CN101838322A - 疟疾重组抗原、IgY抗体及疟疾检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种疟疾重组抗原、IgY抗体及疟疾检测试剂盒。本发明设计出一种序列如SEQ ID No：11所示的疟疾抗原，通过该抗原免疫鸡获得IgY抗体，并制备含有该IgY抗体的检测疟疾感染的试剂盒。本发明试剂盒与现有技术中同类的快速检测卡相比，灵敏度高出1000倍。

Description

疟疾重组抗原、IgY抗体及疟疾检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种新的疟疾重组抗原。具体而言，本发明涉及一种新的疟疾抗原，通过该抗原免疫鸡获得的IgY抗体，以及含有该IgY抗体的检测疟疾感染的试剂盒。

背景技术

疟疾位居全球最严重的三大传染病之一，威胁近40亿居住在热带及亚热带地区人口的健康。其中恶性疟疾每年感染3-5亿人，夺去数百万人的生命。疟疾也因此严重阻碍了发展中国家的经济增长。由于疟疾治疗药物的特殊性，精确快速的诊断不仅能及时发现并治疗疟疾患者，大大降低病死率，也能通过早期排除疟疾，及时挽救感染了其它传染性疾病患者的生命。与此同时，精确快速的早期诊断也是对疟疾进行实时流行病学监测和控制的必要手段。目前诊断疟疾的经典方法仍为血涂片显微镜检法，该方法对检验者的技能和经验要求很高，远远无法满足非洲和南美洲国家中绝大多数生活在偏远地区患者的需要，造成大量患者因延误诊治而死亡。此外，用于疟疾早期诊断疟疾抗原的方法为双抗体夹心法和PCR方法。其中，基于单克隆抗体的双抗体夹心法近年来受到越来越多的关注，它们主要应用三类单克隆抗体：1，抗HRP-II抗体；2，抗pLDH抗体；3，抗Aldolase抗体。迄今为止，现有的该类方法存在的主要问题是：1)敏感性低：由于单克隆抗体只能识别单个表位和抗原，因此敏感性低于血涂片显微镜检法：在82％-95.2％之间，最低的仅有57％，尤其当虫血率低于0.01％时，敏感性明显下降至50％；2)特异性低：由于受到流行区虫株间差异和变异的影响，仍不够理想：一般在93％左右，最低的仅有76.9％；3)交叉反应：单克隆抗体的使用易与类风湿因子、异嗜性抗体、抗核抗体有交叉反应；检测的假阳性率较高；4)半衰期短：大多数商品化的快速检测试剂盒要求在2-30℃存放，但真正在疫区使用时这一条件难以保证；理想的试剂盒应能在40-50℃高温下保存两年；5)成本高：尤其是单克隆抗体的研发和生产成本很难再大幅度降低，这对于疟疾泛滥的发展中国家人民仍然难以接受。因此，建立一套稳定、敏感和廉价的诊断方法成为全球疟疾防治亟待解决的重要问题。

鸡卵黄抗体——IgY被越来越多的应用在疾病诊断、预防、治疗，食品科学和兽医科学等领域，被认为是除哺乳动物外产生多克隆抗体最佳抗体来源。

由于禽类与哺乳动物远源，因此不仅可针对许多哺乳动物中高度保守的抗原产生免疫反应，而且能针对更多的表位产生抗体。

现有技术披露IgY抗体也不与类风湿因子和其它IgG分子反应，避免了免疫分析中的假阳性结果并且降低实验背景。IgY抗体对酸、碱、热、蛋白酶的耐受性很高，适合疟疾疫区的环境特点。

经收集鸡蛋生产IgY的方法既方便又快捷，并且目前已建立了高效、经济、可自动化控制的IgY纯化技术，适合大规模生产应用。这些优点均可成为提高检测灵敏性、降低成本、解决上述疟疾诊断问题的关键因素。

现有技术中未有在疟疾免疫诊断中使用IgY的报道，尤其是使用本发明的抗原获得的特异性IgY抗体在疟疾免疫诊断中应用未见报道。

发明内容

本发明从已证实的恶性疟疾特异性表位结合疟疾基因组数据库，经在线分析和软件预测出来自五个疟疾主要抗原的9个表位，将其连接，从而设计出一种新的人工重组抗原。采用该重组抗原免疫产蛋鸡，从免疫鸡卵中提取得到能够识别疟原虫多个靶向位点的特异性IgY抗体。再将此抗体标记辣根过氧化物酶(HRP)，最终建立双抗体夹心检测疟疾的方法。

本发明一方面提供一种疟疾重组抗原，其具有SEQ ID No：11所示的氨基酸序列。

本发明另一方面提供一种编码SEQ ID No：11所示的氨基酸序列的多核苷酸。由于密码子的简并性，所述多核苷酸可具有多种碱基序列。例如，为了在宿主细胞中(如大肠杆菌E.coli)表达，可使用该宿主偏好的密码子以提高表达效率。优选地，该多核苷酸具有SEQ ID No：10所示的碱基序列。

本发明又一方面提供一种通过本发明的抗原免疫鸡获得的特异性IgY抗体。

本发明又一方面提供本发明特异性IgY抗体在制备检测疟疾的制剂中的用途。由于本发明特异性IgY可有效识别疟原虫，因此可用于制备各种检测疟疾的试剂。

本发明又一方面提供含本发明特异性IgY抗体的试剂盒，优选地，该试剂盒使用ELISA法。该试剂盒可包括本发明特异性IgY抗体包被的酶联反应板、辣根过氧化物酶标记的IgY抗体和显色***。所述试剂盒可通过本领域公知的方法制备，也可包括现有技术中其他可有效提高ELISA试剂盒灵敏度和特异性的辅助成分。

本发明又一方面提供一种制备本发明特异性IgY抗体的方法，所述的方法包括：

1)使用本发明设计的抗原免疫鸡；

2)收取步骤1)中免疫后的鸡所产的卵，并从卵黄中提取获得IgY抗体。

产蛋鸡通过少量的本发明抗原免疫3周后，即可持续不断的产生高特异性的、性质均一的抗体。

优选地，可对上述步骤2)中获得的IgY抗体进一步纯化。

利用本发明设计的重组抗原和其特异性IgY抗体的结合，增加了疟疾诊断中的靶向位点，这一点明显优于传统单克隆抗体单一识别的灵敏性。此外，由于IgY抗体本身具有的特点，避免了传统方法的交叉反应，同时大幅度降低了应用成本。本发明还能为其它突发性重大感染性疾病的快速诊断提供新的研发思路，取得显著的社会效益和经济效益。

术语说明：除非另有说明，本发明中使用的术语具有本领域公知的含义。

抗原：是指一种能刺激人或动物机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能与这些产物在体内或体外发生特异性反应的物质。抗原的基本能力是免疫原性和反应原性。最常见的抗原分子是大分子蛋白质。

表位：免疫细胞通常难以识别整个抗原分子，而仅识别抗原大分子上的一个特定的部分。称为表位(epitope)或抗原决定簇(antigenic determinant)。因而表位代表了抗原分子上的一个免疫活性区，负责与免疫细胞表面的抗原受体或游离的抗体分子相结合。严格说来，抗体的特异性是针对表位而不是针对完整的抗原分子。

抗体：抗体是免疫***用来鉴别和抑制外源物质(例如细菌和病毒)的一种蛋白质复合体。每种抗体只识别特定的目标抗原。

IgY抗体：IgY普遍存在于鸟类、爬行动物和两栖类，在功能上等价于哺乳动物IgG，但其许多生物学性质仍未被发现。近来许多研究者分析了IgY的基因组成和生物学功能，而且证实其为哺乳动物IgG和IgE的直接起源。现有数据表明IgY的用途是非常广泛、多样的。其中最重要的功能是由母体传递IgY给新生儿提供被动地免疫保护力。产生IgY的动物基本是卵生的，通过卵黄把IgY传递给胚胎和新生动物。

附图说明

图1：重组抗原12％还原性SDS-PAGE图谱；M：低分子量蛋白标准；1：诱导前菌体；2：诱导后菌体；3：纯化后的重组抗原。

图2：纯化后IgY抗体12％还原性SDS-PAGE图谱；M：低分子量蛋白标准；1和2：不同的IgY抗体纯化洗脱峰。

图3：莱航鸡卵中IgY抗体的动力曲线。

图4：纯化的IgY抗体对单个表位、混合表位和重组抗原的识别。

图5：纯化的IgY抗体识别重组抗原的免疫印迹图谱；M：低分子量蛋白标准；1：免疫前IgY抗体不能识别重组蛋白；2：免疫后IgY抗体能明显识别重组蛋白。

图6：纯化的IgY抗体对天然疟原虫的免疫荧光图谱；图6A：免疫前IgY抗体不能识别天然疟原虫虫体；图6B：免疫后IgY抗体能明显识别天然疟原虫虫体。

图7：双抗体夹心ELISA法检测全血中恶性疟原虫。

具体实施方式

实施例1：恶性疟重组抗原的制备

从已证实的恶性疟疾特异性表位结合疟疾基因组数据库分析，最终选择出包括来自RESA、MSA1、CSP、MSA1、MAg-1五个主要抗原的9个表位，其序列分别为SEQ ID Nos：1-9，本发明设计的抗原的表位连接顺序为9-6-9-8-6-7-7-3-9-6-4-9-1-5-6-2(数字为相应的序列编号)。根据大肠杆菌密码子偏好性设计编码相应表位的多核苷酸序列，按照本领域技术人员公知的引物重叠方法，在表位编码序列的前后端分别引入BamH I和Bcl II内切酶位点，经PCR扩增后，把扩增后的序列按顺序串联成为重组抗原的编码序列(加上起始密码子ATG，其多核苷酸序列为SEQ ID No：10，共有1068个碱基)，并连接至pET30(a)载体多克隆位点，转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)菌株。也可以使用本领域公知的其他方法合成上述多核苷酸序列SEQ ID No：10并转化大肠杆菌。使用IPTG诱导上述菌株，其可在E.coli BL21(DE3)中大量可溶表达，表达量达到18％。经镍亲和柱和分子筛纯化得到重组抗原，SDS-PAGE电泳分析其纯度在95％以上，结果见图1。该人工重组抗原具有354个氨基酸(其序列为SEQ ID No：11)，预测分子量为39.19kD。

实施例2：抗恶性疟疾(Plasmodium falciparum)重组抗原IgY的制备

(1)抗原免疫莱航鸡

取200μl实施例1获得的抗原(0.5mg/ml)与等体积福氏佐剂充分混合，免疫来航鸡(Leghorn)(购于中国农业大学动物医学院)。第0周采用福氏完全佐剂初次免疫，鸡颈部皮下多点注射；分别在第3、5、11周采用福氏不完全佐剂在腿部和翅部肌肉进行多点加强免疫。每日收取鸡卵，标记后4℃保存备用。

(2)IgY粗纯化

取步骤(1)中获得的新鲜的莱航鸡蛋洗净后浸于0.1％新洁尔灭溶液中消毒，再用75％酒精棉擦拭鸡蛋外壳。去蛋壳后用卵黄分离器尽量去除蛋白，消毒针刺破卵膜，收集卵黄液，用卵黄稀释液0.06M NaAcH5.0按1∶9稀释，搅拌均匀。然后边搅拌边加入终浓度5％的辛酸，室温放置20min，8,000g/min室温高速离心20min，用定性滤纸过滤除去沉淀，获得去脂的卵黄水溶提取物。再加入饱和硫酸铵溶液至终浓度40％的，室温放置20min，12,000g/min室温高速离心20min，收集上清。

(3)纯化总IgY抗体

本步骤及下一步骤均采用AKTA FPLC层析***(GE Healthcare公司)进行处理，首先以Phenyl FF疏水层析柱吸附步骤(2)中获得的样品，选用的结合缓冲液为0.8M(NH₄)₂SO₄，25mM Tris·Cl pH 8.5，50mM NaCl，洗脱缓冲液为25mM Tris·Cl pH 8.5，50mM NaCl，流速为1ml/min，线性梯度洗脱，分管收集蛋白洗脱峰。SDS-PAGE电泳鉴定后，收集纯度高的洗脱样品经30kD超滤管(Millipore公司)浓缩(5,000r/min×30min)。用2倍柱体积的PBS分别预平衡HiPrep 16/60Sephacryl S-100HR和HiLoad 16/60Superdex 30prep grade(GEHealthcare公司)，上样品量为2ml，流速为1ml/min，再用2倍柱体积的0.2M磷酸盐缓冲液洗脱IgY抗体，分管收集蛋白洗脱峰，12％SDS-PAGE鉴定IgY纯度为98.5％以上，每卵产量大于30mg，结果见图2。

(4)纯化抗多表位抗原特异性IgY抗体

取10mg步骤(3)中获得的多表位抗原，溶于偶联缓冲液中(0.1MNaHCO₃0.5M NaCl)，与准备好的CNBr-activated SepharoseTM 4B基质混合在一个可封口的管中。室温颠倒混匀1h或4℃过夜。

用5倍体积的偶联缓冲液洗去未偶联的基质。封闭未偶联的活性基团。将偶联过的基质放入0.1M Tris-HCl buffer，pH 8.0或者1M乙醇胺(ethanolamine)，pH 8.0，放置2h。用PH 4.0和PH 8.0的缓冲液洗偶联过的基质三个循环，每种缓冲液用5倍柱床的体积。把偶联好的基质以恒定压力装柱，0.2M磷酸盐缓冲液平衡后，备用。0.2M磷酸盐缓冲液稀释粗纯化的IgY抗体，以1ml/min恒定流速上样，用亲和柱平衡液平衡10倍体积，改用亲和柱洗脱液洗脱，收集脱峰，SDS-PAGE电泳鉴定。

实施例3：IgY抗体的活性鉴定

(1)免疫莱航鸡卵中IgY抗体的滴度测定：

应用间接酶联免疫实验(ELISA)测定免疫产蛋鸡的抗体水平，用包被液稀释重组抗原，以0.1ug/孔加入ELISA板，4℃包被过夜。倒掉包被液用PBST洗5次，然后用吸水纸吸干；用含3％BSA的PBS封闭板子，每孔200ul，37℃孵育1小时后同前洗涤；2倍梯度稀释待测IgY抗体，每孔加入抗体稀释液100ul，37℃孵育2小时后同前洗涤；每孔加入100ul II抗HRP标记的羊抗鸡IgG以1∶10000稀释(购于Promega公司，G1351)，37℃孵育2小时后同前洗涤；然后每孔加100ul显色液，室温显色15分钟后，每孔加50ul 1M硫酸H₂SO₄终止反应；酶标仪测定OD450nm；以免疫前的IgY抗体为阴性对照，按照阴性对照空OD450nm±3SD为临界值，判定实验结果。显示外周血中抗体的滴度在初次免疫后卵黄抗体的滴度在第五周达到最高(稀释度为1∶1.6x10⁶)，是哺乳动物体内产生抗体的3倍。抗体水平维持6周后下降到一半，此时再加强免疫一次后，卵黄中的抗体在两周后即可回复到原来的最高滴度，并能够维持8周以上，结果见图3。

同时以9种单表位分别包被后，应用间接酶联免疫实验测定显示，免疫后莱航鸡得到的IgY能够有效识别每一种单个表位，结果见图4。

(2)纯化后IgY抗体的免疫学功能测定：

以重组抗原包被应用间接酶联免疫实验测定(具体实验方法同上)显示纯化后的特异性IgY抗体较粗纯化的IgY抗体识别力明显提高，且在0.002ug/ml时仍能够明显识别重组抗原，结果见图5。

同时，用间接免疫荧光实验证实了纯化的IgY抗体能够有效识别培养的恶性疟原虫。具体实施时，首先将虫株培养物均匀涂于载玻片上，放入100％丙酮中固定5分钟后取出风干；用PBS倍比稀释待测IgY抗体，小心加在血涂片上，37℃湿盒内孵育30分钟；吸干I抗后，PBS洗三遍，每次10分钟；再加入FITC标记的羊抗鸡IgG(1∶200)，37℃湿盒内孵育30分钟后同上洗涤，荧光显微镜观察结果。纯化的IgY抗体能够明显识别恶性疟原虫(plasmodium falciparum)天然虫体的多个位点，且效价能够达到1∶1,600，而对天然红细胞无交叉反应，结果见图6。

实施例4：检测用试剂盒的制备

(1)辣根过氧化物酶(HRP)标记IgY抗体

6mg HRP(RZ＞3.0)溶于1.5ml去离子水，搅拌下缓慢加入0.3ml新鲜配制的0.1M高碘酸钠NaIO₄，室温下搅拌40分钟。将HRP反应液在0.001M醋酸钠溶液中4℃透析20小时。同时，取上述纯化的总IgY抗体12mg，在0.01M碳酸钠中透析3小时。将HRP转移至小瓶中，搅拌下加入300微升0.2M碳酸钠溶液(pH9.5)，立刻加入抗体，用0.2M碳酸钠溶液(pH9.5)调pH至9.5。室温下搅拌3小时，加150微升新鲜配制的硼氢化钠溶液，4℃放置2小时，在PBS里透析过夜后，加终浓度为0.01％的柳硫汞4℃保存备用。

(2)酶联反应板的制备：上述纯化的特异性IgY抗体用包被液(1.36g Na₂CO₃/7.35g NaHCO₃/H₂O 1000ml，PH 9.2)稀释后以2ug/孔的量包被板子，每孔加100ul，37℃孵育2小时；用磷酸盐缓冲液洗三次，控干；每孔加入150ul的3％牛血清白蛋白，37℃封闭2小时，用0.1M磷酸盐缓冲液洗三次，37℃干燥，密封保存备用。

(3)酶结合底物：上述辣根过氧化物酶标记的IgY抗体，加入抗体保护剂(0.01％的硫柳汞和1％的牛血清白蛋白)和0.1M磷酸盐缓冲液。

(4)显色***：由A液和B液组成，使用时等体积混合，其中

A液：6.2g柠檬酸，25g Na₂HPO₄-12H₂O，H₂O 500ml，0.03％过氧化氢；

B液：1.05g柠檬酸，0.093g EDTA，H₂O 480ml，140mg TMB，二甲基亚砜20ml。

实施例5：检测全血中恶性疟原虫

按照上述的方法包被纯化的特异性IgY抗体，包被浓度为2ug/ml。同时收集人全血疟原虫培养物，血涂片法计数疟原虫感染率，用新鲜的正常人全血调整感染率为1％、0.1％、0.01％、0.001％和0.0001％，再用含有0.02％Triton X-100的磷酸盐缓冲液裂解样品，然后把裂解后的样品加入上述封闭好的ELISA板中，每孔100ul，37℃孵育2小时。再将HRP标记的IgY抗1∶2000稀释后加入ELISA板，经孵育、洗涤、显色后读取OD450nm并判定结果。当把体外培养的恶性疟原虫感染率用正常人全血稀释到0.0001％时，按照上述IgY抗体配伍及浓度仍然能够检测到虫体。这与现有技术中同类的快速检测卡相比，灵敏度要高出1000倍，结果见图7。

序列表

<110>中国医学科学院基础医学研究所

<120>疟疾重组抗原、IgY抗体及疟疾检测试剂盒

<130>890040CG

<160>11

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>8

<212>PRT

<213>恶性疟原虫(plasmodium falciparum)

<400>1

Glu Glu Asn Val Glu His Asp Ala

1               5

<210>2

<211>20

<212>PRT

<213>恶性疟原虫(plasmodium falciparum)

<400>2

Leu Asp Asn Ile Lys Asp Asn Val Gly Lys Met Glu Asp Tyr Ile Lys

1               5                   10                  15

Lys Asn Lys Lys

            20

<210>3

<211>15

<212>PRT

<213>恶性疟原虫(plasmodium falciparum)

<400>3

Lys Lys Ile Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe Asn Val

1               5                   10                  15

<210>4

<211>19

<212>PRT

<213>恶性疟原虫(plasmodium falciparum)

<400>4

Glu Asp Ser Gly Ser Asn Gly Lys Lys Ile Thr Cys Glu Cys Thr Lys

1               5                   10                  15

Pro Asp Ser

<210>5

<211>19

<212>PRT

<213>恶性疟原虫(plasmodium falciparum)

<400>5

Asp Gly Asn Cys Glu Asp Ile Pro Ile Ile Val Asn Glu Phe Ser Ala

1               5                   10                  15

Ile Asp Leu

<210>6

<211>18

<212>PRT

<213>恶性疟原虫(plasmodium falciparum)

<400>6

Gly Asn Ala Glu Lys  Tyr Asp Lys Met Asp Glu Pro Gln His  Tyr Gly

151015

Lys Ser

<210>7

<211>19

<212>PRT

<213>恶性疟原虫(plasmodium falciparum)

<400>7

Asp Gln Pro Lys Gln Tyr Glu Gln His Leu Thr Asp Tyr Glu Lys Ile

1               5                   10                  15

Lys Glu Gly

<210>8

<211>17

<212>PRT

<213>恶性疟原虫(plasmodium falciparum)

<400>8

Gly Ile Ser Tyr Tyr Glu Lys Val Leu Ala Lys Tyr Lys Asp Asp Leu

1               5                   10                  15

Glu

<210>9

<211>10

<212>PRT

<213>恶性疟原虫(plasmodium falciparum)

<400>9

Gln Thr Asp Glu  Ile Lys Asn Asp AsnIle

1510

<210>10

<21l>1068

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

atggaattcg gatcacagac cgacgagatc aagaacgacc acatccagac cgatgaaatt    60

aaaaatgata atattggatc aggcaacgcc gagaagtacg acaagatgga cgagccgcag    120

cactacggca agagcggatc acagaccgac gagatcaaga acgaccacat ccagaccgat    180

gaaattaaaa atgataatat tggatcaggc atcagctact acgagaaggt gctggccaag    240

tacaaggacg acctggaggg atcaggcaac gccgagaagt acgacaagat ggacgagccg    300

cagcactacg gcaagagcgg atcagaccag ccgaagcagt acgagcagca cctgaccgac    360

tacgagaaga tcaaggaggg cggatcagac cagccgaagc agtacgagca gcacctgacc    420

gactacgaga agatcaagga gggcggatca aagaagatcg ccaagatgga gaaggccagc    480

agcgtgttca acgtgggccc cggccccgga tcaaacaaga acgacaacaa gaacgacgga    540

tcacagaccg acgagatcaa gaacgaccac atccagaccg atgaaattaa aaatgataat    600

attggatcag gcaacgccga gaagtacgac aagatggacg agccgcagca ctacggcaag    660

agcggatcaa acaagaacga caacaagaac gacggatcag aggacagcgg cagcaacggc    720

aagaagatca cctgcgagtg caccaagccg gacagcggat cacagaccga cgagatcaag    780

aacgaccaca tccagaccga tgaaattaaa aatgataata ttggatcaga ggagaacgtg    840

gagcacgacg ccggatcaga cggcaactgc gaggacatcc cgcacgtgaa cgagttcagc    900

gccatcgacc tgggatcagg caacgccgag aagtacgaca agatggacga gccgcagcac    960

tacggcaaga gcggatcact ggacaacatc aaggacaacg tgggcaagat ggaggactac    1020

atcaagaaga acaagaaggg ccccggcccc ggatccgcta gctaataa                 1068

<210>11

<211>354

<212>PRT

<213>人工序列

<400>11

Met Glu Phe Gly Ser Gln Thr Asp Glu Ile Lys Asn Asp His Ile Gln

1               5                   10                  15

Thr Asp Glu Ile Lys Asn Asp Asn Ile Gly Ser Gly Asn Ala Glu Lys

            20                  25                  30

Tyr Asp Lys Met Asp Glu Pro Gln His Tyr Gly Lys Ser Gly Ser Gln

        35                  40                  45

Thr Asp Glu Ile Lys Asn Asp His Ile Gln Thr Asp Glu Ile Lys Asn

    50                  55                  60

Asp Asn Ile Gly Ser Gly Ile Ser Tyr Tyr Glu Lys Val Leu Ala Lys

65                  70                  75                  80

Tyr Lys Asp Asp Leu Glu Gly Ser Gly Asn Ala Glu Lys Tyr Asp Lys

                85                  90                  95

Met Asp Glu Pro Gln His Tyr Gly Lys Ser Gly Ser Asp Gln Pro Lys

            100                 105                 110

Gln Tyr Glu Gln His Leu Thr Asp Tyr Glu Lys Ile Lys Glu Gly Gly

        115                 120                 125

Ser Asp Gln Pro Lys Gln Tyr Glu Gln His Leu Thr Asp Tyr Glu Lys

    130                 135                 140

Ile Lys Glu Gly Gly Ser Lys Lys Ile Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser

145                 150                 155                 160

Ser Val Phe Asn Val Gly Pro Gly Pro Gly Ser Asn Lys Asn Asp Asn

                165                 170                 175

Lys Asn Asp Gly Ser Gln Thr Asp Glu Ile Lys Asn Asp His Ile Gln

            180                 185                 190

Thr Asp Glu Ile Lys Asn Asp Asn Ile Gly Ser Gly Asn Ala Glu Lys

        195                 200                 205

Tyr Asp Lys Met Asp Glu Pro Gln His Tyr Gly Lys Ser Gly Ser Asn

    210                 215                 220

Lys Asn Asp Asn Lys Asn Asp Gly Ser Glu Asp Ser Gly Ser Asn Gly

225                 230                 235                 240

Lys Lys Ile Thr Cys Glu Cys Thr Lys Pro Asp Ser Gly Ser Gln Thr

                245                 250                 255

Asp Glu Ile Lys Asn Asp His Ile Gln Thr Asp Glu Ile Lys Asn Asp

            260                 265                 270

Asn Ile Gly Ser Glu Glu Asn Val Glu His Asp Ala Gly Ser Asp Gly

        275                 280                 285

Asn Cys Glu Asp Ile Pro His Val Asn Glu Phe Ser Ala Ile Asp Leu

    290                 295                 300

Gly Ser Gly Asn Ala Glu Lys Tyr Asp Lys Met Asp Glu Pro Gln His

305                 310                 315                 320

Tyr Gly Lys  Ser Gly Ser Leu Asp AsnIle Lys Asp Asn Val Gly Lys

                 325                 330                 335

Met Glu Asp Tyr Ile Lys Lys Asn Lys Lys Gly Pro Gly Pro Gly Ser

            340                 345                 350

Ala Ser

Claims (8)

1.一种疟疾重组抗原，其具有SEQ ID No：11所示的氨基酸序列。

2.一种编码如权利要求1所述抗原的多核苷酸。

3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其具有SEQ ID No：10所示的碱基序列。

4.一种通过如权利要求1所述抗原免疫鸡获得的IgY抗体。

5.如权利要求4中所述的抗体在制备检测疟疾的制剂中的用途。

6.含有如权利要求4中所述的抗体的试剂盒。

7.一种制备如权利要求4所述抗体的方法，所述的方法包括：

1)使用如权利要求1所述抗原免疫鸡；

2)收取步骤1)中免疫后的鸡所产的卵，并从卵黄中提取获得IgY抗体。

8.如权利要求7所述的方法，其进一步包括对步骤2)获得的抗体的纯化步骤。

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