CN101812482A

CN101812482A - 一种利用木质纤维素原料制备phbv的方法

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Publication number: CN101812482A
Application number: CN201010116276.8A
Authority: CN
Inventors: 黄和; 张红漫; 林增祥; 徐俊; 李莹娟; 赵晶
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2010-03-02
Filing date: 2010-03-02
Publication date: 2010-08-25

Abstract

本发明涉及一种利用木质纤维素原料制备PHBV的方法，其技术要点在于木质纤维素原料经过预处理后，用分批补料的方法进行纤维素酶水解，以获得较高的糖浓度，收集酶解液用氯化锌或磷酸活化制得的活性炭脱毒脱色，脱毒后酶解糖液作为真氧产碱杆菌发酵合成PHBV的唯一碳源。本发明不仅对于开发利用我国丰富的农作物秸秆资源，而且对于更好保护环境和减少白色污染都有重要意义，具有原料丰富、成本低廉、适合工业化应用的特点。

Description

一种利用木质纤维素原料制备PHBV的方法

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，涉及一种利用秸秆类木质纤维素为原料工业化生产PHBV的方法。

背景技术

近年来，由于全球石油资源减少和大量塑胶制品使用过后带来的严重白色污染问题，严重破坏了人类的生存环境。由于为了能更好的保护人类的生存环境，生物降解材料的研究和生产受到了人们广泛地关注。其中，一种新型生物高分子3-羟基丁酸-co-3-羟基戊酸共聚物(即PHBV)，被认为是替代化学合成塑料、攻克白色污染最具潜力的新的热塑性聚脂，PHBV的分子结构式如下：

PHBV是不以石油、天然气为原料，而是利用淀粉和葡萄糖作为原料，通过微生物发酵技术生产出的生物材料。它很容易被细菌消化，在土壤或堆肥化条件下完全分解为二氧化碳和水，没有毒害物质生成，对环境没有污染。由于PHBV具有生物可降解性、生物相容性、压电性、光学活性等许多优良的特性，可在众多领域如生物可降解包装材料、组织工程材料、缓释材料及电学材料等方面得到广泛应用。随着世界范围内能源危机的加剧、以及环境保护意识的增强，PHBV类材料的开发以及利用已引起了科研领域以及工业界的广泛兴趣。

目前PHBV的工业化生产及其广泛应用所面临的最大问题是其生产成本过高的问题，因此目前其主要还是应用在医学和其他要求高的领域。用细菌发酵生产PHBV的一般工艺流程如下：

菌种培养→发酵→巴氏法消毒→沉淀→分离→沉淀物→抽提→干燥

由于工艺路线的选择问题，目前国际上仅有少数几家企业能生产，因生产成本很高，还均未能实现大规模生产。我国中科院微生物所目前已开发出了用淀粉糖与丙酸发酵生产PHBV技术，并与杭州天安有限公司合作建立起了一个年产1kt PHBV的生产装置。随着的开发成功，我国在这一领域的研究和生产达到了国际先进水平，也标志着我国在生物降解塑料的生产方面迈上了一个新的台阶。

天然植物纤维是容易获取的丰富可再生资源，比如，目前我国每年农作物秸秆产量达到10亿吨。因此，可以通过利用廉价的天然纤维素原料生产PHBV以降低发酵的原料成本，必将受到人们的广泛关注。

目前，常用木质纤维原料水解糖化工艺有两种分别是酸水解和酶水解。

酸水解速度快并且容易完成，通常酸水解采用的矿物酸为H₂SO₄或HCl，温度160～240℃。纤维素原料经高温处理后水解液中不但含有可发酵的糖，而且含有糠醛和5-羟甲基糠醛等发酵抑制物，是由糖降解所产生的，这些化合物抑制了微生物对糖的发酵，因此在发酵以前需将糖醛和5-羟甲基糖醛等发酵抑制物脱除。脱除的方法很多，如石灰中和法、蒸发法、亚硫酸盐预处理、离子交换、酶、活性炭处理等，都可以脱除部分发酵抑制物，但是处理成本过高，生产中难于实现。

因此，纤维素的水解现在主要采用的是纤维素酶水解，纤维质材料必须经过预处理才能获得较高的酶解转化率。较好的预处理方法可以减少酶的用量。影响纤维素水解的因素包括多孔性、纤维素束的结晶度以及木质素和半纤维素的含量。木质素和半纤维素的存在使得纤维素酶接触纤维素很困难，因此降低了水解效率。预处理将木质素和半纤维素去除，减小纤维素的结晶度和增加多孔性，可以显著提高水解效率。纤维质材料的很多预处理方法目的是去除半纤维素和木质素，增大纤维素的可接触面积，进而提高水解效率。由于木质素、半纤维素对纤维素的保护作用以及纤维素本身的结晶结构，天然的纤维质原料直接进行水解时，其水解程度是很低的，因此必需对纤维素进行一定的预处理。

目前，木质纤维素酶解反应预处理方法很多，包括物理方法、化学方法和生物方法等。常用的纤维原料物理预处理方法是机械粉碎法，通过切、碾和磨等工艺使纤维原料的粒度变小，增加底物和酶接触的表面积，降低纤维素的结晶度。包括粉碎、球磨、压缩碾磨粉碎、超声波等技术。蒸汽***法是目前国内外研究较多的有效预处理方法之一。目前所用的蒸汽***法是用蒸汽将原料加热至160～260℃，维持20s～30min在高温高压下造成木质纤维素软化，然后迅速使原料减压造成纤维素晶体和纤维素的破裂，木质素和纤维素分离，而半纤维素在高温下发生自水解作用可溶化，木质素也发生部分降解。

以上预处理过程结合稀酸、稀碱法处理可以显著提高酶解效率。但是高温或者稀酸稀碱处理过程会造成纤维素降解生成发酵抑制物，因此发酵抑制物的脱除效果直接影响了后续微生物发酵过程的应用。

活性炭是一种强力高效的吸附剂和脱色剂，广泛应用于水的净化、吸附有害气体及将各种液体制品及饮料进行脱色提纯等许多方面。活性炭对糖液的脱色效能很强，国外不少制造精糖的糖厂，用活性炭将经过澄清处理之后的糖液脱色提纯，霍汉镇的《活性炭-高效的糖液脱色剂》(广西轻工业，2003)一文对活性炭的糖脱色理论进行了研究。活性炭通常是用各种植物碎料(木屑、椰壳及蔗渣等)或适当的煤或木炭为原料，经过特殊的加工处理制成。活性炭的内部有很多极微细的孔隙。孔隙的直径很小，因此总表面积很大，有很强的吸附能力。因原料和制造方法的不同，活性炭的品种相当多，分别适用于不同的用途。

制造活性炭一般要经过炭化和活化两个步骤。尤其活化，这是制造活性炭的关键步骤，有两类方法：一是气体活化法，用水蒸气或二氧化碳等为活化剂；另一为化学剂活化法，用氯化锌或磷酸等为活化剂。气体活化法是使炭在高温下与气体发生反应，将碳化物表面侵蚀，形成微孔发达的构造，产品的形状以颗粒状为主，内部微孔结构较发达，表面积大，吸附容量高。适合用于吸附液相和气相中分子量较小的物质，但不宜用于对大分子物质的吸附。化学活化常用氯化锌或磷酸作活化剂，利用氯化锌或磷酸活化制得的活性炭，孔隙的尺寸通常稍大，这类活性炭适用于吸附溶液中的大分子物质，例如糖液的脱色。活性炭具有芳香环式的结构，善于吸附芳香族有机物(糖汁中的有色物大部分属于这类)，并善于吸附含有三个碳原子以上的其他有机物。它对不带电物质的吸附力较强，而对带电物质(如阴离子)的吸附较弱。对后者的吸附与溶液pH值有关：酸性溶液中吸附较强，碱性溶液中较弱。活性炭的吸附作用和温度有关。对于多数的物理吸附作用，在低温下能够达到较大的吸附量，但吸附的速度较慢。在糖厂使用的多数情况下，活性炭和糖液接触的时间不长，故要求吸附进行得较快，就常用较高的温度，70～85℃在这个温度下，一般经过15～30分钟活性炭的吸附作用就接近其最大值。

中国专利CN1186461C公开了一种低聚木糖的制备方法，利用玉米芯碱处理后用木聚糖酶水解，对水解液用活性炭和离子交换树脂脱色制备木聚糖，该专利介绍了木聚糖脱色的方法，相对操作繁琐，不适用于后续要求脱色脱毒的发酵体系。中国专利CN1020042C公开了一种结晶木糖的制备方法，用蔗渣为原料得到稀酸水解液，用阳离子交换树脂和活性炭一起进行脱色，该过程需要浓缩沉淀等过程，操作比较繁琐，不适用于有后续要求脱色脱毒的发酵体系。中国专利CN1020042C公开了一种以秸秆为原料应用酶和膜技术制备高纯度低聚木糖的方法，对酶解糖液利用纳滤、活性炭、离子交换树脂进行脱色处理，得到低聚木糖，不适用于有后续要求脱色脱毒的发酵体系。以上对于纤维素原料水解液脱色过程，不适用于有脱毒要求的发酵过程。

针对真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)生产PHBV工艺，于平(真养产碱杆菌发酵生产PHBV的培养条件优化，中国食品学报，2007)、堵国成(真养产碱杆菌合成3-羟基丁酸与3-羟基戊酸共聚物发酵条件研究，微生物学报，1999)、杨明(真养产碱杆菌发酵生产聚B-羟基丁酸(PHBV)的研究，食品与发酵工业，1999)等用葡萄糖为碳源对真养产碱杆菌产PHBV的条件进行了研究，相对来讲原料的大规模供应会受到限制。因此，对于真养产碱杆菌生产PHBV工艺而言，现有技术存在的问题可归结为：(1)微生物发酵原料主要是淀粉或者葡萄糖类物质，原料生产成本高，如果大规模生产会存在与人争粮的问题；(2)纤维素原料预处理工艺大多需要使用高温高压处理方法；预处理阶段使用的稀酸或稀碱会形成降解产物，这些降解产物会对后续微生物的发酵产生毒害作用，必须对酶解糖液进行脱毒脱色处理，才能被微生物利用；(3)酶解液的脱色脱毒过程，用到化学试剂和材料较多，甚至会引入新的化学杂质，操作复杂，增加了原料成本。

发明内容

本发明的技术目的在于提供了一种用新的利用木质纤维素原料生产PHBV的方法，使得该方法具有原料丰富、成本低廉、适合工业化应用的特点。

为达到以上目的本发明通过以下技术方案实现的：

一种利用木质纤维素原料制备PHBV的方法，其特征在于木质纤维素原料经过预处理后，用纤维素酶水解，收集酶解液用活性炭脱毒脱色作为真氧产碱杆菌发酵合成PHBV的唯一碳源制备成发酵培养基，并进行发酵生产PHBV。

本发明所述的木质纤维素原料的预处理方法为任意木质纤维素预处理方法的现有技术，例如蒸汽***法、高温水处理法、球磨法、螺杆挤压膨化法等；

本发明所述的原料预处理步骤前可加入0～1.0％的稀酸或稀碱作为辅助剂以提高后续酶解效率；

其中，所述的稀酸包括HCl或H₂SO₄；稀碱包括NaOH、KOH；

本发明所述的酶解糖化步骤：预处理后的原料按照初始固液比1∶10加入底物，调节pH值为4.5～5.0，酶解过程中间隔24h补加纤维素原料1～4次，保持酶解体系固形物含量为10％，按照5.0～30.0FPU/g原料的量加入纤维素酶，反应温度50℃，搅拌酶解36～120h，酶解结束后，过滤除去固体残渣，得到酶解糖液；

本发明所述的活性炭是用氯化锌活化或磷酸活化制得的活性炭；

本发明所述的活性炭的脱色条件为pH2.5～8.0，温度40℃～100℃，炭粉加量0.1～5％，0.1～3h；

本发明所述的真氧产碱杆菌发酵生产PHBV的培养基培养条件为：碳源为葡萄糖浓度为2.0～10.0％的纤维素酶解液，硫酸铵0.1～0.5％；用氨水调节pH7.0～8.0，接种量10％，32～38℃培养35～50h；

本发明所述的木质纤维素包括秸秆、高粱秆、甘蔗渣、或者草类。

本发明的有益效果在于：

1、酶解糖液中直接加入氯化锌或磷酸活化制得的活性炭，不仅具有很好的脱色效果，并且可以去除各种发酵抑制物，而且该过程没有化学杂质的引入，操作简单。

2、利用木质纤维素原料生产PHBV，从而可聚合得到最终产物PHBV，具有原料丰富、成本低廉、适合工业化应用的特点。

3、生物材料PHBV的推广和使用具有很好的可生物降解性，减少了环境中的白色污染。

具体实施方式

本发明实施例中使用到的相关计算公式和测定方法如下：

1、滤纸酶活力的测定——纤维素酶的总体酶活力测定：

采用国际理论和应用化学协会(IUPAC)推荐的标准方法测定[Ghose，T.K.，et al.Pure&Appl.Chem.，1987，59，257～268]，一个滤纸酶活力的国际单位(FPIU)等于在标准反应条件下每分钟生成1μmol葡萄糖量的酶量。测定方法如下：

取3支25mL刻度试管分别在其中加入50mg粉碎成粉末状的滤纸，一定质量的固定纤维素酶，0.05M柠檬酸缓冲液5.0mL。

将上述试管置于恒温水浴器中，保持在振幅100r/min和温度50℃下保温60min后立即取出加入5.0mL DNS试剂，在沸水中反应5min，冷却后加水至25mL摇匀，于550nm波长下测定吸光度A值。反应生成的葡萄糖的量根据葡萄糖标准曲线求得；计算出生成2mg葡萄糖相对的酶量，按下式计算样品的滤纸酶活力(FPU)，最终结果取平均值：

其中，一个滤纸酶活力单位定义为每分钟生成1μmol葡萄糖所需的酶量，单位：IU/mL。

本发明所使用的纤维素酶Accellerase 1000(购自杰能科国际公司)的滤纸酶活93FPIU/mL。

2、PHBV含量的测定采用气相色谱法。

称取50mg干细胞，加入2mL氯仿、2mL酸化甲醇(含3％H₂SO₄)，置于旋塞试管中，100℃酯化4h，冷却，加入1mL蒸馏水，剧烈振荡2min，分层，氯仿相气相色谱分析，计算出样品中PHBV的百分含量。

PHBV质量浓度(g/L)＝细胞干重(g/L)×PHBV百分含量

实施例1

原料预处理：将玉米秸秆于210℃蒸爆处理5min，调节pH值为5.0，反应温度50℃，加入纤维素酶15FPU/g原料，固液比1∶10，24h后补料一次，保持酶解体系固形物含量为10％，搅拌酶解36h，酶解后过滤取酶解液。

脱毒脱色：磷酸活化活性炭(溧阳市江阳活性炭厂)脱色条件为pH2.5，温度40℃，炭粉加量5％，0.1h。

接种发酵：活化液体真养产碱杆菌ATCC 17699，接种量10％，纤维素酶解液葡萄糖浓度2.0％，硫酸铵0.1％，用氨水调节pH7.0，32℃，培养35h。

产物分离提取：发酵液离心，取菌体，干燥后，测定PHBV质量浓度可以达到0.5g/L。

实施例2

原料预处理：玉米秸秆180℃，1.0％稀硫酸，25min处理，取物料调节pH值为4.5，加入纤维素酶15FPU/g原料，反应温度50℃，固液比1∶10，24、48h后补料两次，搅拌酶解78h，酶解后过滤取酶解液。

脱毒脱色：氯化锌活化活性炭(山西新华活性炭)脱色条件为pH8.0，温度100℃，炭粉加量0.1％，3.0h。

接种发酵：活化液体真养产碱杆菌ATCC 17699，接种量10％，纤维素酶解液葡萄糖浓度10.0％，硫酸铵0.1％，用氨水调节pH8.0，38℃，培养50h。

产物分离提取：发酵液离心，取菌体，干燥后，测定PHBV质量浓度可以达到25g/L。

实施例3

原料预处理：甘蔗渣加入1.0％NaOH球磨，25min处理，取物料调节pH值为4.5，加入纤维素酶30FPU/g原料，反应温度50℃，固液比1∶10，24h、48h、72h、96h后补料四次，搅拌酶解120h，酶解后过滤取酶解液。

脱毒脱色：磷酸活化活性炭(溧阳市江阳活性炭厂)脱色条件为pH8.0，温度80℃，炭粉加量2.1％，1.0h。

接种发酵：活化液体真养产碱杆菌ATCC 17699，接种量10％，纤维素酶解液葡萄糖浓度9.0％，硫酸铵0.1％，用氨水调节pH7.8，38℃，培养48h。

产物分离提取：发酵液离心，取菌体，干燥后，测定PHBV质量浓度可以达到15g/L。

实施例4

原料预处理：高梁秆210℃，0.5％稀盐酸5min蒸爆处理，调节pH值为5.0，反应温度50℃，加入纤维素酶15FPU/g原料，固液比1∶10，24h、48h后补料两次，搅拌酶解72h，酶解后过滤取酶解液。

脱毒脱色：磷酸活化活性炭(哈尔滨活性炭厂)脱色条件为pH2.5，温度40℃，炭粉加量5％，0.1h。

接种发酵：活化液体真养产碱杆菌ATCC 17699，接种量10％，纤维素酶解液葡萄糖浓度8.0％，硫酸铵0.1％，用氨水调节pH7.0，32℃，培养48h。

产物分离提取：发酵液离心，取菌体，干燥后，测定PHBV质量浓度可以达到19g/L。

实施例5

原料预处理：稻草，螺杆180℃螺杆挤压膨化处理两次，调节pH值为4.5，反应温度50℃，加入纤维素酶5FPU/g原料，固液比1∶10，24h、48h后补料两次，搅拌酶解72h，酶解后过滤取酶解液。

接种发酵：活化液体真养产碱杆菌ATCC 17699，接种量10％，纤维素酶解液葡萄糖浓度6.0％，硫酸铵0.5％，用氨水调节pH7.0，38℃，培养40h。

实施例6

原料预处理：稻草，210℃高温水处理，取物料调节pH值为4.7，反应温度50℃，加入纤维素酶5FPU/g原料，固液比1∶10，24h、48h后补料两次，搅拌酶解72h，酶解后过滤取酶解液。

脱毒脱色：磷酸活化活性炭(巩义市超越滤料厂)脱色条件为pH5，温度40℃，炭粉加量3％，0.1h。

接种发酵：活化液体真养产碱杆菌ATCC 17699，接种量10％，纤维素酶解液葡萄糖浓度9.0％，硫酸铵1.5％，用氨水调节pH7.0，38℃，培养40h。

Claims

1.一种利用木质纤维素原料制备PHBV的方法，其特征在于木质纤维素原料经过预处理后，用纤维素酶水解，收集酶解液用活性炭脱毒脱色作为真氧产碱杆菌发酵合成PHBV的唯一碳源制备成发酵培养基，并进行发酵生产PHBV。

2.根据权利要求1所述的利用木质纤维素原料制备PHBV的方法，其特征在于所述的木质纤维素预处理方法包括蒸汽***法、高温水处理法、球磨法、螺杆挤压膨化法。

3.根据权利要求2所述的利用木质纤维素原料制备PHBV的方法，其特征在于所述的木质纤维素预处理前可加入0～1.0％的稀酸或稀碱作为辅助剂。

4.根据权利要求3所述的利用木质纤维素原料制备PHBV的方法，其特征在于所述的稀酸包括HCl或H₂SO₄。

5.根据权利要求3所述的利用木质纤维素原料制备PHBV的方法，其特征在于所述的稀碱包括NaOH或KOH。

6.根据权利要求1所述的利用木质纤维素原料制备PHBV的方法，其特征在于所述的纤维素酶解的方法为：预处理后的原料按照初始固液比1∶10加入底物，调节pH值为4.5～5.0，酶解过程中间隔24h补加纤维素原料1～4次，保持酶解体系固形物含量为10％，按照5.0～30.0FPU/g原料的量加入纤维素酶，反应温度50℃，搅拌酶解36～120h，酶解结束后，过滤除去固体残渣，得到酶解糖液。

7.根据权利要求1所述的利用木质纤维素原料制备PHBV的方法，其特征在于所述的活性炭的脱色条件为pH2.5～8.0，温度40℃～100℃，炭粉加量0.1～5％，0.1～3h。

8.根据权利要求1所述的利用木质纤维素原料制备PHBV的方法，其特征在于所述的真氧产碱杆菌发酵生产PHBV的培养基培养条件为：碳源为葡萄糖浓度为2.0～10.0％的纤维素酶解液，硫酸铵0.1～0.5％，用氨水调节pH7.0～8.0；接种量10％，32～38℃培养35～50h。

9.根据权利要求1至9之一所述的利用木质纤维素原料制备PHBV的方法，其特征在于所述的木质纤维素包括秸秆、高粱秆、甘蔗渣、或者草类。