CN101827936A - Cdh3肽以及含有cdh3肽的药剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供以下(A)或(B)的肽：(A)包含SEQ ID NO：1或2所示的氨基酸序列的肽；和(B)包含在SEQ ID NO：1或2所示的氨基酸序列中取代、缺失、***和/或增加一个、两个或者几个氨基酸而得到的氨基酸序列，并具有诱导杀伤性T细胞的活性的肽。

Description

CDH3肽以及含有CDH3肽的药剂
技术领域
本发明涉及新的肽，它们可用作针对诸如胰腺癌，胆管细胞癌，胃癌，结肠癌，肺癌等高表达P-钙黏连蛋白(CDH3)的癌症的疫苗，还涉及用于治疗和预防癌症的含此类肽的药剂。
技术背景
胰腺癌约占所有恶性肿瘤的2-3％。每年世界上大约200,000人死于胰腺癌，它的死亡人数是恶性肿瘤死亡人数的第5位。在日本每年大约20,000人死亡。导致胰腺癌发生的危险因素包括糖尿病，慢性胰腺炎，吸烟等等，有报道表明家族史也是危险因素之一。人们做了各种早期诊断的尝试，包括改善诊断成像；然而，大多数患者是在晚期被诊断出来，此时他们已经对化疗有了抗性。因此，他们的五年存活率约为9.7％，即使通过手术切除的病例中存活率也只有约13％。在消化***的癌症中胰腺癌的预后结果最不理想。由于难以诊断，在癌症引起的死亡中胰腺癌所致的比率逐步提高，尤其是在发达国家。虽然人们正在运用多学科治疗，主要包括外科切除术和放疗、化疗等其他治疗方法，但是治疗效果并没有得到明显的改善，因此迫切需要新的治疗策略。
胆管细胞癌约占原发肝癌的10％，是继肝细胞癌之后的第二大常见癌症。它缺乏特征性的临床表现，在很多病例中，此癌症在检出时已是晚期，并伴随***转移、肝内转移等等。五年存活率为20％，在手术切除的病例中存活率为35％，但不进行手术切除的病例中存活率很低，只有7.4％。虽然手术切除是唯一有希望实现长期存活的治疗方法，但很多患者在检测出癌症时，已经不能进行手术(手术比例：66％，非根治性切除比例：20％)。患者的抗癌药物敏感性和放射敏感性都很低，需要建立一种对无法手术的病例，包括非根治性切除的病例的治疗方法。
与西方国家相比，在亚洲国家胃癌的发病率较高，如日本和中国。随着医学检测的普及，胃癌的早期检测已经成为可能，并且随着内窥镜仪器和检查方法的进步，患者的数量不断减少。然而，在日本胃癌仍然是恶性肿瘤致死的第二大原因，在死因中所占的比例依然很高。在西方国家结肠癌是第二大常见癌症，在日本该疾病也是恶性肿瘤中的第三大致死原因。胃癌和结肠癌的治疗主要依靠手术切除，也借助化学治疗，放射治疗等方法。对于前面提到的治疗方法无法治疗的转移癌症和顽固癌症的治疗，通过提高癌症患者针对癌症的免疫力来抑制癌细胞生长的免疫疗法作为一种新的方法逐渐受到关注。
近年来，在世界范围内肺癌的数量持续增加，目前一年大约有一百万人死于肺癌。在日本肺癌死亡人数也在持续增加，预计在2015年将会达到123,000人。在日本肺癌是恶性肿瘤死亡的首要原因。人们认为随着人口老龄化的发展患者数量会逐渐增加。早检测、早治疗对于肺癌治疗非常重要。然而，最近报道指出健康检查中进行的简单的胸部x-光和痰化验对于肺癌的早期检测效果不好，并不能减少癌症死亡。由于肺癌死亡人数会持续增加，开发新的治疗策略是一项紧迫的任务。
另外，最近的分子生物学和肿瘤免疫学的进展阐明了细胞毒性(杀伤性)T细胞和辅助性T细胞识别由癌细胞中特异性高表达的蛋白降解所产生的肽而引起免疫反应从而破坏癌细胞，这些肽是通过HLA分子呈递到癌细胞或抗原呈递细胞表面的。此外，已经鉴定出很多这样的能刺激产生攻击癌细胞的免疫反应的肿瘤抗原蛋白和肽。并且抗原特异性的肿瘤免疫疗法正在开展临床应用。
I型HLA分子在体内所有的有核细胞表面表达。该分子通过结合由细胞质或细胞核产生的蛋白在细胞内所降解形成的肽从而表达于细胞表面。在正常细胞表面，来自于正常蛋白的肽与I型HLA分子结合，免疫***里的T细胞不会识别这些蛋白而破坏该细胞。另一方面，在癌变的过程中，癌细胞有时会大量表达在正常细胞中很少表达或不会表达的蛋白。当I型HLA分子与这类由癌细胞特异高表达的蛋白降解所产生并随后表达在癌细胞表面的肽结合时，杀伤性T细胞将识别这些肽，并且只破坏癌细胞。此外，通过对个体施用此类癌特异性的抗原或肽，可以诱导产生一种破坏癌细胞并且抑制癌症生长的免疫反应而不会伤害正常细胞。这就叫做应用癌症特异性抗原进行的癌症免疫疗法。II型HLA分子主要在抗原呈递细胞表面表达。II型HLA分子结合来自于癌症特异性抗原的肽-这些肽是由抗原呈递细胞内化的胞外癌症特异性抗原在细胞内降解所产生的-然后表达于细胞表面。然后识别了这些肽的辅助性T细胞被激活，并且通过产生各种可以激活其他免疫能细胞的细胞因子来诱导或增强抗肿瘤的免疫反应。
因此，如果能够研发出一种以癌症中特异的高表达的抗原为靶标的免疫疗法，就可能有效地消灭癌细胞而不会对个体自身的正常器官造成任何伤害。这种治疗也有望可用于任何不能进行其他治疗的终末期癌症患者。另外，通过预先对此类癌症的高危人群施用癌症特异性抗原和肽疫苗，或许可以预防癌症的发生。
虽然对于胰腺癌有多种治疗方法，与其他癌症相比胰腺癌的预后很差。这主要是因为胰腺癌早期检出难、发展快，因此一般只能在晚期发现。虽然手术切除是目前最有希望根治的方法，但可切除病例仅占总数的20％。并且胰腺癌手术创伤大，晚期病例即使在手术切除后预后也很差。不能进行切除手术的病例一般通过主要使用吉西他滨的化疗和放疗来进行医治。然而，很多病例显示出对此类治疗的抗性并且细胞减灭的效果很差，这也是为什么说胰腺癌是难治性的原因之一。相应地，如果开发出一种使用在胰腺癌中特异性高表达的抗原作为靶标的免疫疗法，那么这种疗法将有效消灭癌症而不会引起对个体自身正常器官的任何伤害。这种治疗也可望用于任何终末期癌症患者。此外，由于胰腺癌易于在切除后复发，这种治疗也有希望成为有效的的手术后的辅助治疗方法。
本发明者先前使用cDNA微阵列分析在全基因组范围内对27648个人类基因进行了基因表达分析，检测了这些基因在16个胰腺癌病例中，婴儿器官和各种成人正常器官中的表达谱。结果，他们发现了P-钙黏连蛋白(CDH3)在很多胰腺癌中高表达，同时它在成年人的正常器官中很少表达。此外，还发现CDH3在胆管细胞癌，胃癌，结肠癌，非小细胞肺癌，睾丸癌，***，骨肉瘤，软骨组织瘤等癌症中的大多数病例中也是高表达的。这些事实提示在很多癌症中，CDH3可以做为癌症特异性的抗原。
HLA-A2无论在哪个种族的人群中都常见，约30％的日本人携带有HLA-A2。因此，如果能够鉴定出一种通过HLA-A.2呈递给杀伤性T细胞的肽，则该种肽不仅可以广泛的应用于日本人，而且可用于欧美白人等人群。所以，鉴定出被HLA-A2呈递给杀伤性T细胞的癌症抗原肽是一项重要课题。这将有利于将这种癌症抗原肽用于发病率和死亡率在世界范围内都很高的肺癌的免疫治疗。
与本申请相关的现有技术文献如下所示：
[非专利文献1]Nakamura，T.，et al.，Oncogene 23：2385-2400(2004)
[非专利文献2]Obama，K.，et al.，Hepatology 41：1339-1348(2005)
[非专利文献3]Taniuchi，K.，et al.，Cancer Res 65：3092-3099(2005)
[非专利文献4]Soler，A.P.，et al.，Cancer 86：1263-1272(1999)
[非专利文献5]Paredes，J.，et al.，Clin Cancer Res 11：5869-5877(2005)
[非专利文献6]Ingunn，M.，et al.，J Clin Oncol 22：1242-1252(2004)
[非专利文献7]Glenn，L.，et al.，J Cell Biol 139：1025-1032(1997)
[非专利文献8]Bauer，R.，et al.，Exp.Mol.Pathol.81：224-230(2006)
[非专利文献9]Muzon-Guerra，M.F.，et al.Cancer 103：960-969(2005)
[非专利文献10]Marck，V.V.，et al.，Cancer Res.65：8774-8783(2005)
发明内容
[本发明需要解决的问题]
本发明要达成的目的是开发一种手段来实现通过提高癌症患者的抗癌免疫力来抑制癌症生长的免疫治疗，作为一种新疗法用于治疗难以通过手术、化疗和放疗(它们应用于胰腺癌、胆管细胞癌、胃癌、结肠癌、非小细胞肺癌等癌症的治疗)来治疗的转移或难治性癌症。本发明提供了已得到鉴定的、在癌症细胞中特异性高表达并通过HLA-A2呈递给杀伤性T细胞的肽。从而为开发能够应用于约30％的高表达CDH3的各种癌症的日本人患者的免疫治疗提供了可能。
[解决问题的方法]
本发明通过对胰腺癌组织进行cDNA微阵列分析，鉴定出CDH3(GenBank Accession No.NM_001793)是胰腺癌高表达的基因。为了检测抗癌免疫力是否由CDH3特异性的杀伤性T细胞所诱导，使用了表达HLA-A2(约30％的日本人携带有该基因)的HLA-A2转基因小鼠。具体的说，利用具有HLA-A2结合结构域的人源CDH3肽对小鼠骨髓来源的树突细胞进行冲激(pulse)后，用该树突细胞免疫HLA-A2转基因小鼠，检测是否可诱导HLA-A2限制性的肽特异的杀伤性T细胞。使用ELISPOT方法来检测由通过识别由HLA-A2呈递的肽被激活的杀伤性T细胞产生的γ-干扰素(IFN-γ)从而来检测免疫过的小鼠的脾细胞中是否诱导产生CDH3肽特异的杀伤性T细胞。结果，本发明者鉴定出了两种新的CDH3肽，它们可用于HLA-A2阳性癌症患者的免疫治疗。此外还发现通过使用这些肽诱导出的CDH3反应性CTL具有对表达内源性CDH3和HLA-A2分子的癌细胞特异的细胞毒性，同时CTL以I型HLA限制性的方式识别靶细胞。此外，还揭示了通过静脉注射肽诱导的CD8阳性细胞(CTL过继免疫法)，移植到NOD/SCID小鼠上的肿瘤的生长明显受到抑制。
更具体来说，本发明提供：
(1).以下(A)或(B)的肽：
(A)包含SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列的肽；
(B)包含在SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列中取代、缺失、***和/或增加一个、两个或者几个氨基酸而得到的氨基酸序列的肽，其中该肽具有诱导细胞毒性(杀伤性)T细胞的活性。
(2).(1)的肽，其中该肽自N末端起的第二个氨基酸是亮氨酸或者甲硫氨酸。
(3).(1)的肽，其中C末端氨基酸是缬氨酸或亮氨酸。
(4).一种用于诱导针对癌症的免疫力的药剂，该药剂含有一种或多种(1)的肽作为活性成分。
(5).一种用于治疗和/或预防癌症的药剂，该药剂含有一种或多种(1)的肽作为活性成分。
(6).一种用于诱导具有细胞毒性(杀伤性)T细胞诱导活性的抗原呈递细胞的药剂，该药剂含有一种或多种(1)的肽作为活性成分。
(7).一种用于诱导具有细胞毒性(杀伤性)T细胞诱导性活性的抗原呈递细胞的药剂，该药剂含有一种或多种编码(1)的肽的多核苷酸作为活性成分。
(8).一种用于诱导细胞毒性(杀伤性)T细胞的药剂，该药剂含有一种或多种(1)的肽作为活性成分。
(9).针对(1)的肽的抗体。
(10).使用(1)的肽诱导的辅助性T细胞、细胞毒性(杀伤性)T细胞或者包含这些细胞的免疫细胞群。
(11).一种抗原呈递细胞，其呈递包含(1)的肽及HLA抗原的复合物。
(12).(11)的抗原呈递细胞，该细胞是被(6)或(7)的药剂所诱导的。
(13).一种外来体，其呈递包含(1)的肽及HLA抗原的复合物。
(14).(13)的外来体，其中所述HLA抗原是HLA-A2(HLA-A2*0201)。
(15).一种诱导具有细胞毒性(杀伤性)T细胞诱导活性的抗原呈递细胞的方法，该方法包括使抗原呈递细胞接触(1)的肽的步骤。
(16).一种诱导具有细胞毒性(杀伤性)T细胞诱导活性的抗原呈递细胞的方法，该方法包括将编码(1)的肽的多核苷酸转染至抗原呈递细胞中的步骤。
(17).一种诱导细胞毒性(杀伤性)T细胞的方法，该方法包括使T细胞接触(1)的肽的步骤。
(18).诱导针对癌症的免疫力的方法，该方法包括向受试者施用(1)的肽的步骤。
(19).治疗和/或预防癌症的方法，该方法包括向受试者施用(1)的肽的步骤。
(20).(1)的肽用于生产诱导针对癌症的免疫力的药剂的用途。
(21).(1)的肽用于生产治疗和/或预防癌症的药物的用途。
附图说明
图1显示鉴定被HLA-A2限制性杀伤T细胞识别的CDH3的流程。(将脾细胞从免疫小鼠中分离的那天设定为“0天”)。
图2是显示18个CDH3肽ELISPOT分析结果的图片。使用ELISPOT来检测从免疫小鼠中获得的杀伤性T细胞是否可以与经CDH3肽冲激的细胞特异性结合，并且产生IFN-γ。用CDH3-4或CDH3-7肽诱导的杀伤性T细胞会特异性识别利用CDH3肽冲激过的BM-DC并产生IFN-γ；而用其他肽诱导的杀伤性T细胞没有显示出CDH3特异的CTL免疫反应。因此可以确认CDH3-4和CDH3-7肽是能够诱导CDH3特异的HLA-A2限制性杀伤T细胞的表位肽。图2中展示的CDH3肽的编号对应的是表1中的“位置”一栏处显示的肽编号，而不是本文所述的SEQ ID NO。
图3是显示用ELISPOT测定法检测通过特异性地识别CDH3肽而被激活的杀伤性T细胞所产生的IFN-γ的结果的图片。针对用CDH3-4655-663肽(A左、B上)冲激过的BM-DC，CD4-阴性的脾细胞显示283.7±40.0个点/孔，针对未经肽冲激(A右、B下)的BM-DC，CD4-阴性的脾细胞显示48.7±11.9个点/孔(P＜0.05)。相似地，针对经过CDH3-7757-765肽(C首行)冲激的BM-DC，CD4-阴性的脾细胞显示79.3±3.2个点/孔，而针对未经肽冲激(C末行)的BM-DC CD4-阴性的脾细胞显示42.7±2.5个点/孔(P＜0.05)。实验重复2次，结果相同。
图4是显示从HLA-A2阳性的健康供体和癌症患者的PBMC中诱导CDH3-特异的人CTL的结果的线形图。A：从HLA-A2阳性的健康供体的PBMC中诱导产生CDH3肽反应性CTL。在利用自体单核细胞来源的、并经过CDH3-4655-663(上)或CDH3-7757-765(下)肽冲激的DC刺激三次以后，通过标准51Cr释放测定法来分析针对经过或未经过每种肽冲激的T2细胞(HLA-A2阳性，TAP缺陷)的细胞毒性。CTL显示出对经过CDH3-4655-663(上)或CDH3-7757-765(下)肽冲激的T2细胞的细胞毒性，但对未经肽冲激的T2细胞无毒性。B：CTL显示出对CDH3+HLA-A2+人结肠癌细胞系HCT116、口腔鳞癌细胞系HSC3，以及PANC1/CDH3细胞系的细胞毒性，其中该PANC1/CDH3细胞系用CDH3基因转化了的CDH3-HLA-A2+人胰腺癌PANC1细胞系。但是，CTL对CDH3-HLA-A2+的人肝癌细胞系SKHep1、PANC1和CDH3+HLA-A2-的人胰腺癌细胞系PK8并无细胞毒性。C：从HLA-A2阳性胰腺癌(PC)患者和胃癌(GC)患者的PMBC中诱导产生的CDH3反应性的CTL显示出对HCT116和PANC1/CDH3细胞毒性，但是对PANC1和PK8没有毒性。D：该图显示抗I类HLA单抗对细胞毒性的抑制。将靶细胞SKHep1/CDH3和HSC3与抗I类HLA单抗(W6/32，IgG2a)或抗HLA-DR单抗(H-DR-1，IgG2a)共同孵育1小时后，加入了从经过CDH3-4655-663(左侧，中间)或CDH3-7757-765(右侧)刺激过的健康供体的PBMC中诱导的CTL。W6/32会明显的抑制IFN-γ的产生(左侧和右侧，IFN-γELISPOT测定)和细胞(中间，51Cr释放测定)，但是H-DR-1没有这样的抑制作用。
图.5是显示CDH3诱导的人CTL针对移植入NOD/SCID小鼠的人癌细胞的体内抗肿瘤活性。A：将人结直肠癌细胞系HCT116(CDH3+，HLA-A2+)移植到移植了CTL后的NOD/SCID中，该癌细胞的生长受到了抑制。在皮下肿瘤移植后的第七天，肿瘤的大小达到25mm2，静脉内接种对于CDH3-4655-663肽(□)和CDH3-7757-765肽(■)具有反应性的人CTL。第14天再次用相同的方式接种CTL。用HLA-A2限制性HIV肽刺激的对照组CD8+T细胞没有显示出细胞毒性(◇)。该图显示了在第7天和第14天两次施用CDH3反应性CTL(n＝7)、对照组CD8+T细胞(n＝7)、或只施用PBS(○，n＝7)的NOD/SCID小鼠体内的肿瘤大小。肿瘤大小用平方毫米表示。B：每组的肿瘤大小用±SD(n＝7)表示。
本发明的具体实施方式
除非有另有指出，否则这里使用的措辞“一种”、“一个”和“该”表示“至少一种”或“至少一个”。
除非有其他的定义，这里使用所有的技术和科学名词的含义与本发明所属的领域中的普通技术人员的理解的含义相同。
依据本发明的肽是一种受HLA-A2限制的抗原表位，HLA-A2是日本人和白种人群中常见的HLA等位基因。具体来说，依据它们与HLA-A2的结合能力，选出来源于CDH3的HLA-A2结合性肽的候选物。对于选中的肽，通过检测来源于HLA-A2转基因小鼠骨髓细胞(BM-DC)的树突细胞经过选中的肽冲激后是否能够在HLA-A2转基因小鼠体内诱导出杀伤性T细胞来进行评价。在HLA-A2转基因小鼠中，CDH3-4(FILPVLGAV(SEQ IDNO：1))和CDH3-7(FIIENLKAA(SEQ ID NO：2))能诱导杀伤性T细胞。这些肽诱导的杀伤性T细胞对加入了这些肽的BM-DC显示出免疫反应。但这些杀伤性T细胞对没有加入这些肽的BM-DC没有显示任何免疫反应。这些结果表明来源于CDH3的肽可以用作诱导针对CDH3呈递细胞的免疫反应的肽，并且这些来源于CDH3的肽是HLA-A2限制性的抗原表位肽。CDH3在大部分癌症病例中都高表达，如胰腺癌，胆管细胞癌，胃癌，结肠癌，非小细胞肺癌，睾丸癌，***，骨肉瘤和软组织肿瘤。这表明在很多癌症免疫治疗中可以将CDH3作为靶点。
(1)依据本发明的肽及包含这些肽的用于诱导针对癌症的免疫力的药剂。依据本发明的肽是下列肽中的任何一种：
(A)包含SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列的肽；
(B)包含在SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列中取代、缺失、***和/或增加一个、两个或者几个氨基酸而得到的氨基酸序列的肽，其中该肽具有诱导杀伤性T细胞的活性。
(C)(B)的肽，其中该肽自N-端起的第二个氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸；和
(D)(B)的肽，其中该肽C-端的氨基酸是缬氨酸或亮氨酸；
本发明的肽是具有少于40个氨基酸，优选的是少于20个氨基酸，更优选的是少于15个氨基酸的抗原表位肽，该肽包括氨基酸序列SEQ ID NO：1或2，并且具有诱导杀伤性T细胞的活性。或者，此抗原表位肽可包括这样的肽，其具有SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列中取代，删除，***和/或增加一个，两个或几个氨基酸而得到的氨基酸序列，只要其保留了诱导杀伤性T细胞的活性即可。被取代，删除，***和/或增加的残基数通常为5个氨基酸或者更少，优选的是4个氨基酸或更少，更优选的是3个氨基酸或更少，最优选的是1个氨基酸或2个氨基酸。
已知肽变体(也就是，包含由原氨基酸序列通过取代，删除，***和/或增加一个，两个或几个氨基酸残基发生改变而得到的氨基酸序列的肽)会保留原有的生物活性(Mark DF et al.，(1984)Proc Natl Acad Sci USA 81：5662-6；Zoller MJ and Smith M，(1982)Nucleic Acids Res 10：6487-500；Dalbadie-McFarland G et al，.(1982)Proc Natl Acad Sci USA 79：6409-13)。氨基酸改变优选保留原有氨基酸侧链的特性。氨基酸侧链的性质的例子有：疏水性氨基酸(A，I，L，M，F，P，W，Y，V)，亲水性氨基酸(R，D，N，C，E，Q，G，H，K，S，T)以及具有下列共有功能基团或特性的侧链：脂肪族侧链(G，A，V，L，I，P)；含羟基侧链(S，T，Y)；含硫原子侧链(C，M)；含羧基和氨基的侧链(D，N，E，Q)；含碱性氨基酸的侧链(R，K，H)；和含芳族的侧链(H，F，Y，W)，此处括号中的字母是指氨基酸的单字母代码。
在优选的实施方案中，本发明的肽(免疫原性肽)是九肽(9聚体)或十肽(10聚体)。
此处，具有诱导杀伤性T细胞的活性的肽，是指具有可刺激杀伤性T细胞(细胞毒性T细胞/CTL)的T细胞诱导活性的肽。
为了获得具有高亲和力和杀伤性T细胞诱导活性的肽，天然的CDH3的部分肽的氨基酸序列可能通过取代，删除，***和/或增加一个，两个或几个氨基酸而被改变。此处，“几个”指5个或更少，优选的为3个或更少，更优选为2个或更少。此外，由于具有HLA抗原高亲和性的肽序列的规则性是已知的(Kubo RT，et al.，(1994)J.Immunol.，152：3913-24；RammenseeHG，et al.，(1995)Immunogenetics.41：178-228；Kondo A，et al.(1995)J.Immunol.155：4307-12)，可以依据该规则性来改变本发明的肽(抗原表位肽)以提高肽对HLA抗原的亲和力。例如，将自N-端起的第二个氨基酸替换为亮氨酸或者甲硫氨酸，可以获得与HLA-2具有高结合亲和力的肽。相似地，将C-端的氨基酸替换为缬氨酸或亮氨酸，也可以获得具有与HLA-2的高结合亲和力的肽。
当抗原表位肽的序列与具有不同功能的内源或外源蛋白的一部分氨基酸序列相同时，会引起包括自身免疫异常或对特定物质的过敏反应在内的副作用。为了避免这样的副作用，改变后的抗原表位肽应该与已知蛋白的氨基酸序列不同。为了这个目的，有必要利用已有的数据库进行同源搜索来确认没有与改变后的抗原表位肽有100％的相似性而功能不同的内源或外源蛋白。通过这个过程，可以避免上面提到的为了增加与HLA抗原的结合亲和力和/或为了增加杀伤性T细胞诱导活性而改变氨基酸序列带来的风险。
虽然上述的具有对HLA抗原的高结合亲和力的肽有希望成为高效的癌症疫苗，对于用高亲和力作为指标选出的候选肽，必须检查它们是否确实具有杀伤性T细胞诱导活性。杀伤性T细胞诱导活性可以通过下面的方法确认：诱导具有人MHC抗原的抗原呈递细胞(如，B-淋巴细胞，巨噬细胞和树突细胞)，或更具体地，诱导人外周血单核细胞来源的树突细胞；用感兴趣的肽刺激这些细胞；然后将它们与CD8阳性细胞混合；测量对靶细胞的细胞毒活性。反应体系可以使用表达人HLA抗原(例如，BenMohamed L，et al.，(2000)Hum.Immunol.61(8)：764-79，及相关文章、书籍和链接所述的)的转基因动物。例如，可以用51Cr或类似的同位素标记靶细胞，依据靶细胞释放的放射性来计算细胞毒活性。或者，可以通过以下方法检查靶细胞：在具有固定化肽的抗原呈递细胞存在的情况下，测量从杀伤性T细胞中产生和释放的IFN-γ；然后用抗IFN-γ的单抗来使培养基上产生IFN-γ的区域可见。
如实施例子所示，对肽的杀伤性T细胞诱导活性的检查结果表明对HLA抗原具有高结合亲和力的肽不一定有高的杀伤性T细胞诱导活性。然而，含有氨基酸序列CDH3-4(FILPVLGAV(SEQ ID NO：1))或CDH3-7(FIIENLKAA(SEQ ID NO：2))的肽显示出特别高的杀伤性T细胞诱导活性。
如上所述，本发明提供具有杀伤性T细胞诱导活性的肽，更具体来说，包含氨基酸序列SEQ ID NO：1或2，或其变体(也就是其中一个，两个，或几个氨基酸被替换，删除，***和/或增加的氨基酸序列)的肽。对于包含SEQID NO：1或2或其变体的九个氨基酸的肽，它们的氨基酸序列优选是与其他内源性蛋白不一致的。尤其是，可以通过用亮氨酸或甲硫氨酸替换N-端起第二个氨基酸，和/或用缬氨酸或亮氨酸来替换C-端的氨基酸，来获得具有针对HLA-A2的高结合亲合力的肽。
本发明的肽可包括修饰如糖基化、侧链氧化和磷酸化，以肽不丧失杀伤性T细胞诱导活性为限。其他修饰包括，如，D-氨基酸或其他可以用来增加肽的血清半衰期的氨基酸类似物。
用于获得和制造本发明的肽的方法没有特别限制。本发明的肽可以是化学合成的肽或者是通过基因重组技术产生的重组肽。
本发明的化学合成的肽可以依照化学合成方法如Fmoc法(芴甲氧羰基法)和t-Boc法(叔丁氧羰基法)来合成。本发明的肽也可以利用各种商用肽合成仪合成。
本发明的肽可以作为重组蛋白来制备，方法是获得具有编码该肽或其变体或其同源物的核酸序列的DNA，并将它们导入到合适的表达***中。
表达载体优选地可以是任何这样的载体：其可在宿主细胞中自主复制或可整合入宿主细胞染色体，并且在合适的位点包含启动子，使得肽的编码基因能够表达。可以通过将上述的表达载体转入宿主来产生含本发明肽的编码基因的转化体。宿主可以是任何细菌，酵母，动物细胞和昆虫细胞，并且可以根据宿主的情况使用任何已知技术将表达载体转入宿主。
本发明中，可以通过培养如上所述的转化体，在培养基中产生和积累肽，从培养物中收集肽，来分离本发明的重组肽。
当转化体是原核生物如大肠杆菌(E.coli)或真核生物如酵母时，用于培养这些微生物的培养基既可以是天然培养基也可以是合成培养基，只要其包含了碳源，氮源，矿物质等可以被微生物利用的物质且便于有效率地培养转化体即可。培养条件可以是常用的微生物培养条件。培养后，可以用常规的肽分离纯化方法从转化体的培养基中分离纯化本发明的肽。
本领域技术人员可以根据SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列的编码核苷酸序列的信息来适当地产生或获得包含在SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列中替换或增加一个，两个或几个氨基酸而成的氨基酸序列的肽。具体来说，对于包含在SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列中替换、删除、***、和/或增加一个、两个或几个氨基酸而得到的氨基酸序列、并且具有杀伤性T细胞诱导活性的肽，本领域技术人员可以用例如化学合成，基因工程或诱变等任何方法来生产其编码基因。例如，基因工程技术之一的定点诱变技术是有用的，因为该技术可以在特定的位置引入特定的突变。可以按照MolecularCloning：A Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY.，1989(下文简称Molecular Cloning 2nd Ed.)，CurrentProtocol in Molecular Biology，Supplement 1-38，John Wiley & Sons(1987-1997)(下文简称Current Protocol in Molecular Biology)及类似的文献中描述的方法来进行定点诱变操作。
本发明中的上述肽可以引起抗癌免疫反应，下面的实施例中有详细描述。所以，根据本发明，提供用于诱导针对癌症的免疫力的包含本发明肽的药剂。本发明的诱导免疫力的药剂也可以通过组合2种或更多种抗原表位肽来制备成混合配制剂。通过混合多种肽组成的诱导免疫力的药剂可以是一种鸡尾酒(cocktail)，或用标准技术将多种肽互相连接而成。组合的抗原表位肽可以是来源于相同基因的具有不同氨基酸序列的肽，或者是具有来源于不同基因的氨基酸序列的肽。当对受试者施用本发明中的肽时，施用的肽被密集地呈递在抗原呈递细胞的HLA抗原上，然后与施用的肽和HLA抗原形成的复合物特异地反应的杀伤性T细胞被诱导出来。或者，通过使从受试者处收集的树突细胞接触本发明的肽(或通过利用本发明的肽冲激从受试者处收集的树突细胞)，可以获得在其细胞表面呈递本发明的肽的抗原呈递细胞。将这些抗原呈递细胞输回受试者体内，则可在受试者体内诱导出杀伤性T细胞，结果是针对呈递本发明肽的靶细胞的免疫反应被增强。
当按照本发明将诱导针对癌症的免疫力的药剂用于体外或体内，优选的是体外时，可以诱导辅助性T细胞，杀伤性T细胞，或者包括这些细胞的免疫细胞群，因此产生针对癌症的免疫力。
(2)按照本发明用于治疗和/或预防癌症的药物制剂(癌症疫苗)
实施例中显示了本发明的肽可以在体内诱导特异针对癌细胞的杀伤性T细胞。而且，先前的发明显示CDH3在大多数病例中高表达，如胰腺癌，胆管细胞癌，胃癌，结肠癌，非小细胞肺癌，睾丸癌，***，骨肉瘤，软组织瘤等。因此，包括本发明的肽的用于诱导免疫力的药剂可望作为治疗和/或预防癌症的有效药剂。即，通过将本发明的肽与适当的佐剂一起注射到体内，或使用该肽冲激抗原呈递细胞如树突细胞后，可以诱导和激活能攻击肿瘤的杀伤性T细胞，其结果是可以预期产生抗癌效果。此外，可以将编码本发明肽的基因整合到合适的载体中。转化了重组DNA的抗原呈递细胞(树突细胞等)和细菌如BCG结核分枝杆菌(Mycobaceriumtuberculosis)，或基因组中整合了编码本发明肽DNA的病毒如牛痘病毒，可以有效地用作活疫苗来治疗和/或预防人类癌症。癌症疫苗的使用剂量和施用方法与通常的天花疫苗或BCG疫苗相同。
本发明中涉及的词汇“疫苗”(也称免疫原性组合物)指这样的一种物质，当对动物接种该物质后，可以诱导抗肿瘤免疫力或抑制各种癌症。依照本发明，包含SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列的肽可能是HLA-A2限制性抗原表位肽，它可以诱导强的、特异的抗CDH3呈递细胞的免疫反应。因此，本发明也包括用含SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列的肽或其变体来诱导抗肿瘤免疫力的方法，所述变体可以含有一个，两个，或更多个氨基酸的替换，删除，或添加。一般说来，抗肿瘤免疫力包括下面的免疫应答：
(1)诱导针对含CDH3表达细胞的肿瘤的杀伤性T细胞；
(2)诱导识别含CDH3表达细胞的肿瘤的抗体；和
(3)诱导产生抗癌细胞因子。
如果通过对动物接种某种特定的肽，该肽可以诱导出这些免疫应答中的任何一种，即确定这种肽具有诱导抗肿瘤免疫力效果。可以通过观察宿主体内或体外对此肽的免疫应答来确定该肽对抗癌免疫力的诱导。
例如，检测杀伤性T细胞的诱导的方法已为人所熟知。侵入活体内的外源物质通过抗原呈递细胞(APC)的作用被呈递给T细胞和B细胞。以抗原特异的方式对抗原呈递细胞呈递的抗原作出应答的T细胞，通过抗原的刺激，分化成为杀伤性T细胞(也称细胞毒性T淋巴细胞或CTL)，接着增殖。此处，将该过程称作T细胞的“活化”。特定的肽对杀伤性T细胞的诱导可以通过利用经肽冲激的抗原呈递细胞将该肽呈递给T细胞，然后检测杀伤性T细胞的诱导，来进行评估。此外，抗原呈递细胞有激活CD4+T细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和NK细胞的效果。由于CD4+T细胞在抗肿瘤免疫中很重要，可以将这些细胞的活化效果作为评价肽的诱导抗肿瘤免疫力的效果的指标。
用树突细胞(DC)作为抗原呈递细胞来诱导杀伤性T细胞的评估杀伤性T细胞诱导效果的方法是本领域已熟知的。在抗原呈递细胞中，DC有最强的杀伤性T细胞诱导效果。此方法包括首先使测试肽接触DC细胞，然后使该DC细胞接触T细胞。从与DC接触后的T细胞中检出对靶细胞有细胞毒作用的T细胞。如果T细胞对靶细胞显示细胞毒活性，表示测试肽有诱导细胞毒性T细胞的活性。例如，杀伤性T细胞对靶细胞，如肿瘤细胞的活性可以用51Cr-标记的肿瘤细胞的裂解作为指标来检测。或者，可以通过用3H-胸腺嘧啶摄取活性或乳糖脱氢酶的释放作为指标来评价对肿瘤细胞的破坏程度。
用这些方法确认的具有杀伤性T细胞诱导活性的测试肽是具有DC活化效果和后续的杀伤性T细胞诱导活性的肽。所以，诱导针对肿瘤的细胞杀伤性T细胞的肽可以作为针对呈递CDH3的癌症的疫苗。而且，通过接触此肽而获得诱导针对癌症的杀伤性T细胞的活性的抗原呈递细胞可以作为抗癌疫苗。此外，通过抗原呈递细胞呈递肽而获得细胞毒性的杀伤性T细胞也可以作为针对呈递CDH3的癌症的疫苗。利用抗原呈递细胞和杀伤性T细胞所致的抗肿瘤免疫来治疗癌症的方法叫做细胞免疫治疗。
一般而言，当利用肽进行细胞免疫治疗时，通过组合具有不同结构的多种肽可以提高杀伤性T细胞的诱导效率。所以，当用蛋白片段刺激DC时，使用多于一种的肽段的混合物比较有利。
肽对抗肿瘤免疫力的诱导也可以通过观察针对肿瘤的抗体的产生来评估。例如，若用肽免疫的实验动物中诱导出针对该肽的抗体，而且如果这些抗体能够抑制肿瘤细胞的生长，增殖和/或转移，则可确认这些肽可诱导抗癌免疫力。
施用本发明的疫苗可以诱导抗肿瘤免疫力，抗肿瘤免疫力的诱导有助于治疗和预防癌症。治疗癌症或者预防癌症发病的效果可包括癌细胞生长的抑制，癌细胞的衰退，和癌细胞发展的抑制。降低癌症个体的死亡率、减少血液中的肿瘤标志物、和减轻癌症伴随的可检测症状也包括在治疗或预防癌症的效果中。这种抗癌疫苗的治疗或预防的效果优选与没有接种疫苗的对照组相比是在统计学上显著的。例如，观察到这种效果的显著性水平小于或等于5％。用于确定统计显著性的统计方法有例如，Student t检验，Mann-Whitney U检验，或ANOVA。
在本发明中，受试者优选是哺乳动物。实例包括人类，非人灵长类，小鼠，大鼠，狗，猫，马或牛，但是不局限于这些。
可以对受试者体内或回体施用本发明的肽。此外，为了产生用于治疗或预防癌症的免疫原性组合物，可以使用本发明的免疫原性肽，即SEQ IDNO：1或2的氨基酸序列，或从其变体肽中选择出的九肽。
更具体来说，本发明提供用于***或预防肿瘤的生长、转移等的药物制剂，该制剂包括一种或多种本发明的肽作为活性成分。本发明的肽对于治疗胰腺癌，胆管细胞癌，胃癌，结肠癌，非小细胞肺癌，睾丸癌，***和肿瘤如骨肉瘤和软组织肉瘤特别有用。
本发明的肽可以使用常规的配制方法配制成药物制剂施用受试者。除了本发明中的肽，这种制剂可以包括药用载体、赋形剂、和其他需要的成分。本发明的药物药剂可以用于治疗和预防各种肿瘤。
而且，为了有效的建立细胞免疫，在包含一种或更多种本发明的肽作为活性成分用于治疗和/或预防肿瘤的药物制剂中可以掺入佐剂。或者，此组合物可以与其他活性成分如抗肿瘤剂共同施用。适当的制剂还包括颗粒剂。适当的佐剂在文献(Johnson AG.，(1994)Clin.Microbiol.Rev.，7：277-89)中有所描述。佐剂的例子包括非完全弗氏佐剂，BCG，海藻糖(TDM)，脂多糖(LPS)，明矾佐剂，二氧化硅佐剂，磷酸铝，氢氧化铝，和硫酸铝钾，但不局限于这些。此外，也可以方便的使用脂质体制剂，药物附着在几微米直径的珠子上的颗粒剂，以及通过将脂类与前面提到的肽结合起来形成的药剂。施用方法可以是口服，皮内注射，皮下注射，静脉注射等，并且包括全身施用或在目标肿瘤附近局部施用。
本发明的肽的使用剂量可以根据治疗的疾病，患者的年龄、体重，施用的方法等进行适当的调整。剂量通常是0.001毫克到1,000毫克，优选的是0.01毫克到100毫克，更优选的是0.1毫克到10毫克。优选的是几天施用一次到几个月施用一次，但是本领域技术人员可以容易地选择合适的剂量和施用方法，并且完全可以在常规技术的范围内选择和优化这些参数。制剂的形式也无特别限制，可以冻干或通过加入糖等赋形剂制粒。
本发明的药物制剂中可以添加用来增加肿瘤反应性的T细胞诱导活性的佐剂，包括BCG细菌的细菌成分和胞壁酰二肽(MDP)、在Nature，vol.344，p.873(1990)中提到的ISCOM、在J.Immunol.vol.148，p.1438(1992)中描述的皂角苷系列中的QS-21、脂质体、和氢氧化铝。此外，免疫刺激剂如香菇多糖(lentinan)，西佐喃(sizofiran)，和溶链菌制剂(picibanil)也可以用作佐剂。可以加强T细胞增殖和分化的细胞因子等，如IL-2，IL-4，IL-12，IL-1，IL-6，和TNF，与通过与Toll样受体结合激活天然免疫***的CpG和脂多糖(LPS)和可以激活NKT细胞的α-半乳糖基神经酰胺也可以用做佐剂。
本发明的疫苗成分包括初次刺激(prime)杀伤性T细胞的成分。脂类已经被确定为一类可以在体内针对病毒抗原进行初次刺激的物质。例如，可以在赖氨酸的ε-氨基和α-氨基上搭接棕榈酸残基，然后与本发明的免疫原性肽连接。然后脂质肽可以通过掺入胶束或颗粒、包入脂质体或乳化在佐剂中等任一方法直接施用。另一个脂类初次刺激的可能例子是，当其与合适的肽共价结合时，用大肠杆菌(E.coli)脂蛋白，如三棕榈酰-S-甘油酰半胱氨酰-丝胺酰-丝氨酸(P3CSS)进行初次刺激(Deres K.，et al.，(1989)Nature 342：561-4)。
本发明的免疫原性肽还可以用病毒载体或细菌载体表达。适当的表达载体的例子包括减毒的病毒宿主如牛痘或禽痘。例如，可以使用痘苗病毒作为载体来表达编码所述肽的核苷酸序列。将重组痘苗病毒引入宿主细胞，表达免疫原性肽，引起免疫反应。也可以使用在如美国专利4,722,848中描述过的使用痘苗载体进行免疫的方法。也可以使用卡介苗(Bacille deCalmette et Guerin)(BCG)的。Stover CK等在(1991)Nature 31：456-60中描述了BCG载体。可用于治疗性施用或免疫的多种其他载体在本领域内是已知的，这些载体包括腺病毒和腺伴随病毒载体，逆转录病毒载体，伤寒杆菌(伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi))载体和脱毒的炭疽毒素载体。参见，例如，Shata MT，et al.，(2000)Mol.Med.Today 6：66-71；Shedlock DJ and Weiner DBet al.，(2000)J.Leukoc.Biol.68：793-806；和Hipp JD，et al.，(2000)In Vivo14：571-85。
此外，为了在患者体内有效的诱导杀伤性T细胞，在体外加入抗原肽以便将抗原呈递给从患者处收集来的细胞或呈递给其他共有部分HLA等位基因(allo)的人的细胞，然后将这些细胞血管内施用给患者或局部施用到肿瘤处。或者，将此肽加入患者的外周血淋巴细胞并在体内培养从而在体内诱导出杀伤性T细胞后，这些细胞可以血管内施用给患者或局部施用到肿瘤处。这种通过细胞转移进行的治疗作为一种癌症治疗方法已经在实行并且是一种被熟悉此领域的人所熟知的方法。
本发明的癌症类型无特别限制，具体的例子包括食道癌，乳腺癌，甲状腺癌，结肠癌，胰腺癌，恶性黑素瘤，恶性淋巴瘤，骨肉瘤，嗜铬细胞瘤，头颈癌，子宫癌，卵巢癌，脑瘤，慢性白血病，急性白血病，肾癌，***癌，肺癌，胃癌，肝癌，胆囊癌，睾丸癌、甲状腺癌，膀胱癌和肉瘤。适合使用本发明的癌症的例子优选的是胰腺癌，胆管细胞癌，胃癌，结肠癌或肺癌。
(3)本发明的抗体
本发明涉及能够识别作为抗原表位(抗原)的本发明上述的肽的一部分或完整的肽的抗体，还涉及通过利用该蛋白或该肽体外刺激而诱导的杀伤性T细胞。一般来说，杀伤性T细胞比抗体显示出更强的抗肿瘤活性。
此外，与本发明的肽相似，本发明抗体可用于预防和/或治疗表达CDH3的癌症，至少这些抗体能抑制癌症抗原CDH3的活性。在一种具体的应用中，本发明的肽或抗体可以直接施用，或与药用载体和/或稀释剂一起施用，如果需要可以与佐剂配合使用，施用方法可以是通过注射或者通过喷雾的粘膜透皮吸收之类的方法。更具体地说，人血清白蛋白可以作为此处提到的载体的例子，PBS、无菌水等可以作为稀释液的例子。
本发明的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，可以用本领域技术人员已知的方法来生产。
例如，多克隆抗体的获得可以用本发明的肽作为抗原免疫哺乳动物或鸟类，然后收集该动物或鸟类的血液，从收集来的血液中分离纯化抗体。例如，可以用于免疫的哺乳动物有如小鼠，仓鼠，豚鼠，鸡，大鼠，兔，狗，山羊，绵羊和牛，或鸟类。免疫的方法是本领域技术人员已知的，抗原可以以7到30天的间隔施用2到3次。剂量可以是，例如，每次施用约0.05毫克到2毫克的抗原。施用路径可以是皮下、皮内、腹膜内、静脉、肌肉等任何适合的途径施用，但不局限于此。此外，抗原可以在溶解于适当的缓冲液，例如，含常用的佐剂如弗氏完全佐剂或氢氧化铝的缓冲液后再使用。
经过免疫的哺乳动物或鸟类饲养一定时间，当抗体滴度增加后，可以再用如100微克到1000微克的抗原免疫它们。最后一次施用的一到两个月后，从经免疫的哺乳动物或鸟类收集血液，血液可以用常规方法来分离，从而以多克隆抗血清的形式获得识别本发明肽的多克隆抗体，其中所述的常规方法包括如离心、用硫酸铵或聚乙二醇沉淀、以及层析例如凝胶过滤层析，离子交换层析和亲和层析。
单克隆抗体可以通过制备杂交瘤获得。例如，杂交瘤细胞可以通过将抗体生产细胞与骨髓瘤细胞系融合获得。产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤可以通过如下面所述的细胞融合方法获得。
使用来自于经免疫动物的脾细胞，***细胞，B淋巴细胞等作为抗体生产细胞。将本发明的肽用作抗原。如小鼠和大鼠这样的动物可以用作经免疫动物，对这些动物施用抗原可以使用常规方法来进行。例如，将作为抗原的本发明的肽与佐剂如弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂形成的悬浮液或乳化液，通过静脉，皮下，皮内，腹膜内等途径免疫动物几次。从免疫动物中获取抗体生产细胞，如脾细胞，并可以用已知方法(G.Kohler et al.，Nature，256：495(1975))将它们与骨髓瘤细胞融合来产生杂交瘤。
P3X63Ag8，P3U1，Sp2/0等小鼠是可用于细胞融合的杂交瘤细胞系的例子。细胞融合中使用融合促进剂如聚乙二醇和仙台病毒，细胞融合后，依照常规方法使用次黄嘌呤/氨基蝶呤/胸腺嘧啶(HAT)培养基筛选杂交瘤。通过细胞融合获得的杂交瘤可以用如有限稀释法等方法来克隆。根据需要，产生特异识别本发明肽的单抗的细胞系可以用本发明的肽通过酶联免疫测定筛选获得。
除上述方法之外，可以通过使用本发明的肽、表达所述肽的细胞、或其裂解物体外刺激人淋巴细胞，如感染了EB病毒的淋巴细胞，来制备免疫细胞。与本发明的肽结合的人抗体可以通过融合这样的经免疫的淋巴细胞和人来源的骨髓瘤细胞如U266(特开昭63-17688)来获得。
为了从这样获得的杂交瘤细胞中得到需要的单克隆抗体，可以用常规培养方法或腹水形成方法培养杂交瘤，可以从培养上清液或腹水中纯化单克隆抗体。从培养上清液或腹水中纯化单克隆抗体可以使用常规方法。例如，硫酸铵分级、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析等，根据需要可以组合使用。
此外，也可以用本发明肽，表达所述肽的细胞、或其裂解物来免疫具有一组人抗体基因的转基因动物。可以从经免疫的转基因动物中获取抗体生成细胞与上述骨髓瘤细胞系融合获得杂交瘤。需要的单抗可以从杂交瘤中产生(WO92-03918；WO94-02602；WO94-25585；WO94-33735；WO96-34096)。
或者，也可以使用癌基因使生产抗体的免疫细胞(如经免疫的淋巴细胞)永生化，用来制备单克隆抗体。
这样获取的单克隆抗体也可以用基因操作技术(Borrbaeck and Larrick，(1990)Therapeutic Monoclonal Antibodies)进行调节。例如，可以从抗体生产细胞(如杂交瘤和经免疫的淋巴细胞)中克隆编码抗体的DNA，将其***适当的载体，转化入宿主细胞来制备重组抗体。
本发明的抗体还可以是抗体片段或修饰的抗体，只要它们可以与本发明的肽结合即可。抗体片段可以是Fab，F(ab’)2，Fv，或单链Fv(scFv)，其中来自于H和L链的Fv片段以合适的接头连接在一起(Huston et al.，(1998)Proc Natl Acad Sci USA 85：5879-83)。具体来说，可以用酶如木瓜蛋白酶和胃蛋白酶(Co et al.，(1994)J Immunol 152：2968-76；Better and Horwitz，(1989)Methods Enzymol 178：476-96；Pluckthun and Skerra，(1989)Methods Emzymol178：497-515；Lamoyi(1986)Methods Enzymol 121：652-63；Rousseaux et al.，(1986)Methods Enzymol 121：663-9；Bird and Walker，(1991)Trends Biotech 9：132-7)来处理抗体，获得抗体片段。
本发明的抗体包括连接各种分子如聚乙二醇(PEG)而获得的修饰抗体。抗体可以用本技术领域已知的常规的化学修饰方法来进行修饰。
本发明的抗体包括嵌合抗体和人源化抗体，嵌合抗体包含来源于非人抗体的可变区和来源于人抗体的恒定区，人源化抗体包括来源于非人抗体的互补决定区(CDR)、来源于人抗体的框架区(FR)和来源于人抗体的恒定区。这样的抗体可以用本技术领域已知的常规方法制备。人源化抗体是用具有需要的结合活性的人抗体的CDR序列区域取代啮齿动物的CDR区而获得的(Verhoeyen et al.，(1988)Science 239：1534-6)。相应地，与嵌合抗体相比，人源化抗体是在一个更小的区域内用相应的非人源区域取代人抗体而得到的抗体。
还可以制备具有人的框架区、恒定区和人的可变区的完整人抗体。例如，在一种体外方法中，可以利用展示人抗体片段的噬菌体重组文库来进行筛选(Hoogenboom and Winter，(1992)J Mol Biol 227：381-8)。相似地，可以通过将人免疫球蛋白基因座位引入内源性免疫球蛋白基因部分或完全失活的转基因动物来制备人抗体(US6,150,584，US5,545,807，US5,545,806，US5,569,825，US5,625,126，US5,633,425，US5,661,016)。
如上所述获得的抗体可以用本领域已知的常规方法进行纯化。例如，可以使用普通的蛋白分离和纯化方法。抗体的分离纯化可以组合使用柱层析法如亲和层析，过滤，超滤，盐析，透析，SDS聚丙烯凝胶电泳，等电聚焦电泳等；但是分离纯化方法不局限于这些方法(Antibodies：A LaboratoryManual，Ed Harlow and David Lane，(1988)Cold Spring Harbor Laboratory)。蛋白A柱和蛋白G柱可以用作亲和柱。蛋白A柱用的典型例子有HyperD，POROS和Sepharose F.F(Pharmacia)。
除了亲和层析外，离子交换层析，疏水层析，凝胶过滤，反相层析，吸附层析等也是层析的例子(Strategies for Protein Purification andCharacterization：A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.et al.)。液相色谱如HPLC和FPLC也可以用作层析。
本发明抗体的抗原结合亲和力可以用一些方法测量，例如，吸光率测定，酶联免疫吸附测定(ELISA)，酶免疫测定(EIA)，放射性免疫测定(RIA)，和免疫荧光测定；然而，方法不局限于此。对ELISA来说，将本发明的抗体固定在平板上，加入本发明的肽，再加入含有抗体生产细胞的细胞培养上清液或纯化抗体的样本。下一步，加入具有可检测标记、并且能够识别抗原结合亲和力待测的抗体的第二抗体。洗涤平板后，加入用于检测第二抗体上标记物的试剂，检测吸光度等。例如，酶如碱性磷酸酶可以用作第二抗体的标记物，酶底物如磷酸对硝基苯酯可以用作检测试剂。BIAcore(Pharmacia)也可以用于评估抗体活性。
本发明的抗体可以检测包含在样品中的本发明的肽。即，例如，通过将癌组织的活检样本暴露于本发明的抗体，可以确认本发明的肽在癌组织中的存在。
在使用本发明肽治疗和/或预防癌症之前，用本发明的抗体确认本发明肽在将进行治疗的癌症中的表达情况，可以在治疗前对是否能够有效治疗受试者进行预测。
此外，由于本发明抗体识别CDH3肽片段，而该肽段的表达在癌细胞中增加，所以认为该肽段不仅可以应用于诊断，也可以用于治疗。
(4)辅助性T细胞，杀伤性T细胞，或包含这些细胞的免疫细胞群
本发明也涉及用本发明的肽在体外刺激产生的辅助性T细胞，杀伤性T细胞或包含它们的免疫细胞群。例如，当使用本发明肽在体外刺激外周血淋巴细胞或肿瘤浸润性淋巴细胞时，可诱导产生肿瘤反应性的活化的T细胞，这些活化的T细胞可以有效地用于过继性免疫治疗。此外，作为强力的抗原呈递细胞，树突细胞也可以用本发明肽进行冲激或可以通过转化来表达这些肽，然后可以利用这些树突细胞在体内或体外刺激T细胞来诱导抗肿瘤的免疫应答。
优选地，可以使用本发明的肽和免疫刺激剂进行体外刺激，来产生辅助性T细胞、杀伤性T细胞或包含它们的免疫细胞群。此处的免疫刺激剂包括细胞生长因子或细胞因子。
向体内输注如上所述获得的辅助性T细胞，杀伤性T细胞或包含这些细胞的免疫细胞群，可以抑制肿瘤细胞并且可以预防和/或治疗癌症。
如上所述的可以抑制肿瘤的辅助性T细胞、杀伤性T细胞，或包含这些细胞的免疫细胞群，也可以用本发明的肽来制备。所以，本发明提供含有本发明肽的细胞培养基。可以用这样的细胞培养基制备可以抑制肿瘤的辅助性T细胞、杀伤性T细胞，或包含这些细胞的免疫细胞群。此外，本发明提供包括上述的细胞培养基和细胞培养容器的细胞培养试剂盒用于制备辅助性T细胞、杀伤性T细胞，或包含这些细胞的免疫细胞群。
(5)抗原呈递外来体
本发明进一步提供一种称为“外来体”(exosome)的细胞内小泡，该外来体将本发明肽和HLA抗原之间形成的复合物呈递到其表面。外来体可以使用例如在第平11-510507号和第2000-512161号中公开的日语翻译中详细描述的方法进行制备。优选地，可以用从治疗和/或预防的目标受试者获取的抗原呈递细胞来制备该外来体。可以用与本发明肽相似的方式将本发明的外来体作为癌症疫苗接种。
在本发明中使用的HLA抗原类型应该与需要治疗和/或预防的受试者的HLA抗原类型相匹配。例如HLA-A2，优选的是HLA-A2(HLA-A*0201)。“HLA-A2”表示蛋白，“HLA-A*0201”表示与该蛋白的区段相应的基因(使用这种叫法是因为目前没有代表该蛋白区段的词)。
(6)诱导抗原呈递细胞和杀伤性T细胞的方法
本发明提供使用一种或多种本发明的肽诱导抗原呈递细胞的方法。可以用本发明的一种或多种肽冲激由外周血单核细胞诱导而来的树突细胞来诱导抗原呈递细胞。当对受试者施用本发明的肽时，可以在受试者体内诱导出在其表面呈递本发明的肽的抗原呈递细胞。或者，使抗原呈递细胞与本发明的肽接触后(或在利用本发明肽冲激抗原呈递细胞之后)，可以将该细胞作为疫苗用回体施用方法施用给受试者。例如，回体施用方法包括步骤：
(1)从受试者处收集抗原呈递细胞；和
(2)使步骤(1)中的抗原呈递细胞接触本发明的肽(或者利用本发明肽冲激步骤(1)中的抗原呈递细胞)。
可以将从步骤(2)中获取的抗原呈递细胞作为疫苗施用受试者。
本发明也包括提供诱导具有高水平的杀伤性T细胞诱导活性的抗原呈递细胞的方法。这种方法包括体外转染基因进入抗原呈递细胞，此基因包含编码一种或多种本发明的肽的多核苷酸。用于转染的基因可以是DNA或RNA。在转染方法方面，本领域常规使用的各种方法均可适用，如脂质体，电穿孔和磷酸钙方法，但不局限于此。具体来说，转染可以按照Reeves ME，et al.，(1996)Cancer Res.，56：5672-7；Butterfield LH，et al.，(1998)J.Immunol.，161：5607-13；Boczkowski D，et al.，(1996)J Exp.Med.，184：465-72；和WO2000-509281的日语译本中的描述进行。当基因转入抗原呈递细胞后，在细胞内得以转录和翻译。这样获得的蛋白沿着I型MHC或II型MHC通路进行加工，经过抗原呈递通路并且以部分肽的形式呈递在抗原呈递细胞的表面。
本发明进一步提供用一种或多种本发明的肽诱导杀伤性T细胞的方法。通过将一种或多种本发明的肽施用于受试者，可以在受试者体内诱导出杀伤性T细胞，从而加强针对肿瘤组织中呈递CDH3的癌细胞的免疫***。另一种方式，可以通过在体外使来自受试者的抗原呈递细胞和CD8阳性细胞与一种或多种本发明的肽接触，然后进一步体外使外周血单核白细胞与抗原呈递细胞接触来刺激细胞从而诱导活化的杀伤性T细胞。在回体治疗方法中，可以通过将活化的杀伤性T细胞回输给受试者来增强针对受试者癌组织中呈递CDH3的目标癌细胞的免疫***。例如，此方法包括步骤；
(1)从受试者收集抗原呈递细胞；
(2)使步骤(1)中的抗原呈递细胞接触本发明的肽(或利用本发明的肽冲激步骤(1)中的抗原呈递细胞)；
(3)，将(2)中的抗原呈递细胞与CD8+T细胞混合并共培养来诱导细胞毒性T细胞；和
(4)从(3)共培养物中收集CD8+T细胞
从(4)中获得的具有细胞毒性的CD8+T细胞可以作为疫苗施用受试者。
本发明进一步提供分离用一种或多种本发明的肽诱导的杀伤性T细胞的方法。优选地，用本发明的方法诱导的杀伤性T细胞是来源于要进行治疗和/或预防的受试者。它们可以和其他药剂，包括呈递本发明一种或多种肽的抗原呈递细胞或外来体，组合施用。获得的杀伤性T细胞特异性地针对呈递与诱导所用的肽相同的肽的靶细胞。靶细胞是内源性表达CDH3的细胞或者是转染了CDH3基因的细胞。经过本发明的肽刺激而在其表面呈递本发明的肽的细胞，如来自于胰腺癌，胆管细胞癌，胃癌，结肠癌，非小细胞肺癌，睾丸癌，***，骨肉瘤和软组织肉瘤的癌细胞，可以作为攻击的目标。
本发明也提供呈递HLA抗原和一种或多种本发明的肽的复合物的抗原呈递细胞。表达一种或多种本发明的肽或编码这些肽的核苷酸的抗原呈递细胞，优选地是从将进行治疗和/或预防的受试者收集获得的。本发明的肽、呈递此肽的抗原呈递细胞、外来体、或活化的杀伤性T细胞，可以作为疫苗与其他药剂组合使用。
将在下面的实施例中对本发明作进一步的说明。然而，本发明不局限于这些实施例。
本说明书中引用的所有现有技术文献均通过援引方式并入本文。
实施例
[实施例1]
CDH3在恶性肿瘤中的表达
根据此前cDNA基因微阵列分析的结果，在包括胃癌，大肠癌等多种恶性肿瘤中，CDH3的表达高于临近的正常组织(表1)(Nakamura T，et al.，Oncogene 2004；23：2385-2400；Kitahara O，Cancer Res 2001；61：3544-3549.，Obama K，et al.，Hepatology 2005；41：1339-1348.)。
[表1]
  数目  阳性率*(％)   相对表达率(平均值)
  胰腺癌   16/16  100   1,900,000
  睾丸癌   10/10  100   396,000
  软组织肉瘤   21/21  100   248,000
  胆管细胞癌   19/19  100   3,600
  数目  阳性率*(％)   相对表达率(平均值)
  非小细胞肺癌   35/37  95   73,000
  结直肠癌   31/34  91   84,000
  ***   14/19  74   1,500
  胃癌   20/28  71   35,000
  膀胱癌   24/34  71   30
  小细胞肺癌   3/14  21   7
  乳腺癌   5/81  6   1
  ***癌   2/57  4   1,500
  肾细胞癌   0/20  0   0
  食道癌   0/19  0   2
*相对表达比(癌症/正常组织)＞5时视为“阳性”。
[实施例2]
具有结合HLA-A2能力的CDH3肽库的选择。
利用BIMAS***对人CDH3氨基酸序列进行搜索，按照与HLA-A2的推定结合亲和性进行降序排列并选择出结合能力较强的18种肽(表2)。
[表2]
本发明鉴定出的HLA-A2限制性杀伤性T细胞表位用下划线进行标识。
[实施例3]
首先，利用此前描述的方法(Komori H et al.Clinical Cancer Research 12：2689-2697，2006)从HLA-A2转基因小鼠的骨髓细胞中诱导出树突细胞(DC)。随后，如此获得的BM-DC用CDH3肽(10μM)冲激后，以5×105个细胞/小鼠的量腹膜内施用给HLA-A2转基因小鼠。以一周间隔施用两次进行免疫之后，将小鼠脾细胞收集起来用于检测杀伤性T细胞。为了能够精确地测定来源于CD8+T细胞的杀伤性T细胞的诱导，在摘出脾脏后利用MACS微珠去除脾细胞中的CD4+T细胞，使用这样的脾细胞。
图1展示的是用于确定能够被HLA-A2转基因小鼠中的HLA-A2限制性杀伤T细胞识别的CDH3肽的规程。将从免疫过的小鼠中收集脾细胞的日期设定为“第0天”。
第21天：(1)通过向来自于HLA-A2转基因小鼠的骨髓细胞加入GM-CSF来启动骨髓来源的树突细胞(下文中将其称为“BM-DC”)的诱导。
第14天：(2)向诱导出的BM-DC中加入含有三种CDH3肽的混合物。两小时之后以5×105个细胞/小鼠的量腹膜内施用该BM-DC。
以1周的间隔重复(1)和(2)步骤两次。
第0天：从免疫过的HLA-A2转基因小鼠中收获脾细胞，并将该细胞与BM-DC共培养六天，在共培养之前利用CDH3肽再次孵育该BM-DC两小时。
第6天：为了检测能够识别CDH3的杀伤性T细胞，在抗原刺激之后利用ELISPOT测定对T细胞产生的伽玛干扰素(IFN-γ)进行了定量。使用经CDH3肽冲激过的BM-DC和未冲激过的BM-DC作为靶细胞。
通过ELISPOT测定考察CDH3特异性杀伤T细胞的活性：
为了确认在这些细胞中确实已经存在能够特异地与CDH3反应并产生IFN-γ的杀伤性T细胞，通过ELISPOT测定对其进行了考察。利用MouseIFN-γELISPOT Set(BD Biosciences)检测了IFN-γ。当杀伤性T细胞(效应物)对刺激物细胞(靶)产生应答并生成IFN-γ时，IFN-γ可以作为红色斑点被检测到。使用BM-DC或者经CDH3肽冲激的BM-DC作为靶细胞。首先，利用抗小鼠IFN-γ抗体包被ELISPOT板(BD Biosciences)18个小时，然后利用10％FCS/RPMI封闭2小时。将效应物细胞(100微升/孔)和靶细胞(100微升/孔)混合，并在37℃培养22小时。该实验是按照效应物/靶比例(E/T比)为10∶1进行的。然后利用无菌水洗涤该板并使该板与生物素标记的抗小鼠IFN-γ反应两小时，此后进一步的与链霉抗生物素蛋白-HRP反应一小时。在底物溶液中检出了IFN-γ阳性点。使用MINERVATECH的自动分析软件对斑点进行了计数。结果是，在利用CDH3-4或者CDH3-7两种肽诱导的杀伤性T细胞中观察到了CDH3特异性杀伤T细胞免疫应答，而用其他的肽诱导的杀伤性T细胞中则没有观察到CDH3特异性免疫应答(图2和3)。
用CDH3-4肽(SEQ ID NO：1)和CDH3-7肽(SEQ ID NO：2)诱导的杀伤性T细胞的ELISPOT测定结果如图3所示。
针对用CDH3-4肽(SEQ ID NO：1)冲激过的BM-DC，杀伤性T细胞显示了283.7±40.0个点/孔的应答，但是在未经肽冲激的BM-DC存在的情况下杀伤性T细胞显示出48.7±11.9个点/孔的应答(P＜0.05)。同样地，针对用CDH3-7肽(SEQ ID NO：2)冲激过的BM-DC，杀伤性T细胞显示了79.3±3.2个点/孔的应答，而在未肽冲激的BM-DC存在的情况下显示出42.7个点/孔(P＜0.05)。
统计分析：
使用双尾Student t检验(Two-tailed Student’s t test)方法来评估从ELISPOT测定获得的数据及治疗群体的肿瘤大小的统计显著性。P值＜0.05认为是显著的。统计分析使用商业的统计学分析软件(SPSS for Windows(TM)，version 11.0，Chicago，IL，USA)。
[实施例4]
细胞系和HLA表达：
用于评估细胞毒活性的人胰腺癌细胞系PANC1、口腔癌细胞系HSC3、和TAP-缺陷与HLA-A2(A*0201)阳性细胞系T2均是从Riken Cell Bank(Tsukuba，Japan)购买的。人胰腺癌细胞系PK8由日本东北大学老年医学研究所医用细胞资源中心友情提供。人结肠癌细胞系HCT116由Dr.B.Vogelstein，Johns Hopkins University(Baltimore，MD)友情提供。人肝癌细胞系SKHep1由日本久留美大学(Kurume，Japan)伊藤恭悟教授友情提供。为了筛选HLA-A2阳性血供体和用于细胞毒性测定的靶细胞系，用抗HLA-A2单克隆抗体(mAb)BB7.2(One Lambda，Inc.，Canoga Park，CA，USA)对HLA-A2的表达情况进行流式细胞术检测。这些细胞用加有10％FCS的RPMI 1640或DMEM培养基在37℃5％CO2中培养。
慢病毒基因转移：
慢病毒载体介导的基因转移的操作按照先前的描述进行(Tahara-Hanaoka S，et al.Exp Hematol 2002；30：11-17)。简言之，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen Corporation，CA，USA)，将携带CDH3cDNA的17微克自灭活载体CSII-CMV-RfA和CSIIEF-RfA(Miyoshi H，et al.J Virol1998；72：8150-8157)与10微克pCMV-VSV-G-RSV-Rev和pCAG-HIVgp转入10厘米培养皿上生长的293T细胞。60小时后，回收培养基，用超速离心法(50,000xg，2小时)沉降病毒颗粒。用50微升RPMI 1640培养基重悬沉淀，将10微升病毒悬液加入到以每孔5×104个细胞的浓度接种的培养在平底96-孔板的PANC1细胞或SKHep1细胞。转染CDH3的表达用Western印迹分析来确定。
CDH3反应性人CTL的诱导
用Ficoll-Conray密度梯度离心从HLA-A2阳性的胰腺癌患者、胃癌患者、结肠癌患者或健康人供者的肝素化的血液中分离PBMC。用先前报道的方法(Yoshitake Y，et al.Clin Cancer Res 2004；10：6437-6448，Komori H，et al.Clin Cancer Res 2006；12：2689-2697)制备来源于外周单核细胞的DC。在37℃、加有2％热灭活的自体血清的AIM-V(Invitrogen)中，存在4微克/毫升β2-微球蛋白(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)的条件下，利用20微克/毫升的候选肽冲激DC 2小时。然后照射这些DC(40Gy)，再与CD8阳性细胞共孵育。孵育在24孔板中进行，每个孔包含2毫升加有2％热灭活的自体血清的AIM-V、1×105个肽冲激过的DC、2×106个CD8+T细胞和5纳克/毫升人重组IL-7(Wako，Osaka，Japan)。两天后，向这些培养物中加入人重组IL-2(PeproTec Inc.)至终浓度20IU/毫升。使用经相同的肽冲激过的自体DC，以相同的方法再刺激两次，每周一次(在第7天和第14天)。在最后一次刺激后的第六天，用51Cr释放测定和IFN-γELISPOT测定来评估诱导出的CTL的抗原特异性应答。将用作靶细胞的各种癌症细胞或肽冲激过的T2细胞(5×103个细胞/孔)与CTL以适当的效应物/靶细胞比例共培养，用已知的方法进行51Cr释放测定(Komori H，et al.，Clin Cancer Res 2006；12：2689-2697)。
尝试通过利用CDH3-4655-663和CDH3-7757-765肽刺激从来源于HLA-A2阳性的健康供者和各种癌症患者PBMC诱导CDH3-特异的CTL。将从PBMC中分选出的CD8T细胞与来源于自体单个核细胞(单核细胞)的、用每种肽冲激过的DC进行共孵育。经过三次刺激，用51Cr释放测定(图4A)和IFN-γELISPOT测定评估对肽冲激过的T2细胞的细胞杀伤效果。从健康供者的PBMC诱导的CTL显示出对经CDH3-4655-663肽或CDH3-7757-765肽冲激过的T2细胞的杀伤效果，但是对没有经过肽冲激的T2细胞没有杀伤效果。在其他供体上也观察到相似的应答。这些结果表明这些CTL具有肽特异的细胞毒性。
接着，检测了这些CTL对表达CDH3和HLA-A2的人癌细胞系的细胞毒活性。如图4B中所示，用CDH3-4655-663肽刺激得到的CDH3反应性的CTL在正常供者中显示出对HCT116(CDH3+，HLA-A2+)、HSC3(CDH3+，HLA-A2+)、和PANC1/CDH3(CDH3+，HLA-A2+)的细胞毒性，其中PANC1细胞中已经转入CDH3基因；然而，这些CTL对PANC1(CDH3-，HLA-A2+)、SKHep1(CDH3-，HLA-A2+)和PK8(CDH3+，HLA-A2-)并没有展示相同的效果。相似地，用CDH3-7757-765肽刺激的CTL对HSC3显示出细胞毒性，但是对PANC1、PK8、和SKHep1无细胞毒性。可以从来源于各种癌症患者的CTL中观察到这种细胞毒性(图4C)。
为了确认在自然条件下这些肽是否可以从CDH3蛋白加工产生，将PANC1/CDH3和SKHep1/CDH3(CDH3+，HLA-A2+)用作靶细胞，其中SKHep1细胞中已转入CDH3基因。如图4C所示，用CDH3-4655-663或CDH3-7757-765肽刺激诱导出的CTL对HCT116、PANC1/CDH3和SKHep1/CDH3显示出细胞毒性，但是对PANC1、SKHep1和PK8没有细胞毒性。以上结果表明这些肽在自然状态下被加工，并与HLA-A2分子一起呈递在癌细胞表面。CDH3反应性的CTL对表达内源性CDH3和HLA-A2分子二者的癌细胞显示出特异的细胞毒性。
I类HLA限制性的确认：
为了确认诱导出的CTL是否可以以I类HLA限制的方式识别靶细胞，将靶癌细胞与10微克/毫升抗I类HLA单克隆抗体(W6/32)或10微克/毫升抗-HLA-DR单克隆抗体(H-DR-1)温育1小时，然后与CTL和用于51Cr释放测定或ELISPOT测定的癌细胞系共培养前，并用已知的方法(Gomi S，et al.，JImmunol 1999；163：4994-5004)检测单克隆抗体对CTL的细胞毒性或IFN-γ的产生的影响。结果，在由CDH3-4655-663肽刺激产生的CTL针对抗SKHep1/CDH3的ELISPOT测定中，抗I类HLA抗体可以统计学显著性地抑制IFN-γ的产生(图4D，左，P＜0.01)。在51Cr释放测定中该抗体也可以抑制针对HCT116的细胞毒活性(图4D，中)。相似地，在由CDH3-7757-765肽刺激产生的CTL针对HSC3细胞的ELISPOT测定中，抗I类HLA抗体可以统计学显著性地抑制IFN-γ的产生(图4D，右，P＜0.01)。这些结果提示诱导的CTL以I类HLA限制的方式识别表达CDH3的靶细胞。
[实施例5]
过继免疫疗法
对NOD/SCID小鼠过继免疫的CDH3诱导的人CTL的体内抗癌活性：
为了评估CDH3反应性的CTL施用于移植有CDH3阳性人癌细胞的小鼠后对小鼠的治疗效果，如先前所述(Komori H，et al.Clin Cancer Res 2006；12：2689-2697)进行了实验性过继免疫治疗。简单地说，对NOD/SCID小鼠的右胁部皮下接种对HLA-A2和内源性CDH3均为阳性的HCT116细胞(4×106个细胞)。当小鼠接种肿瘤后的第7天肿瘤大小为25平方毫米时，分别用CDH3肽-4655-663特异的CTL系、或CDH3肽-7757-765-特异的CTL系、或作为阴性对照的用HLA-A2限制性HIV肽(SLYNTYATL，SEQ ID NO：19)刺激的来自5位健康供者的CD8+T细胞系，悬浮在100微升PBS中，对小鼠作静脉注射(4×106)。在第14天再次进行T细胞静脉注射。肿瘤大小一周测量2次，用测径器测量2个相互垂直的直径。用双尾Student’s t检验评估肿瘤尺寸的统计显著性。P值＜0.05认为是显著的。用商业化的统计分析软件包(SPSS for Windows(TM)，version 11.0.)进行统计学分析。
对照HIV肽刺激的CD8+T细胞在体外不显示对HCT116的细胞毒性。评估每组7只小鼠的肿瘤尺寸(图5A)和每组肿瘤大小的平均值±标准偏差(图5B)。对照T细胞系和单独的PBS对肿瘤生长都没有抑制效果。接种了CDH3刺激的CTL的小鼠的肿瘤尺寸明显小于分别接种单独的PBS或接种对照HIV肽诱导的CD8+T细胞的小鼠中的肿瘤尺寸(P＜0.001)。这些结果说明了CDH3反应性人CTL的过继性转移免疫治疗对于NOD/SCID小鼠中的CDH3+人肿瘤的效力。
讨论：
在本研究中，发明人通过对胰腺癌进行cDNA基因微阵列分析鉴定出钙黏着蛋白3(CDH3)/P-钙黏着蛋白是一种新的TAA。根据cDNA基因微阵列分析发现，CDH3在胰腺癌细胞中有很强的表达而在卵巢和乳腺中微弱表达。在其他的器官中很难检测到CDH3的表达。而且，微阵列和RT-PCR的数据显示除了在胰腺癌中CDH3也在胃癌和结直肠癌中有表达，而在对应的正常组织中几乎没有表达。已经有研究者报道，通过免疫组化染色发现在大多数胰腺癌组织中CDH3是过表达的，而在胰腺的正常的导管和腺泡细胞中几乎没有表达(Taniuchi K，et al.Cancer Res 2005；65：3092-3099)。这些结果表明CDH3可以是对上述癌症进行免疫治疗的新的靶标，而该靶标引起自身免疫反应的风险很小。
根据其组织分布可将钙黏着蛋白家族分为不同的亚家族，包括钙黏着蛋白1(CDH1)/E-钙黏着蛋白，钙黏着蛋白2(CDH2)/N-钙黏着蛋白，以及钙黏着蛋白3(CDH3)/P-钙黏着蛋白。CDH1是主要的钙黏着蛋白家族成员，该蛋白表达在所有的上皮组织中。研究者推测CDH1起到肿瘤抑制因子的作用，该蛋白对癌细胞的浸润和扩散起到负调节作用(Frixen U H，et al.J CellBiol 1991；113：173-185，Berx G，et al.Genomics 1995；26：281-289，Oka H，et al.Cancer Res 1993；53：1696-1701)。在浸润性癌症中CDH2的表达增加，并且CDH2可以通过与成纤维细胞生长因子(FGF)以及下游信号传导相互作用而促进浸润现象(Suyama K，et al.Cancer Cell 2002；2：301-314)。对CDH3在癌症中的表达和作用的了解非常少。在此前的研究中Taniuchi等人表明了CDH3的表达的增加可能是增强胰腺癌浸润作用的一个因素，可能是通过与p120ctn和Rho家族GTP酶Rac1和Cdc42发生相互作用来增强胰腺癌的浸润性的(Taniuchi K，et al.Cancer Res 2005；65：3092-3099)。其他的在先研究提示CDH3也是乳腺癌(Palacios J，et al.Am J Pathol 1995；146：605-612，Paredes J，et al.Clin Cancer Res 2005；11：5869-5877，Peralta SolerA，et al.Cancer 1999；86：1263-1272)和子宫内膜癌(Stefansson I M，et al.JClin Oncol 2004；22：1242-1252.)中浸润性增加以及预后变差的因素。
将此前的报道综合在一起可以发现临床试验中癌症疫苗对于癌症的客观应答率仅为2.6％(Rosenberg S A，et al.Nat Med 2004；10：909-915)。一个可能的原因是，免疫诱导性治疗的结果使得癌细胞TAA缺失、突变或者下调，导致癌细胞得以躲避免疫反应。基于肿瘤细胞不能够失去肿瘤发生所需要的抗原的观点，CDH3将会是抗癌免疫治疗的一个有用的备选TAA。
在本发明中，发明者从通过BIMAS算法筛选出来的18个备选肽中鉴定出了两种HLA-A2限制性CDH3表位肽，已经确认该两种肽能够在HLA-A2.1(HHD)转基因小鼠中诱导HLA-A2限制性小鼠CTL。进一步地，发明者确认了通过使用这些肽能够从来自于健康供体和癌症患者的PBMC产生CDH3反应性的CTL(图4)。这些CTL不仅对经过相应的肽冲激的T2细胞有杀伤作用，也能够杀伤表达CDH3和HLA-A2的癌细胞系。上述结果提示，该CDH3肽(CDH3-4655-663和CDH3-7757-765)可在癌细胞中通过对CDH3蛋白的加工而天然地产生，并且细胞会将这些肽与HLA-A2分子一起呈递到细胞表面然后被CTL所识别。
本发明的CDH3反应性CTL的细胞毒性，已经通过体外的51Cr释放测定和体内的CTL过继免疫治疗得到了确认。如图5所示，与对照的CD8+细胞相比，静脉注射通过本发明的肽诱导过的CD8+细胞显著地抑制了NOD/SCID小鼠中移植的肿瘤的生长。
HLA-A2(A*0201)在包括亚洲人，非洲人，美洲黑人以及白种人在内的多种人种中都是最普通的HLA等位基因之一(Browning M.et al.ImmunolToday 1996；17：165-170)。因此，如果能够在医学探索中证明本发明鉴定出的肽在癌症免疫治疗中的安全性和有效性，那么这些能够被杀伤性T细胞通过HLA-A2呈递的肽具有全球性的临床应用的可能。进一步地，由于携带HLA-A2的人在日本人和全人类中都是常见的，鉴定出被杀伤性T细胞通过HLA-A2呈递的肽，很可能为全球大约30％的胰腺癌患者适用的癌症免疫治疗用药物的开发提供可能。
工业实用性
HLA-A2是大约30％日本人具有的I类HLA等位基因。当利用本发明的CDH3肽免疫表达人HLA-A2的转基因小鼠时，这些肽会通过诱导能够识别结合于HLA-A2分子的该肽的细胞毒性T细胞而诱导免疫应答。这些肽在人类中也很有可能诱导出人细胞毒性T细胞，该T细胞能够杀伤表达该肽和HLA-A2分子所成的复合物的癌细胞。因此，本发明的肽可以应用于对HLA-A2阳性的胰腺癌、胆管细胞癌、胃癌、结肠癌以及非小细胞肺癌患者进行免疫治疗。因此，这些肽可望通过抑制上述癌症的增殖和/或恶化来提高患者的QOL。
序列表
<110>肿瘤疗法科学股份有限公司(0NCOTHERAPY SCIENCE，INC.)
     NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION KUMAMOTO UNIVERSITY
     THE UNIVERSITY OF TOKYO
 
<120>CDH3肽以及含有CDH3肽的药剂
 
<130>ONC-A0711P
 
<150>JP 2007-213999
<151>2007-08-20
 
<160>19
<170>PatentIn version 3.4
 
<210>1
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
 
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<223>人工合成的肽序列
 
<400>1
 
Phe Ile Leu Pro Val Leu Gly Ala Val
1               5
 
<210>2
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<212>PRT
<213>人工的
 
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<223>人工合成的肽序列
 
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1               5
 
<210>3
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<212>PRT
<213>人工的
 
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<223>人工合成的肽序列
 
<400>3
Val Leu Gly Ala Val Leu Ala Leu Leu
1               5
 
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<213>人工的
 
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<223>人工合成的肽序列
 
<400>4
Gln Leu Thr Val Ile Arg Ala Thr Val
1               5
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<223>人工合成的肽序列
 
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Val Val Leu Ser Leu Lys Lys Phe Leu
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Lys Leu Pro Thr Ser Thr Ala Thr Ile
1               5
 
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Ala Val Ser Glu Asn Gly Ala Ser Val
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<213>人工的
 
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<223>人工合成的肽序列
 
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Ser Pro Pro Glu Gly Val Phe Ala Val
1               5
 
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Val Leu Pro Gly Thr Ser Val Met Gln Val
1               5                   10
 
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<212>PRT
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Thr Leu Asp Arg Glu Asp Glu Gln Phe Val
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<210>12
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<212>PRT
<213>人工的
 
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<223>人工合成的肽序列
 
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Lys Leu Pro Thr Ser Thr Ala Thr Ile Val
1               5                   10
 
<210>13
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<212>PRT
<213>人工的
 
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1               5                   10
 
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<212>PRT
<213>人工的
 
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Phe Ser Thr Asp Asn Asp Asp Phe Thr Val
1               5                   10
 
<210>15
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<212>PRT
<213>人工的
 
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<223>人工合成的肽序列
 
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Gly Leu Pro Arg Gly Pro Leu Ala Ser Leu
1               5                   10
 
<210>16
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<212>PRT
<213>人工的
 
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<223>人工合成的肽序列
 
<400>16
 
Ile Leu Arg Arg His Lys Arg Asp Trp Val
1               5                   10
 
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<212>PRT
<213>人工的
 
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<400>17
 
Ser Val Leu Glu Gly Val Leu Pro Gly Thr
1               5                   10
 
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<213>人工的
 
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<223>人工合成的肽序列
 
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Phe Ile Leu Pro Val Leu Gly Ala Val Leu
1               5                   10
 
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<212>PRT
<213>人工的
 
<220>
<223>人工合成的肽序列
 
<400>19
 
Ser Leu Tyr Asn Thr Tyr Ala Thr Leu
1               5

Claims (21)

1.以下(A)或(B)的肽：
(A)包含SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列的肽；
(B)包含在SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列中取代、缺失、***和/或增加一个、两个或者几个氨基酸而得到的氨基酸序列的肽，其中该肽具有诱导细胞毒性(杀伤性)T细胞的活性。
2.权利要求1的肽，其中自N末端起的第二个氨基酸是亮氨酸或者甲硫氨酸。
3.权利要求1的肽，其中C末端氨基酸是缬氨酸或亮氨酸。
4.一种用于诱导针对癌症的免疫力的药剂，该药剂含有一种或多种权利要求1的肽作为活性成分。
5.一种用于治疗和/或预防癌症的药剂，该药剂含有一种或多种权利要求1的肽作为活性成分。
6.一种用于诱导具有细胞毒性(杀伤性)T细胞诱导活性的抗原呈递细胞的药剂，该药剂含有一种或多种权利要求1的肽作为活性成分。
7.一种用于诱导具有细胞毒性(杀伤性)T细胞诱导性活性的抗原呈递细胞的药剂，该药剂含有一种或多种编码权利要求1的肽的多核苷酸作为活性成分。
8.一种用于诱导细胞毒性(杀伤性)T细胞的药剂，该药剂含有一种或多种权利要求1的肽作为活性成分。
9.针对权利要求1的肽的抗体。
10.使用权利要求1的肽诱导的辅助性T细胞、细胞毒性(杀伤性)T细胞或者包含这些细胞的免疫细胞群。
11.一种抗原呈递细胞，其呈递包含权利要求1的肽及HLA抗原的复合物。
12.权利要求11的抗原呈递细胞，该细胞是被权利要求6或7的药剂所诱导的。
13.一种外来体，其呈递包含权利要求1的肽及HLA抗原的复合物。
14.权利要求13的外来体，其中所述HLA抗原是HLA-A2(HLA-A2*0201)。
15.一种诱导具有细胞毒性(杀伤性)T细胞诱导活性的抗原呈递细胞的方法，该方法包括使抗原呈递细胞接触权利要求1的肽的步骤。
16.一种诱导具有细胞毒性(杀伤性)T细胞诱导活性的抗原呈递细胞的方法，该方法包括将编码权利要求1的肽的多核苷酸转染至抗原呈递细胞中的步骤。
17.一种诱导细胞毒性(杀伤性)T细胞的方法，该方法包括使T细胞接触权利要求1的肽的步骤。
18.一种诱导针对癌症的免疫力的方法，该方法包括向受试者施用权利要求1的肽的步骤。
19.一种治疗和/或预防癌症的方法，该方法包括向受试者施用权利要求1的肽的步骤。
20.权利要求1的肽用于生产诱导针对癌症的免疫力的药剂的用途。
21.权利要求1的肽用于生产治疗和/或预防癌症的药物的用途。
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