CN101812130B

CN101812130B - 人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性抗体(RVFab5)

Info

Publication number: CN101812130B
Application number: CN2010101708565A
Authority: CN
Inventors: 梁米芳; 孙丽娜; 陈哲; 李川; 李德新
Original assignee: National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2010-05-06
Filing date: 2010-05-06
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2030-05-06
Also published as: WO2011137571A1; CN101812130A

Abstract

本发明公开了一种人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性抗体RVFab5，该抗体是运用噬菌体表面呈现技术筛选获得。本发明的抗体特异性识别狂犬病毒颗粒抗原，且均针对狂犬病毒糖蛋白G，与狂犬病毒具有明显的免疫荧光反应和酶联免疫反应，具有抗狂犬病毒感染的中和活性功能。可将本发明抗体制成预防和治疗狂犬病的特异性抗体药物，从而可在临床上用于预防和治疗由狂犬病毒引起的狂犬病。

Description

人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性抗体(RVFab5)

技术领域

本发明涉及基因工程抗体技术，特别是涉及一种人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性抗体；本发明还涉及该抗体在制备预防或治疗狂犬病的药物中的应用。

背景技术

狂犬病是由狂犬病毒引起的世界性***共患病，一旦发病100％死亡。目前世界上87个国家有狂犬病报道，每年约有5万多人死于狂犬病(Knobel DL，et al.2005)。狂犬病暴露后预防是防治狂犬病的主要措施。对于严重暴露的人，世界卫生组织(World HealthOrganization，WHO)建议采用狂犬疫苗注射结合抗狂犬病毒免疫球蛋白(rabies immune globulin，RIG)的方法。目前使用的两类RIG为人抗狂犬病毒免疫球蛋白(human rabies immune globulin，HRIG)和马抗狂犬病毒免疫球蛋白(Equine rabies immune globulin，ERIG)。由于ERIG副反应比较严重，而且对某些疫苗的抗体反应有抑制，而HRIG价格昂贵，供应量有限并且有潜在的病原威胁。因此制备高效、价廉、副反应小的被动免疫制剂是我们的目标。

含有特异性抗体的人源或动物血清免疫球蛋白用以预防和治疗传染病已历史悠久。单克隆抗体的体外抗病毒中和活性和体内保护肌体抵抗病毒攻击已获得许多实验证明，如鼠抗甲肝病毒、汉坦病毒、麻疹病毒、RSV病毒、CMV病毒等中和性单克隆抗体可以在体内100％保护动物免受病毒攻击。以抗原免疫动物获得多抗血清的途径一直是获得抗体的经典方法，但缺乏特异性和均一性。继而建立的B淋巴细胞杂交瘤技术使得众多科学家通过细胞工程可以在体外定向地制备各种单克隆抗体(monoclonal antibody，McAb)，其特异性强，性质均一，易于大量生产。然而McAb多为鼠源性，鼠源McAb的异源性反应极大地限制了McAb作为治疗制剂在人体的应用。免疫球蛋白(Vaccinia immune globulin，VIG)作为抗体成分主要来自捐献者(恢复期病人)免疫血清，从获得阳性血清到通过安全性检测均需花费大量的人力和财力，这就使其大量制备受到限制，同时由于来源于血清所以容易发生血源性传播疾病的感染。因此使用人源基因工程产品替代血制品则可克服这些缺陷，而人源基因工程抗体研究的不断深入，给这一领域的生物制品发展带来了新的希望和广阔前景。通过抗体分子基因水平的重组可获得多种多样的特异性鼠源及人源抗体，使对单克隆抗体的研究有了突破性进展并越来越显示出其重要意义及实际运用前景。人源抗狂犬病毒单克隆抗体的研制和噬菌体抗体库技术的产生为解决被动免疫制剂问题提供了新的思路。狂犬单克隆抗体CR57和CR4098做成的单克隆抗体鸡尾酒中和了26种典型的街毒株。对动物的保护性实验表明，利用单克隆抗体鸡尾酒进行治疗具有可行性和优越性(Goudsmit J，et al.2006)。

80年代末90年代初兴起的噬菌体抗体基因库技术兴起和整个基因工程抗体技术研究领域的发展，使当今世界人源或基因工程抗体的开发研究取得很大进展并已由基础研究阶段步入实质性应用研究和开发阶段。人源抗病毒基因工程抗体，尤其是人源全抗体的研究成功，给各种病毒性传染病的特异性预防和治疗带来了新的希望，在抗病毒感染生物药领域逐渐形成了一类新的抗病毒药，即所谓的抗体药(Antibody Drug)。如同当***源性疫苗向基因工程疫苗的转变，现在也急需用基因工程抗体替代血源性VIG，如通过嵌合抗体技术(Boulianne，G.L.et al.，1984；Morrison，S.L.et al.，1984)、人源化抗体技术(Jones，P.T.et al.，1986)、携带人单抗的转基因小鼠技术(Green，L.L.et al.，1994)、异体杂交瘤技术(James，K.et al.，1987)、噬菌体表面展示技术(Barbas，C.F.et al.，1991)等产生人源化抗体，现已成为国内外研究的重大方向，并正在逐步走向成功。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性抗体及其活性片段。

本发明的第二个目的在于提供编码上述抗体或其活性片段的基因。

本发明的第三个目的在于提供上述抗体及其活性片段在制备预防或治疗狂犬病药物或诊断试剂中的应用。

本发明运用噬菌体表面呈现技术，采集多个具有高滴度狂犬病毒抗体的疫苗注射者外周血淋巴细胞，通过基因工程手段构建了人源抗狂犬病毒基因工程抗体文库，并筛选获得特异抗狂犬病毒基因工程抗体Fab段。获得的Fab段抗体命名为RVFab5。

这株重组抗体是由存在于抗体轻链和重链基因可变区中的高变区(CDRs)特异性基因序列决定的，并在原核细胞中获得有效表达的特异性结合狂犬病毒的功能性抗体。它们特异性识别狂犬病毒颗粒抗原，且均针对狂犬病毒糖蛋白G，与狂犬病毒具有明显的免疫荧光反应(IFA)和酶联免疫(ELISA)反应，具有抗狂犬病毒感染的中和活性功能。

RVFab5特异性的轻链和重链可变区基因来源于对人源抗狂犬病毒抗体基因库的特异性富积筛选，该抗体库的建立来源于中国狂犬病毒疫苗免疫者外周血淋巴细胞基因。其轻链和重链可变区相应的三个CDR区序列组合及其CDR区之间框架区序列组成了每个抗体可变区序列特征，RVFab5隶属于抗体轻链家族VL1。抗体蛋白功能由存在于抗体基因轻链和重链可变区的决定族互补区域CDR1、CDR2和CDR3中特异性核苷酸序列及其互补所决定，6个相应的CDR区氨基酸序列构成了抗体的特异性抗原结合区域，决定发明中每个抗体的抗原结合特征和抗狂犬病毒功能特征。决定每株中和抗体功能的抗体轻链和重链可变区氨基酸详细序列及其比较结果如表1所示：

表1

RVFab5轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

编码RVFab5轻链可变区的基因序列如SEQ ID No.3所示，重链可变区的基因序列如SEQ ID No.4所示。

应当理解，在不影响Fab抗体活性的前提下，本领域技术人员可对SEQ ID No.1-2所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列，例如在非高变区将具有类似性质的氨基酸进行替换，如将RVFab5的重链VH序列的第8位的Val替换为Ala。

此外，考虑到密码子的简并性，例如可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，对编码上述Fab段抗体的基因序列进行修改，获得编码相同抗体的基因。本领域技术人员可以根据表达抗体宿主的密码子偏爱性，人工合成改造基因，以提高抗体的表达效率。

进一步，本发明将上述Fab抗体的轻链可变区和重链可变区进行重组，获得分子量更小的单链抗体(ScFv)，该抗体同样能够特异性识别狂犬病毒表面抗原，具有细胞内免疫的作用。单链抗体穿透力强，易于进入局部组织发挥作用。

可将上述编码Fab抗体的基因、ScFv基因克隆到表达载体中，进而转化宿主，通过诱导表达获得Fab抗体以及单链抗体。

此外，可将上述Fab抗体的轻链编码基因和重Fd段基因克隆到全抗表达载体中，并导入宿主细胞中，获得表达抗狂犬病毒的全抗免疫球蛋白。

在本发明的实施例中，将上述Fab抗体RVFab5的轻链和重Fd段基因分别克隆入全抗体表达载体pAC-L-Fc并转染昆虫Sf9细胞，利用杆状病毒/昆虫细胞***实现了全抗体的分泌型表达，得到全抗体RVIgG5。

利用ELISA、IFA、SDS-PAGE对获得的全抗体进行功能鉴定，结果表明人源IgG全抗体RVIgG5针对aG株和CTN株狂犬病毒颗粒均有特异性结合，与杆状病毒/昆虫细胞***表达ERA、CVS、CTN和aG株四种狂犬病毒株糖蛋白均有特异性结合。利用狂犬病毒快速免疫荧光灶抑制实验(RFFIT)对全抗体进行功能鉴定，结果表明：RVIgG5具有较好的中和活性，能达到689.8IU/mg，完全具备了中和国际标准攻击毒株CVS-11株的能力。

本发明运用噬菌体抗体库技术，成功地获得了特异性针对狂犬病毒糖蛋白的人源中和性抗体；利用上述获得的人源中和性抗狂犬病毒糖蛋白基因工程抗体可变区基因、Fab抗体基因以及上述每个抗体基因特征下的全抗体基因，可以在原核细胞、酵母细胞、真核细胞及任何重组***中表达和生产此抗体或以此为基础的改建后的含有此抗体基因的任何其他基因，获得具有中和狂犬病毒感染的抗体产物，制成临床上用于预防和治疗狂犬病的特异性抗体药物。

附图说明

图1是抗狂犬病毒人源Fab抗体与ERA、CVS、CTN和aG株狂犬病毒糖蛋白免疫荧光分析；

图2是纯化后IgG的SDS-PAGE电泳图；

图3是抗狂犬病毒人源IgG抗体针对CVS-11狂犬病毒快速免疫荧光灶抑制实验。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

材料和方法

1.病毒、细胞、载体：狂犬病毒aG株，CTN株，CVS株和ERA株由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所提供。人免疫用毒株PM株为进口人用疫苗株，用于狂犬病毒体外中和实验的细胞为BHK-21(ATCC)。菌株为XLI-Blue(美国Stratagene)，载体为pComb3(40kb)，由美国Scripps研究所提供。杆状病毒表达载体为pAC-L-Fc(德国PROGEN PR3003)(Liang，M.F.，Stefan，D.，Li，D.X.，Queitsch，I.，Li，W.，and Bautz，E.F.Baculovirusexpression cassettevectors for rapid production of complete human IgG from phagedisplayselected antibody fragments.Journal of ImmunologicalMethods.247：119-130.)。昆虫细胞Sf9来自美国细胞培养中心(ATCC)。

2.抗原制备

2.1真核表达狂犬病毒糖蛋白(ERA、CVS、CTN、aG株)

分别利用中国疾病预防控制中心病毒病所提供的狂犬病毒aG株，CTN株，CVS株和ERA株的cDNA为模板进行PCR扩增糖蛋白(G)基因，设计引物时2端均引入BamHI酶切位点，并且在3’段添加6-His标签。纯化的扩增产物用BamHI酶切，将酶切后的片段回收，直接克隆到同样经BamHI酶切的杆状病毒表达载体pAcUW51中，使HA基因在多角体启动子的控制下，经PCR鉴定目的基因***方向后，获得重组质粒为：pAc-HA。通过将重组质粒转染昆虫细胞制备重组杆状病毒进行蛋白表达，表达采用美国Pharmogen公司的BaculoGold共转染试剂盒。操作方法略述如下：将5μg的重组质粒DNA与0.5μg的BaculoGold线性DNA混合混合后，利用试剂盒中的转染试剂转染生长密度为50％的Sf9细胞，27℃培养4天后，收集上清作为重组病毒的毒种进行滴定和扩增。具体操作见Baculovirusexpression vector system手册。获得的表达狂犬病毒糖蛋白(ERA、CVS、CTN、aG株)重组杆状病毒感染Sf9细胞，4～5天后收获感染细胞制成重组狂犬病毒糖蛋白(ERA、CVS、CTN、aG株)抗原片。

2.2狂犬病毒纯化

分别收获狂犬病毒aG株和CTN株感染BHK-21细胞后培养上清，经甲醛灭活和安全检查后，用20％～50％连续蔗糖密度梯度35000g，4℃离心3h纯化病毒颗粒(Beckman SW28)。

3.噬菌体抗体库的构建：用淋巴细胞分离液(美国Sigma)从具有高滴度狂犬病毒抗体的疫苗注射者的抗凝血液中分离淋巴细胞，用RNeasy Mini Kit(德国QIAGEN)提取总细胞RNA，用Oligo-dT引物将提取的RNA采用Invitrogen公司的第一链合成试剂盒(SuperScriptTMIII First-Strand Synthesis System for RT-PCR.CatNo.18080-051)逆转录成cDNA，用一组扩增人源抗体IgG1重链Fd及轻链Kappa和Lambda引物，对人源轻链和重链Fab基因进行PCR扩增。PCR条件为：94℃1min，54℃1min，72℃2min，35个循环。建库方法基本按文献进行(Barbas，C.FIII.，Kang，A.S.，and larner，R.A.Assembly of combinatorial antibody libraries on phage surface：the geneIII site.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1991；88(18)：7978-7982)。

4.噬菌体抗体库的富集筛选及Fab段抗体的诱导表达：筛选抗原为超速离心纯化的灭活病毒颗粒aG和CTN株。使用时用0.1m/LNaHCO₃(pH8.6)的溶液稀释，包被免疫管，用4％脱脂奶-PBS，37℃封闭2h后，加入上述噬菌体抗体库，每管1ml，37℃孵育2h，用5％Tween-20-TBS反复洗20遍，最后用每管1ml pH2.2的甘氨酸-盐酸洗脱液洗脱，pH9.6的Tris液中和。洗脱后的噬菌体继续感染2ml新鲜的OD₆₀₀＝1.0左右的XL1-Blu菌，经辅助噬菌体VCSM13(美国Stratagene)感染后进行下一轮筛选。如此反复筛选4～5次。具体富集筛选方法及Fab段的诱导表达基本按文献进行(Barbas，C.FIII.，Kang，A.S.，and larner，R.A.Assembly of combinatorial antibody libraries on phagesurface：the geneIII site.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1991；88(18)：7978-7982)。

5.人源抗狂犬病毒Fab抗体的ELISA检测

5.1Fab表达的检测用0.1m/L NaHCO₃(pH9.6)的溶液包被抗人Fab抗体(美国Sigma，1∶2000稀释使用)于酶标板，4℃过夜；4％脱脂奶封闭，37℃1h，加入表达的Fab抗体，37℃1h；加入酶标抗人Fab二抗(美国Sigma，1∶2000稀释使用)，37℃1h；显色液显色，2M H₂SO₄终止反应，酶标仪检测吸光度A值。

5.2间接酶联免疫法检测Fab与狂犬病毒结合活性用纯化的灭活狂犬病毒颗粒作为包被抗原，随后的步骤同上。

6.间接免疫荧光(IFA)检测：利用已构建的表达狂犬病毒糖蛋白的重组杆状病毒感染Sf9细胞，4～5d后收获感染细胞制成重组狂犬病毒糖蛋白抗原片。加入表达的Fab，37℃温育30min，冲洗，加入FITC标记的抗Fab抗体(美国Sigma)，37℃温育30min，冲洗，晾干，显微镜下观察。

7.人源Fab抗体可变区基因的核酸序列分析：用Qiagen MiniprepKit(德国QIAGEN)制备质粒DNA进行核酸序列分析。轻重链的测序引物分别为5′-AAACTAGCTAGTCGCCAAGGA-3′(如SEQ IDNo.5所示)和5′-CCGCGGTGGCGGCCGCAAAT-3′(如SEQ ID No.6所示)。测序结果和Internet V-Base基因库中IgG基因序列比较。

8.全抗体重组表达质粒的构建：将获得的Fab抗体的轻链先用XbaI/SacI酶切，用末端补平酶(K片段)补平，克隆入pAC-L-Fc载体(德国PROGEN PR3003)(Liang，M.F.，Stefan，D.，Li，D.X.，Queitsch，I.，Li，W.，and Bautz，E.F.Baculovirusexpression cassette vectors for rapid productionof complete human IgG from phage displayselected antibody fragments.Journal ofImmunological Methods.247：119-130.)，再将重链Fd段利用XhoI/SpeI位点克隆进去，构建成全抗体表达载体。

9.转染及重组病毒感染与增殖：采用美国Pharmogen公司的BaculoGold共转染试剂盒。操作方法略述如下：将5μg的重组质粒DNA与0.5μg的BaculoGold线性DNA混合后，利用试剂盒中的转染试剂转染生长密度为50％的Sf9细胞，27℃培养4d后，收集上清作为重组病毒的毒种进行滴定和扩增。具体操作见Baculovirusexpression vector system手册(BD Biosciences Pharmingen，USA)。10.全抗体IgG分泌表达和纯化：重组病毒感染生长密度70％左右的Sf9细胞，27℃吸附1h.改用SF-900II SFM无血清培养液，27℃培养3～5d后收集上清。采用Amersham公司的Protein-A亲和层析柱直接纯化表达上清(Harlow E，Lane D.Antibodies：A Laboratory Manual[M].New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988.)。利用ELISA及IFA对所获纯化的IgG抗体功能特性进行鉴定。具体操作见材料方法5、6部分。

11.人源抗狂犬病毒抗体快速免疫荧光灶抑制实验(RFFIT)：取抗体及抗体标准品各稀释度50μl于96孔培养板中，加入中和用病毒CVS-11，50μl/孔，同时设空白孔对照，以及中和用病毒对照孔，混匀后置37℃中和1小时，每孔加入1×10⁶/ml BHK-21细胞悬液50μl，置37℃5％CO₂孵箱中培养24小时。待培养结束吸干培养液，每孔中加入100μl/PBS清洗并吸干后，每孔加入预冷至4℃的80％丙酮50μl，-30℃固定10分钟，弃丙酮，待挥发干燥后加入工作浓度的荧光标记抗狂犬病病毒核蛋白抗体，50μl/孔，37℃孵育30分钟，甩掉液体，用PBS洗板2～3次，甩干液体，每孔加入80％甘油50μl，荧光显微镜观察。实验组中能使荧光灶抑制≥50％的抗体最高稀释倍数，即为被检抗体的中和抗体滴度。根据Reed & Muench公式，计算各抗体样品及标注品的ED₅₀，从而得出各待检抗体的效价。

12.非高变区突变后的抗体对狂犬病毒抗性的研究

基于RVIgG5重链可变区氨基酸序列，将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第8位的Val替换为Ala，将RVIgG5轻链可变区(SEQ IDNo.1所示)的第10位的Ala替换为Gly。分别合成RVIgG5的重链编码核酸序列(在相应位置将密码子gtg替换为gcc)以及轻链编码核酸序列(在相应位置将密码子gcc替换为ggg)。按照上述8～11的方法，将轻链基因和重链Fd段克隆到pAC-L-Fc中，并转染昆虫Sf9细胞，利用杆状病毒/昆虫细胞***实现全抗体的分泌型表达，并对该突变体进行免疫学检测。

结果

1.人源抗狂犬病毒抗体库的筛选

用纯化的狂犬病毒颗粒aG株对噬菌体抗体库进行富集筛选，2轮筛选后随机挑取6000个克隆。用抗人Fab抗体(sigma公司，1∶2000稀释使用)、狂犬病毒颗粒aG株抗原包被96孔板，加入待测样品上清，用酶标抗人Fab二抗(Sigma公司，1∶2000稀释使用)检测。结果显示共获得2984株人源Fab表达阳性克隆，如表2所示。2984个人源Fab表达阳性克隆中，有181个克隆对狂犬病毒颗粒aG株特异性结合，其中36株Fab克隆被确定为针对狂犬病毒糖蛋白。

表2 aG株对噬菌体抗体库富集筛选

Fab噬菌体库	库容	挑选克隆数	Fab阳性(ELISA)	aG病毒阳性(ELISA)	糖蛋白阳性(IFA)
						Fab噬菌体库L子库Fab噬菌体库K子库	2.4x10⁸2.1x10⁸	30003000	17501234	13546	306
总数	4.9x10⁸	6000	2984	181	36

用纯化的狂犬病毒颗粒CTN株对噬菌体抗体库进行富集筛选，经2轮筛选后随机挑取2400个克隆。用抗人Fab抗体(sigma公司，1∶2000稀释使用)、狂犬病毒颗粒aG株抗原包被96孔板，加入待测样品上清，用酶标抗人Fab二抗(Sigma公司，1∶2000稀释使用)检测。结果显示共获得1833株人源Fab表达阳性克隆，如表3所示。1833个人源Fab表达阳性克隆中，有79个克隆对狂犬病毒颗粒CTN株特异性结合，其中34株Fab克隆被确定为针对狂犬病毒糖蛋白。

表3CTN株对噬菌体抗体库富集筛选

Fab噬菌体库	库容	挑选克隆数	Fab阳性(ELISA)	CTN病毒阳性(ELISA)	糖蛋白阳性(IFA)
						Fab噬菌体库L子库Fab噬菌体库K子库	2.4x10⁸2.1x10⁸	15001500	838995	790	340
总数	4.9x10⁸	3000	1833	79	34

2.人源抗狂犬病毒Fab抗体的序列分析

用DNASTAR序列分析软件进行分析处理，比较InternetV-Base基因库中的IgG序列，上述70株特异性结合狂犬病毒糖蛋白的人源Fab单克隆抗体中，其中有11株序列不同。因此本研究成功筛选并克隆11株带有不同的抗体轻重链可变区序列及其组合的抗体，其重链可变区主要分类在IgG VH4和VH3家族，其轻链可变区主要分类在IgG VL1、VL2、VL3和VK1家族，将11株特异性结合狂犬病毒糖蛋白的人源Fab单克隆抗体命名为RVFab1-11。其中选取RVFab1、RVab3、RVFab5、RVFab8和RVFab9比较序列如下：

表4人源抗狂犬病毒糖蛋白Fab抗体可变区基因的氨基酸序列比较

^aVR，variable region(可变区)；VH，heavy chain in VR(重链可变区)；VL，light chain in VR(轻链可变区).

^b CDR，complementarity determining region(互补决定区).

3.人源抗狂犬病毒Fab抗体对狂犬病毒糖蛋白的特异性结合

为了证实所获得的重组Fab抗体对不同狂犬病毒株糖蛋白的结合特异性，我们进一步通过间接免疫荧光试验(IFA)鉴定原核表达Fab抗体的功能活性。如图1所示，RVFab1与ERA、CVS、CTN和aG株四种狂犬病毒毒株糖蛋白免疫荧光均为阳性，与正常sf9细胞对照反应为阴性，其余10株人源Fab抗体与不同狂犬毒株糖蛋白免疫荧光结果与RVFab1相同。免疫荧光结果证明从抗体库筛选获得的11株Fab阳性抗体均针对狂犬病毒糖蛋白，且反应普较广。

4.全抗体IgG表达和纯化

将5株已完成功能鉴定的Fab抗体(RVFab1、RVFab3、RVFab5、RVFab8、RVFab9)的轻链和重链Fd段基因，分别克隆入全抗体表达载体pAC-L-Fc后转染昆虫Sf9细胞，利用杆状病毒/昆虫细胞***实现全抗体的分泌型表达，分别命名为RVIgG1，RVIgG3，RVIgG5，RVIgG8及RVIgG9。采用Amersham公司的Protein-A亲和层析柱直接纯化表达上清，通过SDS-PAGE检验全抗体IgG的表达及纯化情况，结果证实得到较纯蛋白，可清晰观察到解链后的抗体轻、重链，分别位于约28kD、55kD处。如图2所示。

5.人源抗狂犬病毒抗体快速免疫荧光灶抑制实验(RFFIT)

为了进一步研究5株全抗体IgG(RVIgG1、RVIgG3、RVIgG5、RVIgG8、RVIgG9)的中和活性，我们采用了快速免疫荧光灶抑制实验来检测抗体在体外与国际标准攻击毒株CVS-11株的中和反应，结果显示5株人源抗狂犬病毒全抗体RVIgG1、RVIgG3、RVIgG5、RVIgG及RVIgG9的中和效价分别为866.6IU/mg，813.3IU/mg，689.8IU/mg，876.6IU/mg，428.5IU/mg，根据WHO狂犬病专家委员会评定中和抗体水平等于或高于0.5IU/ml即表示该抗体具有中和活性，因此本研究所获得的5株人源单抗针对狂犬病毒均具有中和活性。其中RVIgG9的中和活性较弱，其余4株具有较好的中和活性，完全具备了中和国际标准攻击毒株CVS-11株的能力，如图3所示。

6.非高变区突变后的抗体对对狂犬病毒抗性影响

按照上述8～11的方法，将基于RVIgG5修改后的轻链基因和重链基因克隆到pAC-L-Fc中，并转染昆虫Sf9细胞，利用杆状病毒/昆虫细胞***实现全抗体的分泌型表达，得到突变体RVIgG5’。对该突变体进行免疫学检测，间接免疫荧光实验表明RVFab5’能特异性针对狂犬病毒糖蛋白G，采用了快速免疫荧光灶抑制实验来检测抗体在体外与国际标准攻击毒株CVS-11株的中和反应，结果显示其性质与RVIgG5基本相同。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所

<120>人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性抗体(RVFab5)

<130>khp10112591.0

<160>6

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>214

<212>PRT

<213>RVFab5-VL

<400>1

Glu Leu Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln Lys Val Thr

1 5 10 15

Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Ser

20 25 30

Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Ala Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp

35 40 45

Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys

50 55 60

Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln Thr Gly Asp

65 70 75 80

Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Ala Trp

85 90 95

Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala

115 120 125

Asn Lys Ala Thr Val Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala

130 135 140

Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val

145 150 155 160

Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Ser Lys Tyr Ala Ala Ser

165 170 175

Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Arg Tyr

180 185 190

Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala

195 200 205

Pro Thr Glu Cys Ser Phe

210

<210>2

<211>223

<212>PRT

<213>RVFab5-VH

<400>2

Leu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu

1 5 10 15

Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Pro Val Ser Ser Val Asn Phe Tyr Trp

20 25 30

Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr

35 40 45

Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg

50 55 60

Ile Thr Thr Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu

65 70 75 80

Ser Ala Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu

85 90 95

Arg Leu Thr Thr Gly Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Ser

210 215 220

<210>3

<211>649

<212>DNA

<213>RVab5-VL1

<400>3

gagctccagc cgccctcagt gtctgcggcc ccaggacaga aggtcaccat ctcctgctct 60

ggaagcagct ccaacattgg gagtaattat gtatcctggt accagcagct cccaggagca 120

gcccccaaac tcctcattta tgacaataat aagcgaccct cagggattcc tgaccgattc 180

tctggctcca agtctggcac gtcagccacc ctgggcatca ccggactcca gactggggac 240

gaggccgatt attactgcgg aacatgggat agcagcctga gtgcttgggt gttcggcgga 300

gggaccaagc tgaccgtcct aggtcagccc aaggctgccc cctcggtcac tctgttcccg 360

ccctcctctg aggagcttca agccaacaag gccacagtgg tgtgtctcat aagtgacttc 420

tacccgggag ccgtgacagt ggcctggaag gcagatagca gccccgtcaa ggcgggagtg 480

gagaccacca caccctccaa acaaagcaac agcaagtacg cggccagcag ctatctgagc 540

ctgacgcctg agcagtggaa gtcccacaga aggtacagct gccaggtcac gcatgaaggg 600

agcaccgtgg agaagacagt ggcccctaca gaatgttcat aattctaga 649

<210>4

<211>669

<212>DNA

<213>RVab5-VH4

<400>4

ctcgagtcgg gcccaggact ggtgaagcct tcggagactc tgtctctcac gtgcactgtc 60

tctggtggcc ccgtcagcag tgttaatttc tactggagct ggatccggca gcccccaggg 120

aagggactgg agtggattgg gtatatctat tacagtggga gcaccaacta taacccctcc 180

ctcaagagtc gaatcaccac atcagttgac acgtccaaga accagttctc cctgaagctg 240

agcgctgtga ctgctgcgga cacggccgtg tattactgtg cgagagagag gttgactact 300

ggcgctatgg acgtctgggg ccaagggacc acggtcaccg tctcgtcagc ctccaccaag 360

ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 420

ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 480

gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 540

ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 600

gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac 660

aaaactagt 669

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

aaactagcta gtcgccaagg a 21

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

ccgcggtggc ggccgcaaat 20

Claims

1.一种人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性抗体，其特征在于，其轻链CDR1、CDR2和CDR3以及重链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列如下表所示：

CDR1 CDR2 CDR3 VH SVNFYWS YIYYSGSTNYNPSLKS ERLTTGAMDV VL SGSSSNIGSNYVS DNNKRPS GTWDSSLSAWV

2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，其轻链可变区氨基酸序列和重链可变区氨基酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。

3.如权利要求2所述的抗体，其特征在于，其为单链抗体ScFv或全抗体免疫球蛋白IgG。

4.编码权利要求1-3任一项所述的抗体的基因。

5.如权利要求4所述的基因，其特征在于，编码轻链可变区的核苷酸序列和编码重链可变区的核苷酸序列分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

6.含有权利要求4或5所述基因的表达载体。

7.含有权利要求6所述表达载体的宿主。

8.权利要求1-3任一项所述的抗体在制备预防或治疗狂犬病的药物中的应用。

9.含有权利要求1-3任一项所述的抗体的药物或检测试剂。