CN101828113B - 自结合重组抗体融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

一种化合物，包括A，B和C三个部分，这些部分共价结合形成具有结构A-B-C的化合物，其中，A部分对抗原具有特异性结合亲和力，B部分与A部分共价结合，C部分是具有烷基化嘌呤或嘧啶(如鸟嘌呤、胞嘧啶等)部分或辅酶A部分的化合物，并且在它上面连接了具有生理效应的部分，其前提是B部分具有催化或受体活性，将C部分与共价结合的A-B部分连接。

Description

自结合重组抗体融合蛋白
本发明领域
本发明涉及由至少一个A部分和至少一个B部分组成的配合物。本发明还涉及编码所述配合物的核酸和/或载体。另外，该配合物的整体部分还包括C部分，C部分由B部分的正交底物组成，它以化学方式连接在化学或固体物质上。C部分通过共价结合反应以底物特异性方式添加到B上，以将它所固有的物理化学特性转移给配合物ABC。
本发明背景
目前，有一系列得到许可的方法可用于人类恶性疾病的诊断和/或治疗，如癌，慢性炎性疾病和***反应。传统的治疗方法由于它们相对缺少选择性(例如，用于癌症治疗的放疗和化疗)具有很多严重的副作用。
在诊断领域，存在很多新的高分辨成像技术，它使得可以对诸如固体肿瘤疾病等进行非常精确的拓扑学定位(X-光照片/磁共振成像(MRI))。尽管有正确定位，但肿瘤生物学和生理学对于最佳的治疗方式来说仍是十分重要的。
现代分子生物学方法，如抗体技术开启了诊断和治疗的新的可能性和途径。因为针对诊断/治疗的选择性成分和融合配偶体可以靶定几乎每一种所希望的细胞/组织特异性标记。它们还能明显改善治疗的特异性，并且限制假象，假阳性/假阴性诊断的发生几率。
它们在作为免疫诊断工具或作为免疫治疗剂(例如，免疫毒素)应用之前，必须使用可检测的试剂或效应分子对完整长度的抗体进行修饰。黄金标准仍然是化学方法。不过，抗体的化学修饰经常会导致问题复杂化，如其结合活性或特异性的丧失。一般蛋白的化学特性，如可溶性，在某些情况下也会受到负面影响。由于越来越复杂的用途，非常需要功能修饰过的抗体。
本领域的另一发展是重组抗体与效应分子的遗传融合。不幸的是，所得到的每一种融合蛋白局限于一种或少数几种用途。对每一种新的用途领域来说，所述抗体必须与其他合适的效应分子结合，结果是每一种情况都有一个麻烦的优化过程。另外，该方法只局限于肽类效应分子。
本发明的一个目的是尽量避免由于全长抗体的化学修饰，例如，用于细胞靶定的融合蛋白的化学修饰而导致的结合活性和特异性的丧失。
本发明的另一个目的是提供一种化合物，它使得技术人员可以使用相似或相同的工具进行疾病的诊断和治疗。本发明的另一个目的是提供一种化合物，它避免了免疫原性/免疫治疗的强副作用。
本发明的另一个目的是提供传统治疗方法和更特异性的新技术之间所缺少的环节。
本发明概述
本发明涉及新型化合物，特别是融合蛋白，它包括至少一个抗原特异性结合部分和至少一种酶型蛋白，它能与特异性底物共价反应。
本发明的目的是通过一种化合物实现的，该化合物包括A，B和C三个部分，这些部分共价结合形成具有A-B-C结构的化合物，其中
A部分对抗原具有特异性结合亲和力，
B部分与A部分共价结合
C部分是具有烷基化嘌呤或嘧啶(如鸟嘌呤、胞嘧啶等)部分或辅酶A部分的化合物，并且在它上面连接了具有生理效应的部分，其前提是：
B部分具有催化或受体活性，使C部分与共价结合的A-B部分偶连。
在本发明的一种具体实施方案中，所述化合物可以表达成具有以下通用结构的配合物：
抗原结合部分(A)-酶型蛋白(B)-C
本发明的化合物，特别是异源配合物包括至少一种重组融合蛋白，其包括至少一个特异性结合的A部分，特别是细胞特异性结合部分和包括一种酶型蛋白B，以及至少一个与B共价结合的附加C部分。
在本发明的另一种具体实施方案中，所述化合物是异源配合物，包括至少一种重组融合蛋白，其包括至少一个与可溶性抗原结合的A部分和一种酶型蛋白B，以及至少一个与B共价结合的附加C部分。
在一种具体实施方案中，本发明的化合物具有通过B部分而以C部分对A部分的共价修饰。
在本发明的另一种实施方案中，本发明的化合物的A部分是具有多肽类抗原结合结构的化学部分，B部分是与A部分连接的酶型蛋白.
在另一种具体实施方案中，本发明化合物的B部分能够以底物特异性方式与C部分起反应，由此共价连接配合物AB和C部分。
具体说来，本发明化合物的A部分属于下列一组：抗原结合多肽/蛋白靶细胞型特异性标记，特别是，A部分是针对病原物质或病原体的疾病特异性结构的。A部分的某些代表包括来自亲和物质的亲和部分或亲和物质整体的部分，其选自下列一组：抗体，受体/受体配体，包括蛋白A/IgG，和抗生物素蛋白/生物素等，酶底物，外源凝集素，白介素，细胞因子，趋化激素，淋巴因子，过敏原，肽类过敏原，重组过敏原，过敏原-独特型抗体，自身免疫-刺激结构，组织排斥诱导结构，免疫球蛋白恒定区及其衍生物，变体或其组合。另外，A部分也可以与疾病/环境/食品和饲料安全或生物防御(例如，毒素)的可溶性标记结合。
A部分还可以具有对抗原的特异性结合亲和力，它只有在与免疫原性分子结合时才在免疫学上相关。所述化合物通常被确定为半抗原，例如，低分子物质，作为个体，它们不会引起免疫反应，但是，在与免疫原性化合物，如蛋白连接之后可以引起免疫反应。
在本发明的一种实施方案中，本发明化合物的B部分是能与特异底物共价反应的多肽。特别是，B部分可以是人类DNA修复蛋白O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(AGT)的衍生物。所述B部分可以来自酰基载体蛋白(ACP)。可以理解的是，本领域技术人员可以在DNA或氨基酸水平上进行多种改变和改进，这会使得有关部分具有等同的功能。
在本发明的一种具体实施方案中，B部分的底物由O6-苄基鸟嘌呤，O2-苄基胞嘧啶或辅酶A(CoA)组成。
优选的是，在本发明的化合物中，A-B部分是共价结合的多肽。
C部分具有转移给配合物AB的物理化学或生理学特性。
在本发明的一种实施方案中，本发明化合物的C部分是药物、可检测标记或能在靶定的细胞或有机体内介导生物活性的其他成分。
在本发明的另一种具体实施方案中，本发明化合物的C部分是固相或支持物。
在本发明的另一种实施方案中，本发明化合物的C部分包括作为B部分底物的部分。
特别是，C部分可以具有结构
(X)n1-(Y)-(Z)n2
其中，X是B部分的特异性底物，n1是1或更大的数，优选1-3，Z是药物、可检测标记或能在靶细胞或有机体内介导生物活性的其他成分，n2是1或更大的数。
C部分的结构元件Y可以满足以下功能：介导X和Z之间(如B和C之间的方式)所需弹性的间隔物，确保组装的配合物中每一个部分的功能。
另外，所述接头结构成分可以包括能够在相互作用(如化学反应)期间，某些环境条件下受控制地释放Z的结构(例如，pH敏感型结构或用于在核内体或细胞溶质内释放的可还原结构)。
所述接头结构成分Y还可以具有线性，分支，树状或聚合物结构。
本发明的另一个主题是编码本发明的多肽的核酸分子。
在本发明的另一种实施方案中，提供了表达框，包括编码所述多肽，特别是嵌合多肽的多核苷酸，包括A部分和B部分，顺序为AB或BA。其他不同的形式也是可能的：AAB，ABB，AAAB，AAAAB，BAA；BBA，BAAA，BAAAA，BAB和ABA。
本发明的核酸分子和本发明的表达框还可以是载体或载体***的一部分，适合在宿主细胞中表达配合物AB(BA)。因此，本发明的另一个主题是载体。
在另一种实施方案中，提供了用于表达编码本发明的重组化合物的重组基因的方法。
在另一种实施方案中，本发明提供了一种使用包括上述本发明的表达载体的宿主细胞，并且在适合表达本发明的相关配合物的条件下培养所述宿主细胞的方法。
所述宿主细胞被进一步限定为原核细胞宿主细胞或真核细胞宿主细胞，如哺乳动物，植物或酵母细胞。
另外，本发明涉及让配合物AB(BA)与化合物C起反应的方法，化合物C包括对B专一的一种或多种酶底物，并且还携带一个或多个药物拷贝、可检测标记或能在靶定的细胞或有机体内介导生物活性的其他成分。
另外，本发明涉及制备和在体外和体内给细胞施用本发明相关配合物的方法，其中，C携带一个或多个药物拷贝、可检测标记或能在靶定的细胞或有机体内介导生物活性的其他成分。
本发明相关配合物的的用途包括体外和体内诊断方法，用于人类和动物疾病领域，以及分析方法，用于环境监测，生态毒理学和生物传感器应用领域，其中，C是或包括可检测标记。
在上述用途的某些实施方案中，配合物被用于治疗人类和动物疾病，其中，C是或包括药物或能在靶定的细胞或有机体内介导生物活性的部分。
在一种具体实施方案中，A部分通过C部分直接固定在特定表面(平面，珠体)上，以便可以将所述标记富集在特定部位。
在另一种具体实施方案中，A部分被用于检测位于独特部位(斑点，珠体)上的富集的标记(优选可溶性的，例如，可溶性CD30/CEA/PSA/sIL-2R/sFAS/sCD23/sCD26/sCD40L/sCD40/CRP/sVCAM-1/MCP1/血栓调节蛋白/血浆C4bBP/蛋白C/激活的蛋白C/蛋白S/血管性假血友病因子/TNFR/p55/p75/Fas(CD95)/神经生长因子R/CD27/CD30/生长激素R/GM-CSF/***-R/血小板生成素/G-CSF/IL-IRI/IL-IRII/IL-2Ra(Tac，CD25)IL-4R/IL-5Ra/IL-7R/IL/CNTFR/LIFR/瘦素R/IL-11R/IL-12/干细胞因子R(c-kit)/干扰素R/脂多糖R(CD14)/补体受体I型/透明质酸盐R(CD44)/CD58/IgER(FceRII，CD23)/IgGR(FcgRII)/ICAM-1(CD54)/ICAM-3(CD50)/转化生长因子bRIII/表皮生长因子R(c-erb B)/血管内皮生长因子R/血小板衍生的生长因子R/成纤维细胞生长因子/集落刺激因子-1R(MCFR，c-fms)/ARK/Tie/胰岛素R/胰岛素-样生长因子-IIR/甘露糖6-磷酸R)，所述标记是通过C部分固定的，具有以下特性：光学方面包括荧光，磁性方面包括resp.珠体(例如，FeOH为基础的)，放射性标记包括γ射线发射核素，如锝-99m，铊-201，镓-67，氟-18，铟-111，超声波方面包括resp.气泡，电化学方面包括酶，如碱性磷酸酶，寡核苷酸，如用于PCR的杂交探针。
所述特定细胞的体外/体内检测是通过具有上述特征的C部分进行的。
在另一种具体实施方案中，所述A部分与被内在化的细胞表面标记结合(EGFR，CD30R，和BCR等)；C部分是选自下列一组试剂：具有细胞毒性/抑制细胞活性的小分子。
在另一种具体实施方案中，所述A部分与没有被内在化的细胞表面标记(MUC1，共结合蛋白聚糖1)结合；C部分是输送CpG基序的试剂，β射线发射核素，如碘-131，钇-90，镥-177，或激活细胞毒性剂的酶(定向酶药物前体治疗：DEPT，例如，使用羧肽酶作为酶)。
在另一种具体实施方案中，A部分包括或者是由D-氨基酸组成，通过人工过程拷贝上述蛋白/肽，这些蛋白或肽在自然条件下是由L-氨基酸合成的。
在具体实施方案中，A部分和B部分由下述物质修饰，或包括下述物质：标记聚糖的化学修饰过的叠氮和炔基单糖前体，携带非天然氨基酸的叠氮化物和用于残基特异性蛋白标记的炔或用于检测脂化蛋白的叠氮脂底物。
上述方法被称为生物正交标记，可以通过点击化学法对A部分或B部分进行位点专一性修饰，参见如Baskin，J.and Bertozzi C.(2007)。
本发明的详细说明
通过以下说明可以理解本发明的其他目的，特征和优点。不过，应当理解的是，用于说明本发明的优选实施方案的详细说明和具体例子仅仅是以说明的方式提供的，因为在本发明的构思和范围内的各种改变和改进对于本领域技术人员来说在阅读该详细说明之后是显而易见的。
本发明还涉及该异源配合物的诊断，治疗或分析组合物，生产该配合物的方法，以及在体外和体内使用所述配合物的方法。
在本文中，词语“a”或“an”可以表示一个或一个以上。在本文的权利要求书中，在与词语“comprising”组合使用时，词语“a”和“an”可以是1或比1大。在本文中“another”可以表示至少另一个或更多。
在本文中，术语配合物的“A部分”表示本发明配合物主动结合结构。所述A部分选自下列一组：主动结合结构，包括抗体或它们的衍生物或其片段，合成肽，如scFv，模拟表位肽等或化学分子，如碳水化合物，脂类，核酸，肽，维生素等，和/或具有高达100个原子的小分子，具有受体-结合活性，如配体，特别是单个原子，肽类分子，非肽类分子等，和/或细胞表面碳水化合物结合蛋白，及其配体，如外源凝集素，特别是钙联蛋白，c-型外源凝集素，1-型外源凝集素，m-型外源凝集素，p-型外源凝集素，r-型外源凝集素，半乳凝素及其衍生物，和/或受体结合分子，如分化(CD)抗原簇的天然配体，如CD30，CD40等，细胞因子，如趋化激素，集落刺激因子，1型细胞因子，2型细胞因子，干扰素，白介素，淋巴因子，单核细胞激活素等，和/或粘附分子，包括它们的衍生物和变体，和/或上面所列举的任何主动结合结构的衍生物或组合，它们与CD抗原，细胞因子受体，激素受体，生长因子受体，离子泵，通道形成蛋白结合。所述A部分还可以选自下列一组：被动结合结构，包括过敏原，肽类过敏原，重组过敏原，过敏原独特型抗体，自身免疫刺激结构，组织排斥诱导结构，免疫球蛋白恒定区及其衍生物，变体或其组合。选自上述各组的至少两个相同或不同结合结构的组合，便可以产生具有更高效价的A部分。
本发明的另一个目的是，A部分与属于分化抗原簇(CD-抗原，表1)的健康或病变细胞的细胞表面标记结合。
在另一种具体实施方案中，所述A部分是趋化因子或它的特异性结合片段，如在表2中列举的，与它的特异性细胞受体结合。
在另一种实施方案中，A部分是白介素或它的特异性结合片段，如在表3中列举的，与它的特异性细胞受体结合。
在另一种实施方案中，A部分是在表1中列举的分化抗原簇的细胞外或细胞内部分，与可溶性因子特异性结合，并且被用于检测可溶性抗原或可溶性抗原家族。
在另一种具体实施方案中，A部分是调节血管内皮细胞生长，趋化行为和/或功能活性的血管生成因子或它的特异性结合片段，包括AcSDKP，aFGF，ANF，血管生成素，血管调节素，血管营养素，AtT20-ECGF，B61，bFGF，bFGF诱导活性物，CAM-RF，ChDI，CLAF，ECGF，ECI，EDMF，EGF，EMAP-2，Neurothelin(参见：EMMPRIN)，血管内皮抑制素，内皮细胞生长抑制剂，内皮细胞活性保持因子，Epo，FGF-5，IGF-2(参见：血管内皮细胞的生长促进活性物)，HBNF，HGF，HUAF，IFN-γ，IL1，K-FGF，LIF，MD-ECI，MECIF，NPY，制瘤素M，PD-ECGF，PDGF，PF4，PlGF，催乳激素，TNF-α，TNF-β，转铁蛋白，VEGF。某些所述因子是最初由某些其他生物学活性物检测到的蛋白因子，并且随后被证实能够促进血管生成。体内血管生成活性的蛋白因子的例子包括成纤维细胞生长因子(参见：FGF)，血管生成素，血管生成素-1，EGF，HGF，NPY，VEGF，TNF-α，TGF-β，PD-ECGF，PDGF，IGF，IL8，生长激素。业已证实纤维蛋白片段E也具有血管生成活性。另外，还有如血管生成素-1等因子，不是像传统生长因子那样对内皮细胞起作用，而是在血管发生和血管生成过程中发挥突出的作用。
在另一种实施方案中，所述A部分是毒力因子或它与人类细胞亚类结合的相应部分，如121R，14.7kDa orf病毒蛋白，145R，16kDa orf病毒蛋白，2C，牛痘病毒的38K基因，3a，5EL，5-HL，7a，A224L，A238L，A39R，A41L，AcMNPV ORF32，伴放线放线杆菌细胞致死扩张毒素，伴放线放线杆菌白细胞毒素，腺病毒死亡蛋白，腺病毒E1B 19kDa蛋白，腺病毒E310.4K/14.5kDa蛋白，腺病毒E314.7kDa蛋白，腺病毒E319kDa蛋白，气溶素，AgMNPV IAP3，AHV-Sema，AIP56，α-溶血素，α-HL，α-毒素，抗-细胞因子，凋亡素，细胞凋亡，B13R，B15R，B18R，B8R，炭疽杆菌毒素，Bacteriokine，杆状病毒p35蛋白，杆状病毒P49蛋白，BAD1，BALF-1，BARF1，BCK，BCL2，BCRF-1，B-溶血素，B-毒素，BHRF-1，Bm-MIF，BmNPV FGF，包特氏菌属皮肤坏死毒素，BORFE2，BPV-1E6，BZLF1，C12L，C21L，CADD，弯曲菌属细胞致死扩张毒素，caspase-7-样蛋白，Caspases，CDT，Ce-MIF，趋化激素，Circo病毒2型ORF3，CLAP，魏氏杆菌α-毒素，魏氏杆菌β-毒素，CMV IL10，CMV RR1，CNF1，CNF2，COPE version 15.8，COPE version 8.7，COPE，crmA，crmB，crmC，crmD，crmE，细胞因子分析，细胞因子种间反应性，细胞因子，D7L，δ-溶血素，δ-毒素，E1.1，E1B-55K，E2，E3-6.7，E3L，E3L-样蛋白，E4orf4，E5，E6，E7，E8，早期响应基因，EBNA-LP，ECRF-3，缺肢畸形痘病毒p13，缺肢畸形病毒p28蛋白，EHV-2E1 ORF，EHV-2 IL10，EP153R，EP402R，Erns，大肠杆菌细胞致死扩张毒素，F1L，FLIP，FPV016蛋白，Fractalkine，腐马素毒素，坏死梭杆菌白细胞毒素，G4R，G5R，GAM-1，γ-溶血素，GIF，糖蛋白G，gp120，GPCMV-MIP，H3L，H4R，H83，杜克雷嗜血杆菌细胞致死扩张毒素，HBx，螺杆菌属细胞致死扩张毒素，溶血素BL，松鼠猴疱疹病毒BCL2，HJ1，HP1118，HP-NAP，HSGF-2，HVP IL10，HVS13，IAP，ICP0，ICP10PK，ICP22，ICP27，ICP34.5，IE1，IE2，IE2579aa，IMP，甲流病毒NS1蛋白，IpaB，ITA，K13，K2，K2R，K3R，K4.1，K6，KSHV ORF4，KSHV，L*，LANA-2，墨西哥利什曼原虫半胱氨酸蛋白酶CPB2.8，LMP2A，M11L，m131/129，M3，M33，M78，MALP-404，溶血性曼氏杆菌白细胞毒素，MC148R，MC159，MC53L，MC54L，MDM，MDV003，MDV078，MEQ，MGF，微囊藻毒素-LR，Microkine，调制蛋白，M-T1，M-T7，MyD，N1R，Nipah病毒P蛋白，Nipah病毒V蛋白，Nipah病毒W蛋白，Npro，NS1，NS2，NS5A，orf病毒IL10，orf病毒，ORF，ORF13，ORF152，ORF16，ORF390，ORF45，ORF50，ORF74，ORFK2，ORFK4.1，ORFK4，ORFK5，ORFK6，ORFK7，ORFK9，ORFV2-VEGF，p13，Panton-Valentine杀白细胞素，多杀性巴氏杆菌毒素，PB1-F2，痘病毒生长因子，PRGF，绿浓假单胞菌外毒素A，RK-BARF0，RRV ORF74，RSV糖蛋白G，RTA，SARS冠状病毒E蛋白，SARS冠状病毒N蛋白，SARS冠状病毒非结构蛋白-1，SCMV IL10，SERP1，SERP2，SERP3，SFGF，志贺氏菌属细胞致死扩张毒素，σC，SipB，sis，Sliap，Slp49，SPI-2，SPV146，金黄色葡萄球菌α-毒素，金黄色葡萄球菌δ-毒素，金黄色葡萄球菌γ-毒素，STI，链球菌溶血素O，SV40大T抗原，SV5V蛋白，猪痘病毒SPV003/148蛋白，T2，TAIP，Tanapox病毒2L蛋白，Tanapox病毒38kDa蛋白，托高土病毒病毒ML蛋白，Trypanokine，U12，U51，U83，U83A，UL111.5A，UL111a，UL119-UL118，UL141，UL144，UL146，UL147，UL18，UL3蛋白，UL36，UL37，UL69蛋白，UL82，US27，US28，US3，Us5，V蛋白，VacA，牛痘19kDa蛋白，牛痘生长因子，牛痘病毒生长因子，牛痘病毒蛋白磷酸酶VH1，vBCK，vBCL2，vC4bBP，vCCI，vCCL1，vCKBP，vCKBP-1，vCKBP-2，vCKBP-3，vCKBP-4，VCP，vCSF1BP，VEGF-E，vFGF，VG71，vGPCR，vICA，vIL17，vIL18BP，vIL6，vIL8，病毒BCK，病毒BCL2，病毒C4b结合蛋白，病毒CCL1，病毒CD30，病毒趋化因子结合蛋白，病毒趋化因子结合蛋白-1，病毒趋化因子结合蛋白-2，病毒趋化因子结合蛋白-3，病毒趋化因子结合蛋白-4，病毒趋化因子抑制剂，病毒CSF1结合蛋白，病毒细胞因子受体s，病毒细胞因子，病毒EGF，病毒Fc-γR2，病毒Fc-γR3，病毒FLICE-抑制蛋白，病毒G-蛋白结合的受体，病毒IFN-γ/IL2/IL5结合蛋白，病毒IL10，病毒IL17，病毒IL18结合蛋白，病毒IL6，病毒IL8，细胞凋亡蛋白的病毒抑制剂，caspase激活的病毒抑制剂，病毒干扰素调节因子，病毒干扰素调节因子-1，病毒干扰素调节因子-2，病毒干扰素调节因子-3，病毒M-CSF结合蛋白，病毒MIP-1，病毒MIP-1-α，病毒MIP-1-β，病毒MIP-2，病毒NGF-β，病毒OX2，病毒脑信号蛋白，病毒TGF-β，病毒VEGF，vIRF，vIRF1，vIRF2，vIRF3，病毒受体，病毒因子，vMCC-1，vM-CSFBP，vMIA，vMIP-1，vMIP-1-α，vMIP-1-β，vMIP-2，vMIP-3，vNGF-β，vOX2，VP35蛋白，VP5，vTGF-β，vTNFR，VVGF，Y134R，雅巴猴肿瘤病毒2L蛋白，YLDV IL10，YopJ，ZmpB，Zta。
在本文中，术语″抗体″表示多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、单链抗体及其片段，如Fab，F(ab′)2，Fv，和其他片段，它保留了亲代抗体的抗原结合功能和特异性。
在本文中，术语″单克隆抗体″表示具有同种抗体群体的抗体组合物，该术语不局限于所提到的抗体种类或来源，也不局限于形成它们的方式。该术语包括所有免疫球蛋白以及片段，如Fab，F(ab′)2，Fv，以及其他保留了所述抗体的抗原结合功能和特异性的其他部分。任何哺乳动物的单克隆抗体都可用于本发明中。不过，在实践中，所述抗体通常是大鼠或鼠类来源的，因为大鼠或鼠类细胞系可用于制备需要的杂交细胞系或杂交瘤，以生产单克隆抗体。
在本文中，术语″人类抗体″表示免疫球蛋白的框架区来自人类免疫球蛋白序列。
在本文中，术语″单链抗体片段″(scFv)表示通过确定结合抗体的结合结构域(包括重链和轻链)，并且补充连接部分而制备的抗体，它可以保留所述结合功能。实质上，这形成了根本上简化了的抗体，它仅具有与抗原结合所需要的可变结构域部分。单链抗体的确定和构建可以参见Ladner等的US-A-4,946,778。
B部分是源于烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)的酶样蛋白，它具有O6-苄基鸟嘌呤或O6杂芳基甲基鸟嘌呤的底物特异性。所述酶样蛋白能够通过以前在WO/2005/085470中披露的反应，从底物转移某些标记。
在一种具体实施方案中，所述酶样蛋白业已被修饰成能识别2-氨基-4-苄氧基嘧啶的，参见WO/2006/114409。
B部分还可以是来自蛋白烷基胞嘧啶转移酶(ACT)的酶样蛋白，它具有对O2-苄基胞嘧啶衍生物和相关的O2杂芳基甲基-胞嘧啶衍生物的底物特异性，参见WO/2008/012296。
在本发明的另一种实施方案中，B由酰基载体蛋白或其片段组成。辅酶A衍生物能够在存在修饰酶卤-酰基载体蛋白(ACPS)或其修饰或其变体的情况下，将它的标记转移给ACP或ACP的一部分，参见WO/2004/104588。
本发明的DNA序列可以工程改造，为改变嵌合编码序列，以便用于各种修饰，包括，但不局限于修饰过程和表达基因产物方面的改变。例如，可以通过本领域众所周知的技术引入突变，例如，定向诱变或SOE-PCR，以便***或除掉限制位点，从而改变活性中心的糖基化或磷酸化方式或改变底物特异性。
在本文中，术语配合物的“C部分”表示通过共价结合添加在配合物AB上的特异性额外功能。C部分是药物、可检测标记或能在靶细胞或有机体内介导生物活性的其他成分。C可以是固相。
C还包括起着B部分的底物作用的部分。
C部分可以具有结构(X)n1-(Y)-(Z)n2，其中，X是B部分特异底物，n1是1或更大的数，优选1-3，Z是药物、可检测标记或能在靶定的细胞或有机体内介导生物活性的其他成分，n2是1或更大的数。
Y被设计成用于功能性连接X和Z的连接结构。Y可以满足以下功能：介导X和Z之间(以至B和C之间的)所需弹性的间隔物，确保组装的配合物中每一种成分的功能。
另外，所述接头可以包括使得Z在某些环境条件下能受控释放的结构(例如，pH敏感型或可还原结构，以便在核内体或细胞溶质内释放或酶可降解的接头)。例如，所述连接结构可以是顺式乌头酰连接，包括酯键接头，酸敏感型腙接头，溶菌酶可降解的肽接头，自我消除的间隔物，sulphhydryl接头，光敏感型接头(参见Dyba et al.)。
另外，所述接头可以包括螯合剂，如DOTA(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸)或DTAP(二乙三胺五乙酸)，例如，它可用于与放射性同位素络合。
Y可以具有线性，分支，树状或聚合物结构。
可用作C部分的药物包括可在靶细胞上表现出作用模式的所有类型的物质，以及在转移到体内的特定部位后可能更有效的物质。优选的是，被证明具有效力的化合物，例如，化疗制剂。所述物质可选自下列一组：烷基化制剂(例如环磷酰胺，苯丁酸氮芥)，安血定制剂(阿霉素，道诺霉素)，美登素类化合物(美登素类化合物DM1)，抗代谢产物，植物碱和萜类，如吲哚类生物碱(长春花碱，长春新碱，民诺宾，长春地辛)足叶草毒素及其衍生物和紫杉烷(紫杉醇，多西紫杉醇，泰素帝)或拓扑异构酶抑制剂(喜树碱)，合成毒素，如玫瑰树碱类似物或肿瘤抗生素的合成类似物，如双联霉素或CC1065，其他微管蛋白结合剂，如软海绵素B，半星海胆素和海兔毒素或类似物，如单甲基-auristatin E；C部分还可以选自下列一组：具有细胞毒性/抑制细胞的活性的小分子，如烷基化制剂(如环磷酰胺，二氯甲基二乙胺，苯丁酸氮芥，美法仑)或蒽环类药(如去甲氧柔红霉素，阿霉素，表柔比星，黄胆素，米托蒽醌，戊柔比星)或cytoskeletal disruptors(如紫杉醇，多西紫杉醇)或埃坡西龙(如)或拓扑异构酶II的抑制剂(如足叶乙甙，替尼泊甙，Tafluposide)或核苷酸类似物和前体类似物(如azacididine，咪唑硫嘌呤，卡培他滨，阿糖胞苷，doxofluridine，氟尿嘧啶，吉西他滨，巯基嘌呤，甲氨蝶呤，硫鸟嘌呤)或肽抗生素(如博来霉素)或铂基制剂(如卡波铂，顺氯氨铂，奥克赛铂)或类维生素A(如所有顺式视黄酸)或吲哚类生物碱和衍生物(如长春花碱，长春新碱，vindestine，长春瑞滨)，β射线发射核素，如碘-131，钇-90，镥-177，选自下列一组的物质：芳香酶抑制剂(如氨鲁米特，阿那曲唑，来曲唑，伏氯唑，依西美坦，4-雄烯-3，6，17-三酮，1，4，6-androstatrien-3，17-二酮，福美司坦，睾内酯)，碳酸酐酶抑制剂(如乙酰唑胺，美舍唑咪，多佐胺，托吡酯)，胆碱脂酶抑制剂(有机磷酸，如美曲磷酯，氨基甲酸酯，如毒扁豆碱，新斯的明，吡啶斯的明，阿伯农，Demarcarium，利凡斯的明，Phananthrine，如加兰他敏，哌啶，如多奈哌齐，他克林，Edophonium，或吩噻嗪)，环加氧酶抑制剂(如塞来昔布，罗非克西，依托昔布，醋氨酚，双氯芬酸，异丁苯丙酸)，也算拮抗剂(如甲氨蝶呤)，羟甲基戊二酰基-CoA还原酶抑制剂(如阿托伐他汀，西立伐他汀，氟伐他汀，洛伐他汀，美伐他汀，匹伐他汀，普伐他汀，罗素他汀，辛伐他汀，维托力，Advicor，Caduet)，整合酶抑制剂(如雷特格韦，Elvitegravir)，脂加氧酶抑制剂(如Zileutron)，单胺氧化酶抑制剂(如异唑肼，吗氯贝胺，苯乙肼，反苯环丙胺，司立吉林，雷沙吉兰，烟肼酰胺，异烟酰异丙肼，异丙氯肼，托洛沙酮，雷奈佐利，色胺，嚏根草甙，Detxtroamphetamine)，核酸合成抑制剂，磷酸二酯酶抑制剂(如咖啡因，Theopyline，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，长春西汀，EHNA，依诺他宾，Lirinone，PDE3，松叶菊碱，咯利普兰，异丁司特，西地那非，他达那非，伐地那非，Udenafil，阿伐那非)，蛋白酶抑制剂(如沙奎那韦，利托那韦，茚地那韦，奈非那韦，安普那韦，洛匹那韦，阿扎那韦，福沙那伟，替拉那韦，地瑞那韦)，蛋白激酶抑制剂(如伊马替尼，吉非替尼，哌加他尼，索拉非尼，达沙替尼，苏尼替尼，埃罗替尼，尼罗替尼，拉帕替尼)，蛋白合成抑制剂(如茴香霉素，环己酰亚胺，氯霉素，四环素，链霉素，红霉素，嘌呤霉素等)，质子泵抑制剂(如奥美拉唑，羊毛二烯，埃索美拉唑，泮托拉唑，雷贝拉唑)，选自下列一组的物质：寡核苷酸核酸，如小干扰RNAs(siRNAs)或短发夹RNA(shRNA)，反义DNA或RNA，双链RNA(dsRNA)或微RNA(miRNA)，可用于下调细胞内的调控途径上的特定关键因子。
在一种具体实施方案中，C部分是聚合物或树枝状化合物，携带若干如上文所述的细胞抑制/细胞毒性制剂，如紫杉醇或氨甲喋呤分子，携带苄基鸟嘌呤(BG)/苄基胞嘧啶(BC)-基团，并且被修饰过，例如PEG化，以便改善其生物适应性。
另外，所述药物可以是选自下列一组的放射性同位素：可用于放疗的β射线同位素(例如，碘-131，镥-177，钇90)。
在另一个例子中，所述药物可以是核酸或核酸类似物，它可以在靶细胞内产生生物学活性。更具体地讲，所述核酸分子可以被设计成允许编码的蛋白在靶细胞中表达(用于基因治疗)或介导RNA干扰(RNAi)包括小干扰RNAs(siRNAs)或短发夹RNA(shRNA)，反义DNA或RNA，双链RNA(dsRNA)或微RNA(miRNA)。
在一种具体实施方案中，C部分是如上文所定义的siRNA或接头结构，具有与siRNAs相关的一种或多种功能，单一特异性或若干不同的特异性。所述RNAi介导化合物可以针对任何需要的细胞mRNA。所述RNA干扰(RNAi)介导化合物可以被设计成直接或间接下调对靶细胞的存活来说关键的因子的表达(例如，siRNA介导的伸长因子II的剔除(eEFII或多种抗-细胞凋亡因子，如BCL2，BCL-xL或其他癌基因)或可以被设计成改变在靶细胞中的基因表达形式，从而发挥治疗作用。
在一种具体例子中，配合物AB-C包括EGFR特异性单链抗体或与SnapTag融合的人EGF，在它上面连接了针对人伸长因子II、核纤层蛋白A/C、或用BG修饰过的GFP的siRNA。
C部分还可以是药物前体，它是在进入靶细胞时可被激活的，例如通过细胞蛋白酶激活。
所述药物还可以是对靶细胞具有毒性活性的肽或多肽。
其例子包括ADP核糖基化酶，假单胞菌外毒素A，白喉，霍乱，百日咳-和肉毒杆菌毒素。核糖体失活蛋白diathin，皂角毒蛋白，bryodin，gelonin，篦麻毒素，相思豆毒素或局限曲菌素。核糖核酸酶(磷酸二酯酶)RNAse H，血管生成素，嗜曙红细胞-衍生的神经毒素(EDN)，嗜曙红细胞阳离子蛋白，onconase和牛蛙列康肽。C表示的其他蛋白包括药物前体活化酶，如caliceamicin，葡萄糖氧化酶，羧肽酶，碱性磷酸酶，cytosindeaminase，β-糖苷酶，β-葡萄糖醛酸苷酶，β-内酰胺酶，硝基还原酶，胸苷激酶或嘌呤-核苷磷酸化酶。其他组织蛋白酶，颗粒酶及其组合和上述蛋白家族的可能的变体。
优选的是经过确认的毒素，如篦麻毒素A，α帚曲菌素(外源凝集素家族)，白喉毒素和假单胞菌外毒素A。它们具有若干临床研究用途，并且它们的效力在文献中有大量报道。
C部分还可以表示有毒的肽，如防御素，抗真菌肽或例如从圆鳍鱼或海绵中分离的若干种肽。
可检测标记是荧光染料，如荧光素，若丹明，香豆素和青色素及其衍生物。优选的荧光团可以在680-950nm的近红外(NIR)范围内发射。该波长导致非常低的背景荧光，和出色的组织渗透能力，因此很适合体内荧光检测。在一种具体实施方案中，肿瘤特异性抗体或与Snap-tag融合的其他配体是用NIR染料的BG衍生物标记的。所述标记的抗体或配体起着成像工具的作用，可用于观察体内肿瘤生长和/或治疗。
在一个具体例子中，发射波长为782nm的NIR染料的BG衍生物结合在单链抗体片段SNAP-tag融合蛋白靶定的EGFR上。将所得到的体内成像探针用于检测EGFR在胰腺癌异种移植模型中的表达。在其他具体例子中，将荧光团结合的几种配合物AB用于流式细胞测定术和共焦显微术。
另外，所述可检测标记可以是γ射线放射性同位素，例如，碘-131，镥-177，钇90或任何其他诊断上相关的同位素，通常用络合剂如DOTA或DTAP与其结合。
另外，所述可检测标记可以是由重金属，如CdSe或InGaP，组成的量子斑。量子斑是优选的光学成像制剂，因为它们的高量子产量和光稳定性。C部分所代表的荧光标记的另一种可能性可以是贵金属纳米簇，由少量(8-12)金或银原子组成，或由俘获在二氧化硅制得的纳米颗粒中的合成荧光团组成。
其他可检测标记是用于MRI基分子成像的超顺磁氧化铁颗粒。
荧光蛋白，如GFP或dsRED或其衍生物可用作检测标记，与配合物AB结合。目前，荧光蛋白覆盖了很大范围的可见光谱和近红外光谱。
其他可检测标记可以是酶，如碱性磷酸酶，过氧化物酶和半乳糖苷酶，它们常用于各种免疫测定。
C部分还可以是固相，如珠体，生物芯片表面或ELISA-平板。
在本文中，术语“抗原”表示与任何A部分结合的任何靶结构。
在本文中，术语“配合物”是化学实体，它可以是由形成化合物的不同的化学结构构建的，所述不同的化学结构通过共价键和/或离子键以及疏水性和/或亲水性相互作用彼此结合。
在本文中，术语“治疗的”表示配合物ABC至少导致疾病稳定的任何应用。
在本文中，术语“诊断的”表示配合物ABC导致医学，科学，工程，环境，食品和饲料，商业，贸易等方面确定问题性质的任何用途。
术语“靶细胞”和或“靶组织”，表示携带有能与配合物的A部分主动或被动结合的细胞外表面结构的细胞或组织。因此，靶细胞和靶组织是配合物的A部分可以结合的细胞和组织。
术语”重组”表示通过分子生物学领域公知的任何一种方法，由不同的来源制备分子，特别是共价结合的分子。在本发明中，术语″重组″特别是表示抗体或配体A部分与酶样蛋白B部分通过分子生物学领域的任何一种已知方法，如通过单链抗体产生而融合。编码包括抗体/配体部分和酶型蛋白部分的重组融合蛋白的重组DNA分子是重组表达的。通过这种方法生产的本发明的重组配合物，可以通过适合这一目的的重组DNA表达技术领域的任何已知技术来分离。
术语“衍生物”表示突变的或修饰的蛋白，它保留了它的特有活性，即结合活性或酶促活性。特别优选的是组成型活性衍生物。术语衍生物包括蛋白，它携带至少一个氨基酸的取代、缺失、添加、单一结构域的交换或至少一个氨基酸的至少一种修饰。特别是，具有尽可能多的修饰，但又不会破坏本发明的化合物的功能的衍生物属于本发明的范围，尤其是携带大约20个这样的改变或携带大约10个这样的改变或携带1-5个这样的改变的蛋白。
“衍生物”的其他含义是蛋白在它的侧链上的化学修饰，例如，糖基化、磷酸化、羧基的修饰，如酰胺化，酯化、硫醇或羟基的修饰，例如烷基化或氧化或二硫化物连接、氨基的修饰，它可以起着亲核部分的作用，如酰化、烷基化或其他亲电子攻击。
另外，术语“衍生物”表示类似于母结构的化学结构，它是通过其他或多或少的配合基团延长或修饰过的，例如，荧光团作为母结构，通过一个或多个活性基团，例如，马来酰亚氨基团使之延长。
在本文中，术语″载体″包括DNA和RNA形式的质粒，粘粒，噬菌体，噬菌粒，它们的衍生物，或病毒。载体包括控制序列和编码序列。
术语″编码重组配合物的重组基因的表达″，其中，所述重组配合物是单链抗体/配体-酶型蛋白融合多肽，表示用编码所述配合物的核酸或载体转化或转染宿主细胞，并且培养选自下列一组的所述宿主细胞：细菌，如大肠杆菌，和/或酵母，如S.cerevisiae，和/或建立的哺乳动物或昆虫细胞系，如CHO，NS0，COS，BHK，293T和MDCK细胞，和/或原代细胞，如人类细胞，非人脊椎动物细胞，和/或无脊椎动物细胞，如昆虫细胞，和相应mRNA的合成或翻译，最终得到所述重组蛋白，即所述重组配合物。更具体地讲，术语″编码所述重组配合物的重组基因的表达″包括以下步骤：
用重组载体转化合适的细胞宿主，所述载体***了编码该融合蛋白的核苷酸序列，该序列受合适调控因子的控制，特别是通过宿主细胞的聚合酶识别的启动子。对于原核宿主来说，合适的核糖体结合位点(RBS)还位于编码所述融合蛋白的核苷酸序列前面，以便能够在所述细胞宿主中翻译，对于真核宿主来说，可以提供任何人工信号序列或前/原序列，或采用天然信号序列。转化的细胞宿主在能够表达所述***序列的条件下培养。
本发明也要求保护细胞或体外翻译***，在用本发明的核酸分子或载体，或加入本发明的核酸分子或载体转化和/或转染之后，便能合成本发明的完整配合物或其各部分。
本发明的另一个实施方案是细胞腔室或除人类之外的有机体，所述腔室或有机体用本发明的核酸转化或转染。所述细胞腔室可以是原核来源的，特别是来自E.coli，B.subtilis，S.carnosus S.coelicolor，和/或Marinococcus sp.，或低等真核生物，如Saccharomyces sp.，Aspergillus sp.，Hansenulapolymorpha，Arxula adeninivorans，Spodoptera sp.和/或P.pastoris，高等非人真核生物，如植物和/或动物，并且所述细胞也可是原代或培养的哺乳动物细胞，如新分离的人类细胞或真核细胞系，如CHO，NS0，COS，BHK，293T和MDCK。
本发明的细胞或有机体是原核来源的，特别是来自E.coli，B.subtilis，S.carnosus，S.coelicolor，Marinococcus sp.，或者真核来源的，特别是来自Saccharomyces sp.，Aspergillus sp.，Spodoptera sp.，P.pastoris，原代或培养的哺乳动物细胞，真核细胞系(例如，CHO，Cos或293)，植物(例如N.tabacum)，或酵母(例如S.cerevisiae，H.polymorpha，A.adenivorans)。
本发明还涉及药品和分析/诊断工具，包括本发明的配合物和/或编码本发明配合物的核酸或载体。一般，本发明的配合物是以生理学上可接受的剂型施用的。其中包括，例如，Tris，NaCl，磷酸缓冲液以及所有得到批准的缓冲***，特别包括以添加得到批准的蛋白稳定剂为特征的缓冲***，所述施用具体通过肠胃外，静脉内，皮下，肌内，肿瘤内，经皮给药，以及通过经粘膜涂敷等实现的。
施用本发明配合物的剂量必须通过临床阶段I研究法(剂量逐步加大研究)，针对每一种新治疗疾病的每一种应用来确定。
本发明的配合物，编码它的核酸分子和/或细胞或体外翻译***可用于制备药品，用于***疾病、***反应、自身免疫疾病、和慢性/急性炎性反应，或用于制备所述疾病的诊断工具。另外，可以治疗恶性疾病和组织/移植排斥反应。
有关重组蛋白工程的其他细节为本领域技术人员所熟知或在阅读被收作本文参考的Rosenblum(US 2006/0280749A1)的文献之后便可以了解。
实施例
下面是对实施本发明的优选实施方案的说明。不过，它们不是限定性例子，其他实施例和方法也可用于实施本发明。
I  C部分的化学合成
缩写：
BC-NH2＝2-(4-氨甲基苄氧基)-4-氨基嘧啶(氨甲基苄基胞嘧啶)。
BG-PEG4-NH2＝6-(4-((2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)苄氧基)-9H-嘌呤-2-胺(peg化的O6-苄基鸟嘌呤)。
CDI＝N，N′-羰基二咪唑
CoA-SH＝辅酶A
DCC＝二环己基碳二亚胺
DCU＝二环己基脲
DIPEA＝二异丙基乙胺
DMF＝二甲基甲酰胺
DMSO＝二甲基亚砜
DTT＝二硫苏糖醇
EDC＝1-(3-(二甲基氨基)丙基)-3-乙基碳二亚胺
eq＝当量
ESI-MS＝电喷射离子化质谱分析
Et3N＝三乙胺
EtOAc＝乙酸乙酯
EtOH＝乙醇
FAB-MS＝高速原子轰击质谱分析
HOBT＝1-羟基苯并***
HPLC＝高压液相层析
Lys＝赖氨酸
MeNH2＝甲胺
MeOH＝甲醇
NHS＝N-羟基琥珀酰亚胺
NMP＝N-甲基吡咯烷
PEG12＝-(CH2CH2O)12-
PMe3＝三甲基膦
PYBOP＝六氟代磷酸(苯并***-1-基氧基)-三吡咯烷基-鎓盐
TFA＝三氟乙酸
Tris＝三(羟甲基)甲胺
分子生物学相关术语的缩写：
BG                 O6-苄基鸟嘌呤(衍生物)
CT                 O2-苄基胞嘧啶(衍生物)
LB                 Luria肉汤
TB                 terrific brith
IMAC                 固定化金属亲和层析
μ                   微
M                    毫
M                    摩尔
mAk                  单克隆抗体
Min                  分钟
mRNA                 (“信使“)核糖核酸(RNA)
siRNA                短干扰核糖核酸
DNA                  脱氧核糖核酸
Mw                   分子量
N                    纳米
N-term               氨基末端(用于蛋白/寡肽)
C-term               羧基-末端(用于蛋白/寡肽)
ORF                  开放读框
PAA                  聚丙烯酰胺
PAGE                 聚丙烯酰胺凝胶电泳
pAk                  多克隆抗体
PBS                  磷酸缓冲盐水
PBS-T                PBS+0，05％(v/v)Tween-20
PCR                  聚合酶链反应
PEG                  聚乙二醇
pelB                E.coli中靶定外周质的细菌引导肽
RT                  反转录酶
RT-PCR              反转录酶PCR
s                   秒
scFv                单链可变片段
SDS                 十二烷基磺酸钠
Taq                 水生栖热菌
Tris                三(羟甲基)氨基甲烷
Tween 20            聚氧乙烯山梨聚糖单月桂酸酯
U                   单位
o.n.                过夜
RPM                 每分钟转数
UV                  紫外线
V                   伏
v/v                 体积/体积
VH/VL               可变区重链(H)或轻链(L)免疫球蛋白
Vol.                体积
W                   瓦特
w/v                 重量/体积
scFv H22            针对人CD64的人源化scFv
scFv 40             抗apple scrap spores的鼠类抗体
CD40L               CD40的天然配体
CD30L               CD30的天然配体
scFv Ki4            针对人CD30的鼠类scFv
scFvKi3             针对人CD30的鼠类scFv
scFvKi2             针对人CD30的鼠类scFv
scFv 425(Hai)       针对人EGF受体(EGFR)的鼠类scFv。
hEGF                与人EGF受体结合的人表皮生长因子
接头3               接头3由红细胞浆质可裂解的+膜转移肽组成
scFv 14.1           针对胰腺癌细胞的鼠类scFv
MOG                 髓磷脂少突细胞糖蛋白
scFv35              针对胎儿乙酰胆碱受体的人scFv
TAT                 来自HIV基因组转录的转录活化剂
scFvM12             针对CEA的人scFv(癌胚抗原)
PIGF                磷脂酰肌醇聚糖，F级别蛋白
VEGF                血管内皮生长因子
mSNAP                        SNAP-Tag的SfiI限制性内切核酸酶识别位点缺失形式
                            (SNAP 26m)
SNAP                        SNAP-Tag(SNAP26m/SNAP26b基因)
IL1-IL31                    白介素1-白介素31
CXCL9(MIG)                  趋化因子CXC基序配体9
CXCL10(IP10)                干扰素-γ-可诱导蛋白10
CXCL11                      趋化因子CXC基序配体11
CXCL13                      趋化因子CXC基序配体13
CXCL16                      趋化因子CXC基序配体16
CCL11(嗜酸细胞              趋化因子CC基序配体11
趋化因子-1)
CCL14                       趋化因子CC基序配体14
CCL16                       趋化因子CC基序配体16
CCL18                       趋化因子CC基序配体18
CCL27                       趋化因子CC基序配体27
CCL28                       趋化因子CC基序配体28
XCL1                        趋化因子C基序配体1
(Lymphotatcin)
CX3CL1(神经趋               趋化因子CX3C基序配体1
化蛋白)
TGFβ                       TGFβ受体，I型
G-CSF                       粒细胞-集落刺激因子
NGF                神经生长因子
HGF                肝细胞生长因子/分散因子
sCD64              可溶性CD64(FCγ受体I)
例1：
三{[2-(叔-丁氧基羰基)乙氧基]甲基}甲胺(图1)的化学合成。
向溶解在4.0mL的新开瓶的DMSO中的三(羟甲基)甲胺(Tris，2.42g，20.0mmol)冷却到15.0℃。然后，搅拌注入0.4mL的5.0M NaOH，然后滴加注入丙烯酸叔丁酯(10.0mL，68mmol)。对于该反应来说，在DMSO中制备的5-10％的水的溶剂混合物是最佳的。让所述反应混合物达到室温，并且搅拌24小时。然后将粗制混合物倾注到水中，并且用乙酸乙酯萃取，有机相在MgSO4上干燥，并且在减压下蒸发备用(图1)。所述化合物直接用于下一个步骤，不需要进一步纯化。FAB-MS：m/z 506[M+H]+。
例2：
N-三{[2-(叔-丁氧基羰基)乙氧基]甲基}甲基三氟乙酰胺(图2)的 化学合成。
在室温下向溶解在MeOH(30mL)中的三{[2-(叔-丁氧基羰基)乙氧基]甲基}甲胺(图1)(10mmol，5.05g)溶液中添加三乙胺(1eq，10mmol，1.39mL)。然后，在室温下缓慢添加三氟乙酸乙酯(1.3eq，13mmol，1.55mL)，用时20分钟。反应混合物在室温下搅拌过夜。然后，蒸发所述溶剂，用EtOAc(100mL)稀释残余物，并且用饱和的NaCl溶液洗涤。有机相在MgSO4上干燥并且在减压下浓缩。经快速层析法(环己烷/EtOAc，2/1→1/1)得到了需要的化合物(图2)。
ESI-MS：m/z 602.31[M+H]+。
例3：
N-三{[2-(羧基)乙氧基]甲基}甲基三氟乙酰胺(图3)的化学合成。
N-三{[2-(叔-丁氧基羰基)乙氧基]甲基}甲基三氟乙酰胺(图2)(4.81g，8mmol)在80mL的96％甲酸中搅拌18小时。然后，在减压下在50℃下除去甲酸，以定量方式生成无色油状物。
ESI-MS：m/z 434.12[M+H]+。
例4：
N-三(BG-PEG4-NH-羰基乙氧基甲基)甲基三氟乙酰胺(图4)的化学 合成。
在室温下向溶解在DMF(10mL)中的图3化合物(433mg，1mmol，1eq)和BG-PEG4-NH2(1.34g，3mmol，3eq)的溶液中连续添加DIPEA(495μL，3mmol，3eq)，HOBT(1M，溶解在NMP中，3mL，3mmol，3eq)和DCC(620mg，3mmol，3eq)。所得到的混合物搅拌过夜。然后在减压下除去所述溶剂，并且用250mL的EtOAc稀释所述混合物。用水洗涤有机层，在MgSO4上干燥，并且在减压下蒸发。经快速层析法(CH2Cl2/MeOH，10/1→5/1)得到了需要的化合物(图4)。ESI-MS：m/z 1718.77[M+H]+。
例5：
三(BG-PEG4-NH-羰基乙氧基甲基)甲胺(图5)的化学合成。
向溶解在EtOH(15mL)中的图4化合物(1.03g，0.6mmol)的溶液中添加MeNH2溶液(30％in EtOH，30mL)。相应的溶液在室温下搅拌过夜。获得了浑浊的混合物。通过过滤除去固体，并且蒸发得到清澈溶液，为需要的化合物(图5)。不需要进一步纯化。ESI-MS：m/z 1621.79[M+H]+。
例6：
N-三(BG-PEG4-NH-羰基乙氧基甲基)甲基荧光素-5-甲酰胺(图6)和 相应的荧光素-6-甲酰胺(图7)的化学合成。
化合物(图5)(29mg，0.018mmol)和5(6)-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(8.5mg，0.018mmol)溶解在1mL的DMF和Et3N(2.7μL，0.018mmol)中，并且在31℃加热过夜。减压下蒸发所述溶剂，并且在C18柱上通过反相HPLC分离所述化合物(图6)和(图7)，使用水∶乙腈的95∶5-20∶80线性梯度液洗脱，用时20min(0.08％TFA)。ESI-MS：m/z 1980.84[M+H]+。
例7：
N-三(BG-PEG4-NH-羰基乙氧基甲基)甲基苯丁酸氮芥-甲酰胺(图8) 的化学合成。
在室温下向溶解在DMF(2mL)中的苯丁酸氮芥(22mg，0.072mmol)溶液中添加PYBOP(38mg，0.072mmol)。在室温下搅拌该溶液20分钟。然后添加化合物(图5)(116mg，0.072mmol)和DIPEA(12μL，0.072mmol)，并且在50℃下加热所述溶液5min。在室温下搅拌该溶液过夜。然后在减压下除去所述溶剂，并且用150mL的EtOAc稀释该混合物。用水洗涤有机层，在MgSO4上干燥，并且在减压下蒸发。经快速层析法(CH2Cl2/MeOH，10/1→5/1)得到了需要的化合物(图8)。
ESI-MS：m/z 1906.86[M+H]+。
例8：
N-三(BG-PEG4-NH-羰基乙氧基甲基)甲基5-马来酰亚氨基戊烷甲酰胺 (图9)的化学合成。
在室温下向溶解在DMF(2mL)中的6-马来酰亚氨基-己酸(8mg，0.036mmol)的溶液中添加PYBOP(19mg，0.036mmol)。在室温下搅拌该溶液20分钟。然后添加化合物(图5)(58mg，0.036mmol)和DIPEA(6μL，0.036mmol)，并且在50℃下加热所述溶液5min。在室温下搅拌该溶液过夜。然后在减压下除去所述溶剂，并且用150mL的EtOAc稀释该混合物。用水洗涤有机层，在MgSO4上干燥，并且在减压下蒸发。快速层析法(CH2Cl2/MeOH，10/1→5/1)得到了需要的化合物(图9)。
ESI-MS：m/z 1815.86[M+H]+。
例9：
三(BG-PEG4-NH-羰基乙氧基甲基)甲基6-马来酰亚氨基-己酰胺siRNA 共轭物(图10)的化学合成。
通过在室温下与溶解在200μL Tris缓冲液pH 8.5中的200mM DTT一起培养1小时还原5’-硫醇修饰的寡核苷酸(43nmol)。通过凝胶过滤除去所述DTT，并且在PBS(pH 7.4)中洗脱所述寡核苷酸。合并浓度最大的级份，得到的总体积为800μL。添加300μL化合物溶液(图9)(2.5mM，溶解在DMF中)，并且在室温下培养所述反应混合物1小时。所述反应混合物用水稀释到总体积为2mL，并且通过凝胶过滤除去多余的马来酰亚胺。然后通过HPLC(溶剂A：0.1M乙酸四乙铵pH 6.9，溶解在水中；溶剂B：乙腈)纯化三(BG-PEG4-NH-羰基乙氧基甲基)甲酰胺-马来酰亚胺-寡核苷酸共轭物(图10)。
例10：
N-2-(2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基-N′-三[2-(叔-丁氧 基羰基)乙基]甲基脲(图11)的化学合成。
向溶解在DMF(2mL)中的11-叠氮-3，6，9-三氧杂十一-1-胺(1.55g，1eq，7.1mmol)的溶液中添加异氰酸三[2-(叔-丁氧基羰基)乙基]甲酯(3.1g，1eq，7.1mmol)和Et3N(988μL，1eq，7.1mmol)。在31℃下搅拌该溶液过夜。然后将粗制混合物倾注到水上，并且用乙酸乙酯萃取，有机相在MgSO4上干燥，并且在减压下蒸发产物(图11)备用。不需要进一步纯化。
FAB-MS：m/z 660.41[M+H]+.
例11：
4-[2-羧基乙基]-4-(2-(2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)-乙氧基)乙基 氨基羰基氨基)-1，7-庚烷二羧酸(图12)的化学合成。
化合物(图11)(3.3g，5mmol)在50mL的96％甲酸中搅拌18h。然后，在减压下，在50℃下除去甲酸，生成无色油状化合物(图12)。ESI-MS：m/z 492.22[M+H]+。
例12：
N-三(BG-PEG4-NH-羰基乙基)甲基-N′-2-(2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙 氧基)乙氧基)乙脲(图13)的化学合成。
在室温下向溶解在DMF(50mL)中的化合物(图12)(491mg，1mmol，1eq)和BG-PEG4-NH2(1.34g，3mmol，3eq)的溶液中连续添加DIPEA(495μL，3mmol，3eq)，HOBT(1M，溶解在NMP中，3mL，3mmol，3eq)和DCC(620mg，3mmol，3eq)。所得到的混合物搅拌过夜。然后在减压下除去所述溶剂，并且用250mL的EtOAc稀释所述混合物。用水洗涤有机层，在MgSO4上干燥，并且在减压下蒸发。快速层析法(CH2Cl2/MeOH，10/1→5/1)得到了需要的化合物(图13)。ESI-MS：m/z 1776.87[M+H]+。
例13：
N-三-(BG-PEG4-NH-羰基乙基)甲基-N′-2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙 氧基)乙氧基)乙脲(图14)的化学合成。
向溶解在二氧六环(10mL)中的化合物(图13)(708mg，0.4mmol)的溶液中添加水(1mL)。然后添加PMe3(2.40mL 1M，在THF中溶解，6eq)，并且在室温下搅拌该溶液2h。在减压下除去所述溶剂，并且通过制备HPLC纯化获得所述化合物(图14)ESI-MS：m/z 1750.88[M+H]+。
例14：
N-三-(BG-PEG4-NH-羰基乙基)甲基-N′-2-(2-(2-(2-荧光素-5-甲酰氨 基-乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙脲(图15)和相应的6-荧光素衍生物(图16) 的化学合成。
化合物(图14)(18mg，0.01mmol)和5(6)-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(5mg，0.01mmol)溶解在800μL DMF和Et3N(1.6μL，0.01mmol)中，并且在31℃下加热过夜。在减压下蒸发所述溶剂，并且在C18柱上通过反相HPLC分离所述化合物(图15)和(图16)，使用水∶乙腈(95∶5-20∶80，用时20min，0.08％TFA)的线性梯度液洗脱。ESI-MS：m/z2108.93[M+H]+。
例15：
N-三(BG-PEG4-NH-羰基乙基)甲基-N′-2-(2-(2-(2-苯丁酸氮芥-甲酰 氨基-乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙脲(图17)的化学合成。
在室温下向溶解在DMF(3mL)中的苯丁酸氮芥(18mg，0.06mmol)溶液中添加PYBOP(31mg，0.06mmol)。在室温下搅拌该溶液20分钟。然后添加化合物(图14)(103mg，0.06mmol)和DIPEA(10μL，0.06mmol)，并且在50℃下加热所述溶液5分钟。在室温下搅拌该溶液过夜。然后在减压下除去所述溶剂，并且用150mL的EtOAc稀释该混合物。用水洗涤有机层，在MgSO4上干燥，并且在减压下蒸发。快速层析法(CH2Cl2/MeOH，10/15/1)得到了需要的化合物(图17)。ESI-MS：m/z 2050.99[M+H]+。
例16：
N-三(BG-PEG4-NH-羰基乙基)甲基-N′-2-(2-(2-(2-(6-马来酰亚氨 基-己酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙脲(图18)的化学合成。
在室温下向溶解在DMF(2mL)中的6-马来酰亚氨基己酸(10mg，0.046mmol)溶液中添加PYBOP(24mg，0.046mmol)。在室温下搅拌该溶液20分钟。然后添加化合物(图14)(80mg，0.046mmol)和DIPEA(7.7μL，0.046mmol)，并且在50℃下加热所述溶液5分钟。在室温下搅拌该溶液过夜。然后在减压下除去所述溶剂，并且用150mL的EtOAc稀释该混合物。用水洗涤有机层，在MgSO4上干燥，并且在减压下蒸发。快速层析法(CH2Cl2/MeOH，10/1→5/1)得到了需要的化合物(图18)。
ESI-MS：m/z 1959.99[M+H]+。
例17：
N-三(BG-PEG4-NH-羰基乙基)甲基-N′-2-(2-(2-(2-(6-马来酰亚氨 基己酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙脲siRNA共轭物(图19)的化 学合成。
通过在室温下与溶解在200μL Tris缓冲液pH 8.5中的200mM DTT一起培养1小时还原5’-硫醇修饰的寡核苷酸(43nmol)。通过凝胶过滤除去所述DTT，并且在PBS(pH 7.4)中洗脱所述寡核苷酸。合并浓度最大的级份，得到的总体积为800μL。添加300μL化合物(图18)溶液(2.5mM，溶解在DMF中)，并且在室温下培养所述反应混合物1小时。所述反应混合物用水稀释到总体积为2mL，并且通过凝胶过滤除去多余的马来酰亚胺。然后通过HPLC纯化所述siRNA共轭物(图19)(溶剂A：0.1M乙酸四乙铵pH 6.9，溶解在水中；溶剂B：乙腈)。
例18：
叠氮-PEG12-丙酸2-马来酰亚氨基乙酰胺(图20)的化学合成。
N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺三氟乙酸酯(343mg，1.35mmol)和叠氮-PEG12-丙酸NHS酯(1g，1.35mmol)溶解在5mL DMF和Et3N(188μL，1.35mmol)中，并且在31℃加热过夜。在减压下蒸发所述溶剂，并且在C18柱上通过反相HPLC分离产物，使用水∶乙腈(95∶5-20∶80，用时20min，0.08％TFA)的线性梯度液洗脱。ESI-MS：m/z 766.40[M+H]+。
例19：
叠氮-PEG12-丙酸2-马来酰亚氨基乙酰胺CoA-SH共轭物(图21)的化 学合成。
向溶解在DMF(2mL)中的马来酰亚胺衍生物(图20)(192mg，1eq，252μmol)的溶液中添加溶解在Tris缓冲液(pH 7.5，200μL)中的CoA-SH(248mg，1.2eq，304μmol)。所述反应混合物在31℃下振荡过夜。然后在真空下除去溶剂，并且通过制备型HPLC纯化粗制混合物。ESI-MS：m/z 1554.48[M-Na]-。
例20：
氨基-PEG12-丙酸2-马来酰亚氨基乙酰胺CoA-SH共轭物(图22)的化 学合成。
向溶解在二氧六环(3mL)中的化合物(图21)(204mg，0.13mmol)的溶液中添加水(450μL)。然后添加PMe3(800μL 1M，在THF中溶解，6eq)，并且在室温下搅拌该溶液2h。减压下除去所述溶剂。通过制备型HPLC纯化获得所述化合物。
ESI-MS：m/z 1527.48[M-Na]-。
例21：
N-三{2-(2-(2-(CoA-S-琥珀酰亚氨基)乙基氨基羰基-PEG12)乙 基氨基羰基)乙氧基甲基}甲基三氟乙酰胺(图23)的化学合成。
在室温下，溶解在DMF(1mL)中的图3化合物(21mg，0.05mmol，1eq)和图22化合物(232mg，0.15mmol，3eq)的溶液中，连续添加DIPEA(25μL，0.15mmol，3eq)，HOBT(1M，溶解在NMP中，150μL，0.3mmol，3eq)和DCC(31mg，0.15mmol，3eq)。所得到的混合物搅拌过夜。在减压下除去所述溶剂，并且通过制备型HPLC纯化获得所述化合物(图23)。ESI-MS：m/z 5010.4[M-Na]-。
例22：
N-三{2-(2-(2-(CoA-S-琥珀酰亚氨基)乙基氨基羰基-PEG12)乙 基氨基羰基)乙氧基甲基}甲胺(图24)的化学合成。
向溶解在EtOH(1.5mL)中的化合物(图21)(100mg，0.02mmol)的溶液中添加MeNH2溶液(3mL，30％，溶解在EtOH中)。相应的溶液在室温下搅拌过夜。蒸发所述溶剂，得到需要的化合物(图24)。不需要进一步纯化。ESI-MS：m/z 4914.4[M-Na]-。
例23：
N-三{2-(2-(2-(CoA-S-琥珀酰亚氨基)乙基氨基羰基-PEG12)乙 基氨基羰基)乙氧基甲基}甲基荧光素-5-甲酰胺(图25)和相应的荧光素 -6-甲酰胺(图26)的化学合成。
化合物(图24)(19mg，0.004mmol)和5(6)-羧基荧光素NHS酯(2mg，0.004mmol)溶解在600μL DMF和Et3N(0.6μL，0.004mmol)中，并且在31℃加热过夜。在减压下蒸发所述溶剂，并且在C18柱上通过反相HPLC分离所述化合物(图25)和(图26)，使用水∶乙腈(95∶5-20∶80，用时20min，0.08％TFA)的线性梯度液洗脱。ESI-MS：m/z5272.7[M-Na]-。
例24：
N-三{2-(2-(2-(CoA-S-琥珀酰亚氨基)乙基氨基羰基-PEG12)乙 基氨基羰基)乙氧基甲基}甲基苯丁酸氮芥-甲酰胺(图27)的化学合成。
在室温下向溶解在DMF(1mL)中的苯丁酸氮芥(1.8mg，0.006mmol)的溶液中添加PYBOP(3mg，0.006mmol)。在室温下搅拌该溶液20分钟。然后添加化合物(图24)(29mg，0.006mmol)和DIPEA(0.9μL，0.006mmol)，并且在50℃下加热所述溶液5min。然后在室温下搅拌该溶液过夜。在减压下除去所述溶剂。在C18柱上通过反相HPLC分离化合物(图27)，使用水∶乙腈(95∶5-20∶80，用时20min，0.08％TFA)的线性梯度液洗脱。
ESI-MS：m/z 5200.6[M-Na]-
例25：
N-三{2-(2-(2-(CoA-S-琥珀酰亚氨基)-乙基-氨基羰基-PEG12)乙基 氨基-羰基)乙氧基甲基}甲基6-马来酰亚氨基-己酰胺(图28)的化学合成。
在室温下向溶解在DMF(1mL)中的6-马来酰亚氨基-己酸(0.844mg，0.004mmol)的溶液中添加PYBOP(2.08mg，0.004mmol)。在室温下搅拌该溶液20分钟。然后添加化合物(图24)(19mg，0.004mmol)和DIPEA(0.66μL，0.004mmol)，并且在50℃下加热所述溶液5min。在室温下搅拌该溶液过夜。然后，在减压下除去所述溶剂。在C18柱上通过反相HPLC分离所述化合物，使用水∶乙腈(95∶5-20∶80，用时20min，0.08％TFA)的线性梯度液洗脱。ESI-MS：m/z 5107.7[M-Na]-。
例26：
N-三{2-(2-(2-(CoA-S-琥珀酰亚氨基)乙基氨基-羰基-PEG12)-乙基 氨基-羰基)乙氧基甲基}甲基6-马来酰亚氨基己酰胺siRNA共轭物(图29) 的化学合成。
通过在室温下与溶解在200μL Tris缓冲液pH 8.5中的200mM DTT一起培养1小时还原5’-硫醇修饰的寡核苷酸(43nmol)。通过凝胶过滤除去所述DTT，并且在PBS(pH 7.4)中洗脱所述寡核苷酸。合并浓度最大的级份，得到的总体积为800μL。添加300μL化合物(图28)溶液(2.5mM，溶解在DMF中)，并且在室温下培养所述反应混合物1小时。所述反应混合物用水稀释到总体积为2mL，并且通过凝胶过滤除去多余的马来酰亚胺。然后通过HPLC纯化所述共轭物(图29)(溶剂A：0.1M乙酸四乙铵pH 6.9，溶解在水中；溶剂B：乙腈)。
例27：
N-三{2-(2-(2-(CoA-S-琥珀酰亚氨基)乙基氨基羰基-PEG12)乙基氨 基羰基)乙氧基甲基}甲基-N’-2-(2-(2-(2-叠氮乙氧基)-乙氧基)乙氧基) 乙脲(图30)的化学合成。
在室温下向溶解在DMF(5mL)中的化合物(图12)(49mg，0.1mmol，1eq)和化合物(图22)(134mg，0.3mmol，3eq)的溶液中连续添加DIPEA(49μL，0.3mmol，3eq)，HOBT(1M，溶解在NMP中，0.3mL，0.3mmol，3eq)和DCC(62mg，0.3mmol，3eq)。所得到的混合物搅拌过夜。在减压下除去所述溶剂。在C18柱上通过反相HPLC分离所述化合物(图30)，使用水∶乙腈(95∶5-20∶80，用时20min，0.08％TFA)的线性梯度液洗脱。ESI-MS：m/z 5068.6[M-Na]-。
例28：
N-三{2-(2-(2-(CoA-S-琥珀酰亚氨基)乙基氨基羰基-PEG12)乙基氨 基羰基)乙氧基甲基}甲基-N’-2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)-乙氧基)乙氧基) 乙脲(图31)的化学合成。
向溶解在二氧六环(3mL)中的化合物(图30)(127mg，0.025mmol)的溶液中添加水(450μL)。然后添加PMe3(154μL的1M THF溶液，6eq)，并且在室温下搅拌该溶液2h。在减压下除去所述溶剂，并且在C18柱上通过HPLC分离获得所述化合物(图31)，使用水∶乙腈(95∶5-20∶80，用时20min，0.08％TFA)的线性梯度液洗脱。ESI-MS：m/z 5042.5[M-Na]-。
例29：
N-三{2-(2-(2-(CoA-S-琥珀酰亚氨基)乙基-氨基羰基-PEG12)乙基 氨基羰基)乙氧基甲基}甲基-N’-2-(2-(2-(2-荧光素-5-甲酰氨基乙氧基) 乙氧基)乙氧基)乙脲(图32)和相应的6-荧光素衍生物(图33)的化学合 成。
化合物(图31)(20mg，0.004mmol)和5(6)-羧基荧光素NHS酯(2mg，0.004mmol)溶解在600μL DMF和Et3N(0.6μL，0.004mmol)中，并且在31℃加热过夜。在减压下蒸发所述溶剂，并且在C18柱上通过反相HPLC分离所述化合物(图32)和(图33)，使用水∶乙腈(95∶5-20∶80，用时20min，0.08％TFA)的线性梯度液洗脱。ESI-MS：m/z5400.9[M-Na]-。
例30：
N-三{2-(2-(2-(CoA-S-琥珀酰亚氨基)乙基氨基羰基-PEG12)乙基氨 基羰基)乙氧基甲基}甲基-N’-2-(2-(2-(2-苯丁酸氮芥-甲酰氨基-乙氧基) 乙氧基)乙氧基)乙脲(图34)的化学合成。
在室温下向溶解在DMF(1mL)中的苯丁酸氮芥(2.1mg，0.007mmol)的溶液中添加PYBOP(3.5mg，0.007mmol)。在室温下搅拌该溶液20分钟。然后添加化合物(图31)(35mg，0.007mmol)和DIPEA(1.1μL，0.007mmol)，并且在50℃下加热所述溶液5分钟。在室温下搅拌该溶液过夜。然后，在减压下除去所述溶剂。在C18柱上通过反相HPLC分离化合物(图34)，使用水∶乙腈(95∶5-20∶80，用时20min，0.08％TFA)的线性梯度液洗脱。
ESI-MS：m/z 5327.8[M-Na]-。
例31：
N-三-{2-(2-(2-(CoA-S-琥珀酰亚氨基)乙基氨基羰基-PEG12)乙基 氨基羰基)乙氧基甲基}甲基-N’-2-(2-(2-(2-(6-马来酰亚氨基-己酰氨基) 乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙脲(图35)的化学合成。
在室温下向溶解在DMF(1mL)中的6-马来酰亚氨基-己酸(1mg，0.005mmol)的溶液中添加PYBOP(2.5mg，0.005mmol)。在室温下搅拌该溶液20分钟。然后添加化合物(图31)(24mg，0.005mmol)和DIPEA(0.8μL，0.005mmol)，并且在50℃下加热所述溶液5分钟。在室温下搅拌该溶液过夜。然后，在减压下除去所述溶剂。在C18柱上通过反相HPLC分离化合物(图35)，使用水∶乙腈(95∶5-20∶80，用时20min，0.08％TFA)的线性梯度液洗脱。ESI-MS：m/z 5235.7[M-Na]-。
例32：
N-三{2-(2-(2-(CoA-S-琥珀酰亚氨基)乙基氨基羰基-PEG12)乙基氨 基羰基)乙氧基甲基}甲基-N’-2-(2-(2-(2-(6-马来酰亚氨基-己酰氨基)乙 氧基)乙氧基)乙氧基)乙脲siRNA共轭物(图36)的化学合成。
通过在室温下与溶解在200μL Tris缓冲液pH 8.5中的200mM DTT一起培养1小时还原5’-硫醇修饰的寡核苷酸(43nmol)。通过凝胶过滤除去所述DTT，并且在PBS(pH 7.4)中洗脱所述寡核苷酸。合并浓度最大的级份，得到的总体积为800μL。添加300μL化合物(图35)溶液(2.5mM，溶解在DMF中)，并且在室温下培养所述反应混合物1小时。所述反应混合物用水稀释到总体积为2mL，并且通过凝胶过滤除去多余的马来酰亚胺。然后通过HPLC纯化所述共轭物(图36)(溶剂A：0.1M乙酸四乙铵pH 6.9，溶解在水中水；溶剂B：乙腈)。
例33：
5-荧光素-Lys-Fmoc-OH(图37)和6-荧光素-Lys-Fmoc-OH(图38) 的化学合成。
Fmoc-Lys-OH(184mg，0.5mmol)和5(6)-羧基荧光素NHS酯(237mg，0.5mmol)溶解在5mL的DMF和Et3N(70μL，0.5mmol)中，并且在31℃加热过夜。然后将粗制混合物倾注到水中(100mL)。用NaOH(1M)将水相碱化(pH＝9)。用乙酸乙酯洗涤水相。在用乙酸酸化水相时，形成了黄色沉淀物。通过过滤收集固体，以同分异构体的混合物的形式得到需要的化合物(图37)和(图38)。
ESI-MS：m/z 727.7[M+H]+。
例34：
5-荧光素-Lys-OH(图39)和6-荧光素-Lys-OH(图40)的化学合成。
在室温下向溶解在DMF(3mL)中的化合物混合物(图37)和(图38)(300mg，0.4mmol)的溶液中添加二乙胺(600μL)。在室温下搅拌该溶液3h。在减压下除去所述溶剂，所需化合物混合物(图39)和(图40)被直接用于下一个步骤。
ESI-MS：m/z 505.15[M+H]+。
例35：
N-5-荧光素-N’-苯丁酸氮芥-Lys-OH(图41)和N-6-荧光素-N’-苯丁酸 氮芥-Lys-OH(图42)的化学合成。
在室温下向溶解在DMF(3mL)中的苯丁酸氮芥(106mg，0.35mmol)的溶液中添加PYBOP(182mg，0.35mmol)。在室温下搅拌该溶液20分钟。然后添加同分异构体的混合物(图39)和(图40)(176mg，0.35mmol)和DIPEA(58μL，0.35mmol)，并且在50℃下加热所述溶液5min。在室温下搅拌该溶液过夜。然后将粗制混合物倾注到水(60mL)上。用NaOH(1M)将水相碱化(pH＝9)。用乙酸乙酯洗涤水相。在用乙酸酸化水相时，形成了黄色沉淀物。通过过滤收集固体，以同分异构体的混合物的形式得到需要的化合物(图41)和(图42)。
ESI-MS：m/z 789.23[M+H]+.
例36：
N-三(BG-PEG4-NH-羰基乙氧基甲基)-甲基N’-5-荧光素-N”-苯丁酸 氮芥-Lys-酰胺(图43)和相应的6-荧光素衍生物(图44)的化学合成。
在室温下向溶解在DMF(2mL)中的同分异构体的混合物(图41)和(图42)(15mg，0.02mmol)的溶液中添加PYBOP(10mg，0.02mmol)。在室温下搅拌该溶液20分钟。然后添加化合物(图5)(32mg，0.02mmol)和DIPEA(3.3μL，0.02mmol)，并且在50℃下加热所述溶液5min。在室温下搅拌该溶液过夜。将所述溶液倾注到水上，过滤沉淀物并且用水洗涤。需要的化合物(图43)和(图44)是作为固体获得的。ESI-MS：m/z 2393.01[M+H]+。
例37：
N-5-荧光素-N’-6-马来酰亚氨基己酰-Lys-OH(图45)和N-6-荧光素 -N’-6-马来酰亚氨基己酰-Lys-OH(图46)的化学合成。
在室温下向溶解在DMF(3mL)中的6-马来酰亚氨基-己酸(66mg，0.31mmol)的溶液中添加PYBOP(161mg，0.31mmol)。在室温下搅拌该溶液20分钟。然后添加(图39)和(图40)化合物的混合物(156mg，0.31mmol)和DIPEA(51μL，0.31mmol)，并且在50℃下加热该溶液5min。在室温下搅拌该溶液过夜。然后将粗制混合物倾注到水上(60mL)。用NaOH(1M)将水相碱化(pH＝9)。用乙酸乙酯洗涤水相。在用乙酸酸化水相时，形成了黄色沉淀物。通过过滤收集固体，以同分异构体的混合物的形式得到需要的化合物(图45)和(图46)。ESI-MS：m/z 699.23[M+H]+。
例38：
N-三(BG-PEG4-NH-羰基乙氧基甲基)甲基N’-5-荧光素-N”-6-马来 酰亚氨基己酰-Lys-酰胺(图47)和相应的6-荧光素衍生物(图48)的化 学合成。
在室温下向溶解在DMF(2mL)中的同分异构体的混合物(图45)和(图46)(9mg，0.013mmol)的溶液中添加PYBOP(6.5mg，0.013mmol)。在室温下搅拌该溶液20分钟。然后添加化合物(图5)(21mg，0.013mmol)和DIPEA(2.1μL，0.013mmol)，并且在50℃下加热所述溶液5min。在室温下搅拌该溶液过夜。将所述溶液倾注到水上，过滤沉淀物并且用水洗涤。需要的化合物为固体同分异构体的混合物(图47)和(图48)。
ESI-MS：m/z 2302.01[M+H]+。
例39：
N-三(BG-PEG4-NH-羰基乙氧基甲基)甲基N’-5-荧光素-N”-6-马来 酰亚氨基己酰-Lys-酰胺siRNA共轭物(图49)和相应的6-荧光素衍生物 (图50)的化学合成。
通过在室温下与溶解在200μL Tris缓冲液pH 8.5中的200mM DTT一起培养1小时还原5’-硫醇修饰的寡核苷酸(43nmol)。通过凝胶过滤除去所述DTT，并且在PBS(pH 7.4)中洗脱所述寡核苷酸。合并浓度最大的级份，得到的总体积为800μL。添加300μL同分异构体的混合物(图47)和(图48)溶液(2.5mM，溶解在DMF中)，并且，所述反应混合物在室温下培养1小时。所述反应混合物用水稀释到总体积为2mL，并且通过凝胶过滤除去多余的马来酰亚胺。然后通过HPLC纯化共轭物的混合物(图49)和(图50)(溶剂A：0.1M乙酸四乙铵pH 6.9，溶解在水中；溶剂B：乙腈)。
例40：
N-三(BG-PEG4-NH-羰基乙氧基甲基)甲基N’-2-(2-(2-(2-(N”-5- 荧光素-N”’-苯丁酸氮芥-Lys-酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-乙脲(图51)和相应的6-荧光素衍生物(图52)的化学合成。
在室温下向溶解在DMF(3mL)中的同分异构体的混合物(图41)和(图42)(19mg，0.024mmol)的溶液中添加PYBOP(13mg，0.024mmol)。在室温下搅拌该溶液20分钟。然后添加化合物(图14)(42mg，0.024mmol)和DIPEA(4μL，0.024mmol)，并且在50℃下加热所述溶液5min。在室温下搅拌该溶液过夜。将所述溶液倾注到水上，过滤沉淀物并且用水洗涤。需要的化合物以同分异构体的混合物的形式获得(图51)和(图52)。
ESI-MS：m/z 2521.10[M+H]+。
例41：
N-三(BG-PEG4-NH-羰基乙氧基甲基)甲基N’-2-(2-(2-(2-(N”-5- 荧光素-N”’-6-马来酰亚胺己酰-Lys-酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙 脲(图53)和相应的6-荧光素衍生物(图54)的化学合成。
在室温下向溶解在DMF(3mL)中的同分异构体的混合物(图45)和(图46)(21mg，0.03mmol)的溶液中添加PYBOP(16mg，0.03mmol)。在室温下搅拌该溶液20分钟。然后添加化合物(图14)(53mg，0.03mmol)和DIPEA(5μL，0.03mmol)，并且在50℃下加热所述溶液5min。在室温下搅拌该溶液过夜。将所述溶液倾注到水上，过滤沉淀物并且用水洗涤。需要的化合物以同分异构体的混合物的形式获得(图53)和(图54)。
ESI-MS：m/z 2430.10[M+H]+。
例42：
N-三(BG-PEG4-NH-羰基乙氧基甲基)甲基N’-2-(2-(2-(2-(N”-5- 荧光素-N”’-6-马来酰亚氨基己酰-Lys-酰氨基)乙氧基)乙氧基)-乙氧基) 乙脲siRNA共轭物(图55)和相应的6-荧光素衍生物(图56)的化学合 成。
通过在室温下与溶解在200μL Tris缓冲液pH 8.5中的200mM DTT一起培养1小时还原5’-硫醇修饰的寡核苷酸(43nmol)。通过凝胶过滤除去所述DTT，并且在PBS(pH 7.4)中洗脱所述寡核苷酸。合并浓度最大的级份，得到的总体积为800μL。添加300μL同分异构体(图53)和(图54)的混合物溶液(2.5mM，溶解在DMF中)，并且在室温下培养所述反应混合物1小时。所述反应混合物用水稀释到总体积为2mL，并且通过凝胶过滤除去多余的马来酰亚胺。然后通过HPLC纯化共轭物的混合物(图55)和(图56)(溶剂A：0.1M乙酸四乙铵pH 6.9，溶解在水中；溶剂B：乙腈)。
例43：
N-三{2-(2-(2-(CoA-S-琥珀酰亚氨基)乙基氨基羰基-PEG12)乙 基氨基羰基)乙氧基甲基}-甲基N’-5-荧光素-N”-苯丁酸氮芥-Lys-酰胺 (图57)和相应的6-荧光素衍生物(图58)的化学合成。
在室温下向溶解在DMF(2mL)中的同分异构体(图41)和(图42)的混合物(12mg，0.015mmol)的溶液中添加PYBOP(8mg，0.015mmol)。在室温下搅拌该溶液20分钟。然后添加化合物(图24)(73mg，0.015mmol)和DIPEA(2.5μL，0.015mmol)，并且在50℃下加热所述溶液5min。在室温下搅拌该溶液过夜。在减压下除去所述溶剂，并且所述化合物是通过制备型HPLC纯化作为同分异构体的混合物获得的(图57)和(图58)。
ESI-MS：m/z 5686.1[M-Na]-。
例44：
N-三{2-(2-(2-(CoA-S-琥珀酰亚氨基)乙基氨基羰基-PEG12)乙 基氨基羰基)乙氧基甲基}甲基N’-5-荧光素-N”-6-马来酰亚氨基己酰 -Lys-酰胺(图59)和相应的6-荧光素衍生物(图60)的化学合成。
在室温下向溶解在DMF(2mL)中的同分异构体(图45)和(图46)的混合物(7mg，0.01mmol)的溶液中添加PYBOP(5mg，0.01mmol)。在室温下搅拌该溶液20分钟。然后添加化合物(图24)(50mg，0.01mmol)和DIPEA(1.65μL，0.01mmol)，并且在50℃下加热所述溶液5min。在室温下搅拌该溶液过夜。在减压下除去所述溶剂，所述化合物通过制备型HPLC纯化，作为同分异构体的混合物获得(图59)和(图60)。
ESI-MS：m/z 5594.1[M-Na]-。
例45：
N-三{2-(2-(2-(CoA-S-琥珀酰亚氨基)乙基氨基羰基-PEG12)乙 基氨基羰基)乙氧基甲基}甲基N’-5-荧光素-N”-6-马来酰亚氨基己酰 -Lys-酰胺siRNA共轭物(图61)和相应的6-荧光素衍生物(图62)的化 学合成。
通过在室温下与溶解在200μL Tris缓冲液pH 8.5中的200mM DTT一起培养1小时还原5’-硫醇修饰的寡核苷酸(43nmol)。通过凝胶过滤除去所述DTT，并且在PBS(pH 7.4)中洗脱所述寡核苷酸。合并浓度最大的级份，得到的总体积为800μL。添加300μL同分异构体(图59)和(图60)的混合物的溶液(2.5mM，溶解在DMF中)，并且在室温下培养所述反应混合物1小时。所述反应混合物用水稀释到总体积为2mL，并且通过凝胶过滤除去多余的马来酰亚胺。然后通过HPLC纯化共轭物的混合物(图61)和(图62)(溶剂A：0.1M乙酸四乙铵pH 6.9，溶解在水中；溶剂B：乙腈)。
例46：
N-三{2-(2-(2-(CoA-S-琥珀酰亚氨基)乙基氨基羰基-PEG12)乙 基氨基羰基)乙氧基甲基}甲基N’-2-(2-(2-(2-(N”-5-荧光素-N”’- 苯丁酸氮芥-Lys-酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙脲(图63)和相 应的6-荧光素衍生物(图64)的化学合成。
在室温下向溶解在DMF(1mL)中的同分异构体(图41)和(图42)的混合物(5mg，0.006mmol)的溶液中添加PYBOP(3mg，0.006mmol)。在室温下搅拌该溶液20分钟。然后添加化合物(图31)(30mg，0.006mmol)和DIPEA(1μL，0.006mmol)，并且在50℃下加热所述溶液5min。在室温下搅拌该溶液过夜。在减压下除去所述溶剂，所述化合物是通过制备型HPLC纯化作为同分异构体的混合物获得的(图63)和(图64)。
ESI-MS：m/z 5814.9[M-Na]-。
例47：
N-三{2-(2-(2-(CoA-S-琥珀酰亚氨基)乙基氨基羰基-PEG12)乙 基氨基羰基)乙氧基甲基}甲基N’-2-(2-(2-(2-(N”-5-荧光素-N”’-6- 马来酰亚氨基己酰-Lys-酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙脲(图65) 和相应的6-荧光素衍生物(图66)的化学合成。
在室温下向溶解在DMF(2mL)中的同分异构体(图45)和(图46)的混合物(14mg，0.02mmol)的溶液中添加PYBOP(10mg，0.02mmol)。在室温下搅拌该溶液20分钟。然后添加化合物(图31)(100mg，0.02mmol)和DIPEA(3.3μL，0.02mmol)，并且在50℃下加热所述溶液5min。在室温下搅拌该溶液过夜。在减压下除去所述溶剂，所述化合物是通过制备型HPLC纯化作为同分异构体的混合物获得的(图65)和(图66)。
ESI-MS：m/z 5722.2[M-Na]-。
例48：
N-三{2-(2-(2-(CoA-S-琥珀酰亚氨基)乙基氨基羰基-PEG12)乙 基氨基羰基)乙氧基甲基}甲基N’-2-(2-(2-(2-(N”-5-荧光素-N”’-6- 马来酰亚氨基己酰-Lys-酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙脲siRNA共 轭物(图67)和相应的6-荧光素衍生物(图68)的化学合成。
通过在室温下与溶解在200μL Tris缓冲液pH 8.5中的200mM DTT一起培养1小时还原5’-硫醇修饰的寡核苷酸(43nmol)。通过凝胶过滤除去所述DTT，并且在PBS(pH 7.4)中洗脱所述寡核苷酸。合并浓度最大的级份，得到的总体积为800μL。添加300μL同分异构体(图65)和(图66)的混合物溶液(2.5mM，溶解在DMF中)，并且在室温下培养所述反应混合物1小时。所述反应混合物用水稀释到总体积为2mL，并且通过凝胶过滤除去多余的马来酰亚胺。然后通过HPLC纯化共轭物(图67)和(图68)的混合物(溶剂A：0.1M乙酸四乙铵pH 6.9，溶解在水中；溶剂B：乙腈)。
例49：
2-苯二甲酰亚氨基-N-(BG-PEG4)-琥珀酸单酰胺(图69)的化学合 成。
在室温下向溶解在(15mL)中的BG-PEG4-NH2(620mg，1.3mmol，1eq)的溶液中添加2-苯二甲酰亚氨基-琥珀酸酐(340mg，1.39mmol，1eq)。反应混合物在室温下搅拌4h，然后将粗制混合物注入水(225mL)中。用NaOH(1M)将水相的pH调节到8，并且使沉淀物消失。用EtOAc洗涤水相(2次，100mL)。然后将pH调节到4，并且收集沉淀物。ESI-MS：m/z 692.69[M+H]+。
例50：
N-4-((4-氨基嘧啶-2-基氧基)甲基)苄基-N’-2-(2-(2-(2-叠氮 乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙脲(图70)的化学合成。
向溶解在DMF(3mL)中的11-叠氮-3，6，9-三氧杂十一-1-胺(73μL，1eq，0.37mmol)的溶液中添加CDI(60mg，1eq，0.37mmol)。该溶液在室温下搅拌过夜。向该溶液中添加BC-NH2(85mg，1eq，0.37mmol)，并且该混合物在65℃下加热3h。然后将粗制混合物倾注到水上，并且用乙酸乙酯萃取，有机相在MgSO4上干燥，减压下蒸发得到需要的化合物。不需要进一步纯化。
TLC(CH2Cl2/MeOH 10∶1)。ESI-MS：m/z 475.51[M+H]+。
例51：
N-4-((4-氨基嘧啶-2-基氧基)甲基)苄基-N’-2-(2-(2-(2-氨基 乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙脲(图71)的化学合成。
向溶解在二氧六环(3mL)中的化合物(图70)(54mg，0.12mmol)的溶液中添加水(360μL)。然后添加PMe3(720μL 1M，在THF中溶解，6eq)，并且在室温下搅拌该溶液2h。在减压下除去所述溶剂，并且通过制备型HPLC纯化获得所述化合物(图71)。ESI-MS：m/z 449.52[M+H]+。
例52：
化学合成N-4-((4-氨基嘧啶-2-基氧基)甲基)苄基-N’-2-(2-(2- (2-(3-BG-PEG4-NH-羰基-2-苯二甲酰亚氨基-丙酰基氨基乙氧基)乙氧 基)-乙氧基)乙脲(图72)。
在室温下向溶解在DMF(2mL)中的化合物(图71)(45mg，0.1mmol，1eq)和化合物(图69)(69mg，0.1mmol，1eq)的溶液中连续添加DIPEA(17μL，0.1mmol，1eq)，HOBT(1M，溶解在NMP中，0.1mL，0.1mmol，1eq)和DCC(21mg，1mmol，1eq)。所得到的混合物搅拌过夜。然后在减压下除去所述溶剂，并且用50mL EtOAc稀释所述混合物。用水洗涤有机层，在MgSO4上干燥，并且在减压下蒸发。以快速层析法(CH2Cl2/MeOH，10/1→5/1)得到了需要的化合物(图72)。
ESI-MS：m/z 1123.19[M+H]+。
例53：
N-4-((4-氨基嘧啶-2-基氧基)甲基)苄基-N’-2-(2-(2-(2- (3-BG-PEG4-NH-羰基-2-氨基-丙酰基氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙脲 (图73)的化学合成。
向溶解在EtOH(3mL)中的化合物(图72)(45mg，0.04mmol)的溶液中添加甲胺(300μl)，并且在室温下搅拌该溶液12h。在减压下除去所述溶剂，通过制备型HPLC纯化获得化合物(图73)。ESI-MS：m/z 993.09[M+H]+。
例54：
N-4-((4-氨基嘧啶-2-基氧基)甲基)苄基-N’-2-(2-(2-(2- (3-BG-PEG4-NH-羰基-2-(荧光素-5-甲酰氨基)丙酰基氨基-乙氧基)乙 氧基)乙氧基)乙脲(图74)和相应的荧光素-6-甲酰胺(图75)的化学 合成。
化合物(图73)(9mg，0.009mmol)和5(6)-羧基荧光素NHS酯(4mg，0.009mmol)溶解在800μL DMF和Et3N(1.35μL，0.009mmol)中，并且在31℃加热过夜。在减压下蒸发所述溶剂，并且在C18柱上通过反相HPLC分离所述化合物(图74)和(图75)，使用水∶乙腈(95∶5-20∶80，用时20min，0.08％TFA)的线性梯度液洗脱。
ESI-MS：m/z 1351.39[M+H]+。
例55：
N-4-((4-氨基嘧啶-2-基氧基)甲基)苄基-N’-2-(2-(2-(2- (3-BG-PEG4-NH-羰基-2-(6-马来酰亚氨基己酰基氨基)丙酰基-氨基- 乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙脲(图76)的化学合成。
在室温下向溶解在DMF(1mL)中的6-马来酰亚氨基-己酸(4.4mg，0.02mmol)的溶液中添加PYBOP(10mg，0.02mmol)。在室温下搅拌该溶液20分钟。然后添加化合物(图73)(20mg，0.02mmol)和DIPEA(3.3μL，0.02mmol)，并且在50℃下加热所述溶液5min。在室温下搅拌该溶液过夜。然后在减压下除去所述溶剂，并且用150mL EtOAc洗脱所述混合物。用水洗涤有机层，在MgSO4上干燥，并且在减压下蒸发。快速层析法(CH2Cl2/MeOH，10/1 5/1)得到了需要的化合物(图76)。ESI-MS：m/z 1186.29[M+H]+。
例56：
化学合成N-4-((4-氨基嘧啶-2-基氧基)甲基)苄基-N’-2-(2-(2- (2-(3-BG-PEG4-NH-羰基-2-(6-马来酰亚氨基己酰基氨基)丙酰基氨基 -乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙脲siRNA共轭物(图77)。
通过在室温下与溶解在200μL Tris缓冲液pH 8.5中的200mM DTT一起培养1小时还原5’-硫醇修饰的寡核苷酸(43nmol)。通过凝胶过滤除去所述DTT，并且在PBS(pH 7.4)中洗脱所述寡核苷酸。合并浓度最大的级份，得到的总体积为800μL。添加300μL化合物(图76)溶液(2.5mM，溶解在DMF中)，并且将所述反应混合物在室温下培养1小时。所述反应混合物用水稀释到总体积为2mL，并且通过凝胶过滤除去多余的马来酰亚胺。然后通过HPLC纯化所述共轭物(图77)(溶剂A：0.1M乙酸四乙铵pH 6.9，溶解在水中；溶剂B：乙腈)。
例57：
化学合成N-4-((4-氨基嘧啶-2-基氧基)甲基)苄基-N’-2-(2-(2- (2-(3-BG-PEG4-NH-羰基-2-苯丁酸氮芥羧氨基-丙酰基氨基乙氧基)乙 氧基)乙氧基)乙脲(图78)。
在室温下向溶解在DMF(1mL)中的苯丁酸氮芥(6mg，0.02mmol)的溶液中添加PYBOP(10mg，0.02mmol)。在室温下搅拌该溶液20分钟。然后添加化合物(图73)(20mg，0.02mmol)和DIPEA(3.3μL，0.02mmol)，并且在50℃下加热所述溶液5min。在室温下搅拌该溶液过夜。然后在减压下除去所述溶剂，并且用150mL的EtOAc稀释该混合物。用水洗涤有机层，在MgSO4上干燥，并且在减压下蒸发。以快速层析法(CH2Cl2/MeOH，10/1 5/1)得到了需要的化合物(图78)。
ESI-MS：m/z 1276.56[M+H]+。
例58：
BG-PEG12-NHFmoc(图79)的化学合成。
在室温下向溶解在DMF(2mL)中的Fmoc-酰氨基-PEG12-酸(1g，1.19mmol)的溶液中添加PYBOP(619mg，1.19mmol)。在室温下搅拌该溶液20分钟。然后添加O6-氨甲基苄基鸟嘌呤(320mg，1.19mmol)和DIPEA(196μL，1.19mmol)，并且在50℃下加热所述溶液5min。然后在室温下搅拌该溶液过夜。粗制混合物倾注在***上。收集沉淀物，并且用***洗涤。将得到的固体溶解在MeOH中，并且将所述溶剂浓缩至干燥。不需要进一步纯化。MS(ESI)m/z 1093[M+H]+。
例59：
BG-PEG12-NH 2 (图80)的化学合成。
在室温下向溶解在二氧六环(10mL)中的化合物(图79)(1.5g，1.72mmol)的溶液中添加二乙胺(2.5mL)。在室温下搅拌该溶液3h。然后，在减压下除去所述溶剂。粗制混合物溶解在DMF(1.5mL)中，并且注入到***(10mL)中。收集得到的沉淀物。不需要进一步纯化。MS(ESI)m/z 871[M+H]+.
例60：
三{[2-羧基乙氧基]甲基}甲胺(图81)的化学合成。
三{[2-叔-丁氧基羰基]乙氧基}甲基}甲胺(图1)(4.3g，8mmol)在80mL的96％甲酸中搅拌18小时。然后在减压下在50℃下除去甲酸，以定量方式生成无色油状物。1H NMR((CD3)2SO，400MHz)：8.2(m，2H)，7.45(m，3H)，3.6(m，6H)，3.4(m，6H)，2.45(m，6H)。
例61：
N-三[(2-羧基乙氧基)甲基]甲基7-(二乙基氨基)香豆素-3-甲酰 胺(图82)的化学合成。
化合物(图81)(66mg，0.195mmol)和7-(二乙基氨基)香豆素-3-羧酸N-琥珀酰亚胺酯(70mg，0.195mmol)溶解在2mL的DMF和Et3N(28μL，0.195mmol)中，并且在40℃下加热过夜。在减压下蒸发所述溶剂，并且在C18柱上通过反相HPLC分离所述化合物(图82)，使用水∶乙腈(95∶5-20∶80，用时20min，0.08％TFA)的线性梯度液洗脱。MS(ESI)m/z 581[M+H]+。
例62：
N-三{[2-(叔丁氧基羰基)乙氧基]甲基}甲基ATTO-495-甲酰胺(图83)的化学合成。
三{[2-(叔-丁氧基羰基)乙氧基]甲基}甲胺(图1)(4.8mg，9.45μmol)和ATTO-495N-琥珀酰亚胺酯(5.2mg，9.45μmol)溶解在2mL DMF和Et3N(1.3μL，9.45μmol)，并且在40℃下加热过夜。在减压下蒸发所述溶剂，并且在C18柱上通过反相HPLC分离所述化合物(图83)，使用水∶乙腈(95∶5-20∶80，用时20min，0.08％TFA)的线性梯度液洗脱。MS(ESI)m/z 841[M+H]+。
例63：
N-三[(2-羧基乙氧基)甲基]甲基ATTO-495-甲酰胺(图84)的化 学合成。
化合物(图83)(210mg，0.25mmol)在250μL的96％甲酸中搅拌18h。然后在减压下在5℃下除去甲酸，以定量方式生成无色油状物。MS(ESI)m/z 672[M+H]+。
例64：
N-三{[2-(叔-丁氧基羰基)乙氧基]甲基}甲基尼罗红-氧乙酰胺(图 85)的化学合成。
向溶解在DMF(50mL)中的尼罗红-氧乙酸(9-二乙基氨基-5-氧代-苯并[a]吩噁嗪-2-氧乙酸，100mg，0.255mmol，1eq)的溶液中连续添加DCC(160mg，0.765mmol，3eq)和NHS(90mg，0.765mmol，3eq)。所得到的混合物搅拌过夜。然后通过离心除去DCU盐。在室温下向该溶液中添加化合物(图1)(130mg，0.255mmol，1eq)和DIPEA(42μL，0.255mmol，1eq)。所得到的混合物搅拌过夜。在减压下除去溶剂。快速层析法(CH2Cl2/MeOH，10/1→5/1)得到了需要的化合物(图85)。MS(ESI)m/z 881[M+H]+。
例65：
N-三[(2-羧基乙氧基)甲基]甲基尼罗红-氧乙酰胺(图86)的化学 合成。
化合物(图85)(70mg，0.08mmol)在250μL的96％甲酸中搅拌18h。然后在减压下在50℃下除去甲酸，以定量方式生成无色油状物。MS(ESI)m/z 712[M+H]+。
例66：
N-三{[2-(叔-丁氧基羰基)乙氧基]甲基}甲基5-马来酰亚氨基戊烷甲酰 胺(图87)的化学合成。
在室温下向溶解在DMF(5mL)中的6-马来酰亚氨基-己酸(106mg，0.5mmol)溶液中添加PYBOP(260mg，0.5mmol)。在室温下搅拌该溶液20分钟。然后添加化合物(图1)(253mg，0.5mmol)和DIPEA(83μL，0.5mmol)，并且在50℃下加热所述溶液5min。在室温下搅拌该溶液过夜。然后在减压下除去所述溶剂。以快速层析法(环己烷/乙酸乙酯，1/1)得到了需要的化合物(图87)。1H NMR((CD3)2SO，400MHz)：6.7(s，2H)，3.7(s，6H)，3.65(m，6H)，3.5(m，2H)，2.45(m，6H)，2.1(m，2H)，1.6(m，4H)，1.45(m，27H)，1.35(m，2H)。
例67：
N-三[(2-羧基乙氧基)甲基]甲基5-马来酰亚氨基-戊烷甲酰胺(图 88)的化学合成。
化合物(图87)(214mg，0.305mmol)在3mL的96％甲酸中搅拌18h。然后在减压下在50℃下除去甲酸，以定量方式生成无色油状物。所述化合物被直接用于下一个步骤。
例68：
N-三-{[2-(BG-PEG12-NH)-羰基乙氧基]甲基}甲基7-(二乙基氨基) 香豆素-3-甲酰胺(图89)的化学合成。
在室温下向溶解在DMF(1mL)中的N-三[(2-羧基乙氧基)甲基]甲基7-(二乙基氨基)-香豆素-3-甲酰胺(图82)(10mg，0.018mmol)和BG-PEG12-NH2(图80)(54mg，0.062mmol，3.6eq)的溶液中连续添加DIPEA(8μL，0.062mmol，3.6eq)，HOBT(1M，溶解在NMP中，18μL，0.018mmol，1eq)和EDC(12mg，0.062mmol，3.6eq)。所得到的混合物搅拌过夜。在减压下蒸发所述溶剂，并且在C18柱上通过反相HPLC分离所述化合物(图89)，使用水∶乙腈(95∶5-20∶80，用时20min，0.08％TFA)的线性梯度洗脱。所述化合物(图89)启动蛋白三聚体形成的构造能力，通过使用实施例76所述融合蛋白SNAP-FKBP进行体外实验得到证实。通过SDS-PACE证实了蛋白三聚体的形成，然后对蛋白进行考马斯染色。
例69：
N-三-{[2-(BG-PEG12-NH)-羰基乙氧基]甲基}-甲基ATTO-495-甲酰胺 (图90)的化学合成。
在室温下向溶解在DMF(1mL)中的N-三[(2-羧基乙氧基)甲基]甲基ATTO-495-甲酰胺(图84)(4mg，0.005mmol)和BG-PEG12-NH2(图80)(15mg，0.0175mmol，3.6eq)的溶液中连续添加DIPEA(3μL，0.0175mmol，3.6eq)，HOBT(1M，溶解在NMP中，5μL，0.005mmol，1eq)和EDC(4mg，0.0175mmol，3.6eq)。所得到的混合物搅拌过夜。在减压下蒸发所述溶剂，并且在C18柱上通过反相HPLC分离所述化合物(图90)，使用水∶乙腈(95∶5-20∶80，用时20min，0.08％TFA)的线性梯度液洗脱。所述化合物(图90)启动蛋白三聚体形成的构造能力，通过使用实施例76所述融合蛋白SNAP-FKBP的体外实验得到证实。
例70：
N-三-{[2-(BG-PEG12-NH)-羰基乙氧基]甲基}-甲基尼罗红-氧乙酰胺(图 91)的化学合成。
在室温下向溶解在DMF(1mL)中的N-三[(2-羧基乙氧基)甲基]甲基尼罗红-氧乙酰胺(图86)(8mg，0.011mmol)和BG-PEG12-NH2(图80)(34mg，0.039mmol，3.6eq)的溶液中连续添加DIPEA(7μL，0.039mmol，3.6eq)，HOBT(1M，溶解在NMP中，11μL，0.01mmol，1eq)和EDC(8mg，0.039mmol，3.6eq)。所得到的混合物搅拌过夜。在减压下蒸发所述溶剂，并且在C18柱上通过反相HPLC分离所述化合物(图91)，使用水∶乙腈(95∶5-20∶80，用时20min，0.08％TFA)的线性梯度液洗脱。所述化合物(图91)启动蛋白三聚体形成的构造能力，通过使用例76所述融合蛋白SNAP-FKBP的体外实验得到证实。
例71：
N-三-{[2-(BG-PEG12-NH)-羰基乙氧基]甲基}-甲基5-马来酰亚氨基戊 烷甲酰胺(图92)的化学合成。
在室温下向溶解在DMF(1mL)中的N-三[(2-羧基乙氧基)甲基]甲基5-马来酰亚氨基戊烷甲酰胺(图88)(8mg，0.016mmol)和BG-PEG12-NH2(图80)(50mg，0.057mmol，3.6eq)的溶液中连续添加DIPEA(10μL，0.057mmol，3.6eq)，HOBT(1M，溶解在NMP中，16μL，0.016mmol，1eq)和EDC(2mg，0.057mmol，3.6eq)。所得到的混合物搅拌过夜。在减压下蒸发所述溶剂，并且在C18柱上通过反相HPLC分离所述化合物(图92)，使用水∶乙腈(95∶5-20∶80，用时20min，0.08％TFA)的线性梯度液洗脱。所述化合物(图92)启动蛋白三聚体形成的构造能力，通过使用实施例76所述融合蛋白SNAP-FKBP的体外实验得到证实。
例72：
3-[2-(2-马来酰亚氨基乙基)二磺酰基]丙酸(图93)的化学合成。
将溶解在乙酸/甲苯混合物(3/1，3mL)中的3-[2-(2-氨基乙基)二磺酰基]丙酸(250mg，1.38mmol)和马来酐(272mg，2.76mmol)的溶液在120℃下加热过夜。然后将粗制混合物冷却到室温，并且在冰浴中进一步冷却到0℃。添加戊烷(50mL)，并且形成沉淀物。将***添加该沉淀物中，并且除去所形成的白色固体。在真空下浓缩***溶液，得到产物(图93)。不需要进一步纯化。1H NMR((CD3)2SO，400MHz)：7.4(s，1H)，6.7(s，2H)，3.7(m，2H)，2.9(m，4H)，2.6(m，2H)。
例73：
N-三{[2-(叔-丁氧基羰基)乙氧基]甲基}甲基3-[2-(2-马来酰亚氨基乙 基)二磺酰基]丙酰胺(图94)的化学合成。
在室温下向溶解在DMF(2mL)中的3-[2-(2-马来酰亚氨基乙基)二磺酰基]丙酸(图93)(188mg，0.72mmol)的溶液中添加PYBOP(376mg，0.72mmol)。在室温下搅拌该溶液20分钟。然后添加三{[2-叔-丁氧基羰基]乙氧基}甲基}甲胺(图1)(364mg，0.72mmol)和DIPEA(119μL，0.72mmol)，并且在50℃下加热所述溶液5min。在室温下搅拌该溶液过夜。然后在减压下除去所述溶剂。以快速层析法(环己烷/乙酸乙酯，2/1)得到了需要的化合物(图94)。1H NMR((CD3)2SO，400MHz)：6.6(s，2H)，3.8(m，2H)，3.6(m，6H)，3.55(m，6H)，2.8(m，4H)，2.5(m，2H)，2.35(m，6H)，1.4(m，27H)。
例74：
N-三[(2-羧基乙氧基)甲基]甲基3-[2-(2-马来酰亚氨基乙基)二磺酰 基]丙酰胺(图95)的化学合成。
化合物(图94)(112mg，0.15mmol)在1.5mL的96％甲酸中搅拌18小时。然后在减压下在50℃下除去甲酸，以定量方式生成无色油状物。所述化合物直接用于下一个步骤。1H NMR((CD3)2SO，400MHz)：7.0(s，2H)，3.7(m，2H)，3.55(m，12H)，2.75(m，4H)，2.45(m，6H)。
例75：
N-三-{[2-(BG-PEG12-NH)-羰基乙氧基]甲基}-甲基-3-[2-(2-马来酰亚 氨基乙基)二磺酰基]丙酰胺(图96)的化学合成。
在室温下向溶解在DMF(1mL)中的化合物(图95)(10mg，0.017mmol)和BG-PEG12-NH2(图80)(120mg，0.138mmol，8eq)的溶液中连续添加DIPEA(17μL，0.069mmol，4eq)，HOBT(1M，溶解在NMP中，17μL，0.017mmol，1eq)和EDC(14mg，0.069mmol，4eq)。所得到的混合物搅拌过夜。在减压下蒸发所述溶剂，并且在C18柱上通过反相HPLC分离所述化合物(图96)，使用水∶乙腈(95∶5-20∶80，用时20min，0.08％TFA)的线性梯度液洗脱。所述化合物(图96)启动蛋白三聚体形成的构造能力，通过使用实施例76所述融合蛋白SNAP-FKBP的体外实验得到证实。
例76：
用FKBP-AGT融合蛋白确定化合物(图89)，(图90)，(图91)， (图92)和(图96)的反应性
将1μL与从Covalys公司以SNAP26TM商品名买到的AGT变体融合的FKBP蛋白的591μM溶液和1μL 100μM化合物(图89)，(图90)，(图91)，(图92)或(图96)的溶液添加到8μL的50mM Tris-HCl，pH 7.5；100mM NaCl；0.1％Tween20TM；1mM DTT溶液中。然后在室温下培养4小时之后，添加15μL的100mM Tris-HCl pH 6.8；2％SDS；35％甘油；10mM EDTA；20mM DTT溶液，在95℃下将该混合物煮沸5分钟。在冷却到室温之后，将25μL的该溶液加样到4-20％线性梯度SDS-PAGE凝胶上。电泳之后，对凝胶中的蛋白进行考马斯染色，以显现蛋白三聚体。
II  表达载体的A部分和B部分的组装和表达：
真核表达载体
为了构建编码重组配合物AB的载体，用储存载体pSS26m(COVALYSAG)进行PCR克隆提供了具有SNAP 26m基因的修饰过的pSecTac基哺乳动物表达载体(pMS，
Figure GPA00001009084400661
et al.，2003)。有两种版本可供使用，可以将A部分连接在B部分的N-末端或连接在B部分的C-末端，如附图中所示(97A+B)。在所述载体的其他版本中，除去了SNAP26m基因(Covalys)的内部SfiI核酸内切酶限制位点，以便可以通过常规SfiI/NotI克隆快速更换scFv融合配偶体(图97F+G)。所述SNAP-Tag的SfiI的缺失版本被称作mSNAP。
所述载体的表达框包括以下关键结构：人巨细胞病毒启动子序列(CMV)，牛生长激素聚腺苷酸化信号(BGH pA)和内部IVS核糖体进入位点(IRES)。所述SNAP-tag融合蛋白是通过Igkappa前导肽分泌的，而位于IRES位点的3′的报导EGFP基因缺少分泌信号，因此积累在细胞质中。
植物表达载体
设计了植物表达载体***，以便在植物中瞬时和稳定表达SNAP-tag融合蛋白(图97C)。该载体包括以下结构：
KDEL：植物ER保留信号；LPH：密码子优化的鼠类信号肽；Bla：氨苄青霉素抗性(E.coli)，羧苄青霉素抗性(A.tumefaciens)；nptII：卡那霉素抗性植物；SAR：烟草RB7基因的支架附着区；P35SS：转录起始区；CHS：来自查耳酮合成酶的5′UTR；pA35S：来自CaMV的聚腺苷酸化信号；RK3 ori：A.tumefaciens的ori；ColE1 ori：E.coli的ori；LB/RB：左/右边界；pAnos：胭脂碱合成酶聚腺苷酸化信号；Pnos：胭脂碱合成酶基因启动子。
原核细胞表达载体
这里所提到的原核细胞表达质粒是基于pET26bTM***(Novagen)的，并且是为了C/N-末端SNAP-tag融合蛋白在E.coli中进行外周质表达而设计的(图97D)。所述SNAP-tag版本(26b)是进行过密码子优化的，并且用购自Covalys公司的储存载体pSET7-26b进行PCR扩增。所述表达是通过T7启动子调控的；同时具有宿主编码的T7聚合酶，该表达的调控是极其严谨的。所述卡那霉素抗性基因允许选择转化细菌。所述pelB引头将重组蛋白导入细胞周质间隙。
酵母表达载体
基于CoMedTM***的酵母表达质粒是由Pharmedartis(Aachen，Germany)提供的(图97E)。所述载体主链是标准E.coli载体的衍生物，结合了ColE1 ori和氨苄青霉素抗性(bla)序列。变体I包括f1(-)起点，变体II没有所述序列。业已工程改造了多克隆位点(MCS)，以便摄取各种模块。为了***，在ARS/CEN模块(模块1)旁侧具有SacII/BcuI限制位点，rDNA片段(模块2)旁侧是BcuI/Eco47III位点，选择标记模块(模块3)旁侧是Eco47III/SalI位点，而表达框(模块4)旁侧是SalI/ApaI位点。在变体II上存在额外的SphI和BsiWI克隆位点。
对所述质粒进行设计，以便与各种酵母菌株一起工作：
酵母菌株(选择)
种                                营养缺陷型
Arxula adeninivorans (LS3)        野生型；leu2
Arxula adeninivorans (CBS7350)    野生型；leu2
Arxula adeninivorans (CBS1738)    野生型；leu2
Hansenula polymorpha (CBS4732)    野生型；ura3；leu2 ura3；arg1
                                  leu2 ura；ade1 leu2 ura3
Kluyveromyces lactis              met-ura3
Pichia pastoris                   野生型；ura3；ura3 his3
Saccharomyces cerevisiae          野生型；ura3；leu2 ura3 trp1
                                  lys2
Yarrowia lipolytica E150          野生型；ura3；leu2；ura3 leu2
将所述关键结构细分成四个模块，而具体载体构建体的模块可以包括一个或多个以下结构：
模块1由ARS/CEN序列组成，以便在酵母内复制：
HARS1(H.polymorpha-衍生的自发复制序列)
ARS(S.cerevisiae)
CEN(S.cerevisiae)
模块2由rDNA靶序列组成，用于酵母基因组整合：
NTS2-ETS-18SrDNA-ITS1(H.polymorpha，Arxula adeninivorans)
模块3由选择标记组成，用于转化体选择：
1.显性选择标记：
TEF启动子(A.gossypii；A.adeninivorans)-hph(E.coli)-TEF终止子(潮霉素抗性)
TEF启动子(A.gossypii；A.adeninivorans)-kanMX(E.coli)
-TEF终止子(庆大霉素抗性)
2.互补选择标记：
URA3(S.cerevisiae)
LEU2(S.cerevisiae，A.adeninivorans)
dLEU2(A.adeninivorans)(缺陷启动子)
TRP1(S.cerevisiae)
模块4包括SNAP-tag融合蛋白表达框，它由启动子-克隆位点-终止子组成，而终止子序列主要来自MOX，不过还可以来自TEF和PHO5。
与B部分融合的A部分的开放读框的构建
将不同的A部分，如抗体片段和受体的天然配体包括可溶性配体，受体，趋化激素，生长因子或白介素或其片段与SNAP-tag一起克隆到开放读框(ORF)中。所提到的ORFs是通过它们的序列表示的(表达是在克隆到哺乳动物pMS载体构建体中之后举例说明的)(图98和112)。参见图112中列举的序列ID 1-71。
SNAP-tag融合蛋白的哺乳动物表达
在TransFast-介导(Promega，Mannhein，Germany)转化到293T-细胞中之后，重组SNAP-tag融合蛋白按照
Figure GPA00001009084400691
M.et al.，2003中披露的方法表达。简单地讲，1μg质粒-DNA(如Ki4-SNAP(抗-CD30scFv)；SNAP-EGF(EGFR配体)；Hai-SNAP(抗-EGFR scFv 425)；H22-SNAP(抗-CD64 scFv)或SNAP-CD30L(CD30配体))和3μl TransFast按照生产商推荐的方法用于12孔细胞培养平板。通过计数绿色荧光确定的细胞转染率为75-95％。在首次转染3天之后，分析细胞培养上层的重组蛋白。然后，将转染细胞转入中等细胞培养瓶(Nunc；85m2)，并且在补充了100μg/ml Zeocin的RPMI复合培养基中生产。1-2周之后，生产性转染克隆产生绿色荧光，因此，可以通过荧光显微镜检测。通过继代培养所述克隆建立转染细胞群体。
SNAP-tag融合蛋白的植物表达
为了在植物(例如，烟草-Nicotiana benthamiana)中瞬时表达SNAP-tag融合蛋白，选择根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)介导的转化方法。
因此，将A.tumefaciens(例如，菌株GV3101：：pMP90RK)作成电感受态(Shen & Forde，1989)并且将100μl的感受态细胞与50-200ng的二元载体(pTRAkc based)在0.1cm的electrogap样品池(BioRad)中混合，所述载体包括编码SNAP-Tag融合蛋白的表达框。通过电脉冲转化细胞，使用基因Pulser(BioRad)，设定为1.8kV，25mF和200V。电穿孔的细胞在1ml Luria-Bertani(LB)肉汤中培养2小时，然后铺平板到LB培养基上，该培养基含有50mg羧苄青霉素ml-1，50mg利福平ml-1和30mg卡那霉素ml-1。
为了在烟草植物中进行A.tumefaciens介导的SNAP-tag融合蛋白的瞬时表达，A.tumefaciens培养物含有pTRAkc载体，它具有SNAP-tag融合蛋白表达框克隆，补充了50mg羧苄青霉素ml-1和50mg利福平ml-1。培养物在含有合适抗生素LB的肉汤中在27℃下振荡生长到指数生长期(OD600大约为0.8)。通过以4000g的速度离心收集细胞，重新悬浮在含有合适抗生素的诱导培养基(LB肉汤，pH 5.6，含有10mM MES，20mM乙酰丁香酮和2mM MgSO4)，并且按上述方法生长。通过以4000g的速度离心收集细胞，并且重新悬浮在浸润培养基(10mM MgCl2，10mMMES，2％蔗糖和150mg乙酰丁香酮ml-1，pH 5.6)中。所述土壤杆菌悬浮液在浸润培养基中稀释到OD600为1.0，并且在22℃下保存2-3小时。
有两种浸润方法，直接注射和真空浸润。对于注射来说，对土壤杆菌悬浮液进行稀释，并且在浸润培养基中合并。使最终的OD600都达到0.25。当土壤杆菌(pTRAkc)与上述悬浮液共同浸润时，它在最终的OD600为0.0125时使用。来自2-4周大的Nicotiana benthamiana植物的叶片通过以下方法浸润，从叶片下面将所述细菌悬浮液注入轴外的空气间隙。例如，用每一种细菌混合物对6个叶片进行土壤杆菌浸润(三个植株，每个植株两个叶片)。所述植物在16小时光照，8小时黑暗，22℃的条件下生长5-6天。
对于真空浸润来说，土壤杆菌培养物在诱导培养基中生长过夜。将得到的细胞重新悬浮在1-8l浸润培养基中，使每一种培养物的OD600达到0.25。将去掉了根的完整的Nicotiana tabacum L.‘Petite Havana’SR1植株浸没在细菌悬浮液中，并且在290kPa的真空下处理5-10分钟，偶然进行搅拌，以便释放滞留的空气泡。迅速解除所述真空(大约10kPa s-1)。将所述植物茎秆放入水饱和的花状泡沫中。所述植物在16小时光照，8小时黑暗，22℃下生长3天。
为了进行重组蛋白萃取，从土壤杆菌浸润的叶片上收集N.tabacum叶子圆片(使用微型离心管的盖子切割)并且在每盘250ml高盐磷酸缓冲液(0.5M NaCl)中研磨。提取物以13000r.p.m.的速度离心5分钟，收集上清液并且重复离心。
为了进行Western印迹分析，植物提取物在加样缓冲液(Sambrook etal.，1989)中在95℃下培养2分钟。通过SDS-PAGE(10％凝胶)分离，然后通过半干燥电吸印转移到硝酸纤维素膜上。用辣根过氧化物酶结合的抗His-tag mAb(1∶5000)检测重组SNAP-tag融合蛋白。检测反应是用DAB ragent(SIGMAFAST，Sigma)进行的。
所述SNAP-tag融合蛋白还可以通过添加合适量的BG染色SNAP-vistagreen在细胞提取物中检测。染色条件和反应条件按照生产商推荐的方法进行。通过SNAP-vista green染色的重组SNAP-tag融合蛋白可以在凝胶文件编制所用的标准UV透照器上观察。
本领域的科学家可以理解的是，不同的A.tumefaciens菌株与除了pTRAkc之外其他二元A.tumefaciens的质粒载体一起，也可导致烟草植物的成功转化，因此实现SNAP-Tag融合蛋白的功能表达。
本领域技术人员还可以理解的是，可以采用本文所采用的基于A.tumefaciens的方法转化多种不同的宿主植物。
SNAP-tag融合蛋白的酵母表达
酵母菌株，如A.adeninivorans LS3，A.adeninivorans 135，A.adeninivorans G1211([aleu2-]，D.hansenii H158，D.polymorphus H120，P.pastoris GS115(his4-)和H.polymorpha MedHp1(odc1-)，以及S.cerevisiae C13ABYS86(MATαleu2 ura3 his pra1 prb1 prc1 cps-)被用作可能的宿主(Steinborn，G.et al.，2006)。所有菌株在非选择条件下在复合培养基(YEPD)中生长或在选择条件下在添加了2％的选择的碳源的酵母基本培养基(YMM)中生长(Steinborn，G.et al.，2006)。培养是在30℃下进行的。按照
Figure GPA00001009084400741
h等1988和Dohmen RJ等1991中所披露的方法转化A.adeninivorans LS3，A.adeninivorans 135，A.adeninivorans G1211，D.hansenii H158，D.polymorphus H120，H.polymorpha MedHp1，P.pastorisGS115和S.cerevisiae C13ABYS86。在选择性和非选择性培养基上进行一系列传代之后获得了稳定的转化体。在用hph选择标记的质粒转化之后，在补充了150-400mg l-1潮霉素B的YEPD琼脂平板上选择潮霉素B-抗性菌落(200mg l-1用于A.adeninivorans LS3和135，250mg l-1用于D.hansenii H158和D.polymorphus H120，400mg l-1用于H.polymorphaMedHp1，150mg l-1用于P.pastoris GS115和S.cerevisiae C13ABYS86)。分离单一菌落，并且在30℃下在YEPD培养基和潮霉素B上生长2天。重复该步骤三次，然后将细胞铺平板到非选择性YEPD琼脂上，并且在30℃下生长3-5天。然后分离来自每一个转化体的单一菌落并且定义为菌株。
对于营养缺陷互补型来说，在缺少相应氨基酸的YMM琼脂平板上选择所述转化体。
通过Western印迹实验分析SNAP-tag融合蛋白的细胞内和细胞外表达水平，将抗-His-Tag抗体用于新制备的表达酵母细胞系。
为此，将每个酵母菌种的五个转化体放在YMM12％葡萄糖中在30℃下培养72小时。所述SNAP-tag融合蛋白还可以通过添加合适量的BG染色SNAP-vista green在细胞提取物中检测。染色条件和反应条件按照生产商推荐的方法进行。通过Vista green染色的重组SNAP-tag融合蛋白可以在用于凝胶文件编制的标准UV透照器上观察。
SNAP-tag融合蛋白的细菌表达
为了进行SNAP-tag融合蛋白的细菌表达，将需要的融合配偶体克隆到“表达载体的构建”中披露的、来自细菌外周质表达载体的pET26b+中。
对合适E.coli菌株(例如ROSETTA，EMD Biosciences，Darmstadt，Germany)的热休克感受态细菌进行转化，是例如进行热休克转化。将在含有卡那霉素的琼脂平板上生长的选择的克隆(pET编码的KanR提供具有抗性基因的细菌)用于表达。
质粒编码的SNAP-Tag融合蛋白的表达是使用渗透压胁迫表达方法进行的，参见Barth et al.，2000.
重组RFT5-SNAP-tag融合蛋白是在IPTG可诱导T7 lac启动子的控制下在E.coli ROSETTA(DE3)中表达的。细菌在26℃下在Terrific肉汤(TB)(Sambrook&Maniatis，1989)中生长过夜，培养基中含有50mg卡那霉素/ml和0.5mM ZnCl2，因为早先业已证实在添加这种盐时可以显著减弱外周质蛋白裂解(Baneyx，F.，and G.Georgiou.1992.)。振荡培养物在200mL的相同培养基中稀释30倍。在600nm下的光学密度(OD600)为2，其中添加了0.5M山梨糖醇，4％NaCl，和10mM甘氨酸甜菜碱，然后在26℃下再培养30-60分钟。然后通过添加2mM IPTG在26℃下诱导SNAP-tag融合蛋白产生。
15小时之后，通过以3,700  3g的速度在4℃下离心10分钟收获细胞。对所有以下步骤来说，试管是在冰上冷却的。对细菌沉淀物进行离心，并且测定其湿重量。细胞在-80℃下冷冻直到进一步处理。
RFT5-SNAP的表达和纯化是通过IMAC进行的，参见“通过IMAC纯化哺乳动物表达的SNAP-Tag融合蛋白”章节。
通过IMAC纯化哺乳动物表达的SNAP-Tag融合蛋白
His-标记的蛋白的纯化是通过Ni-NTA金属亲和法进行的(Hochuli，V.，1989，Porath，J.et al.，1975)。所述蛋白纯化采用的是Qiagen公司提供的用于纯化天然蛋白的方法的改进方案(The Expressionist 07/97)。为进行蛋白的微量制备，在900μl离心澄清的细胞培养上清液中添加300μl的4x培养缓冲液(200mM NaH2PO4，pH 8.0；1.2M NaCl；40mM咪唑)和30μl 50％Ni-NTA。在培养1小时之后，通过离心使Ni-NTA树脂沉淀。在用175μl 1x培养缓冲液洗涤培养物两次之后，用30μl的洗脱缓冲液(50mM NaH2PO4，pH 8.0；1.2M NaCl；和40mM咪唑)和30μl 50％Ni-NTA洗脱结合的蛋白。在培养1小时之后，通过离心使Ni-NTA树脂沉淀。用175μl 1x培养缓冲液洗涤沉淀物两次之后，在室温下用30μl的洗脱缓冲液(50mM NaH2PO4，pH 8.0；300mM NaCl；250mM咪唑)用20分钟时间洗脱结合的蛋白。多至500ml细胞培养上清液的真核表达蛋白的较大规模纯化是在AEKTAFPLC***(Amersham-Pharmacia，USA)上进行的。将细胞培养上清液加样到Ni-NTA柱上，然后在上述条件下洗脱His-标记的蛋白。
图(101)表示12％SDS-PAGE凝胶(A：UV光，B：考马斯染色)，它上面加载有5μg不同哺乳动物表达的和IMAC(Immobilized Metal AffinityChromatography)纯化的蛋白。所述凝胶包括：1：Ki4-SNAP；2：SNAP-EGF；3：Hai-SNAP；4：H22-SNAP；5：SNAP-CD30L；M：预染色的蛋白标记(NEB)。
III配合物ABC及其应用
用有机荧光团的BG衍生物标记SNAP-tag融合蛋白
第一步，对SNAP-tag融合蛋白(Ki4-SNAP)进行Ni-NTA纯化，参见“通过IMAC纯化哺乳动物表达的SNAP-Tag融合蛋白”部分。同时通过His-Tag-镍相互作用仍然结合在树脂上的Ki4-SNAP蛋白可以用一种SNAP-tag特异性BG底物进行标记，如BG505，参见附图(99c)。
CT-505的2mM标记溶液是在1×Ni-NTA洗涤缓冲液(300mM NaCl，50mM磷酸钠，pH＝7,5)中配制的。制备与估算的Ni-NTA树脂空隙空间一样多的溶液，并且添加到所述柱中。培养在室温下在黑暗中进行30分钟。用5倍床体积的Ni-NTA洗涤缓冲液洗脱两次。CT-荧光团标记的His-tagged蛋白的洗脱是用Ni-NTA洗脱缓冲液(300mM NaCl，50mM磷酸钠，500mM咪唑，pH＝7,5)进行的。
通过SDS-PAGE记录所述标记反应的成功，然后在UV透照器(BioRadGel Doc XR凝胶文件编制)下进行分析(图99c)。
另外，也可用Intas CRI-Maestro体内成像仪记录标记的成功。
用CT衍生物标记CLIP-tag融合蛋白
CLIP-tag融合蛋白进行Ni-NTA纯化，与纯化SNAP-tag构建体的方法一样。当通过His-Tag-镍相互作用仍然结合在树脂上时，用一种CLIP-tag特异性CT底物对CLIP-Tag融合蛋白进行标记，如CT-360，CT-430，CT-FL/CT-PF，CT-488，CT-505，CT547，CT-TMR，CT-647CT-生物素，CLIP-vista Green等。
CT-505的2μM标记溶液是在1x Ni-NTA洗涤缓冲液(300mM NaCl，50mM磷酸钠，pH＝7,5)中配制的。配制与估算的Ni-NTA树脂空隙空间一样多的溶液，并且添加到所述柱中。培养在室温下在黑暗中进行30分钟。用5倍床体积的Ni-NTA洗涤缓冲液洗树脂两次。CT-荧光团标记的His-tagged的蛋白的洗脱是用Ni-NTA洗脱缓冲液(300mM NaCl，50mM磷酸钠，500mM咪唑，pH＝7,5)进行的。
通过SDS-PAGE记录所述标记反应的成功，然后在UV透照器(BioRadGel Doc XR凝胶文件编制)下分析。
另外，也可用Intas CRI-Maestro体内成像仪记录标记的成功。
用CoA-衍生物在活细胞中标记ACP-/MCP-tag融合蛋白
用含有血清的组织培养基洗涤ACP-Tag-嗜酸细胞趋化因子/MCP-Tag-CXCL9表达HEK293细胞三次。将一小瓶ACP-tag底物溶解在25μL的DMSO中，得到用DMSO配制的1mM的标记储备溶液。在混合10分钟之后，溶解所有的ACP-tag底物。
以1∶200的比例用培养基稀释1mM ACP-tag底物储备溶液，以便得到5μM的标记培养基。然后添加MgCl2使最终浓度为10mM。最后，添加ACP-合酶使最终浓度为1μM。
表达ACP-tag融合蛋白的细胞的培养基位于细胞膜内或细胞膜上，使所述ACP-tag朝向所述细胞外侧，与所述标记培养基进行交换，并且培养30分钟。
然后除去所述标记培养基，并且更换新的细胞培养基，再培养20分钟，除去未反应的ACP-tag底物。再次更换培养基，并且将所述细胞用于显微镜观测，流式细胞计量分析或FACS分选。
用表达MCP-Tag融合蛋白的细胞重复相同的过程。因此，标记底物是相同的，即CoA衍生物，但以SFP-合酶取代ACP-合酶用于催化所述标记反应。
用CoA衍生物标记纯化的ACP-/MCP-tag融合蛋白
ACP/MCP-tag融合蛋白是使用与SNAP-Tag构建体相同的方法进行Ni-NTA纯化的。当通过His-Tag-镍相互作用仍然结合在树脂上时，用一种ACP/MCP-tag特异性CoA基底物对ACP/MCP-Tag融合蛋白进行标记，如CoA-488，CoA-547，CoA-647和CoA-生物素等。
将一小瓶ACP-tag底物溶解在25μL的DMSO中，以便得到用DMSO配制的浓度为1mM的标记储备溶液。在混合10分钟之后，所有ACP-tag底物都被溶解。
制备与估算的Ni-NTA树脂空隙空间一样大的溶液，并且添加到所述柱中。培养在室温下在黑暗中进行30分钟。用5倍床体积的Ni-NTA洗涤缓冲液洗树脂两次。BG-荧光团标记的His-tagged蛋白的洗脱是用Ni-NTA洗脱缓冲液(300mM NaCl，50mM磷酸钠，500mM咪唑，pH＝7,5)完成的。
用表达MCP-Tag融合蛋白的细胞进行相同的过程。因此，标记底物是相同的，即CoA衍生物，但用SFP-合酶取代ACP-合酶用于催化所述标记反应。
通过SDS-PAGE记录所述标记反应的成功，然后在UV透照器(BioRadGel Doc XR凝胶文件编制)下分析。
另外，也用Intas CRI-Maestro体内成像仪记录标记的成功。
纯合/杂合二价抗体-SNAP-tag共轭物
本发明相关配合物的分子结构允许两种SNAP-tag构建体与具有不同/相同结合特异性的(抗体)融合配偶体相结合，该结合通过包括两个或两个以上BG残基的接头结构结合，得到双特异性分子。
为了构建杂合二价(双特异性)构建体，整个过程包括两个步骤，以便使构建的杂合二聚体的数量最大化。
在第一步，通过His-Tag-镍相互作用，将具有特异性1的重组SNAP-tag融合蛋白结合在树脂上。
用1x Ni-NTA洗涤缓冲液(300mM NaCl，50mM磷酸钠，pH＝7,5)配制所需的2μM纯合双功能BG-交联剂(图3b)溶液。制备与估算的Ni-NTA树脂空隙空间一样多的溶液，并且添加到所述柱中。培养在室温下在黑暗中进行30分钟。用5倍床体积的Ni-NTA洗涤缓冲液洗树脂两次，以便除去未反应的交联剂。
BG-交联剂标记的His-tagged蛋白的洗脱是用Ni-NTA洗脱缓冲液(300mM NaCl，50mM磷酸钠，500mM咪唑，pH＝7.5)进行的。
在第二步，以与预标记的蛋白1相同的摩尔比添加具有特异性2的重组SNAP-tag融合蛋白。然后在溶液中在4℃下进行交联反应过夜。
通过SDS-PAGE和考马斯染色记录交联反应的成功(图99a)。凝胶显示Ki4-SNAP(泳道1x)及其交联的形式(泳道2x)一起具有分子量标记(泳道M)。通过密度分析测定分子量，单一Ki4-SNAP的分子量为53kDa，而交联形式的分子量为122kDa。交联是通过纯化双功能交联剂，包括PEG 12间隔物的SV 305实现的(图99b)。包括荧光团的交联剂，如图(99b)用CRi-Maestro体内成像仪(INTAS，
Figure GPA00001009084400811
，Germany)额外记录，它能够激发并且检测从430nm到800nm的所有类型的荧光团。它能够评估500到900nm的发射波长。
取决于荧光团的量子产量，成功结合的SNAP-tag融合蛋白，即使少至50ng都可以检测到。
双-/多聚体SNAP-tag融合蛋白共轭物
与在“双特异性抗体-SNAP-tag共轭物”部分所披露的方法类似，具有一种结合特异性的双或多聚体配合物可以通过具有两个或两个以上BG部分的交联剂产生。
所述反应还可以借助于用于双特异性的I MAC基质，但也不是单一步骤的反应来完成。
对于单一步骤的反应来说，将IMAC纯化的SNAP-tag融合蛋白与所述交联剂按以下比例混合，即对于具有特定数量BG残基BGn的交联剂来说，该混合物的配制是：
(n)mol SNAP融合体+1M BGn
反应混合物在4℃下在黑暗中培养12小时。
图(100a-d)表示，(图100a)：用三种不同荧光团标记的纯合三聚体交联剂标记、并且通过Cri-MAESTRO体内成像仪观察的Hai-SNAP融合蛋白合成图像。(图100b)：相同的凝胶进行考马斯染色和(图100c)：相同的考马斯染色的凝胶用密度分析软件进行分析。HaiSNAP与交联剂以3∶1的摩尔比进行混合。所述荧光团可以使用常用的发射过滤器装置很好地检测。样品1：用BG430标记的C1776-4(Ex 421nm，Em 444nm和484nm)，2：用Atto 495标记的C1884-4(Ex：495，Em：527)；3：用尼罗红标记的C1883-4(ex.：554nm；ex：638)。化学结构可以参见图15，16和17。化学结构式可以参见附图(89-91)。
图(100d)表示用Hai-SNAP的SV305交联版本进行的共焦显微术。通过100kDA MWCO旋转柱(Pall Nanosep)将交联的蛋白与非交联的版本分开。简单地讲，将25μg交联的样品添加到所述柱上，并且以10.000g的速度离心10分钟。然后添加500μl 1xPBS再次对样品进行离心，直到体积减少为50μl。重复该步骤，并且将所述柱中的残余物用于显微分析。
对5x105L3.6pl细胞进行染色，参见“SNAP-tag融合蛋白的共焦显微术应用”部分。
抗体-核酸共轭物(RNA)
通过Dharmacon合成优化的siRNAs，在正义链的3’或5’末端具有氨基和C(6)间隔物。将siRNA双链体溶解在PBS中，并且在室温下与溶解在无水DMF中的50倍摩尔余量的BG-GLA-NHS(Covalys)反应4小时。下一步，用乙醇使siRNA沉淀，并且通过凝胶过滤柱(Centri-spin 10，Princeton separations)除去残余的BG-GLA-NHS。类似地，在用DTT还原硫醇之后，修饰的RNA可以与BG-马来酰亚胺一起使用。图(104A)表示si-RNA与SNAP-tag融合蛋白结合的示意过程。
针对H22-SNAP和Hai-SNAP的抗eEFII siRNA的结合反应结果在10％SDS-PAGE上分离。凝胶表示以下样品：1：H22-SNAP+eEFII-BG；2：H22-SNAP；3：Hai-SNAP+eEFII-BG和4：Hai-SNAP。图(104B)是在标准UV透照器(BioRad)下分析的溴化乙锭染色的凝胶。图(104C)是随后进行考马斯染色的相同的凝胶。所述siRNA结合的SNAP-tag融合蛋白与它们的非结合形式相比表现出明确的电迁移率。SiRNA结合的配合物以预期的大约15kDa的大小移动。而实际尺寸较大(65kDa而不是50kDa)。
抗体-核酸共轭物(DNA)
为了靶向输送DNA分子，用苄基鸟嘌呤修饰所述DNA，可以用末端苄基鸟嘌呤(BG)或苄基胞嘧啶(BC)直接修饰寡核苷酸。对于较长的DNA链或完整的质粒来说，通过PCR扩增所述DNA片段，将BG或BC修饰的寡核苷酸用作两种引物之一。
所述PCR产物是通过商业质粒制备试剂盒(EndoFree Plasmid MaxiKit QIAGEN，Hilden Germany)从未反应的BG或BC修饰的寡核苷酸中纯化的。
然后将纯化的PCR产物与SNAP-tag融合蛋白以2∶1的摩尔比(RNA：SNAP-tag融合蛋白)在4℃下培养过夜。通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色监测结合反应的成功，只有DNA标记的SNAP-tag融合蛋白被染色，而SNAP-tag融合蛋白本身不会被染色。DNA标记的和非标记的融合蛋白之间的区别也可通过标记蛋白的电迁移率来识别。
成功的DNA标记的Ki4-SNAP-tag融合蛋白能够通过它们超量表达的细胞表面标记CD30来靶定癌细胞。
在结合蛋白-DNA配合物之后，通过受体介导的内吞过程将其内在化。内在化的另一个途径是在配合物与核转染因子(AMAXA)结合之后对细胞进行电穿孔。
在另一种具体实施方案中，所述SNAP-tag融合蛋白-DNA配合物首先通过特异性DNA-DNA相互作用结合在DNA加载的表面上。在结合之后，所述配合物能够将超量表达CD30的细胞固定在某些部位。其中，所述蛋白-DNA配合物此前已被固定。
SNAP-tag融合蛋白直接固定在颗粒上
在某些实施方案中，使用尺寸分布在20-80nm之间并且用若丹明荧光团包裹的二氧化硅纳米珠。所述珠体的浓度为9.5mg/ml，具有5.3x1015氨基(NH2)基团(8.76x10-3μmol/ml)。
以1500g的速度使500μl珠体(包括4.38nmol NH2基团)离心2分钟，用无水DMF洗涤2次，并且重新悬浮在80μl DMF中。
将悬浮在DMF中的珠体添加到过量的BG-GLA-NHS(
Figure GPA00001009084400851
倍摩尔过量)中，并且在25℃下振荡培养1小时。
用800μl PBS洗涤两次，重新悬浮在用PBS/1mM DTE制备的200mlKi4-SNAP(100μg，2nmol)中，并且在室温下培养一小时。
用800μl PBS洗涤珠体两次，并且在使用之前重新悬浮在100μl PBS中。
图(102A)表示Ki4-SNAP功能化纳米珠结合CD30-阳性L540细胞的共焦显微分析。基于若丹明的珠体发射光线为红色(A)和Draq5的发射为拟蓝色(B)，overlay(D)具有灰度级图片(C)。
图(102B)表示与不同数量(0.5和5μl)的Ki4-SNAP结合的若丹明斑点纳米珠一起培养的cD30超量表达L540cy细胞的流式细胞计量分析。作为对照，将5μl未结合的珠体加样到L540cy细胞上。
图(102C)表示与不同数量(0.5和5μl)的Ki4-SNAP结合的若丹明斑点纳米珠一起培养的CD30阴性U937细胞的流式细胞计量分析。作为对照，将5μl未结合的珠体加样到U937细胞上。
用SNAP-tag融合蛋白直接进行ELISA
用分析物涂敷96孔ELISA平板，用移液管将25μl的包被缓冲液(100mM碳酸钠，pH 9,6)转移到每一个孔中，然后在每一个孔中与25μl分析物溶液混合。
在室温下包被2小时之后用1xPBS洗涤平板两次，然后添加50μl的检测抗体溶液(SNAP-tag融合蛋白，50-100ng)。所述SNAP-tag融合蛋白事先用SNAP-vista green荧光团(Covalys)进行标记，参见“用有机荧光团的BG衍生物标记SNP-tag融合蛋白”章节。所述检测抗体溶液在室温下培养1小时，并且用1xPBS洗涤平板两次。然后在荧光ELISA读数器上分析所述平板，使用适合SNAP-tag结合的荧光团的滤光器装置。
用SNAP-tag融合蛋白进行夹心ELISA分析
ELISA平板表面可以用BG-PEG-NH2修饰，以便它们使SNAP-tag融合蛋白共价固定化。表面激活是使用标准氨基-结合方法完成的(如接触NHS和EDC)。然后按以下方式修饰该表面：将1.4mg(0.0031mmol)bG-PEG-NH2溶解在10mL HBS缓冲液中，并且离心(20,000xg，室温，20min)。用移液管将100μL的该溶液转移到具有羧基化表面的96孔ELISA平板的每一个孔中。在培养30分钟之后，通过添加乙醇胺(10mmol)将多余的活性基团淬火，并且再培养10分钟。在用1x PBS洗涤三次之后，所述ELISA平板表面就可用于直接固定样品中的SNAP-tag融合蛋白。然后用移液管将100ng纯化的Ki2 mab(溶解在50μl PBS中)转移到每一个孔中，并且在室温下培养2小时或在4℃下培养过夜。
在用1x PBS洗涤两次之后，用移液管将含有分析物(分泌的CD30)的样品(50μl)转移到所述孔中，并且在室温下培养2小时。然后用1x PBS洗涤平板两次，然后添加50μl的检测抗体溶液(scFv Ki3，200ng/孔)。所述检测抗体包括scFv-GFP融合蛋白或荧光团标记的scFv-SNAP-tag融合蛋白，用于荧光读数。
免疫-PCR
该方法基本上是由Niemeyer等2007披露的定量免疫-PCR(qIPCR)方法的改进形式。
该分析方法的基本原理取决于夹心免疫测定，随后是qPCR 1：由涂敷在96孔PCR/ELISA平板上的非标记的抗体(Ki2mab)捕捉抗原，和2：从血清中捕捉sCD30抗原，和3：通过Ki3scFv环绕SNAP-tag的融合蛋白检测所述捕捉的sCD30，所述融合蛋白是事先用dsDNA PCR模板进行共价标记的，以及最后4：用于信号放大和读数的qPCR步骤。
部分1-3表示常见的夹心ELISA方案，与以前公开的方法类似。在图(103)中给出了示意性综述。
所述测定必须在薄壁聚碳酸酯平板上进行，它适合免疫测定，并且适合热循环为基础的应用(例如，Nunc TopYield starter kit)。
为了避免被PCR产物污染，免疫-PCR产物DNA的操作是与较早的免疫-PCR步骤严格分开的，这两种操作是在不同的，完全隔离的实验室中进行的。
所述方法是按以下方式实施的：
最初的工作步骤主要是参见“夹心ELISA“方法进行的。唯一的区别是，使用薄壁聚碳酸酯PCR级96孔平板或条带取代常规ELISA平板。
用DNA模板结合检测抗体配合物取代荧光团标记的检测抗体(SNAP-tag融合蛋白)。
为了除去未结合的靶DNA，用PBS+Tween(0.01％)严格洗涤所述平板五次。在每一个循环期间用洗涤缓冲液浸泡孔3分钟，然后用超纯净的0.2mm过滤水洗涤两次。在添加PCR试剂之后，对所述平板进行30轮的PCR扩增，使用96孔实时PCR循环仪，例如，ABIprism 7000(AppliedBiosystems)***。
按照生产商的说明，使用所披露的引物1，引物2和探针浓度制备TaqMan Universal PCR Mastermix。通过移液管将30μl的PCR Mastermix转移到每一个孔中。用粘性箔密封所述模块。将平板或PCR条放入预先净化的实时PCR仪中，并且进行典型的PCR程序。初始变性：5分钟95℃，然后进行30轮变性步骤：30s，50℃，合成步骤：30s，72℃和变性步骤：12s，95℃。在运行以上程序之后，通过软件评估所获得的数据。
SNAP-tag融合蛋白的流式细胞计量应用
含有起靶定作用的A部分的SNAP-tag融合蛋白的细胞结合活性使用FACS Calibur流式细胞计数器和细胞Quest软件(Becton Dickinson，Heidelberg，Germany)或免费软件WinMDI 2.8进行评估。所述SNAP-tag融合蛋白是在使用之前标记的，参见“用有机荧光团的BG衍生物标记SNAP-tag融合蛋白”章节。冰上培养30分钟，用荧光团标记的SNAP-tag配合物标记细胞。然后用500μl冷却的PBS在自动化细胞洗涤器(DadeSerocent；Baxter)中洗涤细胞两次。作为对直接配合物进行染色的替代，通过聚组氨酸标记来检测SNAP-tag融合蛋白(仅为AB)的结合，该方法使用Penta-His Alexa Fluor 488抗体(Qiagen，Hilden，Germany)。
在该方法的某些实施方案中，采用靶定人类细胞表面分子CD30(霍奇金淋巴瘤)，CD64(激活的巨噬细胞上的(FcγRI))和EGF受体(位于胰腺，乳腺，肺和非小细胞肺癌)的抗体SNAP-tag融合构建体。
a)靶定CD30：
所述scFv Ki4，亲代CD30特异性单克隆抗体(Barth e al.2000)的单体重组形式及其对应体CD30配体以融合蛋白形式克隆到SNAP-tag上。位置(N-或C-末端)的选择是为保持两种融合配偶体的所有功能而进行的。
图(105A)表示用结合在CD30超量表达细胞系L540cy上的SNAP-vistaGreen(Covalys)标记的Ki-SNAP的流式细胞计量分析的评估。
简单地讲，5×105 L540cy细胞与不同数量的SNAP-vista Green标记的Ki4-SNAP(5，50和500ng)在500μl PBS中混合。结合反应在冰上在黑暗中进行20分钟。然后用PBS洗涤细胞两次，并且在FACS Calibur(Becton&Dickinson)流式细胞器上进行分析。
图(105B)表示用结合在CD30超量表达细胞系L540cy上的SNAP-vistaGreen(Covalys)标记的SNAP-CD30L的流式细胞计量分析的评估。
简单地讲，5×105 L540cy细胞与500ng的Vista Green标记的SNAP-CD30L在500μl PBS中混合。该结合反应在冰上在黑暗中进行20分钟。然后用PBS洗涤细胞两次，并且在FACS Calibur(Becton&Dickinson)流式细胞器上进行分析。作为阴性对照，用相同的方法对CD30阴性细胞系L3.6pl进行染色和分析。
b)靶定EGFR：
scFv 425(又被称作Hai)，亲代EGFR特异性单克隆抗体(Haisma et.al.，2000)的单体重组形式和天然EGFR配体EGF以融合蛋白形式克隆到SNAP-tag上。位置(N-或C-末端)的选择是为保持两种融合配偶体的所有功能决定的。
图(105C)表示用结合在EGFR超量表达细胞系A431上的SNAP-vistaGreen(Covalys)标记的Hai-SNAP的流式细胞计量分析的评估。
简单地讲，5×105A431细胞与500ng的SNAP-vista Green标记的HAi-SNAP在500μl PBS中混合。结合反应在冰上在黑暗中进行20分钟。并且在FACS Calibur(Becton&Dickinson)流式细胞器上进行分析。作为阴性对照，对EGFR阴性细胞系Monomac进行相同的染色。
图(105D)表示用结合在EGFR超量表达细胞系A431上的SNAP-vistaGreen(Covalys)标记的SNAP-EGF的流式细胞计量分析的评估。
简单地讲，5×105A431细胞与500ng的Vista Green标记的SNAP-EGF在500μl PBS中混合。结合反应在冰上在黑暗中进行20分钟。然后用PBS洗涤细胞两次，并且在FACS Calibur(Becton&Dickinson)流式细胞器上进行分析。作为阴性对照，对EGFR阴性细胞系CHO K1进行相同的染色。
c)靶定CD64：
H22，亲代抗CD64特异性单克隆抗体(Tur等，2003)的单体重组形式作为融合蛋白N-末端克隆到SNAP-tag上。
简单地讲，5×105U937细胞(CD64阳性)与500ng的SNAP-vista Green标记的H22-SNAP在500μl PBS中混合。结合反应在冰上在黑暗中进行20分钟。然后用PBS洗涤细胞两次，并且在FACS Calibur(Becton&Dickinson)流式细胞器上进行分析。作为阴性对照，对CD64阴性细胞系L540进行相同的染色。
图(105E)表示用结合在CD64超量表达细胞系U937而不是结合在CD64阴性细胞系L540上的SNAP-vista Green(Covalys)标记的H22-SNAP的流式细胞计量分析的评估。
d)靶定胰腺癌：
为了区分炎性胰腺炎和胰腺癌，在胰腺炎衍生的细胞材料上耗尽免疫鼠类scFv噬菌体的展示文库，随后进行三轮噬菌体展示选择。选择一个胰腺癌特异性scFv克隆(clone 14.1)作为胰腺癌衍生的细胞系L3.6pl和A431的特异性粘合剂，而在胰腺炎细胞膜上是阴性的。
简单地讲，5×105A431/L3.6pl细胞与SNAP-vista Green标记的14.1-SNAP在500μl PBS中混合。结合反应在冰上在黑暗中进行20分钟。然后用PBS洗涤细胞两次，并且在FACS Calibur(Becton&Dickinson)流式细胞器上进行分析。作为阴性对照，对EGFR阴性细胞系L540进行相同的染色，参见图(105F)。
SNAP-tag融合蛋白的共焦显微术应用
制备靶细胞，参见“SNAP-tag融合蛋白的流式细胞计量应用”，不过在最后的洗涤步骤之后是用甲醛固定的。因此，将300μl冰镇的0.4％甲醛-PBS溶液添加到放置在冰上的细胞中，并且培养30分钟。再次在自动化细胞洗涤机中用PBS洗涤所述细胞。为了对核进行对染，将所述细胞与2μl的Draq5(BioStatus，Leicestershire，UK)的1/100的稀释液混合。在培养5分钟之后，将10μl的细胞悬浮液装载到玻璃载玻片上，用玻璃盖玻片覆盖，并且用Leica荧光(DMR)和共焦显微镜(TSC SP)研究。
图(106)表示用BG505(Covalys)标记的Ki4-SNAP染色的L540cy细胞的共焦照片。
体内成像
L3.6pl(EGFR+)肿瘤异种移植的体内成像是使用Intas Cri Maestro体内成像仪进行的。
将L3.6pl胰腺癌5×105细胞静脉内注射到6周大的雌性SCID小鼠体内，并且在生长1周之后，通过retrobulbic注射70μg用BG-782NIR染料标记的Hai-SNAP而观察到。按前面披露的方法进行标记反应，参见“用有机荧光团的BG衍生物标记SNP-tag融合蛋白”章节。成像是在注射Hai-SNAP-BG782成像剂之后5分钟，12，24和72小时用麻醉的小鼠进行的。
图(107)表示来自完整小鼠的红外线照片，它是以Intas Cri-Maestro体内成像仪，采用未混合背景信号的光谱获得和分析的。位于小鼠腹部的大肿瘤根据Hai-SNAP的积累可以很好地观察。在24小时范围内，可以清楚地看到注射的肿瘤图像底物从注射部位向肿瘤的明显运动。
图(108)表示来自完整小鼠的红外线照片，它是以Intas Cri-Maestro体内成像仪，采用未混合背景信号的光谱获得和分析的。与图片10相反，稳定的EGFP表达L3.6pl胰腺癌5×105细胞注射到6周大雌性SCID小鼠的皮肤下面，位于右侧和左侧股骨区，并且在生长1周之后观察，通过retrobulbic注射70μg用BG-782NIR染料标记的Hai-SNAP而显现。标记反应是按前述方法进行的，参见“用有机荧光团的BG衍生物标记SNP-tag融合蛋白”章节。在注射Hai-SNAP-BG782成像剂24小时之后用麻醉的小鼠进行成像。
当遮盖Cri-Maestro体内成像仪拍摄的相应照片时，绿色荧光和红外荧光信号明显重叠。
用SNAP-tag融合蛋白进行受体内在化研究
制备EGFR-阳性靶细胞，按“SNAP-tag融合蛋白的共焦显微术应用”章节所述，但是在SNAP-tag融合蛋白应用之后的不同的时间点用甲醛固定。因此，在4℃/37℃下培养15，30和60分钟之后，将300μl的冰镇0.4％甲醛-PBS添加到放置在冰上的细胞中，并且培养30分钟。在自动化细胞洗涤器中用PBS再次洗涤所述细胞。为了进行核对染，将所述细胞与2μl的Draq5(BioStatus，Leicestershire，UK)的1/100稀释液混合。在培养5分钟之后，将10μl的细胞悬浮液装载到玻璃载玻片上，用玻璃盖玻片覆盖，并且用Leica荧光(DMR)和共焦显微镜(TSC SP)研究。
图(109)表示用BG505(Covalys)标记的Hai-SNAP染色的L3.6pl细胞的共焦照片。与4℃的样品相比，当在37℃下培养时，结合的Hai-SNAP进入细胞的内在化率明显更高。EGFR阴性细胞系，如L540和U937在相同的条件下不会染色。
图(110)表示在内在化之后Hai-SNAP BG505标记的和转铁蛋白ALEXA 594标记的是共处的(参见(图109E)中的黑色箭头)。图(109A)表示内在化的HaiSNAP-BG505为绿色；(图109B)表示网格蛋白介导的转铁蛋白-ALEXA594内在化为蓝色，(图109C)表示A和B和D的重叠是C与非透射光照片的重叠；(图109E)：(图109D)的放大，箭头表示包含标记的转铁蛋白和HaiSNAP-BG505的小泡。存在转铁蛋白和HaiSNAP-BG505的高度的重叠定域。
已知转铁蛋白可以通过网格蛋白支持的内在化而实现内在化。还报导了EGFR的这种内在化形式。因此，Hai-SNAP和转铁蛋白的共处表明了EGFR的原始内在化途径不受结合Hai-SNAP的影响。
将SNAP-tag融合蛋白用于基于流式细胞测定术的高产菌株筛选
可以将细胞渗透SNAP-tag染色底物，如BG-430，BG-505，BG-DAF和TMR-Star(Covalys)等用于在活的哺乳动物细胞内对SNAP-tag融合蛋白进行特异性标记。为了检测瞬时转染HEK 293或CHO细胞(使用pMS基载体，参见图1A+B和5)表达率，所述细胞用细胞渗透TMRstar培养。
按照生产商(Covalys)的说明，将TMS-Star底物溶解在DMSO中。将5μM TMR-Star稀释到最终工作浓度为1μM。在37℃下在黑暗中标记细胞30分钟，然后用培养基洗涤两次，并且在成像之前再培养30分钟，以便使未反应的底物扩散到细胞外面。所有步骤都是在层流下进行的，并且使用消毒过滤的溶液。
为了进行显微镜预评估，用DRAQ5TM溶液的1∶2000的稀释液对1×105TMR染色的细胞进行对染2分钟，然后用PBS洗涤。染色溶液的浓度和在TMR染色之后的洗涤条件是通过显微镜检查仔细确定的，直到非转染细胞系或假转染细胞系的TMR背景值低到足以获得表达SNAP-tag融合蛋白的细胞达到良好的信噪比为止。
其余的适当染色的细胞根据TMR信号的强度进行适当分选。对具有最强TMR信号的百分之十的细胞进行分选，然后转入新的培养瓶中。
根据需要重复该程序，以便得到纯合的高产细胞群体，用于扩大哺乳动物表达的规模。
图(111)表示HEK293细胞的TMR染色，所述细胞表达Hai-SNAP融合蛋白和EGFP报导蛋白，它是双顺反子mRNA上编码的3′末端。图(111A)表示EGFP报导物的信号，(图111B)表示属于SNAP-Tag融合蛋白的TMR信号，(图111C)表示Draq5核对染，和(图111D)表示相同细胞的透射光照片。
通过SNAP-tag融合蛋白靶向输送干扰RNA
抗eEFII siRNA和Hai-SNAP融合蛋白的结合，基本上是按照“抗体-核酸共轭物(RNA)”部分所披露的方法进行的。
将配合物添加到靶细胞上，浓度范围为10ng/孔(1×105靶细胞)-100ng/孔(EGFR超量表达细胞系L3.6pl)，并且在添加siRNA配合物之后62小时通过westen印迹和定量PCR检测所述细胞的靶基因的特异性剔除。
该方法能方便地适应其他配体和核糖核酸基分子，例如，具有不同特异性的miRNAs/shRNA。
在其他应用中，RNA分子的结合是通过纯合三功能或杂合三功能以及包括马来酰亚胺功能的纯合双功能/杂合双功能的交联剂实现的，通过这种方式包括末端主要SH基团的RNA分子(优选具有RNA干扰特性，如siRNA)得以结合。
然后以2∶1摩尔比将预形成的交联剂-RNA配合物添加到预先纯化的SNAP-/CLIP-tag融合蛋白中，并且按上述方法反应。
在图(77)中，提供了具有杂合双功能RNA的交联剂的例子(一个BG和一个BC残基用于交联一个SNAP-tag和一个CLIP-tag融合蛋白)。
在图(10，19，50)中提供了具有杂合三功能RNA的交联剂的例子(三个BG残基用于三个SNAP-tag融合蛋白的交联)。该交联剂(图50)还包括荧光素残基，使得它可以通过例如显微镜分析的方法跟踪配合物。
通过SNAP-tag融合蛋白靶向输送细胞毒性/细胞抑制剂
在本发明的一种具体实施方案中，靶向配合物AB是由EGFR靶向抗体(Hai)或天然配体(EGF)组成的，而SNAP-tag与苄基鸟嘌呤修饰的细胞毒性剂，如紫杉醇结合。该紫杉醇代表本发明相关的C部分，并且与AB配合物一起以细胞毒性有效负荷量输送到靶定的细胞中(EGFR超量表达)。
为了提高每一个结合的配合物AB的毒性有效负荷，将所述毒性部分加载到树枝状化合物结构上，参见Jongdoo Lim等，2007文献中对紫杉醇所作的披露，或加载到氨甲喋呤上，参见Gong Wu等，2006文献。
简单地讲，将携带大量细胞毒性部分的苄基鸟嘌呤修饰的树枝状化合物结合在Hai-SNAP上，如在“用有机荧光团的BG衍生物标记SNAP-tag融合蛋白”部分所述。
然后将纯化的(透析)树枝状化合物-Hai-SNAP配合物涂敷在靶细胞上，并且通过XTT基细胞活性测定法检测特异性细胞毒性。
在本发明的另一个实施方案中，将毒性分子，如苯丁酸氮芥结合在纯合三功能交联剂上。然后以3∶1的摩尔比将预形成的交联剂-苯丁酸氮芥配合物添加到预先纯化的SNAP-/CLIP-tag融合蛋白中，并且按上述方法反应。
在图(17，43，51)中提供了具有杂合三功能承载苯丁酸氮芥的交联剂的例子(三个BG残基用于交联三个SNAP-tag蛋白)。
使用SNAP-/CLIP-tag和ACP-tag技术纯化多标记融合蛋白
所述蛋白配合物的一般结构是SNAP-/CLIP-tag-蛋白酶裂解位点-靶蛋白(+His-Tag)-ACP-tag。
所有步骤都是在FPLC***中进行的，以便更好地监测每一个工艺步骤的蛋白浓度。简单地讲，所述蛋白首先通过SNAP-/CLIP-tag与SNAP-/CLIP-俘获纯化树脂而共价结合。在该步骤之后，对所述树脂进行充分洗涤，直到在洗涤级份中不再能检测到蛋白信号。然后，通过添加需要的蛋白酶，裂解所述靶蛋白，并且从所述树脂中释放。然后将洗脱的蛋白直接结合在IMAC(Ni-NTA)柱上，以便通过His-Tag重新结合所述靶蛋白，并且通过简单的洗涤步骤除去所述蛋白酶。然后在所述柱上用荧光团等在ACP-tag位点对所述蛋白进行标记。然后，将未反应的ACP底物洗掉，并且可以将标记的高纯度靶蛋白从Ni-NTA柱上洗脱。
通过阅读本说明书，无需过多的实验就可以制备和实施本文所披露的并且要求保护的所有方法和组合物。尽管业已以优选实施方案的形式对本发明的组合物和方法进行了说明，本领域技术人员可以理解的是，在不超出本发明的构思，实质和范围的前提下可以对本发明的方法和步骤或本发明的方法步骤的顺序加以改变。更具体地讲，可以理解的是，某些化学和生理学相关的试剂可以取代本文所披露的试剂，并且可以获得相同或相似的结果。对技术人员来说所有这些类似的取代和改变都被视为属于由所述权利要求书确定的本发明的实质范围和构思。
表1
Figure GPA00001009084400971
Figure GPA00001009084400981
Figure GPA00001009084401001
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表2
援引自R.Thorpe et al.，Cytokine 21(2003)48-49
Figure GPA00001009084401151
表3
  名称   来源   靶受体   靶细胞   功能
  IL-1   巨噬细胞，B细胞，单核细胞，树状细胞   CD121a/IL1R1，CD121b/IL1R2   T辅助细胞   共刺激
  B细胞   成熟和增殖
  Nk细胞   激活
  巨噬细胞，内皮，其他   炎症，少量引起急性期反应，大量引起发热
  IL-2   TH1-细胞   CD25/IL2RA，CD122/IL2RB，CD132/IL2RG   激活的T细胞和B细胞，NK细胞，巨噬细胞，少突细胞   刺激T细胞生长和分化响应。可用于免疫治疗，治疗癌症或抑制移植患者
  IL-3   激活的T辅助细胞[3]，肥大细胞，NK细胞，内皮，嗜曙红细胞   CD123/IL3RA，CD131/IL3RB   造血干细胞   生长和分化成例如红血球，粒细胞
  肥大细胞   生长和组胺释放
  IL-4   TH2-细胞，   CD124/IL4R，   激活的B   增殖和分化，IgG1
  刚激活的原始CD4+细胞，记忆CD4+细胞，肥大细胞，巨噬细胞   CD132/IL2RG   细胞   和IgE合成。在***反应中的重要作用(IgE)
  T细胞   增殖
  IL-5   TH2-细胞，肥大细胞，嗜曙红细胞   CD125/IL5RA，CD131/IL3RB   嗜曙红细胞   生产
  B细胞   分化，IgA生产
  IL-6   巨噬细胞，TH2-细胞，B细胞，星形胶质细胞，内皮   CD126/IL6RA，CD130/IR6RB   激活的B细胞   分化成血浆细胞
  血浆细胞   抗体分泌
  造血干细胞   分化
  T细胞，其他   诱导急性期反应，造血作用，分化，炎症
  IL-7   骨髓基质细胞和胸腺基质细胞   CD127/IL7RA，CD132/IL2RG   前/原-B细胞，前/原-T细   与B，T，和NK细胞存活，发育，和动态平衡相
  胞，NK细胞   关，↑促炎细胞因子
  IL-8   巨噬细胞，淋巴细胞，上皮细胞，内皮细胞   CXCR1/IL8RA，CXCR2/IL8RB/CD128   嗜中性粒细胞，嗜碱细胞，淋巴细胞   嗜中性粒细胞趋化现象
  IL-9   Th2-细胞，特异性byCD4+辅助细胞   CD129/IL9R   T细胞，B细胞   加强IgM，IgG，IgE，刺激肥大细胞
  IL-10   单核细胞，TH2-细胞，CD8+T细胞，肥大细胞，巨噬细胞，B细胞亚类   CD210/IL10RA，CDW210B/IL10RB   巨噬细胞   细胞因子生产
  B细胞   激活
  Th1细胞   抑制Th1细胞因子产生(IFN-γ，TNF-β，IL-2)。
  Th2细胞   刺激
  IL-11   骨髓基质   IL11RA   骨髓基质   急性期蛋白产生，破骨细胞形成
  IL-12   树状细胞，B   CD212/IL12RB1，   激活的[3]   分化成细胞毒性
  细胞，T细胞，巨噬细胞 IR12RB2   T细胞，   T细胞，具有IL-2[3]，↑IFN-γ，TNF-α，↓IL-10
  NK细胞   ↑IFN-γ，TNF-α
  IL-13   激活的TH2-细胞，肥大细胞，NK细胞 IL13R   TH2-细胞，B细胞，巨噬细胞   刺激B-细胞生长和分化(IgE)，抑制TH1-细胞和噬菌体炎性细胞因子(例如IL-1，IL-6)生产，↓IL-8，IL-10，IL-12
  IL-14   T细胞和某些恶性B细胞   激活的B细胞   控制B细胞的生长和增殖，抑制Ig分泌
  IL-15   病毒感染之后的单核噬菌细胞(和某些其他细胞)，特别是巨噬细胞。 IL15RA   T细胞，激活的B细胞   诱导产生天然杀伤细胞
  IL-16   淋巴细胞，上皮细胞，嗜曙红细 CD4   CD4+T细胞   CD4+化学引诱物
  胞，CD8+T细胞
  IL-17   T细胞亚类   CDw217/IL17RA，IL17RB   上皮，内皮，其他   破骨细胞生成，血管生成，↑炎性细胞因子
  IL-18   巨噬细胞   CDw218a/IL18R1   Th1细胞，NK细胞   诱导产生IFNγ，↑NK细胞活性
  IL-19   -   IL20R   -
  IL-20   -   IL20R   调节角化细胞增殖和分化
  IL-21   -   IL21R
  IL-22   -   IL22R   激活STAT1和STAT3，并且提高急性期蛋白如血清淀粉状蛋白A，α1-抗凝乳蛋白酶和结合珠蛋白在肝癌细胞系中的产量
  IL-23   -   IL23R   增强血管生成，但减弱CD8T-细胞浸润
  IL-24   -   IL20R   通过影响细胞存活在肿瘤抑制，伤口愈合和牛皮癣
  中发挥重要作用。
  IL-25 -   LY6E   诱导能刺激嗜曙红细胞膨大的IL-4，IL-5和IL-13产生。
  IL-26 -   IL20R1   增强IL-10和IL-8分泌和增强CD54在上皮细胞上的细胞表面的表达
  IL-27 -   IL27RA   调节B淋巴细胞和T淋巴细胞的活性
  IL-28 -   IL28R   在抗病毒的免疫防御方面发挥作用
  IL-29 -   在宿主防御微生物方面发挥作用
  IL-30 -   形成IL-27的一条链
  IL-31 -   IL31RA   可能在皮肤炎症方面发挥作用
  IL-32 -   诱导单核细胞和巨噬细胞分泌TNF-α，IL-8和CXCL2
  IL-33 - 诱导辅助T细胞产生2型细胞因子
  IL-35 调控T细胞 抑制T辅助细胞激活
参考文献：
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Claims (5)

1.一种化合物，包括A，B和C三个部分，这些部分共价结合形成具有结构A-B-C的化合物，所述化合物是包括至少一种重组融合蛋白的异源配合物，其含有至少一个结合部分A，和一种酶型蛋白B，以及与B共价结合的至少一个附加部分C，其中
A部分对抗原具有特异性结合亲和力，A部分属于针对病原物质或病原物的疾病特异性结构的抗原结合多肽/蛋白靶定细胞类型特异性标记，B部分是SNAP-tag或者CLIP-tag，与A部分共价相连；
C部分是聚合物或树枝状化合物，携带若干细胞抑制/细胞毒性制剂，携带苄基鸟嘌呤/苄基胞嘧啶基团，并且所述的苄基鸟嘌呤/苄基胞嘧啶基团被PEG化修饰过，以便改善其生物适应性，其前提是：
B部分具有催化或受体活性，使C部分与共价结合的A-B部分共价连接。
2.如权利要求1所述的化合物，其中C部分具有结构（X）n1-（Y）-（Z）n2，其中，X是B部分的特异性底物，n1是1或更大的数，Z是药物，可检测标记或能在靶定的细胞或有机体内介导生物活性的成分，n2是1或更大的数，Y是被设计成用于功能性连接X和Z的接头结构成分，所述接头结构成分包括能使Z在反应条件下受控制地释放的结构元件,用于确保组装的化合物内的每一种成分的功能，Y具有树状或聚合物结构。
3.如权利要求2的化合物，其中，所述结构元件为pH敏感型结构、或在核内体或细胞溶质中释放的可还原结构。
4.一种药品，包含权利要求1的化合物。
5.权利要求1的化合物在制备治疗恶性疾病，***性疾病，自身免疫反应，慢性炎性反应或组织/移植排斥反应的药品的应用。
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