物展示出与亲本转基因植物相同的异常表型(即，严重扭曲的叶)，而所有不表达NaD1的植物具有正常的表型。图8A显示了对于78.131.1子代植物的观察的照片。
在78.131.1的子代中NaD1表达的分离与原初转基因植物具有一个拷贝的NaD1基因相一致(表6)。这通过Southern印迹分析而得到证实(图8B)。
这些结果证实，缺乏CTPP的成熟NaD1的存在导致不寻常的异常表型。可以得出结论，成熟NaD1对于植物是有毒性的。用包含C-末端尾的NaD1基因(SMT)转化的植物没有展现出异常表型，这暗示CTPP(SEQ ID NO：1，残基73-105)保护植物不受该分子的毒性部分的影响，或者它将该蛋白质靶向至液泡，在液泡中该蛋白质被隔离起来。
3.免疫印迹分析
通过免疫印迹分析来评估通过ELISA而被确定关于NaD1而言阳性的植物。在丙酮中从100mg叶组织(第一片完全展开的叶)之中提取总蛋白质，并且使沉淀的蛋白质重悬浮于具有3％PVPP的PBS-T中。在离心后，将上清液调整至1X LDS样品缓冲液(NuPAGETM(Invitrogen，Carlsbad，CA 92008))和5％(v/v)β-巯基乙醇。NaD1抗体(针对具有尾的NaD1而制备的)以1mg/ml储液的1/1000稀释物进行使用。对照是：150或50ng纯化的NaD1，35.125.1植物(具有尾的NaD1，纯合的)，未转化的Coker。
在品系35.125.1(SMT构建体)、78.131.1(SMΔT构建体)和83.68.2(SMΔT构建体)中检测出成熟NaD1(SEQ ID NO：1，残基26-72)(图9)。在品系35.125.1中检测出成熟NaD1加上CTPP(图9)。
4.NaD1的亚细胞定位
使用免疫荧光(用抗NaD1抗体)来测定NaD1在转基因植物中的亚细胞定位。
在固定时，从相同的叶获取样品，并且如上所概述的通过ELISA测定法来测定NaD1水平。在品系35.125.1和78.131.1中的NaD1水平分别为0.01％和0.02％的总可溶性蛋白质。
将来自非转基因的Coker、品系35.125.1(用pHEX 3NaD1，SMT构建体转化的)和品系78.131.1(用pHEX22NaD1，SMΔT构建体转化的)的叶片段在4％低聚甲醛中进行固定并包埋在石蜡中，并且通过Austin Health进行切片。将切片与抗NaD1抗体(50μG/mL，在封闭溶液中)[0.2％Triton X 100，1mg/mL BSA，在PBS中]一起温育60分钟，并且在施加二抗[Alex
Figure G2008800195411D00361
Molecular Probes，在封闭溶液中以1∶200进行稀释]之前用1XPBS进行洗涤。切片在Olympus BX50显微镜上进行显现，并且使用具有点RT软件的单色点照相机(spotcamera)来捕获图像。
防卫素，NaD1，存在于来自品系35.125.1的叶细胞的液泡中，所述品系35.125.1表达具有CTPP尾的NaD1(SMT构建体)(图10A)。在与免疫前血清进行温育的对照中，未观察到免疫荧光(图10B)。相反地，NaD1明显不存在于品系78.131.1的液泡中，所述品系78.131.1表达不含CTPP尾的NaD1(SMΔT构建体)(图10C)。这些细胞中的NaD1在细胞质和细胞外空间中形成点状沉积物。在与免疫前血清一起进行温育的对照中，在液泡中未检测出荧光，未观察到免疫荧光(图10D)。与在35.125.1转化体(具有CTPP尾的NaD1)中的叶细胞相比较，在78.131.1转化体中的叶细胞看起来更小，并且具有更不规则的形状。这个观察结果可以解释图8中所呈现的改变的叶形态。
实施例2：在转基因植物中具有C-末端前肽的防卫素前体的鉴定
使用CTPP特异性抗体，如实施例1中所描述的，通过免疫印迹分析来测试来自花烟草的未成熟芽和来自转基因棉花品系35.125.1(具有尾的NaD1，纯合的)的叶的蛋白质样品(图11)。转基因棉花品系35.125.1先前在美国专利7,041,877中进行了描述，该专利通过提及而合并入本文。它的实施例11公开了用编码NaD1(在那里称为NaPdf1)的全长(SMT)核酸转化的品系35.125.1。
在提取缓冲液(100mM Tris HCl、10mM EDTA、2mM CaCl2和15mM β-巯基乙醇，1∶4)中，从未成熟的花烟草芽中提取总可溶性蛋白质。在丙酮中，从35.125.1的叶组织中提取蛋白质，并且使粒状沉淀重悬浮于提取缓冲液中。在离心后，将上清液调整至1XLDS样品缓冲液(NuPAGETM(Invitrogen，Carlsbad，CA 92008))和5％(v/v)β-巯基乙醇。经A蛋白纯化的CTPP抗体以1mg/ml储液的1/500稀释物进行使用。对照是1ug纯化的NaD1。
关于CTPP抗体的产生，化学合成NaD1的具有33个氨基酸的CTPP(SEQ ID NO：1，残基73-105)(其在C-末端处具有额外的半胱氨酸残基)(VFDEKMTKTGAEILAEEAKTLAAALLEEEIMDNC)(SEQ ID NO：42)，以促进所述肽与载体蛋白的缀合。根据制造商的指导，将所述CTPP肽化学交联至经马来酰亚胺活化的大匙孔帽贝(Megathuracrenulata)匙孔血蓝蛋白(KLH)(
Figure G2008800195411D00371
，来自Pierce，Rockford，Il 61105)。使经缀合的肽在PD-10柱(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)上进行脱盐，然后注射入兔中以用于产生多克隆抗体，如先前在Lay等人(2003，同上)中所描述的。
在花烟草的未成熟芽中和在品系35.125.1的叶中检测出成熟NaD1加上CTPP(SEQ ID NO：1，残基26-105)(图11A)。
紧在用CTPP抗体进行探测后，印迹用NaD1抗体(1mg/ml储液的1/1000稀释物)再次探测过夜。在未成熟芽中检测出成熟NaD1(SEQID NO：1，残基26-72)(图11B)。
结果证明，通过编码全长NaD1(SMT)的DNA转化的转基因棉花植物表达成熟结构域(M)和成熟结构域加上尾(MT)，如在实施例1，图9，泳道4中所描述的，并且通过如上所述使用针对NaD1 CTPP的多肽特异性抗体而得到证实。此处的数据不同于在美国专利7,041,877中报道的数据(参见例如，那里的图14)，其显示出从转基因烟草中提取的与抗体具有反应性的NaD1的单个条带。这一明显差异的解释被认为是由于经改善的提取，特别是在丙酮沉淀的使用方面。现在，显然的是，在全长(SMT)NaD1的翻译后加工之后，保留了一部分的NaD1 CTPP。
实施例3：在表达NaD1的转基因棉花中蚀脉尖镰孢(Fov)感染的抑制
转基因棉花品系35.125.1先前在美国专利7,041,877中进行了描述，该专利通过提及而合并入本文。它的实施例11公开了用编码NaD1(在那里称为NaPdf1)的全长(SMT)核酸转化的品系35.125.1。它的实施例8公开了，20μg/mL的纯化的NaD1M结构域在体外抑制了灰葡萄孢和石竹尖镰孢的生长。
使用受感染的土壤的温室生物测定法
温室受感染土壤生物测定法用于评估品系35.125.1中对于Fov的抗性水平。在粟中制备Fov(从棉花中分离的澳大利亚分离物VCG01111#24500。来自Wayne O’Neill，Farming Systems Institute，DPI，Queensland，Australia的赠予)的培养物，并且掺入土壤混合物中。在1/4强度的马铃薯右旋糖培养液(6g/L马铃薯右旋糖)中制备Fov的培养物，并且于26℃生长约1周。将该培养物(5-10mL)用于感染经高压灭菌的脱壳的粟，随后让其在室温下生长2-3周。通过在200L堆肥大玻璃杯中用力混合，将受感染的粟以1％(v/v)掺入到经巴氏灭菌的基于泥炭的土壤混合物中。将受感染的土壤转移至塑料容器(10L混合物/13.5L容器)。对照土壤包含未感染的粟。将受感染的土壤用于生长品系35.125.1、Siokra 1-4(对于Fov易感的)、Sicot 189(较不易感的；工业标准)和未转化的Coker。种植每个品种/品系的八十七粒(87)种子。将种子直接播种到容器中，12粒种子/盒，以3X4阵列。在每个盒中随机播种每个品系的2-3粒种子，并且使盒每周进行旋转和移动，以减少由于在温室中的位置而可能出现的变化。使植物生长8周。在该试验自始至终测量高度和症状发展，并且在试验结束时通过破坏性取样来测定疾病得分。
结果
疾病发生率在该生物测定法中是高的，并且追踪疾病的进程8周。易感的品种Siokra 1-4和未转化的Coker首先显示出在叶中的萎蔫，而较不易感的品种Sicot 189(澳大利亚棉花工业标准)和转基因品系35.125.1(D1)在几天后才开始显示萎蔫症状。到第33天时，约83％的Siokra 1-4和76％的未转化的Coker植物显示出症状，而对于Sicot 189和转基因品系35.125.1(D1)来说，分别仅26％和36％显示出症状。
在植物存活方面可见类似的倾向(图12)。易感的品种Siokra 1-4的植物首先死亡，并且到该生物测定法结束时，仅5％的Siokra 1-4植物存活。未转化的Coker植物的存活是中等的(最终存活为38％)，而Sicot 189和品系35.125.1的植物具有显著更低的死亡率(最终存活分别为61％和57％，表7)。
在该生物测定法结束时，通过对在每株植物的横截面中维管变褐的量进行评分，来就疾病对植物进行评估(表7)。易感的品种Siokra1-4具有最高的疾病得分(4.9)，而较不易感的品种Sicot 189和转基因品系35.125.1具有最低的疾病得分(3.3和3.6)。未转化的Coker对照具有4.0的疾病得分，这在较不易感的品种(Sicot 189)和易感的品种(Siokra 1-4)中间。
使用顺序逻辑回归(ordinal logistic regression)来分析疾病得分，并且使用逻辑回归(logistic regression)来分析死亡率。表8显示了所测试的4个品系的疾病得分的成对比较。所有品系(未转化的Coker、Sicot 189和品系35.125.1)显著优于Siokra 1-4，以＜0.001的p值。在转基因品系35.125.1和亲本Coker的疾病得分之间存在显著差异(P＝0.04)。对于植物死亡率也看到了类似的统计学差异(表9)。
表7
在温室中的受镰孢感染的土壤的生物测定法的结果
  Siokra 1-4   Coker 315   Sicot 189   品系35.125.1
  发芽的植物的数目   87   84   80   80
  死亡植物的数目   83   52   31   34
  活植物的数目   4   32   49   46
  活植物％   5％   38％   61％   57％
  疾病得分*   4.9   4.0   3.3   3.6
*所有发芽的种子的平均值。0＝无症状，1＝维管变褐至茎的基部，2＝维管变褐至子叶，3＝维管变褐越过子叶，4＝维管变褐至真叶，5＝死亡。
表8
疾病得分数据的分析
  Siokra 1-4   未转化的Coker 315   Sicot 189
  Siokra 1-4   -   -   -
  Coker 315   p＜0.001   -   -
  Sicot 189   p＜0.001   P＝0.005   -
  品系35.125.1   p＜0.001   P＝0.04   P＝0.5
表9
植物死亡率数据的分析
  Siokra 1-4   未转化的Coker 315   Sicot 189
  Siokra 1-4   -   -   -
  Coker 315   p＜0.001   -   -
  Sicot 189   p＜0.001   P＝0.003   -
  品系35.125.1   p＜0.001   P＝0.01   P＝0.6
田间试验
在2006-2007年的棉花季节，在田间试验中评估转基因品系35.125.1(品系D1)、未转化的Coker 315和较不易感的品种Sicot 189(澳大利亚工业标准)。植物在澳大利亚昆士兰州的Darling Downs地区中的农场之中生长。用手将种子种植到已知受Fov感染的土壤中。在4个重复地块中种植总共800粒种子/品种，每个地块包含200粒种子/品种。记录出苗和植物存活。在试验结束时，通过测量在尽可行地接近地平面处切下的主茎的横截面中可见的维管变色，来就疾病对植物进行评估(csd.net.au/，在万维网上，2007 Variety Guide)。
结果
在该季节早期种植下种子和有利的天气条件(早雨和几天的低温)导致非常高的疾病发生率。在试验结束时关于植物存活的结果显示在图13中。关于未转化的Coker看到最高的死亡率，其中仅7.5％的植物存活。转基因品系D1具有22％的植物存活，和Sicot 189具有36％的植物存活(图13)。此外，转基因品系D1具有比非转基因Coker对照(疾病得分24)更高的疾病得分(66)，即更高的对于尖镰孢的抗性。总体转基因品系D1具有比存活的非转基因Coker对照植物高10-12％的产量(棉铃重量)。“平均产量/植物”对于品系D1来说为52g，而对于Coker对照来说为45g。这些结果类似于温室生物测定法数据，并且显示，转基因品系具有相比于未转化的Coker 315亲本而言经改善的对于Fov的抗性。
实施例4
使用构建体pHEX98(图14A)在番茄叶和棉花子叶中瞬时表达嵌合防卫素，SMT″类型。S和M结构域是NaD1的序列(SEQ ID NO：1，残基1-72)；T″获自TPP3(SEQ ID NO：8)，番茄(西红柿(Solanumlycopersicum))的防卫素。C-末端TPP3酸性结构域(T″)的氨基酸序列(SEQ ID NO：8，残基74-105；和图3A)在Lay等人(2003，同上)和Genbank登录号U20591中给出。例示的嵌合防卫素图示在图 14B中。
将pHEX98(图14A)引入到根瘤土壤杆菌中，并且使用棉花子叶或番茄叶通过瞬时测定法来测定NaD1的表达。将土壤杆菌的细菌“菌苔”涂布在选择性平板上，并且在黑暗中于30℃生长3天。然后，将细菌在渗透缓冲液(10mM氯化镁和10μm乙酰丁香酮(在DMSO中的0.1M储液))中重悬浮至1.0的OD600nm，并且在室温下温育2-4小时。在渗透之前，让棉花植物在控温生长箱(25℃，16小时/8小时的光照/黑暗循环)中生长8天。通过将1mL注射器轻轻按压在子叶上并且用土壤杆菌悬浮液充满子叶腔，来对子叶的下侧进行渗透。在子叶的顶侧上注意到渗透区域(通过变黑来指明)。每个子叶施行最多4次渗透。让植物再生长4天。然后，切掉经渗透的区域，称重，并在液氮中进行冷冻。对于来自3周龄番茄幼苗的叶使用相同操作程序。如实施例1和3中所描述的，通过ELISA和免疫印迹来测定蛋白质表达。
关于在番茄叶(图14C)和棉花子叶(图14D)中的NaD1表达的ELISA测定法阐明了，从pHEX98构建体上表达出NaD1，并且用TPP3尾(T″)替代NaD1尾(T)对于NaD1积累没有显著影响。也就是说，TPP3尾与NaD1尾一样有效。所表达的蛋白质的蛋白质印迹分析(图 14E)显示，从pHEX98构建体产生的防卫素主要是成熟NaD1。也就是说，TPP3尾被有效地从成熟NaD1结构域(M)上加工下来。
使用pHEX98构建体在转基因番茄中稳定表达上文所描述的嵌合防卫素。由于转基因番茄中的NaD1表达，所述嵌合防卫素提供了增强的真菌抗性。TPP3尾的使用提供了转运功能，以用于使NaD1移动至贮存液泡和用于改善NaD1 M结构域在转基因番茄细胞中的毒性效应。
通过用于番茄转化的已知技术来施行转化，其中使用具有上文所描述的SMT′嵌合序列的二元载体(McCormick，S.等人(1986)PlantCell Rep.5：81-84)。
通过已知的番茄转化方法来再生转化体。使用实施例1-3中所描述的ELISA测试，就NaD1(M结构域)表达来检验转基因植物的幼苗。基本上如本文中所述的，就真菌抗性和对昆虫害虫的毒性来测试具有正常形态且表达可检测量的NaD1的植物。
可以通过下列方式来达到表达的进一步优化：将TPP3的S(SEQ IDNO：8，残基1-25)和T(SEQ ID NO：8，残基74-105)结构域与NaD1的成熟(M)防卫素结构域相组合，以形成被设计用于在转基因番茄中NaD1成熟结构域的最佳表达的S′MT′的嵌合防卫素。
实施例5
使用构建体pHEX89(图15A)在棉花子叶中瞬时表达嵌合防卫素，SMT′类型。S和M结构域是NaD1的序列(SEQ ID NO：1，残基1-72)；T′获自NaPI，来自花烟草的蛋白酶抑制剂(SEQ ID NO：35；还可参见图4(图15B))。C-末端NaPI液泡靶向序列的氨基酸序列在美国专利6,031,087中给出，所述专利通过提及而合并入本文，至与此不相矛盾的程度。例示的嵌合防卫素图示在图15B中。
可以通过下列方式来达到表达的进一步优化：将NaPI的信号肽(S′)和C-末端液泡靶向序列(T′)与NaD1的成熟(M)防卫素结构域相组合，以形成被设计用于在转基因棉花中NaD1成熟结构域的最佳表达的S′MT′的嵌合防卫素。用于表达S′MT′的构建体pHEX80在图15C中给出，并且蛋白质产物的图示呈现在图15D中。
如实施例4中所述的，进行在棉花子叶中pHEX89和pHEX80的瞬时表达。通过ELISA对于NaD1表达的定量呈现在图14D中。从pHEX89(SMT′)和pHEX80(S′MT′)构建体表达出NaD1。在棉花中的瞬时表达期间，用NaPI尾替代NaD1尾对于NaD1积累没有显著影响。在pHEX80构建体中用NaPI的信号序列替代NaD1信号序列增加了NaD1的表达(图14D)。所表达的蛋白质的蛋白质印迹分析(图14E)显示，成熟防卫素在从pHEX89和pHEX80构建体上表达期间积累。也就是说，NaPI尾被有效地从成熟NaD1防卫素结构域(M)上去除。
为了证实NaPI尾足以将NaD1靶向液泡，制备了这样的DNA构建体，所述DNA构建体在绿色荧光蛋白(GFP)以及随后的NaPI CTPP的编码序列之前编码NaPI信号肽(pHEX96)。还制备了不含编码NaPICTPP的DNA的相同构建体(pHEX97)(图16A)。将编码具有NaPI信号肽和NaD1 CTPP的GFP的pHEX70用于证明，NaD1CTPP也足以将蛋白质导向液泡。如在实施例4中对于棉花所描述的，在本氏烟草的叶中瞬时表达这些构建体，并且使用Leica共焦显微镜来检查GFP荧光。
从pHEX96和pHEX70[GFP+NaPI CTPP]构建体产生的GFP在液泡中积累，而在细胞质和细胞外空间中检测出来自pHEX97构建体的GFP(无CTPP的GFP)(图16B)。
使用pHEX89构建体在转基因棉花中稳定表达SMT′类型嵌合防卫素。由于转基因棉花中的NaD1表达，该嵌合防卫素提供了相比于未转化的亲本品系而言增强的真菌抗性。NaPI尾的使用提供了转运功能，以用于使NaD1移动至贮存液泡和用于改善NaD1 M结构域在转基因棉花细胞中的毒性效应。
通过用于棉花转化的已知技术来施行转化，其中使用具有上文所描述的SMT′嵌合序列的二元载体。
通过已知的棉花转化方法来再生转化体(实施例1)。使用实施例1-3中所描述的ELISA测试，就NaD1表达来检验转基因植物的幼苗。基本上如本文中所述的，就真菌抗性来测试具有正常形态且表达可检测量的NaD1的植物。
可以通过下列方式来达到表达的进一步优化：将NaPI的S和C-末端液泡靶向序列与NaD1的成熟(M)防卫素结构域相组合，以形成被设计用于在转基因棉花中NaD1成熟结构域的最佳表达的S′MT′的嵌合防卫素。
实施例6
使用pHEX44(图17A)在棉花和本氏烟草中瞬时表达嵌合防卫素，SMT′类型。本氏烟草是来自Richard McKnight，University of Utago，New Zealand的赠予。该植物也可得自商业来源。S和M结构域是先前所描述的NaD1的序列；T′是截短形式的NaD1 CTPP(图17B)。所述CTPP由NaD1 CTPP的前4个氨基酸(VDFE)(图4；SEQ ID NO：1，残基73-76)组成。
如实施例4中所述的，进行在棉花子叶中pHEX44的瞬时表达。通过ELISA对于NaD1表达的定量呈现在图17C中。将完整的具有33个氨基酸的NaD1CTPP(T)截短至4个氨基酸(VFDE)并没有取消NaD1表达，但导致NaD1积累大为减少。当构建体在本氏烟草中瞬时表达并且在蛋白质印迹上检查NaD1产生时，从具有截短的CTPP的构建体(pHEX44)上NaD1产生的减少也是明显的(图17D)。
使用pHEX44构建体来进行棉花转化实验。如实施例1中所述的，通过土壤杆菌介导的转化来产生转基因棉花品系。如实施例1中所述的，通过使用特异性抗血清的ELISA来测定从编码SMT′的DNA上NaD1(SEQ ID NO：1，残基26-72)的表达。从处于组织培养中的小植株收集叶样品。
鉴定出表达可检测水平的成熟NaD1的5株植物(图17E)。表达水平低于当使用已用pHEX3构建体(SMT)转化的纯合品系35.125.1(美国专利7,041,877)时通常获得的那些表达水平(图17E)。
总之，四氨基酸元件(VFDE，图4)对于NaD1(M)的完全表达来说不是足够的。然而，例示的嵌合防卫素可以提供增强的通过在转基因棉花和烟草中的NaD1表达而提供的真菌抗性。
实施例7
使用DNA构建体pHEX92(图18A)在棉花子叶中瞬时表达嵌合防卫素，SMT″类型(参见实施例4)。S和M结构域是NaD2的序列(SEQID NO：33)；T″获自NaD1(SEQ ID NO：1，残基73-105)(图18B)。为了进行比较，还在棉花子叶中瞬时表达了编码不含C-末端尾(T)的NaD2的S和M结构域(图18C)的第二种构建体pHEX91(图18B)。NaD2(SM)的核酸和氨基酸序列呈现在图19中。
如实施例4中所述的，进行在棉花子叶中pHEX92和91的瞬时表达。通过ELISA对于NaD2表达的定量呈现在图18D中。与从pHEX91构建体(其编码不含C-末端尾的NaD2)产生的NaD2的水平相比较，向NaD2防卫素(M)添加NaD1尾增加了在瞬时表达期间积累的NaD2的水平。使用NaD2抗体的免疫印迹证实，从pHEX92构建体(NaD2防卫素加上NaD1 CTPP)产生了更多的NaD2，并且NaD1CTPP已通过蛋白水解而被去除(图18E)。
使用pHEX92构建体在转基因拟南芥和棉花中稳定表达SMT″类型嵌合防卫素。由于转基因棉花中的NaD2表达，该嵌合防卫素提供了相比于未转化的亲本品系而言增强的真菌抗性。NaD1尾的使用提供了转运功能，以用于使NaD2移动至贮存液泡和用于改善以不含尾形式表达的NaD2在转基因棉花细胞中的毒性效应。
通过用于棉花转化的已知技术来施行转化，其中使用具有上文所描述的SMT′嵌合序列的二元载体。
通过已知的棉花转化方法来再生转化体。使用实施例1-3中任一个之中所描述的ELISA测试，就NaD2(M结构域)表达来检验转基因植物的幼苗，除了针对NaD2(SEQ ID NO：33，残基32-78)来制备抗体外。基本上如本文中所述的，就真菌抗性来测试具有正常形态且表达可检测量的NaD2(SEQ ID NO：33)的植物。
实施例8
使用DNA构建体pHEX76(图20A)在棉花子叶中瞬时表达嵌合防卫素，SMT″类型。S和M结构域是Rs-AFP2的序列(SEQ ID NO：16)；T″获自NaD1(SEQ ID NO：1，残基73-105)。Rs-AFP2的氨基酸序列呈现在图3和SEQ ID NO：17中。
如实施例4中所述的，进行在棉花子叶中pHEX76的瞬时表达。使用针对来自NaD1的CTPP的抗体(关于该抗体的描述可参见实施例2)，采用蛋白质印迹来达到蛋白质表达的分析。从pHEX76构建体产生Rs-AFP2加上CTPP(MT″)(图20C)。有趣的是，从pHEX76上的表达看起来高于从pHEX43和pHEX3构建体上的表达，所述pHEX43和pHEX3构建体编码NaD1(M)+NaD1CTPP(T)。这个结果可能是所产生的防卫素的水平或从成熟防卫素结构域上去除NaD1CTPP(T)的速率的反映。对于评估Rs-AFP(M)积累，针对Rs-AFP(M)的抗体是不可用的。
在转基因棉花植物中稳定表达图20A和20B的SMT′嵌合防卫素。例示的嵌合防卫素[图20B]提供了增强的通过在转基因植物中的Rs-AFP2(SEQ ID NO：17)表达而提供的真菌抗性。NaD1尾(SEQ IDNO：1，残基73-105)的使用提供了转运功能，以用于使Rs-AFP2(SEQID NO：17)移动至贮存液泡和改善Rs-AFP2在转基因双子叶和单子叶细胞中的毒性效应。
如本文实施例1中所述的，进行棉花的转化和再生。使用针对Rs-AFP2而产生的抗体，采用ELISA测试就Rs-AFP2(M结构域)(SEQID NO：17，残基30-80)表达来检验转基因植物的幼苗。基本上如本文中所述的，就真菌抗性来测试具有正常形态且表达可检测量的Rs-AFP2的植物。
实施例9
使用DNA构建体pHEX63(图21A)在棉花子叶和本氏烟草叶中瞬时表达嵌合防卫素，SMT′类型。S和M结构域是NaD1的序列(SEQ IDNO：1，残基1-72)；T′获自BL，大麦(Hordeum vulgare)的凝集素(SEQ ID NO：24)(图21B)。来自大麦凝集素(BL)的C-末端液泡靶向序列的氨基酸序列在图4中给出。
如实施例4中所述的，进行pHEX63的瞬时表达。通过ELISA来进行在棉花子叶中蛋白质表达的分析(图21C)。当考虑幼苗间的变化时，将NaD1 CTPP(T)交换成来自大麦凝集素的CTPP序列对于表达水平没有重大影响。在本氏烟草叶中瞬时表达pHEX63期间获得了类似的结果(图21D)。有趣的是，所表达的蛋白质的蛋白质印迹分析(图 21E)表明，大麦凝集素CTPP结构域比NaD1 CTPP(T)更加有效地被从NaD1成熟防卫素(M)上加工下来。
使用DNA构建体pHEX63在经转化的棉花植物中稳定表达图21B的SMT′类型嵌合防卫素。如实施例1中所述的进行转化，其中使用具有上文所描述的SMT′嵌合序列的二元载体。
如先前所描述的，再生转化体。使用实施例1-3中任一个之中所描述的ELISA测试，就NaD1(M结构域)表达来检验转基因植物的幼苗。基本上如本文所述的，就真菌抗性来测试具有正常形态且表达可检测量的NaD1的植物。
例示的嵌合防卫素提供了增强的通过在转基因植物中的NaD1表达而提供的真菌抗性。BL尾的使用提供了转运功能，以用于使NaD1移动至贮存液泡和改善NaD1在转基因双子叶和单子叶细胞中的毒性效应。
实施例10
使用DNA构建体pHEX62(图22A)在棉花子叶中瞬时表达嵌合防卫素，SMT″类型。S和M结构域是NaD1的序列(SEQ ID NO：1，残基1-72)；T″获自ZmESR-6，玉米(玉蜀黍)的防卫素(SEQ ID NO：18，残基80-107)[图22B]。来自ZmESR-6的C-末端靶向序列的氨基酸序列在图3B和3D中给出。
如实施例4中所述的，进行pHEX63的瞬时表达。通过ELISA来进行在棉花子叶(图21C)和本氏烟草叶(图21D)中蛋白质表达的分析。如在实施例9中对于大麦凝集素CTPP所观察到的，用来自玉蜀黍防卫素(ZmESR-6)的CTPP(T″)置换NaD1CTPP(T)对于在瞬时表达期间产生的NaD1的水平没有显著影响(图21C和21D)。此外，免疫印迹证明，ZmESR-6CTPP也比NAD1-CTPP更加有效地被从NaD1成熟结构域上加工下来(图21E)。因此，来自单子叶植物的CTPP序列在双子叶植物中对于防卫素(M结构域)的有效表达来说是起作用的。
使用pHEX62构建体来进行棉花转化实验。如实施例1中所述的，通过土壤杆菌介导的转化来产生转基因棉花品系。如实施例1中所述的，通过使用特异性抗血清的ELISA来测定从编码SMT″的DNA上NaD1(SEQ ID NO：1，残基26-72)的表达。从处于组织培养中的小植株收集叶样品。
鉴定出2株表达可检测水平的成熟NaD1的植物(图21F)。
基本上如本文中所述的，就真菌抗性来测试具有正常形态且表达可检测量的NaD1的植物。例示的嵌合防卫素提供了增强的通过在转基因植物中的NaD1表达而提供的真菌抗性。ZmESR-6C-末端序列(或其部分)的使用提供了转运功能，以用于使NaD1移动至贮存液泡和改善NaD1在转基因单子叶和双子叶植物细胞中的毒性效应。
如本文所使用的，“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，并且是包括式的或开放式的，和不排除另外的、未描述的元素或方法步骤。如本文所使用的，“由……组成”排除了在该权利要求要素中未指定的任何元素、步骤或成分。如本文所使用的，“基本上由……组成”不排除实质上不影响该权利要求的基本和新型特征的材料或步骤。在本文中术语“包含”的任何描述，特别是在组合物的组分的描述或装置的元件的描述中，应当被理解为包括基本上由所述组分或元素组成的那些组合物和方法，以及由所述组分或元素组成的那些组合物和方法。在本文中适当地举例说明性地描述的本发明可以在不存在本文未具体公开的任何一种或多种元素、一种或多种限制的情况下进行实施。
将已使用的术语和表述用作描述性而非限制性的术语，并且不希望此类术语和表述的使用排除了所显示和描述的特征的任何等价物或其部分，但应认识到各种修饰在所要求保护的本发明的范围内都是可能的。因此，应当理解，尽管本发明已通过优选的实施方案和任选的特征而进行了具体公开，但本领域技术人员可以采取本文公开的概念的修饰和变化形式，并且此类修饰和变化形式被视为在由所附权利要求定义的本发明的范围内。
一般而言，本文使用的术语和短语具有其在本领域中所公认的含义，这可以通过参考本领域技术人员已知的标准教科书、期刊参考文献和上下文而找到。提供了下述定义以澄清其在本发明的背景中的具体用途。
说明书中提及的所有专利和出版物通过提及而合并，至与本公开内容不相矛盾的程度，并且那些参考文献反映了本发明所属领域的技术人员的技术水平。
本领域技术人员会容易地意识到，本发明完全适合于实现所提及的目的并获得所提及的结果和优点，以及本发明中所固有的那些。在本文中作为优选实施方案的目前代表而描述的方法、组分、材料和尺度是作为例子而提供的，并不希望作为对于本发明的范围的限制。本领域技术人员将会想起在本发明的精神内所包括的其中变化和其他用途，它们包括在权利要求书的范围内。
尽管本文的描述包括某些具体信息和例子，但它们不应被解释为限制了本发明的范围，而应被解释为仅仅提供了本发明的某些实施方案的举例说明。因此，另外的实施方案也在本发明的范围内，并且在下述权利要求书的范围内。
表10
构建体列表
防卫素构建体
  pHEX编号   信号肽(S)  成熟防卫素蛋白质(M)   CTPP(T)
  3   NaD1  NaD1   NaD1
  22   NaD1  NaD1   -
  43   NaD1  NaD1   NaD1
  44   NaD1  NaD1   截短的NaD1
  62   NaD1  NaD1   ZmESR-6
  63   NaD1  NaD1   大麦凝集素
  76   RsAFP2  RsAFP2   NaD1
  80   NaPI   NaD1   NaPI
  89   NaD1   NaD1   NaPI
  91   NaD2   NaD2   -
  92   NaD2   NaD2   NaD1
  98   NaD1   NaD1   TPP3
GFP构建体
  pHEX编号   信号肽(S)   成熟蛋白质   CTPP(T)
  70   NaPI   GFP   NaD1
  71   NaPI   GFP   ZmESR-6
  72   NaPI   GFP   大麦凝集素
  95   -   GFP   -
  96   NaPI   GFP   NaPI
  97   NaPI   GFP   -
表11
  SEQ ID NO-图3
  1   NaD1   氨基酸序列
  2   PhD1   氨基酸序列
  3   PhD2   氨基酸序列
  4   FST   氨基酸序列
  5   NaThio1   氨基酸序列
  6   NeThio2   氨基酸序列
  7   NpThio1   氨基酸序列
  8   TPP3   氨基酸序列
  9   CcD1   氨基酸序列
  10   Nt-硫素   氨基酸序列
  11   NTS13   氨基酸序列
  SEQ ID NO-图3
  12   TGAS118   氨基酸序列
  13   PPT   氨基酸序列
  14   J1-1   氨基酸序列
  15   J1-2   氨基酸序列
  16   Rs-AFP1   氨基酸序列
  17   Rs-AFP2   氨基酸序列
  18   ZmESR-6   氨基酸序列
  19   Art v1(成熟结构域到C-末端结构域)   氨基酸序列
  20   SF18(成熟结构域到C-末端结构域)   氨基酸序列
  SEQ ID NO-图4
  21   烟草β-1，3-葡聚糖酶   氨基酸序列
  22   烟草渗透蛋白AP-24   氨基酸序列
  23   巴西坚果25白蛋白   氨基酸序列
  24   大麦凝集素   氨基酸序列
  25   小麦胚凝集素   氨基酸序列
  26   烟草CBP 20   氨基酸序列
  27   大豆β-伴大豆球蛋白(conglycinin)á亚基   氨基酸序列
  28   proCon A   氨基酸序列
  SEQ ID NO-图4
  29   大麦多胺氧化酶   氨基酸序列
  30   烟草壳多糖酶A   氨基酸序列
  31   菜豆蛋白   氨基酸序列
  42   NatD1   氨基酸序列
  43   SGN U372549   氨基酸序列
  SEQ ID NO-图19
  32   NaD2   DNA序列
  33   NaD2   氨基酸序列
  SEQ ID NO-其他
  34   TPP3 CTPP   氨基酸序列
  35   NaPI   氨基酸序列
  36-表3   甘薯sporamin   氨基酸序列
  37-表3   马铃薯22kDa蛋白N-末端前肽   氨基酸序列
  38-表3   大麦aleurain N-末端前肽   氨基酸序列
  39-表3   马铃薯组织蛋白酶D抑制剂N-末端前肽   氨基酸序列
  40   经修饰的CTPP   氨基酸序列
  41   液泡易位序列   氨基酸序列
  44   NaPI S-肽   氨基酸序列
序列表
 
<110>Hexima LTD
Anderson，Marilyn
Heath，Robyn
 Italic="0"> 
<120>经修饰的植物防卫素
 
<130>46-06
 
<140>unassigned
<141>2008-01-01
 
<150>US 60/912,984
<151>2007-04-20
 
<160>44
 
<170>PatentIn version 3.5
 
<210>1
<211>105
<212>PRT
<213>花烟草
 
<400>1
 
Met Ala Arg Ser Leu Cys Phe Met Ala Phe Ala Ile Leu Ala Met Met
1               5                   10                  15
Leu Phe Val Ala Tyr Glu Val Gln Ala Arg Glu Cys Lys Thr Glu Ser
            20                  25                  30
Asn Thr Phe Pro Gly Ile Cys Ile Thr Lys Pro Pro Cys Arg Lys Ala
        35                  40                  45
Cys Ile Ser Glu Lys Phe Thr Asp Gly His Cys Ser Lys Ile Leu Arg
    50                  55                  60
Arg Cys Leu Cys Thr Lys Pro Cys Val Phe Asp Glu Lys Met Thr Lys
65                  70                  75                  80
Thr Gly Ala Glu lle Leu Ala Glu Glu Ala Lys Thr Leu Ala Ala Ala
                85                  90                  95
Leu Leu Glu Glu Glu Ile Met Asp Asn
            100                 105
 
<210>2
<211>103
<212>PRT
<213>碧冬茄
 
<400>2
 
Met Ala Arg Ser Ile Cys Phe Phe Ala Val Ala Ile Leu Ala Leu Met
1               5                   10                  15
Leu Phe Ala Ala Tyr Asp Ala Glu Ala Ala Thr Cys Lys Ala Glu Cys
            20                  25                  30
Pro Thr Trp Asp Ser Val Cys Ile Asn Lys Lys Pro Cys Val Ala Cys
        35                  40                  45
Cys Lys Lys Ala Lys Phe Ser Asp Gly His Cys Ser Lys Ile Leu Arg
    50                  55                  60
Arg Cys Leu Cys Thr Lys Glu Cys Val Phe Glu Lys Thr Glu Ala Thr
65                  70                  75                  80
Gln Thr Glu Thr Phe Thr Lys Asp Val Asn Thr Leu Ala Glu Ala Leu
                85                  90                  95
Leu Glu Ala Asp Met Met Val
            100
 
<210>3
<211>101
<212>PRT
<213>碧冬茄
 
<400>3
 
Met Ala Arg Ser Ile Cys Phe Phe Ala Val Ala Ile Leu Ala Leu Met
1               5                   10                  15
Leu Phe Ala Ala Tyr Glu Thr Glu Ala Gly Thr Cys Lys Ala Glu Cys
            20                  25                  30
Pro Thr Trp Glu Gly Ile Cys Ile Asn Lys Ala Pro Cys Val Lys Cys
        35                  40                  45
Cys Lys Ala Gln Pro Glu Lys Phe Thr Asp Gly His Cys Ser Lys Ile
    50                  55                  60
Leu Arg Arg Cys Leu Cys Thr Lys Pro Cys Ala Thr Glu Glu Ala Thr
65                  70                  75                  80
Ala Thr Leu Ala Asn Glu Val Lys Thr Met Ala Glu Ala Leu Val Glu
                85                  90                  95
Glu Asp Met Met Glu
            100
 
<210>4
<211>105
<212>PRT
<213>普通烟草(Nicotiana tabacum)
 
<400>4
 
Met Ala Arg Ser Leu Cys Phe Met Ala Phe Ala Ile Leu Ala Met Met
1               5                   10                  15
Leu Phe Val Ala Tyr Glu Val Gln Ala Arg Glu Cys Lys Thr Glu Ser
            20                  25                  30
Asn Thr Phe Pro Gly Ile Cys Ile Thr Lys Pro Pro Cys Arg Lys Ala
        35                  40                  45
Cys Ile Ser Glu Lys Phe Thr Asp Gly His Cys Ser Lys Leu Leu Arg
    50                  55                  60
Arg Cys Leu Cys Thr Lys Pro Cys Val Phe Asp Glu Lys Met Ile Lys
65                  70                  75                  80
Thr Gly Ala Glu Thr Leu Val Glu Glu Ala Lys Thr Leu Ala Ala Ala
            85                      90                 95
Leu Leu Glu Glu Glu Ile Met Asp Asn
        100                     105
 
<210>5
<211>106
<212>PRT
<213>渐狭叶烟草(Nicotiana attenuata)
 
<400>5
 
Met Ala Arg Ser Leu Cys Phe Met Ala Phe Ala Val Leu Ala Met Met
1               5                   10                  15
Leu Phe Val Ala Tyr Glu Val Gln Ala Lys Ser Thr Cys Lys Ala Glu
            20                  25                  30
Ser Asn Thr Phe Glu Gly Phe Cys Val Thr Lys Pro Pro Cys Arg Arg
        35                  40                  45
Ala Cys Leu Lys Glu Lys Phe Thr Asp Gly Lys Cys Ser Lys Ile Leu
    50                  55                  60
Arg Arg Cys Ile Cys Tyr Lys Pro Cys Val Phe Asp Gly Lys Met Ile
65                  70                  75                  80
Asn Thr Gly Ala Glu Thr Leu Ala Glu Glu Ala Asn Thr Leu Ala Glu
                85                  90                  95
Ala Leu Leu Glu Glu Glu Met Met Asp Asn
            100                 105
 
<210>6
<211>105
<212>PRT
<213>高烟草(Nicotiana excelsior)
 
<400>6
 
Met Ala Arg Ser Val Cys Phe Met Ala Phe Ala Ile Leu Ala Val Met
1               5                   10                  15
Leu Phe Val Ala Tyr Asp Val Glu Ala Lys Asp Cys Lys Thr Glu Ser
            20                  25                  30
Asn Thr Phe Pro Gly Ile Cys Ile Thr Lys Pro Pro Cys Arg Lys Ala
        35                  40                  45
Cys Ile Lys Glu Lys Phe Thr Asp Gly His Cys Ser Lys lle Leu Arg
    50                  55                  60
Arg Cys Leu Cys Thr Lys Pro Cys Val Phe Asp Glu Lys Met Ile Lys
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Thr Gly Ala Glu Thr Leu Ala Glu Glu Ala Thr Thr Leu Ala Ala Ala
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Leu Leu Glu Glu Glu lle Met Asp Asn
                100             l05
 
<210>7
<211>106
<212>PRT
<213>圆锥烟草(Nicotiana paniculata)
 
<400>7
 
Met Ala Arg Ser Leu Cys Phe Met Ala Phe Ala Val Leu Ala Met Met
1               5                   10                  15
Leu Phe Val Ala Tyr Glu Val Gln Ala Lys Ser Thr Cys Lys Ala Glu
            20                  25                  30
Ser Asn Thr Phe Pro Gly Leu Cys Ile Thr Lys Pro Pro Cys Arg Lys
        35                  40                  45
Ala Cys Leu Ser Glu Lys Phe Thr Asp Gly Lys Cys Ser Lys Ile Leu
    50                  55                  60
Arg Arg Cys Ile Cys Tyr Lys Pro Cys Val Phe Asp Gly Lys Met Ile
65                  70                  75                  80
Gln Thr Gly Ala Glu Asn Leu Ala Glu Glu Ala Glu Thr Leu Ala Ala
                85                  90                  95
Ala Leu Leu Glu Glu Glu Met Met Asp Asn
            100                 105
 
<210>8
<211>105
<212>PRT
<213>西红柿(Lycopersicon esculentum)
 
<400>8
 
Met Ala Arg Ser Ile Phe Phe Met Ala Phe Leu Val Leu Ala Met Met
1               5                   10                  15
Leu Phe Val Thr Tyr Glu Val Glu Ala Gln Gln Ile Cys Lys Ala Pro
            20                  25                  30
Ser Gln Thr Phe Pro Gly Leu Cys Phe Met Asp Ser Ser Cys Arg Lys
        35                  40                  45
Tyr Cys Ile Lys Glu Lys Phe Thr Gly Gly His Cys Ser Lys Leu Gln
    50                  55                  60
Arg Lys Cys Leu Cys Thr Lys Pro Cys Val Phe Asp Lys Ile Ser Ser
65                  70                  75                  80
Glu Val Lys Ala Thr Leu Gly Glu Glu Ala Lys Thr Leu Ser Glu Val
                85                  90                  95
Val Leu Glu Glu Glu Ile Met Met Glu
            100                 105
 
<210>9
<211>107
<212>PRT
<213>中国辣椒(Capsicum chinense)
 
<400>9
Met Ala Arg Ser Ile Tyr Phe Met Ala Phe Leu Val Leu Ala Val Thr
1               5                   10                  15
Leu Phe Val Ala Asn Gly Val Gln Gly Gln Asn Asn Ile Cys Lys Thr
            20                  25                  30
Thr Ser Lys His Phe Lys Gly Leu Cys Phe Ala Asp Ser Lys Cys Arg
        35                  40                  45
Lys Val Cys Ile Gln Glu Asp Lys Phe Glu Asp Gly His Cys Ser Lys
    50                  55                  60
Leu Gln Arg Lys Cys Leu Cys Thr Lys Asn Cys Val Phe Asp Asn Ile
65                  70                  75                  80
Pro Asn Asp Val Gly Thr Ile Leu Val Gln Asp Ala Lys Thr Leu Glu
                85                  90                  95
Ala Gln Leu Leu Glu Glu Glu Ile Leu Gly Leu
            100                 105
 
<210>10
<211>78
<212>PRT
<213>普通烟草
 
<400>10
 
Met Ala Asn Ser Met Arg Phe Phe Ala Thr Val Leu Leu Ile Ala Leu
1               5                   10                  15
Leu Val Thr Ala Thr Glu Met Gly Pro Met Thr Ile Ala Glu Ala Arg
            20                  25                  30
Thr Cys Glu Ser Gln Ser His Arg Phe Lys Gly Pro Cys Ser Arg Asp
        35                  40                  45
Ser Asn Cys Ala Thr Val Cys Leu Thr Glu Gly Phe Ser Gly Gly Asp
    50                  55                  60
Cys Arg Gly Phe Arg Arg Arg Cys Phe Cys Thr Arg Pro Cys
65                  70                  75
 
<210>11
<211>78
<212>PRT
<213>普通烟草
 
<400>11
 
Met Ala Asn Ser Met Arg Phe Phe Ala Thr Val Leu Leu Ile Ala Leu
1               5                   10                  15
Leu Val Thr Ala Thr Glu Met Gly Pro Met Thr Ile Ala Glu Ala Arg
            20                  25                  30
Thr Cys Glu Ser Gln Ser His Arg Phe Lys Gly Pro Cys Ser Arg Asp
        35                  40                  45
Ser Asn Cys Ala Thr Val Cys Leu Thr Glu Gly Phe Ser Gly Gly Arg
    50                  55                  60
Cys Pro Trp Ile Pro Pro Arg Cys Phe Cys Thr Ser Pro Cys
65                  70                  75
 
<210>12
<211>72
<212>PRT
<213>西红柿
 
<400>12
 
Met Arg Leu Phe Ala Thr Met Leu Leu Leu Ala Met Leu Val Met Ala
1               5                   10                  15
Thr Gly Pro Met Arg Ile Val Glu Ala Arg Thr Cys Glu Ser Gln Ser
            20                  25                  30
His Arg Phe Lys Gly Pro Cys Val Ser Glu Lys Asn Cys Ala Ser Val
        35                  40                  45
Cys Glu Thr Glu Gly Phe Ser Gly Gly Asp Cys Arg Gly Phe Arg Arg
    50                  55                  60
Arg Cys Phe Cys Thr Arg Pro Cys
65                  70
 
<210>13
<211>78
<212>PRT
<213>全缘叶碧冬茄(Petunia integrifolia)
 
<400>13
 
Met Gly Arg Ser Ile Arg Leu Phe Ala Thr Phe Phe Leu Ile Ala Met
1               5                  10                  15
Leu Phe Leu Ser Thr Glu Met Gly Pro Met Thr Ser Ala Glu Ala Arg
            20                  25                  30
Thr Cys Glu Ser Gln Ser His Arg Phe Hi s Gly Thr Cys Val Arg Glu
        35                  40                  45
Ser Asn Cys Ala Ser Val Cys Gln Thr Glu Gly Phe Ile Gly Gly Asn
    50                  55                  60
Cys Arg Ala Phe Arg Arg Arg Cys Phe Cys Thr Arg Asn Cys
65                  70                  75
 
<210>14
<211>75
<212>PRT
<213>辣椒(Capsicum annuum)
 
<400>14
 
Met Ala Gly Phe Ser Lys Val Val Ala Thr Ile Phe Leu Met Met Leu
1               5                   10                  15
Leu Val Phe Ala Thr Asp Met Met Ala Glu Ala Lys Ile Cys Glu Ala
            20                  25                  30
Leu Ser Gly Asn Phe Lys Gly Leu Cys Leu Ser Ser Arg Asp Cys Gly
        35                  40                  45
Asn Val Cys Arg Arg Glu Gly Phe Thr Asp Gly Ser Cys Ile Gly Phe
    50                  55                  60
Arg Leu Gln Cys Phe Cys Thr Lys Pro Cys Ala
65                  70                  75
 
<210>15
<211>74
<212>PRT
<213>辣椒
 
<400>15
 
Met Ala Gly Phe Ser Lys Val Ile Ala Thr Ile Phe Leu Met Met Met
1               5                   10                  15
Leu Val Phe Ala Thr Gly Met Val Ala Glu Ala Arg Thr Cys Glu Ser
            20                  25                  30
Gln Ser His Arg Phe Lys Gly Leu Cys Phe Ser Lys Ser Asn Cys Gly
        35                  40                  45
Ser Val Cys His Thr Glu Gly Phe Asn Gly Gly His Cys Arg Gly Phe
    50                  55                  60
Arg Arg Arg Cys Phe Cys Thr Arg His Cys
65                  70
 
<210>16
<211>80
<212>PRT
<213>萝卜(Raphanus sativus)
 
<400>16
 
Met Ala Lys Phe Ala Ser Ile Ile Ala Leu Leu Phe Ala Ala Leu Val
1               5                   10                  15
Leu Phe Ala Ala Phe Glu Ala Pro Thr Met Val Glu Ala Gln Lys Leu
            20                  25                  30
Cys Glu Arg Pro Ser Gly Thr Trp Ser Gly Val Cys Gly Asn Asn Asn
        35                  40                  45
Ala Cys Lys Asn Gln Cys Ile Asn Leu Glu Lys Ala Arg His Gly Ser
    50                  55                  60
Cys Asn Tyr Val Phe Pro Ala His Lys Cys Ile Cys Tyr Phe Pro Cys
65                  70                  75                  80
 
<210>17
<211>80
<212>PRT
<213>萝卜
 
<400>17
 
Met Ala Lys Phe Ala Ser Ile Ile Val Leu Leu Phe Val Ala Leu Val
1               5                   10                  15
Val Phe Ala Ala Phe Glu Glu Pro Thr Met Val Glu Ala Gln Lys Leu
            20                  25                  30
Cys Gln Arg Pro Ser Gly Thr Trp Ser Gly Val Cys Gly Asn Asn Asn
        35                  40                  45
Ala Cys Lys Asn Gln Cys Ile Arg Leu Glu Lys Ala Arg His Gly Ser
    50                  55                  60
Cys Asn Tyr Val Phe Pro Ala His Lys Cys Ile Cys Tyr Phe Pro Cys
65                  70                  75                  80
 
<210>18
<211>107
<212>PRT
<213>玉蜀黍
 
<400>18
 
Met Pro Ser Tyr Lys Lys Leu Val Ile Val Gly Phe Ala Leu Thr Leu
l               5                   10                  15
Leu Leu Val Ser Phe Gly Met Asp Ala Ser Ala Lys Leu Cys Ser Thr
            20                  25                  30
Thr Met Asp Leu Leu Ile Cys Gly Gly Ala Ile Pro Gly Ala Val Asn
        35                  40                  45
Gln Ala Cys Asp Asp Thr Cys Arg Asn Lys Gly Tyr Thr Gly Gly Gly
    50                  55                  60
Phe Cys Asn Met Lys Ile Gln Arg Cys Val Cys Arg Lys Pro Cys Ala
65                  70                  75                  80
Leu Glu Glu Gln Thr Glu Ala Arg Ala Gly Asp Glu Ala Ala Gly Gly
                85                  90                  95
Ala Gly Asp Met Met Ser Arg Thr Met Ala Asp
            100                 105
 
<210>19
<211>108
<212>PRT
<213>艾蒿(Artemisia vulgaris)
 
<400>19
 
Ala Gly Ser Lys Leu Cys Glu Lys Thr Ser Lys Thr Tyr Ser Gly Lys
1               5                   10                  15
Cys Asp Asn Lys Lys Cys Asp Lys Lys Cys Ile Glu Trp Glu Lys Ala
            20                  25                  30
Gln His Gly Ala Cys His Lys Arg Glu Ala Gly Lys Glu Ser Cys Phe
        35                  40                  45
Cys Tyr Phe Asp Cys Ser Lys Ser Pro Pro Gly Ala Thr Pro Ala Pro
    50                  55                  60
Pro Gly Ala Ala Pro Pro Pro Ala Ala Gly Gly Ser Pro Ser Pro Pro
65                  70                  75                  80
Ala Asp Gly Gly Ser Pro Pro Pro Pro Ala Asp Gly Gly Ser Pro Pro
                85                  90                  95
Val Asp Gly Gly Ser Pro Pro Pro Pro Ser Thr Hi s
            100                 105
 
<210>20
<211>154
<212>PRT
<213>向日葵(Helianthus annuus)
 
<400>20
 
Asp Ile Ala Thr Val Asn Gly Lys Ile Cys Glu Lys Pro Ser Lys Thr
1               5                   10                  15
Trp Phe Gly Asn Cys Lys Asp Thr Asp Lys Cys Asp Lys Arg Cys Ile
            20                  25                  30
Asp Trp Glu Gly Ala Lys His Gly Ala Cys His Gln Arg Glu Ala Lys
        35                  40                  45
His Met Cys Phe Cys Tyr Phe Asp Cys Asp Pro Gln Lys Asn Pro Gly
    50                  55                  60
Pro Pro Pro Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Thr Pro Pro Ala Pro Pro
65                  70                  75                  80
Gly Lys Gly Glu Gly Asp Ala Pro His Pro Pro Pro Thr Pro Ser Pro
                85                  90                  95
Pro Gly Gly Asp Gly Gly Ser Gly Pro Ala Pro Pro Ala Gly Gly Gly
            100                 105                 110
Ser Pro Pro Pro Ala Gly Gly Asp Gly Gly Gly Gly Ala Pro Pro Pro
        115                 120                 125
Ala Gly Gly Asp Gly Gly Gly Gly Ala Pro Pro Pro Ala Gly Gly Asp
    130                 135                 140
Gly Gly Gly Gly Ala Pro Pro Pro Gly Ala
145                 150
 
<210>21
<211>22
<212>PRT
<213>普通烟草
 
<400>21
 
Val Ser Gly Gly Val Trp Asp Ser Ser Val Glu Thr Asn Ala Thr Ala
1               5                   10                  15
Ser Leu Val Ser Glu Met
            20
 
<210>22
<211>20
<212>PRT
<213>普通烟草
 
<400>22
 
Asn Gly Gln Ala His Pro Asn Phe Pro Leu Glu Met Pro Gly Ser Asp
1               5                   10                  15
Glu Val Ala Lys
            20
 
<210>23
<211>21
<212>PRT
<213>巴西坚果(Bertholletia excelsa)
 
<400>23
 
Ile Pro Ser Arg Cys Asn Leu Ser Pro Met Arg Cys Pro Met Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Ile Ala Gly Phe
            20
 
<210>24
<211>15
<212>PRT
<213>大麦
 
<400>24
 
Val Phe Ala Glu Ala Ile Ala Ala Asn Ser Thr Leu Val Ala Glu
1               5                   10                  15
 
<210>25
<211>14
<212>PRT
<213>普通小麦(Triticum aestivum)
 
<400>25
 
Val Phe Ala Glu Ile Thr Ala Asn Ser Thr Leu Leu Gln Glu
1               5                   10
 
<210>26
<211>11
<212>PRT
<213>普通烟草
 
<400>26
 
Met Asn Val Leu Val Ser Pro Val Asp Lys Glu
1               5                   10
 
<210>27
<211>10
<212>PRT
<213>大豆(Glycine max)
 
<400>27
 
Pro Leu Ser Ser Ile Leu Arg Ala Phe Tyr
1               5                   10
 
<210>28
<211>9
<212>PRT
<213>直生刀豆(Canavalia ensiformis)
 
<400>28
 
Glu Ile Pro Asp Ile Thr Ala Val Val
1                5
 
<210>29
<211>8
<212>PRT
<213>大麦
 
<400>29
 
Lys Tyr Asp Asp Glu Leu Lys Ala
1                5
 
<210>30
<211>7
<212>PRT
<213>普通烟草
 
<400>30
 
Gly Leu Leu Val Asp Thr Met
1               5
 
<210>31
<211>4
<212>PRT
<213>菜豆(Phaseolus vulgaris)
 
<400>31
 
Ala Phe Val Tyr
1
 
<210>32
<211>237
<212>DNA
<213>花烟草
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(234)
 
<400>32
atg gca aac tcc atg cgc ttc ttt gct act gtg tta ctt cta aca ttg
48
Met Ala Asn Ser Met Arg Phe Phe Ala Thr Val Leu Leu Leu Thr Leu
1               5                   10                  15
ctt ttc atg gct aca gag atg gga cca atg aca att gca gag gca aga
96
Leu Phe Met Ala Thr Glu Met Gly Pro Met Thr Ile Ala Glu Ala Arg
            20                  25                  30
act tgc gag tct cag agc cac cgt ttc aag gga cca tgc gca aga gat
144
Thr Cys Glu Ser Gln Ser His Arg Phe Lys Gly Pro Cys Ala Arg Asp
        35                  40                  45
agc aac tgt gcc acc gtc tgt ttg aca gaa gga ttt tcc ggt ggc gac
192
Ser Asn Cys Ala Thr Val Cys Leu Thr Glu Gly Phe Ser Gly Gly Asp
    50                  55                  60
tgc cgt gga ttc cgc cgc cgt tgt ttc tgt acc agc cct tgc taa
237
Cys Arg Gly Phe Arg Arg Arg Cys Phe Cys Thr Ser Pro Cys
65                  70                  75
 
<210>33
<211>78
<212>PRT
<213>花烟草
 
<400>33
 
Met Ala Asn Ser Met Arg Phe Phe Ala Thr Val Leu Leu Leu Thr Leu
1               5                   10                  15
Leu Phe Met Ala Thr Glu Met Gly Pro Met Thr Ile Ala Glu Ala Arg
            20                  25                  30
Thr Cys Glu Ser Gln Ser His Arg Phe Lys Gly Pro Cys Ala Arg Asp
        35                  40                  45
Ser Asn Cys Ala Thr Val Cys Leu Thr Glu Gly Phe Ser Gly Gly Asp
    50                  55                  60
Cys Arg Gly Phe Arg Arg Arg Cys Phe Cys Thr Ser Pro Cys
65                  70                  75
 
<210>34
<211>32
<212>PRT
<213>西红柿
 
<400>34
 
Val Phe Asp Lys Ile Ser Ser Glu Val Lys Ala Thr Leu Gly Glu Glu
1               5                   10                  15
Ala Lys Thr Leu Ser Glu Val Val Leu Glu Glu Glu Ile Met Met Glu
            20                  25                  30
 
<210>35
<211>25
<212>PRT
<213>花烟草
 
<400>35
 
Glu Tyr Ala Ser Lys Val Asp Glu Tyr Val Gly Glu Val Glu Asn Asp
1               5                   10                  15
Leu Gln Lys Ser Lys Val Ala Val Ser
            20                  25
 
<210>36
<211>16
<212>PRT
<213>甘薯(Ipomoea batatas)
 
<400>36
 
His Ser Arg Phe Asn Pro Ile Arg Leu Pro Thr Thr His Glu Pro Ala
1               5                   10                  15
 
<210>37
<211>17
<212>PRT
<213>马铃薯(Solanum tuberosum)
 
<400>37
 
Phe Thr Ser Glu Asn Pro Ile Val Leu Pro Thr Thr Cys His Asp Asp
1               5                   10                  15
Asn
 
<210>38
<211>12
<212>PRT
<213>大麦
 
<400>38
 
Ser Ser Ser Ser Phe Ala Asp Ser Asn Pro Ile Arg
1               5                   10
 
<210>39
<211>11
<212>PRT
<213>马铃薯
 
<400>39
 
Phe Thr Ser Gln Asn Leu Ile Asp Leu Pro Ser
1               5                   10
 
<210>40
<211>34
<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>合成构建体：CTTP肽经修饰，以使得能够交联至经马来酰亚胺活化的大
匙孔帽贝匙孔血蓝蛋白
 
<400>40
 
Val Phe Asp Glu Lys Met Thr Lys Thr Gly Ala Glu Ile Leu Ala Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Lys Thr Leu Ala Ala Ala Leu Leu Glu Glu Glu Ile Met Asp
            20                  25                  30
Asn Cys
 
<210>41
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成构建体：液泡靶向序列
 
<400>41
 
Val Phe Ala Glu
1
 
<210>42
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成构建体：源自渐狭叶烟草蛋白质NatD1的CTPP
 
<400>42
 
Val Phe Asp Gly Lys Met Ile Asn Thr Gly Ala Glu Thr Leu Ala Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Asn Thr Leu Ala Glu Ala Leu Leu Glu Glu Glu Met Met Asp
            20                  25                  30
Asn
 
<210>43
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成构建体：源自普通烟草蛋白质(SGN-U372549)的CTTP
 
<400>43
 
Val Phe Asp Glu Lys Met Ile Lys Thr Gly Ala Glu Thr Phe Ala Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Lys Thr Leu Ala Ala Ala Leu Leu Glu Glu Glu Ile Met Asp
            20                  25                  30
Asn
 
<210>44
<211>29
<212>PRT
<213>花烟草
 
<400>44
 
Met Ala Ala His Arg Val Ser Phe Leu Ala Leu Leu Leu Leu Phe Gly
1               5                   10                  15
Met Ser Leu Leu Val Ser Asn Val Glu His Ala Asp Ala
            20                  25

Claims (48)

1.嵌合植物防卫素，所述防卫素为基本上由信号肽(S)、成熟(M)结构域和C-末端前肽尾(T)结构域组成的肽，所述M结构域为第一植物防卫素的成熟结构域，并且所述T结构域为第二植物防卫素或非防卫素植物液泡易位肽的C-末端前肽尾结构域。
2.权利要求1的嵌合植物防卫素，其中所述M结构域选自具有下述序列的植物M结构域：
X1X2X3X4X5X6X7C8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19C20X21X22X23X24X25X26X27X28C29X30X31X32
X34X35X36X37X38X39X40X41X42X43X44X45X46C47X48X49X50X51X52X53X54X55C56X57C58X59X60X61C62X63
其中：
·X1-X5、X26-28、X63为无氨基酸或任意氨基酸，
·X6、X7、X9-12、X14、X15、X17、X19、X21-25、X30-32、X46、X57、X59-61为任意氨基酸，
·X13为S、A、C、V、K、P或无氨基酸，
·X16为F、W、Y或H，
·X18为G、F、K或S，
·X34-37为任意氨基酸，或X34-37中至多两个为无氨基酸，
·X39-44为任意氨基酸，或X39-44中至多两个为无氨基酸，
·X38为E或A，
·X45为G或A，
·X48-55为任意氨基酸，或X48-55中至多三个为无氨基酸，
·C8与C62以二硫键键合，
·C20与C47以二硫键键合，
·C29与C56以二硫键键合，和
·C33与C58以二硫键键合，
并且所述T结构域为选自由下述序列组成的T结构域肽的肽：
SEQ ID NO：1，氨基酸73-105；
SEQ ID NO：1，氨基酸73-76；
SEQ ID NO：2，氨基酸73-103；
SEQ ID NO：3，氨基酸75-101；
SEQ ID NO：5，氨基酸74-106；
SEQ ID NO：6，氨基酸73-106；
SEQ ID NO：7，氨基酸74-106；
SEQ ID NO：8，氨基酸74-105；
SEQ ID NO：9，氨基酸76-107；
SEQ ID NO：18，氨基酸80-107；
SEQ ID NO：19，氨基酸54-108；
SEQ ID NO：20，氨基酸58-154；
SEQ ID NO：21-31，35，40-44，整个序列。
3.权利要求2的嵌合防卫素，其中所述M结构域为选自由下述序列组成的植物M结构域的肽：
SEQ ID NO：1，氨基酸26-72；
SEQ ID NO：2，氨基酸26-72；
SEQ ID NO：3，氨基酸26-74；
SEQ ID NO：4，氨基酸26-72；
SEQ ID NO：5，氨基酸26-73；
SEQ ID NO：6，氨基酸26-72；
SEQ ID NO：7，氨基酸26-73；
SEQ ID NO：8，氨基酸26-73；
SEQ ID NO：9，氨基酸27-75；
SEQ ID NO：10，氨基酸31-77；
SEQ ID NO：11，氨基酸31-77；
SEQ ID NO：12，氨基酸25-72；
SEQ ID NO：13，氨基酸31-77；
SEQ ID NO：14，氨基酸28-75；
SEQ ID NO：15，氨基酸28-74；
SEQ ID NO：16，氨基酸30-80；
SEQ ID NO：17，氨基酸30-80；
SEQ ID NO：18，氨基酸26-79；
SEQ ID NO：19，氨基酸1-53；
SEQ ID NO：20，氨基酸1-57；或
SEQ ID NO：33，氨基酸32-78。
4.根据权利要求1的嵌合防卫素，其中所述M结构域为选自由下述序列组成的植物防卫素M结构域的肽：
SEQ ID NO：1，氨基酸26-72；
SEQ ID NO：2，氨基酸26-72；
SEQ ID NO：3，氨基酸26-74；
SEQ ID NO：4，氨基酸26-72；
SEQ ID NO：5，氨基酸26-73；
SEQ ID NO：6，氨基酸26-72；
SEQ ID NO：7，氨基酸26-73；
SEQ ID NO：8，氨基酸26-73；
SEQ ID NO：9，氨基酸27-75；
SEQ ID NO：10，氨基酸31-77；
SEQ ID NO：11，氨基酸31-77；
SEQ ID NO：12，氨基酸25-72；
SEQ ID NO：13，氨基酸31-77；
SEQ ID NO：14，氨基酸28-75；
SEQ ID NO：15，氨基酸28-74；
SEQ ID NO：16，氨基酸30-80；
SEQ ID NO：17，氨基酸30-80；
SEQ ID NO：18，氨基酸26-79；
SEQ ID NO：19，氨基酸1-53；
SEQ ID NO：20，氨基酸1-57；或
SEQ ID NO：33，氨基酸32-78，
并且所述T结构域为选自由下述序列组成的T结构域肽的肽：
SEQ ID NO：1，氨基酸73-105；
SEQ ID NO：1，氨基酸73-76；
SEQ ID NO：2，氨基酸73-103；
SEQ ID NO：3，氨基酸75-101；
SEQ ID NO：5，氨基酸74-106；
SEQ ID NO：6，氨基酸73-106；
SEQ ID NO：7，氨基酸74-106；
SEQ ID NO：8，氨基酸74-105；
SEQ ID NO：9，氨基酸76-107；
SEQ ID NO：18，氨基酸80-107；
SEQ ID NO：19，氨基酸54-108；
SEQ ID NO：20，氨基酸58-154；或
SEQ ID NO：21-31，35，40-44，整个序列。
5.根据权利要求4的嵌合防卫素，其中所述T结构域为选自由下述序列组成的T结构域肽的肽：
SEQ ID NO：1，氨基酸73-105；
SEQ ID NO：1，氨基酸73-76；
SEQ ID NO：8，氨基酸74-105；
SEQ ID NO：35，(整个序列)；
SEQ ID NO：24，(整个序列)；或
SEQ ID NO：18，氨基酸80-107。
6.根据权利要求5的嵌合防卫素，其中所述T结构域为包含SEQ IDNO：1的氨基酸73-105的肽。
7.根据权利要求4的嵌合防卫素，其中所述T结构域为包含SEQ IDNO：35的肽。
8.根据权利要求4的嵌合防卫素，其中所述M结构域为由SEQ ID NO：1的氨基酸26-72的氨基酸序列组成的肽，并且所述T结构域为选自由下述序列组成的T结构域肽的肽：
SEQ ID NO：1，氨基酸73-76；
SEQ ID NO：8，氨基酸74-105；
SEQ ID NO：35，(整个序列)；
SEQ ID NO：24，(整个序列)；或
SEQ ID NO：18，氨基酸80-107。
9.根据权利要求5的嵌合防卫素，其中所述M结构域为由SEQ ID NO：17的氨基酸30-80的氨基酸序列组成的肽。
10.根据权利要求7的嵌合防卫素，其中所述M结构域为选自SEQ IDNO：1的氨基酸28-72或SEQ ID NO：18的氨基酸26-79的肽。
11.权利要求1的嵌合植物防卫素，其进一步包含信号序列(S)。
12.权利要求2的嵌合植物防卫素，其进一步包含选自由下述序列组成的信号肽的信号序列(S)：
SEQ ID NO：1，氨基酸1-25；
SEQ ID NO：2，氨基酸1-25；
SEQ ID NO：3，氨基酸1-25；
SEQ ID NO：4，氨基酸1-25；
SEQ ID NO：5，氨基酸1-25；
SEQ ID NO：6，氨基酸1-25；
SEQ ID NO：7，氨基酸1-25；
SEQ ID NO：8，氨基酸1-25；
SEQ ID NO：9，氨基酸1-26；
SEQ ID NO：10，氨基酸1-30；
SEQ ID NO：11，氨基酸1-30；
SEQ ID NO：12，氨基酸1-24；
SEQ ID NO：13，氨基酸1-30；
SEQ ID NO：14，氨基酸1-27；
SEQ ID NO：15，氨基酸1-27；
SEQ ID NO：16，氨基酸1-29；
SEQ ID NO：17，氨基酸1-29；
SEQ ID NO：18，氨基酸1-25；或
SEQ ID NO：44，整个序列。
13.权利要求4的嵌合植物防卫素，其进一步包含选自由下述序列组成的信号肽的信号序列(S)：
SEQ ID NO：1，氨基酸1-25；
SEQ ID NO：2，氨基酸1-25；
SEQ ID NO：3，氨基酸1-25；
SEQ ID NO：4，氨基酸1-25；
SEQ ID NO：5，氨基酸1-25；
SEQ ID NO：6，氨基酸1-25；
SEQ ID NO：7，氨基酸1-25；
SEQ ID NO：8，氨基酸1-25；
SEQ ID NO：9，氨基酸1-26；
SEQ ID NO：10，氨基酸1-30；
SEQ ID NO：11，氨基酸1-30；
SEQ ID NO：12，氨基酸1-24；
SEQ ID NO：13，氨基酸1-30；
SEQ ID NO：14，氨基酸1-27；
SEQ ID NO：15，氨基酸1-27；
SEQ ID NO：16，氨基酸1-29；
SEQ ID NO：17，氨基酸1-29；
SEQ ID NO：18，氨基酸1-25；或
SEQ ID NO：44，整个序列。
14.权利要求13的嵌合植物防卫素，其中所述信号肽(S)包含SEQID NO：1的氨基酸1-25，所述M结构域选自由SEQ ID NO：1的氨基酸73-105或SEQ ID NO：33的氨基酸32-78组成的肽，并且所述T结构域为选自由SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：18的氨基酸80-107组成的肽的肽。
15.权利要求13的嵌合植物防卫素，其中所述信号肽(S)由SEQ IDNO：44组成，所述M结构域为选自由SEQ ID NO：1的氨基酸73-105或SEQID NO：33的氨基酸32-78组成的肽的肽，并且所述T结构域为选自SEQ IDNO：1的氨基酸73-105、SEQ ID NO：35的整个序列或SEQ ID NO：18的氨基酸80-107的肽。
16.用于制备表达嵌合植物防卫素的转基因植物的方法，所述方法包括用编码嵌合植物防卫素的DNA转化植物细胞，由此产生表达所述嵌合植物防卫素的经转化的植物细胞，并且使所述经转化的植物细胞再生从而产生表达嵌合植物防卫素的成体转基因植物，其中所述防卫素为基本上由成熟(M)结构域和C-末端前肽尾(T)结构域组成的肽，所述M结构域为第一植物防卫素的成熟结构域，并且所述T结构域为第二植物防卫素或非防卫素植物液泡易位肽的C-末端前肽尾结构域。
17.根据权利要求6的方法，其中所述嵌合防卫素M结构域选自具有下述序列的植物M结构域肽：
X1X2X3X4X5X6X7C8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19C20X21X22X23X24X25X26X27X28C29X30X31X32
X34X35X36X37X38X39X40X41X42X43X44X45X46C47X48X49X50X51X52X53X54X55C56X57C58X59X60X61C62X63
其中：
·X1-X5、X26-28、X63为无氨基酸或任意氨基酸，
·X6、X7、X9-12、X14、X15、X17、X19、X21-25、X30-32、X46、X57、X59-61为任意氨基酸，
·X13为S、A、C、V、K、P或无氨基酸，
·X16为F、W、Y或H，
·X18为G、F、K或S，
·X34-37为任意氨基酸，或X34-37中至多两个为无氨基酸，
·X39-44为任意氨基酸，或X39-44中至多两个为无氨基酸，
·X38为E或A，
·X45为G或A，
·X48-55为任意氨基酸，或X48-55中至多三个为无氨基酸，
·C8与C62以二硫键键合，
·C20与C47以二硫键键合，
·C29与C56以二硫键键合，和
·C33与C58以二硫键键合，
由此产生表达所述嵌合植物防卫素的经转化的植物细胞，并且使所述经转化的植物细胞再生从而产生表达嵌合植物防卫素的成体转基因植物。
18.根据权利要求17的方法，其中所述嵌合防卫素M结构域为选自由下述序列组成的植物M结构域肽的肽：
SEQ ID NO：1，氨基酸26-72；
SEQ ID NO：2，氨基酸26-72；
SEQ ID NO：3，氨基酸26-74；
SEQ ID NO：4，氨基酸26-72；
SEQ ID NO：5，氨基酸26-73；
SEQ ID NO：6，氨基酸26-72；
SEQ ID NO：7，氨基酸26-73；
SEQ ID NO：8，氨基酸26-73；
SEQ ID NO：9，氨基酸27-75；
SEQ ID NO：10，氨基酸31-77；
SEQ ID NO：11，氨基酸31-77；
SEQ ID NO：12，氨基酸25-72；
SEQ ID NO：13，氨基酸31-77；
SEQ ID NO：14，氨基酸28-75；
SEQ ID NO：15，氨基酸28-74；
SEQ ID NO：16，氨基酸30-80；
SEQ ID NO：17，氨基酸30-80；
SEQ ID NO：18，氨基酸26-79；
SEQ ID NO：19，氨基酸1-53；
SEQ ID NO：20，氨基酸1-57；或
SEQ ID NO：33，氨基酸32-78，
由此产生表达所述嵌合植物防卫素的经转化的植物细胞，并且使所述经转化的植物细胞再生从而产生表达嵌合植物防卫素的成体转基因植物。
19.根据权利要求17的用于制备转基因植物的方法，其中所述嵌合防卫素T结构域为选自由下述序列组成的T结构域肽的肽：
SEQ ID NO：1，氨基酸73-105；
SEQ ID NO：1，氨基酸73-76；
SEQ ID NO：2，氨基酸73-103；
SEQ ID NO：3，氨基酸75-101；
SEQ ID NO：5，氨基酸74-106；
SEQ ID NO：6，氨基酸73-106；
SEQ ID NO：7，氨基酸74-106；
SEQ ID NO：8，氨基酸74-105；
SEQ ID NO：9，氨基酸76-107；
SEQ ID NO：18，氨基酸80-107；
SEQ ID NO：19，氨基酸54-108；
SEQ ID NO：20，氨基酸58-154；或
SEQ ID NO：21-31，35，40-44，整个序列。
20.根据权利要求16的用于制备转基因植物的方法，其中所述嵌合防卫素M结构域选自由下述序列组成的植物M结构域：
SEQ ID NO：1，氨基酸26-72；
SEQ ID NO：2，氨基酸26-72；
SEQ ID NO：3，氨基酸26-74；
SEQ ID NO：4，氨基酸26-72；
SEQ ID NO：5，氨基酸26-73；
SEQ ID NO：6，氨基酸26-72；
SEQ ID NO：7，氨基酸26-73；
SEQ ID NO：8，氨基酸26-73；
SEQ ID NO：9，氨基酸27-75；
SEQ ID NO：10，氨基酸31-77；
SEQ ID NO：11，氨基酸31-77；
SEQ ID NO：12，氨基酸25-72；
SEQ ID NO：13，氨基酸31-77；
SEQ ID NO：14，氨基酸28-75；
SEQ ID NO：15，氨基酸28-74；
SEQ ID NO：16，氨基酸30-80；
SEQ ID NO：17，氨基酸30-80；
SEQ ID NO：18，氨基酸26-79；
SEQ ID NO：19，氨基酸1-53；
SEQ ID NO：20，氨基酸1-57；或
SEQ ID NO：33，氨基酸32-78，
并且所述嵌合防卫素T结构域为选自由下述序列组成的植物T结构域肽的肽：
SEQ ID NO：1，氨基酸73-105；
SEQ ID NO：1，氨基酸73-76；
SEQ ID NO：2，氨基酸73-103；
SEQ ID NO：3，氨基酸75-101；
SEQ ID NO：5，氨基酸74-106；
SEQ ID NO：6，氨基酸73-106；
SEQ ID NO：7，氨基酸74-106；
SEQ ID NO：8，氨基酸74-105；
SEQ ID NO：9，氨基酸76-107；
SEQ ID NO：18，氨基酸80-107；
SEQ ID NO：19，氨基酸54-108；
SEQ ID NO：20，氨基酸58-154；或
SEQ ID NO：21-31，35，40-44，整个序列。
21.根据权利要求20的用于制备转基因植物的方法，其中所述嵌合防卫素T结构域为选自由下述序列组成的T结构域肽的肽：
SEQ ID NO：1，氨基酸73-105；
SEQ ID NO：1，氨基酸73-76；
SEQ ID NO：8，氨基酸74-105；
SEQ ID NO：35，(整个序列)；
SEQ ID NO：24，(整个序列)；
SEQ ID NO：18，氨基酸80-107；或
SEQ ID NO：44，整个序列。
22.根据权利要求20的用于制备转基因植物的方法，其中所述T结构域为包含SEQ ID NO：1的氨基酸73-105的肽，并且所述M结构域不为SEQ ID NO：1的氨基酸26-73。
23.根据权利要求20的用于制备转基因植物的方法，其中所述T结构域为包含SEQ ID NO：35的肽。
24.根据权利要求20的用于制备转基因植物的方法，其中所述M结构域为由SEQ ID NO：1的氨基酸26-72的氨基酸序列组成的肽，并且所述T结构域为选自由下述序列组成的T结构域肽的肽：
SEQ ID NO：1，氨基酸73-76
SEQ ID NO：8，氨基酸74-105；
SEQ ID NO：35，(整个序列)；
SEQ ID NO：24，(整个序列)；或
SEQ ID NO：18，氨基酸80-107。
25.根据权利要求20的用于制备转基因植物的方法，其中所述M结构域为包含SEQ ID NO：17的氨基酸30-80的氨基酸序列的肽。
26.根据权利要求23的用于制备转基因植物的方法，其中所述M结构域为选自由SEQ ID NO：1的氨基酸28-72或SEQ ID NO：18的氨基酸26-79组成的M结构域多肽的肽。
27.依照权利要求16的方法制备的转基因植物。
28.依照权利要求20的方法制备的转基因植物。
29.依照权利要求22的方法制备的转基因植物。
30.依照权利要求23的方法制备的转基因植物。
31.依照权利要求24的方法制备的转基因植物。
32.依照权利要求25的方法制备的转基因植物。
33.依照权利要求26的方法制备的转基因植物。
34.通过在具有编码防卫素的核酸的读码框相中提供编码液泡易位肽的核酸来减少在转基因植物中防卫素表达的毒性效应的方法，其中通过相比于表达不含液泡靶向肽的防卫素的植物而言在表达连同液泡易位肽一起的防卫素的植物中正常化的表型或增加的表达水平，来评估所述毒性效应。
35.权利要求34的方法，其中所述转基因植物为棉花。
36.权利要求34的方法，其中所述转基因植物为油菜。
37.权利要求34的方法，其中所述转基因植物为玉蜀黍。
38.权利要求34的方法，其中所述转基因植物选自大豆、稻、小麦或向日葵。
39.权利要求35的方法，其中所述防卫素为选自由下述序列组成的M结构域的防卫素M结构域肽：
SEQ ID NO：1，氨基酸26-72；
SEQ ID NO：2，氨基酸26-72；
SEQ ID NO：3，氨基酸26-74；
SEQ ID NO：4，氨基酸26-72；
SEQ ID NO：5，氨基酸26-73；
SEQ ID NO：6，氨基酸26-72；
SEQ ID NO：7，氨基酸26-73；
SEQ ID NO：8，氨基酸26-73；
SEQ ID NO：9，氨基酸27-75；
SEQ ID NO：10，氨基酸31-77；
SEQ ID NO：11，氨基酸31-77；
SEQ ID NO：12，氨基酸25-72；
SEQ ID NO：13，氨基酸31-77；
SEQ ID NO：14，氨基酸28-75；
SEQ ID NO：15，氨基酸28-74；
SEQ ID NO：16，氨基酸30-80；
SEQ ID NO：17，氨基酸30-80；
SEQ ID NO：18，氨基酸26-79；
SEQ ID NO：19，氨基酸1-53；
SEQ ID NO：20，氨基酸1-57；或
SEQ ID NO：33，氨基酸32-78。
40.权利要求35的方法，其中所述液泡易位肽选自由下述序列组成的肽：
SEQ ID NO：1，氨基酸73-105；
SEQ ID NO：1，氨基酸73-76；
SEQ ID NO：2，氨基酸73-103；
SEQ ID NO：3，氨基酸75-101；
SEQ ID NO：5，氨基酸74-106；
SEQ ID NO：6，氨基酸73-106；
SEQ ID NO：7，氨基酸74-106；
SEQ ID NO：8，氨基酸74-105；
SEQ ID NO：9，氨基酸76-107；
SEQ ID NO：18，氨基酸80-107；
SEQ ID NO：19，氨基酸54-108；
SEQ ID NO：20，氨基酸58-154；或
SEQ ID NO：21-31，35，40-44，整个序列。
41.权利要求40的方法，其中所述防卫素为SEQ ID NO：1的氨基酸26-72的M结构域肽的防卫素。
42.权利要求39的方法，其中所述液泡易位肽为SEQ ID NO：1的氨基酸73-105的肽。
43.根据权利要求18的方法，其中所述转基因植物为棉花植物。
44.通过权利要求17的方法制备的转基因植物。
45.通过权利要求18的方法制备的转基因植物。
46.用于增加植物品种中的真菌抗性的方法，所述方法包括用编码嵌合植物防卫素的DNA转化所述植物品种的植物细胞，所述嵌合植物防卫素包含信号结构域(S)和成熟结构域(M)以及C-末端前肽尾结构域(T)，所述信号结构域和所述成熟结构域一起具有SEQ ID NO：1(残基1-72)所示的氨基酸序列，并且所述C-末端前肽尾结构域具有选自由下述序列组成的T结构域肽的氨基酸序列：
SEQ ID NO：2，氨基酸72-103；
SEQ ID NO：3，氨基酸75-101；
SEQ ID NO：4，氨基酸73-105；
SEQ ID NO：5，氨基酸74-106；
SEQ ID NO：6，氨基酸73-105；
SEQ ID NO：7，氨基酸74-106；
SEQ ID NO：8，氨基酸74-105；
SEQ ID NO：9，氨基酸76-107；
SEQ ID NO：18，氨基酸80-107；
SEQ ID NO：19，氨基酸53-107；
SEQ ID NO：20，氨基酸58-154；或
SEQ ID NO：44，整个序列。
47.权利要求46的方法，其中所述植物品种为棉花品种。
48.用于增加棉花品种中的真菌抗性的方法，所述方法包括用编码具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的防卫素的DNA转化棉花品种细胞，由此产生表达所述防卫素的棉花品种细胞，并且使所述经转化的细胞再生从而产生表达所述防卫素的成体转基因棉花植物，由此将增加的真菌抗性赋予给了所述棉花品种。
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