CN101824478A - ChREBP基因甲基化状态的检测 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于检测ChREBP基因启动子区和第一外显子区甲基化状态的PCR引物，以及含有该引物的检测试剂盒。本发明采用亚硫酸盐测序法研究发现冠心病组中ChREBP基因启动子区和第一个外显子区甲基化频率显著高于正常对照人群，ChREBP基因高甲基化状态与冠心病相关。可作为AS的一个新的预警指标。本发明提供的检测引物和检测试剂盒可以有效用于ChREBP基因启动子区和第一外显子区甲基化状态的检测。为评估对象的患病潜在可能性提供了手段和依据。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一个与动脉粥样硬化(atherosclerosis，As)相关的碳水化合物反应元件结合蛋白(carbohydrate-response-element-binding protein，ChREBP；Gene ID51085；OMIM No.605678)启动子和第一个外显子区甲基化状态的检测。
背景技术
As性疾病位居人类疾病谱的首位，特别是心脑血管As性疾病具有很高的发病率和致死率。高血糖、高血压、胰岛素抵抗、高脂血症和不良的生活***降低甚至沉默[Iwase Y，Shiraya T，Takeno K.Flowering and dwarfism induced by DNAdemethylation in Pharbitis nil.Physiol Plant.2010 Jan 5.]。许多证据支持AS和表观遗传学特别是DNA甲基化的相关性：①高同型半胱氨酸血症是AS的独立风险因子[Thampi P，Stewart B W，Joseph L，et al.Dietary homocysteine promotes atherosclerosis in apoE-defcient mice byinducing scavenger receptors expression.Atherosclerosis，2008；(197)620-62]，而同型半胱氨酸是体内DNA甲基化反应的甲基供体；②AS斑块区的特定基因存在表观遗传学变化，如***受体基因的高甲基化[Kim J，Kim JY，Song KS，et al.Epigenetic changes in estrogenreceptor βgene in atherosclerotic cardiovascular tissues and in-vitrovascular senescence.Biochim Biophys Acta.2007；1772(1)：72-80.]，一氧化氮合酶基因的高甲基化和组蛋白修饰[Fish J.E.，Yan M.S.，MatoukC.C.，et al.Hypoxic repression of endothelial nitric-oxide synthasetranscription is coupled with eviction of promoter histones.J.Biol.Chem，2010；285：810-826.]，超氧化物歧化酶基因的低甲基化[Laukkanen MO，Mannermaa S，Hiltunen MO，et al.Local hypomethylation inatherosclerosis found in rabbit ec-sod gene，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol，1999；19：2171.]；③AS患者外周血白细胞的基因组DNA的总体甲基化水平降低且和血浆同型半胱氨酸和S腺苷同型半胱氨酸水平相关[Yi P，Melnyk S.，Pogribna M，Pogribny IP，et al.Increase in plasmahomocysteine associated with parallel increases in plasmaS-adenosylhomocysteine and lymphocyte DNA hypomethylation.J BiolChem.2000，275：29318-29323.]，更有报道患者白细胞低密度脂蛋白受体基因启动子高甲基化[Zhi YF，Huang YS，Li ZH，et al.Hypermethylation in promoter area of LDLR gene in atherosclerosispatients.Fen Zi Xi Bao Sheng Wu Xue Bao，2007；40(6)：419-27.]；④在ApoE基因敲除小鼠中，主动脉和外周血白细胞的DNA甲基化谱的改变早于动脉壁的组织学改变[Lund G，Andersson L，Lauria M，et al.DNA methylation polymorphisms precede any histological sign ofatherosclerosis in mice lacking apolipoprotein E.J Biol Chem，2004；279(28)：29147-54.]。可见基因组DNA的低甲基化与特异基因的高甲基化与As的形成密切相关。脂代谢紊乱和As的发生发展密切相关，然而脂代谢基因甲基化状态的改变与As的关系研究甚少。对于脂代谢相关基因的表观遗传学研究仅局限于低密度脂蛋白受体相关蛋白、载脂蛋白E、肝X受体这几个基因。ChREBP在葡萄糖和多不饱和脂肪酸调控糖酵解和生脂基因上发挥着决定性的调节作用。(Ma L，TsatsosNG，Towle HC.Direct role of Chrebp.mlx in regulating hepaticglucose-responsive genes[J].J Biol Chem，2005，280(12)：12019-12027；Renaud Dentin，Fadila Benhamed，Jean-Paul Pégorier，et al.Polyunsaturated fatty acids suppress glycolytic and lipogenic genesthrough the inhibition of ChREBP nuclear protein translocation.TheJournalof Clin Inves.2005，115(10)：2843-2854)。然而迄今为止，还没有有关与As相关的基因ChREBP甲基化状态与疾病的相关性的研究报道。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供用于检测基因CHREBP启动子区和第一外显子区甲基化状态的PCR引物。
本发明的第二个目的在于，提供用于检测基因CHREBP启动子区和第一外显子区甲基化状态的试剂盒。
本发明研究发现，与As相关的基因ChREBP启动子区和第一个外显子区甲基化状态与冠心病相关。ChREBP启动子区和第一个外显子区甲基化频率在AS组中显著高于正常对照人群(具体数值见下表)。
表1病例组和对照组甲基化率的比较
注：这里甲基化涉及ChREBP基因CG岛内的29个CG位点，只要其中存在甲基化的位点，则认为ChREBP启动子区和第一个外显子区为甲基化状态。
由此可见，通过检测ChREBP基因启动子区和第一个外显子区高甲基化状态可以用作AS预警的一个新指标。
为此，本发明提供一种提供用于检测基因ChREBP启动子区和第一外显子区甲基化状态的PCR引物，其扩增产物至少包括SEQ IDNo.1所示核苷酸序列中的C220、C222、C227、C229、C245、C251、C254、C257、C270、C273、C275、C291、C293、C308、C310、C315、C317、C332、C338、C350、C359、C367、C370、C375、C377、C381、C391、C395以及C411位点中的一个。优选，其扩增产物包括SEQ IDNo.1所示核苷酸序列中的220～411片段。一般而言，PCR引物应当以SEQ ID No.1所示核苷酸序列为模板。当然，本领域技术人员可以根据亚硫酸盐修饰后的DNA为模板设计恰当的PCR引物，但其至少应当包括上述位点中的一个或多个。此外，在设计引物时应当避开C甲基化位点，这样在扩增时不论是甲基化的ChREBP还是未甲基化的ChREBP都能扩增出相应的序列。
为了保证PCR扩征的特异性，采用巢式PCR方式进行扩增，这时就需要设计2对引物。具体而言，巢式PCR的外侧引物包括但不限于：
ChREBPWS 5′TTTTTGGAGTAAAGTAGGGG 3′
ChREBPWA 5′CTCACAAACTCAAACCAAATATC 3′
内侧引物包括但不限于：
| 序号 | 正向引物(5′-3′) | 反向引物(5′-3′) | 扩增产物(bp) |
| 1 | 41GAAAGACGGGAAGGGAGA | 435TTTTATGGTGTCGTCGTCG | 395 |
| 2 | 41GAAAGACGGGAAGGGAGA | 400GGTTTGTTTCGTTCGTAGG | 360 |
| 3 | 43AAGACGGGAAGGGAGATG | 400GGTTTGTTTCGTTCGTAGG | 358 |
| 4 | 43AAGACGGGAAGGGAGATG | 441CGATATGCTGCTGCTGTGG | 399 |
| 5 | 37TAAGGAAAGACGGGAAGG | 435CGACGACGACACCATAAAA | 399 |
| 6 | 41GAAAGACGGGAAGGGAGA | 436TGCTGCTGCTGTGGTATT | 396 |
| 7 | 43AAGACGGGAAGGGAGATG | 442GCGATATGCTGCTGCTGT | 400 |
| 8 | 41GAAAGACGGGAAGGGAGA | 402TTGGATGCTTGCTTTGTTT | 362 |
| 9 | 41GAAAGACGGGAAGGGAGA | 405TTATTGGATGCTTGCTTTGT | 365 |
| 10 | 43AAGACGGGAAGGGAGATG | 402TTGGATGCTTGCTTTGTTT | 363 |
| 11 | 43AAGACGGGAAGGGAGATG | 405TTATTGGATGCTTGCTTTGT | 393 |
| 12 | 43AAGACGGGAAGGGAGATG | 435CGACGACGACACCATAAAA | 211 |
| 13 | 228GCGGAGTAGGGATTAGGC | 438TATGCTGCTGCTGTGGTA | 209 |
| 14 | 234TAGGGATTAGGCGGTTGC | 442GCGATATGCTGCTGCTGT | 304 |
| 序号 | 正向引物(5′-3′) | 反向引物(5′-3′) | 扩增产物(bp) |
| 15 | 37TAAGGAAAGACGGGAAGG | 340GGCTTAGGCTTAGATTTGAT | 215 |
| 16 | 228GCGGAGTAGGGATTAGGC | 442GCGATATGCTGCTGCTGT | 394 |
| 17 | 43AAGACGGGAAGGGAGATG | 438TATGCTGCTGCTGTGGTA | 400 |
| 18 | 39AGGAAAGACGGGAAGGGAG | 400GGTTTGTTTCGTTCGTAGG | 362 |
| 19 | 39AGGAAAGACGGGAAGGGAG | 402TTGGATGCTTGCTTTGTTT | 364 |
| 20 | 189ATGAGGTTCGGTTGGTTAAGAGT | 437TACGACGACGACACCATAAAATA | 248 |
基于上述引物，采用亚硫酸盐测序法检测基因CHREBP启动子区和第一外显子区甲基化状态。首先，提取基因组DNA，亚硫酸氢钠修饰和纯化基因组DNA。然后，针对亚硫酸盐修饰后的DNA序列，设计巢式PCR扩增引物(例如上述引物)。采用Touch-Down程序(95℃，5min；95℃，45s，65℃-45℃，每个循环降一度，72℃，45s；72℃，10min)扩增目的片段，并将PCR产物纯化后进行T-A克隆。挑取单个菌落增菌后用CHREBP内侧引物扩增验证阳性克隆。每一个样品至少挑取5个阳性克隆测序。采用反向测序，甲基化的CG在测序图上表现为GC，未甲基化的CG在测序图上表现为AC，因而可以鉴别相关位点是否甲基化。
为方便应用，本发明还提供一种检测试剂盒，其包括上述PCR引物，还可以进一步包括亚硫酸盐测序法应用到的相关试剂、耗材，例如选自对苯二酚、亚硝酸氢钠、异丙醇、乙酸铵、糖原、无水乙醇、氢氧化钠中的一种或多种。
本发明研究发现ChREBP基因高甲基化状态与冠心病相关，可作为AS的一个新的预警指标。通过本发明的引物及方法可以对冠心病的发病有效提供预警。
附图说明
图1显示的是采用亚硫酸盐测序法获得的甲基化的ChREBP基因启动子区和第一外显子区序列，其中“CG”表示甲基化的CG位点。
图2显示的是ChREBP基因启动子区及第一外显子区亚硫酸盐测序图中，CG岛内代表性的CG位点。
图3显示的是ChREBP基因启动子区及第一外显子区亚硫酸盐测序图中，CG岛内代表性的未甲基化CG位点，未甲基化的CG经亚硫酸盐处理后C-U，经PCR扩增后变为T。采用反向测序，所以未甲基化的CG在测序图上表现为CA。
图4患者组和对照组ChREBP基因启动子区甲基化分布图，A为冠心病组，B为正常对照组。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
1.材料与方法
1.1对象
采集100例2007年10月至2008年10月在武汉市亚洲心脏病医院心血管内科经冠状动脉造影术确诊的50-75岁冠心病患者血样，并收集其年龄、性别、血压等基本资料。所有冠心病患者至少一支血管内径有≥50％的具有临床意义的狭窄。96名正常对照为武汉大学中南医院健康体检人员。患者和对照者的种族及地区来源无明显差异，均为汉族，无血缘关系，入选者均无严重肝、肾、肺功能不全，无严重贫血、营养不良、糖尿病、风湿病、恶性肿瘤及生殖***、内分泌***疾病，自身免疫性疾病和感染性疾病史。所有研究对象均经知情同意。
1.2基因组DNA提取和血脂水平的检测
所有研究对象均空腹12h后于次日清晨采集2mL静脉血，经EDTA抗凝，分离白细胞，用蛋白酶K法提取基因组DNA。同时采集2mL静脉血，经肝素抗凝，分离血浆用全自动生化分析仪检测血脂水平。
1.3基因组DNA的亚硫酸氢钠修饰及纯化
1.3.1将约2μg DNA于1.5ml EP管中使用双蒸水(DDW)稀释至50ul；加5.5μl新鲜配制的3M NaOH；55℃水浴20min；
1.3.2水浴期间配制：10mM对苯二酚(氢醌)，加30ul至上述水浴后混合液中；(溶液变成淡黄色)，3.6M亚硫酸氢钠(Sigma，S9000)，配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至pH 5.0，最终体积为5ml。加520μl至上述水浴后溶液中。轻柔颠倒混匀溶液。加200μl石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。55℃避光水浴16h。
1.3.3将移液器枪头伸入石蜡油层下，先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出，然后吸取混合液至一洁净1.5ml EP管中。使用PromegaWizard Cleanup DNA纯化回收***(Promega，A7280)回收纯化亚硫酸盐修饰的DNA。
1)加1ml Promega’s Wizard DNA Clean-up resin，轻柔颠倒混匀，使DNA充分与树脂结合；
2)将5ml的注射器针筒与试剂盒提供的回收小柱紧密连接后，将上述混合物用移液器移至针筒内，加针栓，轻轻加压，将液体挤出，此时可见小柱内有白色的树脂沉积；
3)向针筒内加入2ml 80％的异丙醇，***针栓，轻轻加压，将异丙醇挤出；
4)将注射器与小柱分离，将小柱置于洁净1.5ml洁净EP管上，离心12000rpm，2min，以甩去残余异丙醇成分，使树脂干燥；
5)将小柱取下置于另一洁净1.5ml EP管上，移液器加50μl预热好的DDW，室温放置5min；
6)离心12000rpm，20s。
1.3.4加5.5μl新鲜配制的3M NaOH，室温放置15min。
1.3.5加33μl 10M乙酸铵、4μl 10mg/ml糖原，250μl冰无水乙醇，置于-20度，过夜沉淀。
1.3.6在4度12000rpm离心15min，弃上清液，加入180μl 70％
乙醇，4度12000rpm离心5min。离心后弃上清，重复一次。
1.3.7倒掉上清，室温干燥5min，或沉淀由不透明变为半透明或透明时，加入20μl-30μl DDW，溶解沉淀。-20℃保存DNA溶液。
1.4PCR扩增及测序检测
针对亚硫酸盐修饰后的DNA序列，应用在线引物设计软件设计巢式PCR扩增引物。采用Touch-Down程序(95℃，5min；95℃，45s，65℃-45℃，2cycles/2℃，45s，72℃，45s；72℃，10min)扩增目的片段，并将PCR产物纯化后进行T-A克隆。挑取单个菌落增菌后用ChREBP内侧引物扩增验证阳性克隆。每一个样品至少挑取5个阳性克隆测序。本发明中的扩增产物片段包含29个CpG位点，但片段大小是一个范围涵盖从209bp到400bp之间的片段，根据巢式PCR所采用的内侧上下游引物起始位置而定。在本例中，外侧引物为：
ChREBPWS 5′TTTTTGGAGTAAAGTAGGGG 3′
ChREBPWA 5′CTCACAAACTCAAACCAAATATC 3′
内侧引物为：
P 15′GAAAGACGGGAAGGGAGA 3′
P25′TTTTATGGTGTCGTCGTCG 3′
2.结果分析
对病例组合对照组的检测结果如表2所示。结果表明，ChREBP启动子区和第一个外显子区甲基化频率在AS组(病例组)中显著高于正常对照人群，表明冠心病与ChREBP启动子区和第一个外显子区甲基化相关，通过对ChREBP基因启动子区和第一个外显子区甲基化检测能够有效评估冠心病发病的潜在可能性。
表2病例组和对照组甲基化率的比较
以上实施例虽然仅给出了一组巢式PCR引物，然而，本领域技术人员按照本发明公开的实质，很容易设计其他PCR引物来扩增本发明所给出的包含CpG岛的序列，从而实现对是否甲基化的检测。
序列表
<110>郑芳
郭书忍
严明
杨娜
熊陈岭
钱冉
涂建成
<120>ChREBP基因甲基化状态的检测试剂盒
<130>
<160>44
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>557
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Genomic DNA modified by sodium Bisulfate
Promoter and part of exon 1 region of ChREBP gene
<400>1
ttttggagta aagtaggggc ggttttatta ggattttaag gaaagacggg aagggagatg 60
gggttaattc gttagagttt tagagtatcg ggtttttatt tggcgtaagg attatgttaa 120
tataagtttc gtttcgtttt aggtttcgtt tattcgatcg gtttatggtg tgggggcggg 180
gttatgttaa tgaggttcgg ttggttaaga gttgtttttc gcgttgcgcg gagtagggat 240
taggcggttg cggcggcgat agttatggtc ggcgcgttgg taggtttggt cgcgggtttg 300
taggtttcgc gggtcgcgtt tagtttagat tcggattcgg atatagattc ggaggattcg 360
agttttcggc gtagcgcggg cggtttgttt cgttcgtagg ttatttatag cggttatttt 420
atggtgtcgt cgtcgtatag cgattcgttg tttcggcggc gcgattagga ggggttcgtg 480
gggtttttcg atttcgggtc gcgtagtatc gattttatat ttatacgttt tttcgagtgt 540
ttgagtttgg tttatag 557
<210>2
<211>557
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<223>Promoter and part of exon 1 region of ChREBP gene
<400>2
ctttggagca aagtaggggc ggctctatca ggactccaag gaaagacggg aagggagatg 60
gggccaaccc gccagagctc cagagcaccg ggttctcacc tggcgtaagg attatgctaa 120
tacaagcccc gccccgtccc aggccccgcc cacccgatcg gcctatggtg tgggggcggg 180
gctatgttaa tgaggcccgg ctggccaaga gctgttcccc gcgctgcgcg gagcagggac 240
caggcggttg cggcggcgac agccatggcc ggcgcgctgg caggtctggc cgcgggcttg 300
caggtcccgc gggtcgcgcc cagcccagac tcggactcgg acacagactc ggaggacccg 360
agtctccggc gcagcgcggg cggcttgctc cgctcgcagg tcatccacag cggtcacttc 420
atggtgtcgt cgccgcacag cgactcgctg ccccggcggc gcgaccagga ggggtccgtg 480
gggccctccg acttcgggcc gcgcagtatc gaccccacac tcacacgcct cttcgagtgc 540
ttgagcctgg cctacag 557
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
tttttggagt aaagtagggg 20
<210>4
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
ctcacaaact caaaccaaat atc 23
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
gaaagacggg aagggaga 18
<210>6
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
ttttatggtg tcgtcgtcg 19
<210>7
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
gaaagacggg aagggaga 18
<210>8
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
ggtttgtttc gttcgtagg 19
<210>9
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
aagacgggaa gggagatg 18
<210>10
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
ggtttgtttc gttcgtagg 19
<210>11
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
aagacgggaa gggagatg 18
<210>12
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
cgatatgctg ctgctgtgg 19
<210>13
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
taaggaaaga cgggaagg 18
<210>14
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
cgacgacgac accataaaa 19
<210>15
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
gaaagacggg aagggaga 18
<210>16
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
tgctgctgct gtggtatt 18
<210>17
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>17
aagacgggaa gggagatg 18
<210>18
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
gcgatatgct gctgctgt 18
<210>19
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>19
gaaagacggg aagggaga 18
<210>20
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>20
ttggatgctt gctttgttt 19
<210>21
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>21
gaaagacggg aagggaga 18
<210>22
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>22
ttattggatg cttgctttgt 20
<210>23
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>23
aagacgggaa gggagatg 18
<210>24
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>24
ttggatgctt gctttgttt 19
<210>25
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>25
aagacgggaa gggagatg 18
<210>26
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>26
ttattggatg cttgctttgt 20
<210>27
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>27
aagacgggaa gggagatg 18
<210>28
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>28
cgacgacgac accataaaa 19
<210>29
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>29
gcggagtagg gattaggc 18
<210>30
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>30
tatgctgctg ctgtggta 18
<210>31
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>31
tagggattag gcggttgc 18
<210>32
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>32
gcgatatgct gctgctgt 18
<210>33
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>33
taaggaaaga cgggaagg 18
<210>34
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>34
ggcttaggct tagatttgat 20
<210>35
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>35
gcggagtagg gattaggc 18
<210>36
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>36
gcgatatgct gctgctgt 18
<210>37
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>37
aagacgggaa gggagatg 18
<210>38
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>38
tatgctgctg ctgtggta 18
<210>39
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>39
aggaaagacg ggaagggag 19
<210>40
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>40
ggtttgtttc gttcgtagg 19
<210>41
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>41
aggaaagacg ggaagggag 19
<210>42
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>42
ttggatgctt gctttgttt 19
<210>43
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>43
atgaggttcg gttggttaag agt 23
<210>44
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>44
tacgacgacg acaccataaa ata 23
Claims (5)
1.用于检测ChREBP基因启动子区和第一外显子区甲基化状态的PCR引物，其扩增产物至少包括SEQ ID No.1所示核苷酸序列中的C220、C222、C227、C229、C245、C251、C254、C257、C270、C273、C275、C291、C293、C308、C310、C315、C317、C332、C338、C350、C359、C367、C370、C375、C377、C381、C391、C395以及C411位点中的一个。
2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物的扩增产物包括SEQ ID No.1所示核苷酸序列中的220～411片段。
3、如权利要求1或2所述的引物，其特征在于，该引物以SEQ ID No.1所示核苷酸序列为模板。
4.如权利要求1所述的引物，其特征在于，该引物为巢式PCR引物，包括外侧引物：
ChREBPWS 5′TTTTTGGAGTAAAGTAGGGG 3′
ChREBPWA 5′CTCACAAACTCAAACCAAATATC 3′
以及选自以下引物中的内侧引物：
序号 正向(5′-3′) 反向(5′-3′)
1 GAAAGACGGGAAGGGAGA TTTTATGGTGTCGTCGTCG
2 GAAAGACGGGAAGGGAGA GGTTTGTTTCGTTCGTAGG
3 AAGACGGGAAGGGAGATG GGTTTGTTTCGTTCGTAGG
4 AAGACGGGAAGGGAGATG CGATATGCTGCTGCTGTGG
5 TAAGGAAAGACGGGAAGG CGACGACGACACCATAAAA
6 GAAAGACGGGAAGGGAGA TGCTGCTGCTGTGGTATT
7 AAGACGGGAAGGGAGATG GCGATATGCTGCTGCTGT
8 GAAAGACGGGAAGGGAGA TTGGATGCTTGCTTTGTTT
9 GAAAGACGGGAAGGGAGA TTATTGGATGCTTGCTTTGT
10 AAGACGGGAAGGGAGATG TTGGATGCTTGCTTTGTTT
11 AAGACGGGAAGGGAGATG TTATTGGATGCTTGCTTTGT
12 AAGACGGGAAGGGAGATG CGACGACGACACCATAAAA
13 GCGGAGTAGGGATTAGGC TATGCTGCTGCTGTGGTA
14 TAGGGATTAGGCGGTTGC GCGATATGCTGCTGCTGT
15 TAAGGAAAGACGGGAAGG GGCTTAGGCTTAGATTTGAT
16 GCGGAGTAGGGATTAGGC GCGATATGCTGCTGCTGT
17 AAGACGGGAAGGGAGATG TATGCTGCTGCTGTGGTA
18 AGGAAAGACGGGAAGGGAG GGTTTGTTTCGTTCGTAGG
19 AGGAAAGACGGGAAGGGAG TTGGATGCTTGCTTTGTTT
20 ATGAGGTTCGGTTGGTTAAGAGT TACGACGACGACACCATAAAATA。
5.用于检测基因CHREBP启动子区和第一外显子区甲基化状态的试剂盒，其包括权利要求1～4任一项所述的PCR引物。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其还包括选自对苯二酚、亚硝酸氢钠、异丙醇、乙酸铵、糖原、无水乙醇、氢氧化钠中的一种或多种。
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| 《中华医学会第八次全国检验医学学术会议暨中华医学会检验分会成立30周年庆典大会资料汇编》 20091231 杨娜等 《MLXIPL、PMVK、TRIB3基因启动子区甲基化检测方法的建立》 107 1－6 , 2 * |
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