CN101809166A - 用于快速竞争性同质性分析的装置、组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本文实施方案涉及用于检测和/或确定样品中靶分子的存在和/或浓度的***、方法、组合物和装置。在某些实施方案中，可以使用非凝胶电泳技术分离和分析靶分子。

Description

用于快速竞争性同质性分析的装置、组合物和方法

相关申请

本申请要求2007年9月10日提交的序号为60/993,034和2007年9月25日提交的序号为60/995,186的美国临时专利申请的权益，其通过引用整体并入本文。

领域

本文实施方案一般涉及用于快速检测和/或确定样品中靶分子的浓度和/或存在的装置、方法和/或组合物。某些实施方案涉及使用本文公开的装置和***检测和确定靶分子的浓度和/或存在。方法、组合物和/或装置对于宽浓度范围的靶分子的检测和/或浓度测量有效。

背景

检测低浓度蛋白在医药、食品检验、生物研究和生物战剂检测领域是至关重要的。测量蛋白质的最常用工具之一是抗体，例如免疫分析。对于使用完整抗体分子的一种常用替代方法是只使用抗体的结合区。例如，多种抗原结合抗体片段是已知的，例如Fab片段、Fab′片段、F(ab)₂片段、F(ab′)₂片段或scFv片段。

对于测量靶分子的抗体的另一近期替代物是适体。适体是能够被获得用于测量靶分子的核酸分子。适体提供一些优点：在相对短的时间内体外生成、具有长的贮存期限、易于化学修饰以及可能表现出比抗体更好的结合特征，但适体生成的成本高并且通常在一些生物流体中稳定性低。

用于检测和/或确定溶液中分子浓度的现有方法未能将短分析时间、高灵敏度和检测和/或定量非常低浓度存在的靶分子所需的分析较大样品容量的能力结合起来。

概述

本文实施方案涉及用于检测和/或确定靶分子的设备、方法和组合物。在某些实施方案中，本文方法涉及检测和/或确定宽浓度范围的蛋白质或其它靶分子。根据这些实施方案，组合物和方法可以涉及使用结合剂，例如抗体、适体、生物受体或设计的小分子结合剂，用于使用本文公开的方法和设备来检测和/或确定靶分子浓度。

其他实施方案涉及通过未标记靶分子和可追踪剂-靶分子复合物与轭合于捕获剂的溶液相剂(solution phase agent)竞争性结合来检测样品中的靶分子。在某些实施方案中，溶液相剂可以是已经轭合于捕获分子的抗体、抗体片段、生物受体、适体或特别选择的小分子结合剂。在某些实施方案中，捕获分子可以是抗生物素蛋白，例如链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白(neutravidin)、寡核苷酸引物或肽核酸(PNA)引物。根据这些实施方案，溶液相剂可以结合与捕获分子轭合物轭合的溶液相聚合物，并降低凝胶电泳中溶液相剂的电泳迁移率。因此，结合的可追踪剂-靶分子复合物在分子分离技术(例如电泳)中容易与未结合的可追踪剂-靶分子复合物分离，提供两个群体的靶分子。此外，这两个群体可以被测量，提供与靶分子浓度成反比和成正比的信号。靶分子/溶液相剂/聚合物复合物与未结合靶分子之间的电泳迁移率差异允许该过程既快速又有效。

在某些实施方案中，特异性抗体可以结合与捕获分子轭合的溶液相聚合物以降低抗体的电泳迁移率。因此，结合的可追踪剂-靶蛋白分子复合物可通过分离方法(例如电泳)与未结合的可追踪剂-靶蛋白分子分离。然后，这两个群体可使用特异性单克隆或多克隆抗体测量，提供与靶蛋白分子浓度成反比和成正比的信号。根据这些实施方案，靶/抗体/聚合物复合物与未结合靶之间可以产生大的电泳迁移率差异，允许感兴趣靶分子的分离、快速检测和确定。

在某些实施方案中，所公开的方法将夹心免疫分析从异质性分析转变为同质性分析，从而消除了许多通常伴随异质性分析(例如夹心ELISA分析)的劳动密集和高成本的步骤。在其他实施方案中，所公开的方法获得完全在溶液相中进行分析所具有的动力学优点。本文实施方案可以允许夹心免疫分析在数分钟而非数小时内进行并且具有降低的成本。

其他实施方案涉及用以评估、读取和/或记录本文公开方法所提供数据的***。在某些实施方案中，本文公开的设备提供对感兴趣靶分子的存在或不存在和/或定量的实时的视觉检测和评估。本文涵盖的一些实施方案允许靶分子在无凝胶***中分离。根据这些实施方案，本文涵盖的装置可以是反应室。在某些示例性反应室中，靶分子的存在或不存在和/或浓度的评估可以在小于一小时或小于45分钟或小于30分钟或小于15分钟内评估。一个示例性反应室可以包括但不限于至少两个电极(例如，阳极和阴极铂电极)(901)、至少两个电极端子(902)、至少两个缓冲液贮器(903)、至少两个橡胶垫片(例如，硅)(904)、位于反应室上端和下端的透析膜(905)、至少一个石英反应通道(906)、至少两个通道托架(907)、以及位于至少两个缓冲液贮器和至少一个反应通道之间的至少两个电压传送通道(908)。本文公开的其他实施方案包括作为***的部分而涵盖的装置。根据这些实施方案，***可以包括装置、电压源(例如，提供约10v/cm至约1,000v/cm的电压源)、激光器(例如，连续波激光器)(1001)、激光束(1002)、整形棱镜(例如，激光线束整形棱镜)(1003)、反应室(900)、反应通道(906)、光发射(例如，发射的荧光)(1006)或颜色发射、透镜和过滤器(1007)、照相机(例如，电荷耦合器件照相机)(1008)和任选的、接收***数据的计算机。在某些实施方案中，***还可以包括加载设备(例如自动化的)(1101)、滚筒(1102)和用于分析多个分析(multiple assay)的多个反应室(1103)。

在某些实施方案中，本文使用的涵盖的膜(例如，透析膜)可以包括任何透析膜，例如商业上可获得的透析膜。根据这些实施方案，透析膜位于反应室的顶部并任选位于底部。在某些实施方案中，透析膜与反应室的顶部和底部直接接触。

本文预期公开的反应室被布置为单通道分析或多通道分析。单通道反应室分析可以是能够位于工作台上的独立的反应室或手持式可移动反应室设备。预期单通道反应室允许将受治疗者的样品放入无凝胶反应室，并且样品的分离结果可以容易地在实验室或实验室环境外分析。

本文涵盖的其他实施方案可以包括计算机和计算机软件，用于接收、记录、处理和/或显示从本文公开的组合物和方法获得的数据。在某些实施方案(例如，图12所示的实施方案)中，示例性软件的截屏可以包括照相机(1008)捕获的图像。本文涵盖的软件程序的进一步实施方案可以允许选择待分析区域，例如用于条带强度分析和/或评价靶分子复合物浓度。根据这些实施方案，预期计算机软件程序将允许评价和分析多个反应室实验和多种样品中的靶分子分析。如图12右窗口所示，每一分析运行的参数可以被设置，例如暴露时间、暴露间隔时间、暴露次数，然后数据可以被显示，允许在线分析数据。

在一个实施方案中，计算机软件程序可以用于评估样品中靶分子的存在或浓度。在另一实施例中，可以评估多样品中靶分子的存在或不存在。样品的参数，例如与受治疗者有关的来源和从受治疗者的取样，可以用于确认每个样品。此外，可以相对于其他样品分析样品制备的相关参数和用于确认样品的结合剂。可以从本文涵盖的软件程序获得最佳条件以增加样品制备和分析中的重现性和一致性。此外，样品分析获得的数据可以用于评估获得样品的受治疗者中病况的存在、污染物的存在、物质的存在，或者物质的存在或不同浓度所代表的病况的进展。本文涵盖的受治疗者可以是人或动物。可选择地，样品可以获自地点或表面而非受治疗者。分析本文公开的分析而获得的数据可以用于评估受治疗者施用至少一种治疗剂的治疗的需要。如果靶分子的存在、不存在或浓度水平与受治疗者的病况相关，则这些分析可以在患者的整个治疗性处理过程中使用，以连续分析治疗进展。在另一实施方案中，这些测试可以与其他测试一起使用，以获得对受测试的受治疗者的总体病况更全面的理解。

附图简述

图1表示可追踪分子(101)(例如荧光素)与靶分子(102)连接形成可追踪靶分子(103)的示例性示意图。

图2表示捕获成分(104)(例如生物素)与结合剂(202)(例如抗体)连接形成捕获成分-结合剂复合物(203)的示例性示意图。

图3表示可追踪靶分子(103)、捕获成分-结合剂(203)和游离靶分子(102)结合形成复合物(301，302)和过量可追踪剂-靶分子复合物(103)的示例性示意图。

图4表示图3所示反应的可追踪产物与过量中性抗生物素蛋白(401)混合产生可追踪剂(403)或游离靶分子(402)与捕获成分-结合剂和多价剂(例如，中性抗生物素蛋白)(401)的复合物以及过量的可追踪剂-靶分子复合物(103)和中性抗生物素蛋白的示例性示意图。

图5表示图4所示反应产物与过量多价剂(例如，中性抗生物素蛋白)和过量基本不带电的可捕获聚合物(例如，生物素轭合的聚合物)混合产生靶分子(502)或可追踪剂-靶分子复合物(503)与捕获成分-结合剂和多价剂和可捕获聚合物的复合物，以及过量的可捕获聚合物(501)和过量的可追踪剂-靶分子复合物(103)的示例性示意图。

图6A表示从顶部到底部三层的反应室初始状态的示意图：分别是样品层、捕获层和堆积层。样品层可以包括图3所示反应左侧的任何或所有组分，反应缓冲液中含有过量多价剂(例如，中性抗生物素蛋白)。捕获层含有在反应缓冲液中基本不带电的可捕获聚合物(例如，生物素轭合的聚合物)。堆积层含有基本不带电的聚合物(例如，线性聚丙烯酰胺)。每个图中室左侧显示的灰色迹线表示在每个点可检测量的信号生成抗体。

图6B表示能够在示例性样品层中自组装的、示例性图3和图4所示反应所示复合物的示意图。

图6C表示垂直方向上的电压应用示意图，导致所有组分电泳进入捕获层并形成图5所示反应所示的复合物。

图6D表示所有组分由于电压进一步应用而迁移的示意图，导致所有未结合基本不带电的可捕获聚合物(例如，生物素轭合的聚合物)的复合物移动进入并通过堆积层，而结合的复合物浓缩在捕获层和堆积层的界面。

图7A表示其中样品中的未标记的运铁蛋白(靶分子)与8nM FITC-标记的运铁蛋白(可追踪靶分子)竞争的剂量-响应实验的数据的示例性曲线图。这些示例性曲线图代表从顶部到底部约30秒间隔的时间点。每个曲线图左侧最接近阴极，因此大多数物类向右迁移。

图7B表示其中样品中的未标记的运铁蛋白(靶分子)与8nM FITC-标记的运铁蛋白(可追踪靶分子)竞争的剂量-响应实验的数据的示例性曲线图。条件与图7A相同，除了将26nM未标记的运铁蛋白与图7A的所有组分一起混入样品层。

图7C表示其中样品中的未标记的运铁蛋白(靶分子)与8nM FITC-标记的运铁蛋白(可追踪靶分子)竞争的剂量-响应实验的对照运行数据的示例性曲线图。条件与图7A相同，除了抗体(结合剂)被置于样品层之外。

图8表示图7A-7C的示例性曲线图以及介于0和102nM之间的其他未标记的运铁蛋白(靶分子)浓度在各浓度10分钟计算的峰面积的示例性图。表示了典型的竞争曲线。

图9A-9C表示示例性反应室(900)。9A表示反应室的示例性俯视图，包括但不限于(901)铂电极、(902)电极端子、(903)缓冲液贮器、(904)硅橡胶垫片、(905)透析膜、(906)石英反应通道、(907)通道托架、(908)缓冲液贮器和反应通道之间的电压传送通道。9B表示反应室的示例性前视图，包括但不限于(906)石英反应通道和(904)硅橡胶垫片。9C表示反应室的示例性侧视图，包括但不限于(907)通道托架、(903)缓冲液贮器、(902)电极端子、(905)透析膜、(904)硅橡胶垫片、(908)缓冲液贮器和反应通道之间的电压传送通道。

图10表示本文涵盖的装置(1000)的示例性示意图，包括但不限于(1001)473nm连续波激光器、(1002)激光束、(1003)激光线束整形棱镜、(900)反应室、(901)铂电极、(906)石英反应通道、(1004)发射的荧光、(1005)透镜和过滤器、和(1006)电荷耦合器件(CCD)照相机。

图11表示本文涵盖的具有多个反应室的***(1100)的示例性示意图，包括但不限于(1001)473nm连续波激光器、(1006)CCD照相机、(1101)自动加载设备、(1102)滚筒、和(1103)反应室。

图12表示本文涵盖的一些实施方案的软件的示例性截屏。左窗口表示CCD照相机(1102)捕获的图像，并允许选择待分析区域。右窗口设置本文涵盖的分析的参数(例如暴露时间、暴露间隔时间、暴露次数)，显示一个或多个分析的代表性数据，并允许在线分析数据。

图13A-13B表示本文涵盖的一些实施方案的示例性软件截屏。

图14表示本文涵盖的一些实施方案的示例性软件截屏。

图15表示图13的曲线图以及介于0和102nM之间的其他未标记的运铁蛋白浓度在各浓度10分钟计算的峰面积的示例性数据，描绘了得到的图。

图16表示本文公开的示例性***的视图。该示例性图表示反应室(900)、照相机(1006)、激光器(1001)、与激光器可操作连接的光束定向器(例如，45度光束定向器)(1601)、和光束扩展器(例如，Galilean光束扩展器AR涂层：350-650nm)(1602)的侧视图。在一个示例性实施方案中，图16所示***可以是面包盒尺寸，例如5-6英寸×16英寸，或甚至小5倍或10倍，以便例如以实现便携性。

图17表示本文公开的示例性***的视图。该示例性图表示反应室(900)、照相机(1006)和光束扩展器(例如，Galilean光束扩展器AR涂层：350-650nm)(1602)的俯视图。

图18表示本文公开的示例性装置的视图。该示例性图表示带有室支架板(例如，Delrin室支架板)(1801)的反应室(900)、贮器(Delrin缓冲液贮器)(903)和基板(例如，Delrin基板)(1802)的俯视图，A指示图19放大视图所表示的图解圆圈。

图19表示本文公开的示例性装置的视图，还在图18中以缩小尺寸表示为A。该示例性图表示反应室(900)的侧视图，其具有石英反应室(906)、室密封件(例如，硅反应室密封件)(1901)、支架(例如，Delrin反应室支架)(1801)、窗(例如，尺寸调节窗)(1902)、膜(例如，透析膜)(905)、垫片(例如，硅反应室垫片)(904)、与1902不同的窗(例如，蓝宝石窗)(1903)、窗密封件(例如，硅蓝宝石窗密封件)(1904)和窗架(例如，Safire窗架)(1905)。

图20表示示例性计算设备。

图21表示用于评估样品中靶分子存在或浓度的示例性方法的流程图，具有用于产生根据本文公开的一些实施方案的标准曲线的示例性操作。

定义

如本文使用，″一个″或″一种″可以表示一个或多于一个的项目。

如本文使用，器皿(vessel)可包括但不限于管、通道或容器(container)。

详述

在以下章节中，描述了各种示例性组合物和方法以详细说明各种实施方案。对于本领域技术人员明显的是，实施各种实施方案不需要采用本文列出的具体细节的全部或甚至某些，而是浓度、时间和其他具体细节可以通过常规实验来修改。在一些情况下，公知的方法或组分未包括在说明书中。

本文实施方案涉及用于检测和/或确定靶分子的设备、方法和组合物。在某些实施方案中，本文方法涉及检测和/或确定样品中宽范围浓度的蛋白质或其他靶分子。根据这些实施方案，组合物和方法可以涉及使用结合剂例如抗体、抗体片段、适体、生物受体或设计的小分子结合剂，用于使用本文公开的方法和设备来检测和/或确定靶分子。

分子运动的理论处理

如本文涵盖的，粒子(其可以是分子)经流体的运动经历与其速度、其尺寸(由其流体动力学半径描述)和流体粘度成正比的摩擦力。方程1(参见示例性方程)所示的该正式表达被称为斯托克斯方程。

称为迁移率的量由方程1定义，以便粒子速度除以迁移率得到摩擦力。对于球形分子，流体动力学半径等于半径。对于非球形分子，其可以定义为在蠕动流条件下有等效表现的球形分子的半径(如果分子形状已知，则其可以被理论推导)。从方程1获得的迁移率在方程2a中表达。如果假定已知分子量的分子为球形，则半径如方程2b所示计算。将方程2b代入方程2a产生依照分子密度、分子量和流体粘度的迁移率的表达，如方程2c所示。

粒子以恒定速度运动，此时归因于该运动的摩擦力等于施加力(例如重力、电压梯度)。设置摩擦力等于施加力并求解速度，将粒子速度表示为施加力乘以迁移率，如方程3所示。因此，迁移率提供计算粒子速度的方便的方式。分子在电场中经受的力与分子上的电荷和电场强度成正比。因此，分子速度由方程4给出，其中″u ″表示的量称为电泳迁移率(单位为cm²/V sec)，由方程5定义。方程5中的因子10⁷将电荷e伏特(其为m-kg-s单位)转换成cm-g-s单位。

注意，方程4暗示，带负电的分子(负离子)以与正离子相反的方向运动。在方程4的更一般形式中，粒子速度和电场(其是电压梯度)是向量并因此具有与其相伴的方向。

迁移率还与斯韦柏系数s密切相关，斯韦柏系数s被定义为粒子在离心机中20℃水中的沉降速度除以离心加速度。斯韦柏系数以10^-13秒的单位表达。使用方程3的浮力来发现速度，斯韦柏系数作为迁移率的函数由方程6a给出。因此，迁移率可以如方程6b所示从斯韦柏系数导出。

在一些实施方案中，可以使用与感兴趣的靶分子特异性缔合或结合的结合剂。在一些更具体的实施方案中，可以使用结合感兴趣的靶分子的抗体、适体或其他特别设计的分子。在某些实施方案中，血清中发现的抗体的最常见类型之一可以被导向结合靶分子，例如免疫球蛋白G(IgG或γ球蛋白)。IgG的分子量为大约150kDa(1320氨基酸残基)。不同IgG分子的等电点范围从6至7.5，暗示在中性pH下中等负电荷至轻微正电荷。IgG的斯韦柏系数为大约7。假设密度约1.2g/cm³，根据方程2b计算的迁移率为2.1×10⁷s/g，而根据方程6b计算的迁移率为1.7×10⁷s/g。

这两种计算之间的差异来自至少三个原因：(1)IgG不是完美球形分子，因此通过沉降计算的迁移率应该较低；(2)IgG的密度不是精确已知的，并且这种不确定性在第二种计算中被放大而在第一种计算中被缩小；和(3)第二种计算中使用的斯韦柏系数仅是大约已知的。在某些实施方案中，IgG的迁移率可以估计为2×10⁷s/g。

可靠测量的蛋白质浓度已导致许多涉及抗体或抗体样分子的分析的发展。多种多样的免疫分析是本领域已知的并且涵盖在本文中。以下一些描述使用抗体作为结合剂，但是许多其他物质涵盖在本文中，例如适体、特别设计的结合剂以及抗体片段例如Fab片段或适体。在某些实施方案中，选择信号***对于本文公开的方法而言是重要的但不一定是核心的。荧光标签可以轭合于本文公开的结合剂。例如，诸如FITC或若丹明的分子可以轭合于抗体以提供荧光信号。在其他实施方案中，轭合的酶可以轭合于结合剂，例如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶(如果需要比色分析)，或者诸如碳酸酐酶或脲酶的酶(如果需要电导率分析)。根据这些实施方案，酶分析通常需要添加适合的酶底物。

免疫分析

免疫分析可以被表征为“异质性的”或“同质性的”。本领域技术人员对这些术语的含义存在一些困惑。在一些情况下，术语“同质性的”可以暗示结合的复合物在检测前与未结合的分子分离(通过任何方式)，而术语“异质性的”暗示很少或没有分离发生。可选地，本文涵盖的术语“异质性的”可以表示分析可以使用固相和溶液相两者，其中复合物与固相的连接允许未结合分子在检测复合物之前被洗掉(或者结合的分子被洗掉，取决于相)。此外，如本文所涵盖的，术语“同质性的”可以表示结合、分离(如果有)和检测步骤发生在溶液相。在许多情况下，这些不同的定义在分析如何分类中产生很少差异，因为大部分分离或洗涤步骤涉及结合至固相支持体，因此涉及分离或洗涤的分析通过任一定义都将被分类为异质性的。一个例外是通过电泳的分离，其中分析可能根据第一套定义而被分类为异质性的，并根据第二套定义而被分类为同质性的。预期本公开的实施方案可能主要根据第二套定义。

因此，如在本文某些实施方案中公开的，异质性分析包括将抗体-靶分子复合物在测试过程中结合至表面，然后洗掉未结合的靶分子、样品中的其他物质和未结合的抗体，然后测定样品中靶分子的存在和/或测量其量。另一方面，异质性分析允许样品和抗体混合在一起并确定待确定样品中靶分子的存在和/或测量其量，不需要结合至表面或洗涤。

异质性分析可以具有高灵敏度和特异性，并且能以提供极高通量测试***的形式进行。这些形式还可适以测试大多数靶分子。一个限制包括缓慢的测试时间需要相对精密的仪器以大量进行以及伴随表面结合和洗涤步骤增加的成本。

同质性分析可以是非常快的，可容易适用于新的蛋白质、肽或其他分子和平台，并且可以是非常具有成本效益的。限制可包括可能较低的特异性和灵敏度。此外，这些形式可能局限于小的靶抗原。因此，同质性和异质性分析两者在本文根据需要、被分析的样品和感兴趣的靶分子而被考虑。

定量竞争性免疫分析的一个实施方案可以包括与固相支持体结合的抗体以及溶液中被允许结合至抗体的标记的和未标记的靶。标记的靶可以与未标记的靶竞争有限数目的抗原结合位点。靶分子上的标记可以是放射性同位素、酶或荧光分子。使用该类型免疫分析产生的信号与未标记的靶浓度成反比。

本领域存在许多同质性竞争性免疫分析。一般，同质性免疫分析是有利的，因为结合的和游离的配体的分离通常不是必要的，因此简化了仪器。这里，所有结合发生在溶液相中，因此这些方法往往是快速的。

这些技术的一般优点包括：(1)由于仅需要单一结合剂(例如抗体)而简化了分析的开发，(2)通常比传统的双位点分析更快的分析时间，(3)跨宽分析范围的定量测量，和(4)有能力对太小以致于不允许同时结合两个抗体的靶有效(例如，夹心分析)。

同质性免疫分析提供与靶浓度成反比的一种或多种信号。该事实导致很难以该技术测量小浓度，因为小信号中的小变化能够比大信号中的小变化更可靠地测量。特异性仅源自单一结合事件，而同质性分析的灵敏度可以使用高品质抗体来提高。

下文是一些常用技术的一些描述。该列表不是穷尽性的，并且不意味着排除可能在本领域已知的任何其他同质性竞争性分析。

一些最早的同质性竞争性分析涉及监测不溶性抗原-抗体复合物的形成，例如使用多克隆抗体。简言之，因为靶特异性多克隆抗体可以识别靶上的多个表位并且是二价的，靶和抗体的大型复合物可以在靶和抗体浓度大致相等时形成。这些复合物的尺寸可以长至它们变成不溶性的点。这些不溶性复合物阻碍或散射穿过样品基质的光。这些散射的光可以通过浊度法测量，或者相反地，通过样品的光衰减可以通过比浊法测量。产生的信号与样品中存在的靶的量成正比。该技术对于以相对高水平存在并且尺寸足以具有多个抗原结合位点的分析物非常有效。注意，随着靶浓度逐渐超过抗体结合位点，多个抗体同时结合同一抗原的能力下降。因此，通过在分析混合物中加入已知浓度的纯化抗原以使抗体-抗原复合物形成最大化，可以使分析成为竞争性的；待分析样品中添加抗原可以导致复合物形成的减少。一些限制可能包括需要多个结合位点和低浓度测量的不适合性。该方法还可能受到样品基质改变和特异性缺乏的影响。

另外的同质性竞争性免疫分析是荧光偏振免疫分析(FPIA)。FPIA取决于溶液中分子或复合物的转速。较大的分子或复合物比较小的分子或复合物旋转更慢。当适合波长的偏振光穿过样品时，如果分子或复合物旋转足够慢，则荧光发射光的偏振被保持。如果未结合的荧光标记靶足够小以致于其转速足够快，则发射光消偏振。如果荧光标记的靶结合至特异性IgG，则复合物的质量增加，减缓转速并保持发射光的偏振。

在某些***中，FPIA分析***包括靶特异性抗体、荧光标记的靶和待定量的未标记的靶。标记的和未标记的靶竞争特异性IgG上有限数目的结合位点。偏振荧光信号与未标记靶的浓度成反比。该方法因其简单性和速度而受到关注。FPIA限于小分子靶并且因为灵敏度而牺牲了分析范围。

有许多其他竞争性同质性分析，例如CEDIA^TM，EMIT^TM、辅基免疫分析(prosthetic-group immunoassay)、酶连传免疫分析(enzyme-channelingimmunoassay)和底物标记的荧光免疫分析。这些方法是竞争性的，并且一般涉及抗体与靶结合后酶或酶复合物的活化或失活。这些方法具有与FPIA相似的益处和限制。

亲和探针毛细管电泳(APCE)

毛细管电泳涉及借助带正电和带负电的电极在填充有离子缓冲液的长毛细管的两端施加电压，从而导致带电分子向一个电极或另一个电极迁移(Oda和Landers，1997)。一个常见的伴随现象被称为“电渗流”。玻璃毛细管往往具有带负电的表面，其与溶液中接近表面的带正电的离子结合。这些带正电的离子向负电极(阴极)迁移，随其拖带主体溶液。该电渗流导致所有离子向阴极迁移(尽管以不同速率)并通常被良好利用，因为单一检测器可以分析所有离子物类，而不论它们流过时的电荷。电渗流可以通过改变毛细管壁的电特征而被消除或甚至逆转。

对于APCE，靶分子与已经轭合至检测分子(通常为荧光探针)的同源抗体一起孵育。然后将混合物注射入毛细管并施加电压，建立电渗流。游离靶、游离抗体和靶/抗体复合物将以不同速率迁移，并可以因此通过荧光检测器检测为单独的峰(游离靶不应该产生信号)。

电泳

电泳是可以用于替代洗涤结合至固相支持体的复合物、从而将正常为异质性蛋白质分析的分析转化为同质性分析的技术。电泳通常用于根据分离尺寸和电荷来分离分子(例如，诸如蛋白质或核酸的大分子)。正电极和负电极可以放入含有待分离分子的溶液中，并在电极之间施加电压降。一般，带正电的分子会向带负电的电极迁移，而带负电的分子会向带正电的电极迁移。一般，分子迁移的速度与它们的电荷成正比并且与它们的尺寸成反比。例如，小的高电荷分子比大的较少电荷分子移动快。然而，致密分子比松散分子移动快，使得具有相同质量和电荷的两个分子可以不同速率迁移。较高的电压降导致更快的迁移，而溶液中其他带电分子的较高浓度导致较慢的迁移。

有许多本领域已知的电泳的改变。分子移动通过的溶液可以是通常在毛细管中自由的，或者其可以嵌入基质中。常见基质包括聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶和滤纸。基质用于根据尺寸筛分分子，导致更好的分离。溶液Ph(酸度)影响分子电荷，并且可以被改变(甚至从基质一端至另一端)以影响分子的迁移速率。溶液可以包括引起蛋白质和核酸分子解折叠以使相同质量和电荷的分子的迁移率相同的变性剂，例如尿素。待电泳的样品可以用洗涤剂(例如SDS)预处理，所述洗涤剂包裹所有蛋白质以消除电荷差异，以便迁移速率取决于质量而非电荷。然而，对于需要结合剂(例如抗体、抗体片段或适体)的大多数分析而言，蛋白质和结合剂都可能需要保持为其天然状态，以使改变pH或变性蛋白质的过程通常不是可行的选择。

蛋白质的检测

本文某些实施方案涉及将异质性竞争性分析转化为同质性竞争性分析。在一个实施方案中，异质性竞争性免疫分析可以转化为同质性竞争性免疫分析。在一些实施方案中，这些转化的某些优点包括减少了通常伴随异质性竞争性免疫分析的劳动密集和高成本步骤和限制。此外，这些转化允许同质性免疫分析的几种形式。在其他实施方案中，几乎或完全在溶液相中进行本文涵盖的分析可以具有其他潜在的动力学优点。而在其他实施方案中，涵盖了同质性竞争性分析较大分子的组合物、方法和装置。例如，这些分析可以是免疫分析或使用其他结合剂的分析。在某些实施方案中，竞争性免疫分析可以在数分钟而非数小时内进行并且具有降低的成本和对靶分子提高的灵敏度。

在示例性实施方案中，使用的物质可以包括下述的一种或多种：aplidin、阿扎立滨、阿那罗唑、氮胞苷、博来霉素、硼替佐米(bortezomib)、苔藓抑制素-1、白消安、刺孢霉素、喜树碱、10-羟基喜树碱、卡莫司汀、西乐葆、苯丁酸氮芥、顺铂、伊立替康(CPT-11)、SN-38、卡铂、克拉屈滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、多西他齐(docetaxel)、更生霉素、葡糖苷酸道诺霉素、柔红霉素、***、己烯雌酚、多柔比星、2-吡咯啉并多柔比星(2P-DOX)、氰基-吗啉代多柔比星、葡糖苷酸多柔比星、葡糖苷酸表柔比星、炔雌醇、雌莫司汀、依托泊苷、葡糖苷酸依托泊苷、磷酸依托泊苷、氟尿苷(FUdR)、3′，5′-O-二油酰基-FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨、氟他米特、氟尿嘧啶、氟***、吉西他滨、己酸羟孕酮、羟脲、伊达比星、异环磷酰胺、L-天冬酰胺酶、甲酰四氢叶酸、洛莫司汀、氮芥、醋酸甲孕酮(medroprogesterone acetate)、醋酸甲地孕酮、美法仑、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、氨甲蝶呤、米托蒽醌、光辉霉素、丝裂霉素、米托坦、丁酸苯酯、***、丙卡巴肼、紫杉醇、喷司他丁、PSI-341、司莫司汀链脲菌素、三苯氧胺、紫杉烷类、紫杉酚、丙酸睾酮、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、替尼泊苷、托泊替康、尿嘧啶氮芥、velcade、长春花碱、长春瑞滨、长春新碱、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶、onconase、rapLR1、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单孢菌外毒素、假单胞菌内毒素、反义寡核苷酸、干扰RNA或其组合。

适体

在某些实施方案中，使用的结合剂可以是适体。构建和确定适体结合特征的方法是本领域公知的。例如，这样的技术描述于美国专利第5,582,981、5,595,877和5,637,459号，每一个通过引用并入本文。

适体可以通过包括合成、重组和纯化方法在内的任何已知方法制备，并且可以单独使用或者与特异性针对相同靶的其他配体组合使用。一般，最少约3个核苷酸、优选至少5个核苷酸是实现特异性结合所必要的。比10个碱基短的序列的适体可能是可行的，尽管10、20、30或40个核苷酸的适体可能是优选的。

适体需要含有赋予结合特异性的序列，但可以侧翼区扩展和以其他方式衍生。在进一步实施方案中，侧翼序列可以包含优先识别或结合部分以增强适体固定于底物的特异性序列。

适体可以如常规DNA或RNA分子一样被分离、测序和/或扩增或合成。可选地，感兴趣的适体可以包含修饰的寡聚体。通常存在于适体中的任何羟基可以被膦酸基团、磷酸基团替代，被标准保护基保护，或者被活化以制备与其他核苷酸的额外键合，或者可以轭合于固相支持体。一个或多个磷酸二酯键可以被可选的连接基团所替代，例如P(O)O被P(O)S、P(O)NR₂、P(O)R、P(O)OR’、CO或CNR₂替代，其中R是H或烷基(1-20C)并且R’是烷基(1-20C)；此外，该基团可以通过O或S连接于相邻核苷酸。并不是寡聚体中所有的键合都需要相同。

用作确定特异性结合序列的本发明方法中起始材料的适体可以是单链或双链DNA或RNA。在优选实施方案中，所述序列可以是单链DNA，其比RNA较不易受核酸酶降解。在优选实施方案中，起始适体将含有随机化的序列部分，一般包括约10至400个核苷酸、更优选20至100个核苷酸。随机化序列侧翼为引物序列，所述引物序列允许扩增发现与靶结合的适体。为了合成随机化区，可以在合成过程中在希望随机化的位置添加核苷酸混合物。

与感兴趣的特定靶分子结合的适体的制备和筛选方法是本领域公知的并涵盖在本文中。技术一般涉及从候选适体混合物选择和分步重复结合、分离结合适体与未结合适体以及扩增。因为混合物中仅存在少数对应于最高亲和力适体的序列(可能仅一个适体分子)，一般希望设置划分标准以使混合物中显著量的适体(大约5-50％)在分离过程中被保留。每个循环导致对靶高亲和力的适体的富集。三至六个选择和扩增循环的重复可以用于产生与感兴趣的靶分子高亲和力和特异性结合的适体。

成像剂和放射性同位素

在某些实施方案中，靶分子(例如肽或蛋白质)可以连接于用于成像和诊断各种患病器官、组织或细胞类型的成像剂。许多适合的成像剂以及它们连接至蛋白质或肽的方法是本领域已知的。某些连接方法可以涉及使用金属螯合剂络合物，采用例如有机螯合剂例如DTPA与蛋白质或肽连接。靶分子也可在偶合剂(例如戊二醛或高碘酸盐)存在下与酶反应。与荧光素标志物的轭合物在这些偶合剂存在下或通过与异硫氰酸盐反应制备。

可能用作成像剂的顺磁离子的非限制性实例包括铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和铒(III)，钆是特别优选的。用于其他环境例如X射线成像中的离子包括但不限于镧(III)、金(III)、铅(II)和特别是铋(III)。

可能用作成像剂或治疗剂的放射性同位素包括砹²¹¹、¹⁴碳、⁵¹铬、³⁶氯、⁵⁷钴、⁵⁸钴、铜⁶²、铜⁶⁴、铜⁶⁷、¹⁵²Eu、氟¹⁸、镓⁶⁷、镓⁶⁸、³氢、碘¹²³、碘¹²⁴、碘¹²⁵、碘¹³¹、铟¹¹¹、⁵²铁、⁵⁹铁、³²磷、³³磷、铼¹⁸⁶、铼¹⁸⁸、Sc⁴⁷、⁷⁵硒、银¹¹¹、³⁵硫、锝^94m、锝^99m、钇⁸⁶和钇⁹⁰。¹²⁵I通常优选用于某些实施方案，并且锝^99m和铟¹¹¹也由于其低能量和适合远程检测而通常是优选的。

放射性标记的蛋白质或肽可以根据本领域公知的方法生成。例如，它们可以通过与碘化钠或碘化钾以及化学氧化剂(例如次氯酸钠)或酶氧化剂(例如乳过氧化物酶)接触而被碘化。蛋白质或肽可以通过配体交换过程或直接标记技术而被锝^99m标记，所述配体交换过程例如通过用亚锡溶液还原高锝酸盐、将还原的锝螯合至葡聚糖凝胶柱并将肽施加于该柱，所述直接标记技术例如通过孵育高锝酸盐、还原剂(例如SNCl₂)、缓冲溶液(例如酞酸钠-钾溶液)和肽。通常用于将作为金属离子存在的放射性同位素结合至肽的中间官能团包括二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、DOTA、NOTA、卟啉螯合剂和乙二胺四乙酸(EDTA)。还考虑使用的有荧光标记物，包括若丹明、异硫氰酸荧光素和肾造影剂。

在某些实施方案中，要求保护的蛋白质或肽可以连接至第二结合配体或酶(酶标签)，其在与生色底物接触后会产生带色产物。适合的酶的实例包括脲酶、碱性磷酸酶、(辣根)氢过氧化物酶和葡萄糖氧化酶。优选的第二结合配体是生物素和抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白化合物。这种标记物的使用对于本领域技术人员而言是公知的。这些荧光标记物对于体内使用而言是优选的，但也可以用于体外应用、特别是内窥镜或血管内检测程序。

在可选实施方案中，靶分子可以用荧光标志物标记。可光检测标记物的非限制性实例包括Alexa 350、Alexa 430、AMCA、氨基吖啶、BODIPY630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基若丹明、6-羧基若丹明、6-羧基四甲基氨基、级联蓝(Cascade Blue)、Cy2、Cy3、Cy5、6-FAM、丹磺酰氯、荧光素、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯-2-氧-1，3-二唑)、俄勒冈绿488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514、太平洋蓝、酞酸、对酞酸、异酞酸、甲酚紫(cresyl fast violet)、甲酚蓝紫(cresyl blue violet)、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、藻红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴合物(rare earth metal cryptates)、铕三联吡啶二胺(europiumtrisbipyridine diamine)、铕穴合物或螯合物、二胺、双花青苷、La Jolla蓝染料、别藻蓝蛋白(allopycocyanin)、allococyanin B、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、硫胺素、藻红蓝蛋白、藻红蛋白R、REG、若丹明绿、异硫氰酸若丹明、若丹明红、ROX、TAMRA、TET、TRIT(四甲基若丹明异硫醇)、四甲基若丹明和德克萨斯红。这些和其他发光标记物可以获自商业来源例如Molecular Probes(Eugene，OR)。

使用的化学发光标记化合物可以包括鲁米诺、异鲁米诺、芳香吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯或生物发光化合物例如荧光素、荧光素酶和水母发光蛋白。可以例如在手术中、内窥镜或血管内肿瘤或疾病诊断中使用诊断免疫轭合物。

在各种实施方案中，使用的标记物可以包含金属纳米粒子。制备纳米粒子的方法是已知的。纳米粒子可以获自商业来源(例如，NanoprobesInc.，Yaphank，NY)。修饰的纳米粒子可商业获得，例如来自Nanoprobes，Inc.(Yaphank，NY)的

纳米粒子。用于轭合蛋白质或肽的功能化纳米粒子可以商业获得。

交联剂

在一些实施方案中，蛋白质或肽可以使用本领域已知的各种交联试剂标记，所述交联试剂例如同-双官能、异-双官能和/或可光活化的交联试剂。这样的试剂的非限制性实例包括双酰亚胺酯；1，5-二氟-2，4-(二硝基苯)；辛二酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯；酒石酸二琥珀酰亚胺酯；二甲基-3，3′-二硫-双丙亚氨酸酯；N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯；4-(溴氨基乙基)-2-硝基苯基叠氮基苯；和4-叠氮乙二醛。在示例性实施方案中，碳二亚胺交联剂(例如DCCD或EDC)可以用于交联酸性残基与氨基或其它基团。这样的试剂可以被修饰以连接各种类型的标记物，例如荧光标记物。

双官能交联试剂已经广泛用于各种目的。携带两个相同官能团的同双官能试剂证明高效诱导相同和不同大分子或大分子亚基之间的交联以及多肽配体与其特异性结合位点的交联。异双官能试剂含有两个不同的官能团。通过利用两个不同官能团的差别的反应性，交联可以被选择地并顺序地控制。双官能交联试剂可以根据它们的官能团的特异性来衍生，所述官能团例如氨基、巯基、胍基、吲哚、羧基特异性基团。这些中，针对游离氨基的试剂已经特别流行，因为它们的可商业获得性、容易合成以及并且它们可以被应用的温和反应条件。大部分异双官能交联试剂含有伯胺-反应性基团和硫醇-反应性基团。

在另一实例中，异双官能交联试剂和使用所述交联试剂的方法被描述(美国专利5,889,155，通过引用并入本文)。交联试剂组合了亲核酰肼残基与亲电马来酰亚胺残基，在一个实例中允许乙醛偶联至游离硫醇。交联试剂可以被修饰以交联各种官能团。

如本领域已知，任何可区别的组分可以任何方式与样品中待检测的感兴趣的靶分子共价连接或结合。

符号：

a＝离心加速度[cm/s2]

e＝电子或质子的单位电荷[1.6×10-19C(库伦)]

f＝施加力[g cm/s2]

ff＝摩擦力[g cm/s2]

r＝分子的流体动力学半径[cm]

m＝迁移率[s/g]

M＝分子量[g/摩尔]

N＝阿伏加德罗常数(6.023×1023/摩尔)

s＝斯韦柏系数[10-13s]

u＝电泳迁移率[cm2/s-V]

v＝粒子通过流体的速度[cm/s]

z＝分子上的净电荷

η＝流体粘度[g/cm-s]

p＝分子密度[g/cm3]

pf＝流体密度[g/cm3]

ψ＝电场[伏/cm]

f_f＝6πrηv            (方程1)

m＝v/f_f＝1/(6πrη)    (方程2a)

$r=\sqrt[3]{\frac{3V}{4\mathrm{\π}}}=\sqrt[3]{\frac{3M}{4\mathrm{\πN\ρ}}}$ (方程2b)

$m=\sqrt[3]{\frac{\mathrm{N\ρ}}{{162\mathrm{\π}}^2{\mathrm{\η}}^{3}M}}$ (方程2c)

v＝fm                  (方程3)

v＝zemψ·＝uψ        (方程4)

u＝ezm×10⁷            (方程5)

$s=v/a\·{10}^{13}=\frac{(\mathrm{\ρ}-{\mathrm{\ρ}}_f)}{{\mathrm{\ρ}}_f}\frac{M}{N}\mathrm{amla}\·{10}^{13}$ (方程6a)

$m=\frac{\mathrm{\ρNs}}{(\mathrm{\ρ}-{\mathrm{\ρ}}_f)M}\×{10}^{13}$ (方程6b)

$m=\sqrt[3]{\frac{(6\×{10}^{23})\left(1.2\right)}{{162\mathrm{\π}}^2{\left(0.01\right)}^3(1.5\×{10}^5)}}=2.1\×{10}^{7}s/g$ (方程7a)

$m=\frac{\left(1.2\right)(6\×{10}^{23})(7\×{10}^{-13})}{(1.2-1.0)(1.5\×{10}^5)}=1.7\×{10}^{7}s/g$ (方程7b)

计算机软件

在本文涵盖的某些实施方案中，用于本文公开方法的有关反应室和具有一个或多个反应室的***的软件应用(例如，EVEIA分析和EVEIA仪器)可以使用本领域已知用于此类方法的任何软件编写。可以使用软件开发程序，例如Java Developers Kit(例如JDK 1.5.06)和Eclipse集成开发环境(例如版本：3.2)，包括与随购买的硬件提供的驱动器连接的一些适配软件。本文使用的软件是高度模块化的，由超过一百个编写的类(软件模块)组成，其转而取决于JDK中包含的数百个类。Eclipse IDE组合了先进的代码编辑器与编译器和文件管理***。

软件用户将看到一套至少三个不同的应用。在一个应用中，软件控制装置，收集并保存数据至文件，并提供运行中的实时显示。在另一应用中，软件提供运行中产生的数据显示。此外，第三个应用允许比较来自不同运行的数据。所有应用允许简单的数据分析(峰高和峰面积)。

在其他实施方案中，控制器应用由两个或更多个窗口组成。至少一个窗口显示照相机捕获的图像，并为用户提供选择感兴趣区域进行图像分析的工具。至少第二个窗口提供对于分析数据获得的控制，包括暴露时间、暴露间隔时间和运行总长。在这时，对仪器的控制限于：在规定时间打开激光器并持续规定时长(或控制快门来实现相同结果)，请求照相机捕获规定暴露时间的图像，并且请求图像下载到计算机。基线数据也可被获取或从之前保存的运行载入。每次运行保存的文件包括顺序保存的每个单独时间点的原始数据。改变数据显示方式(下一段详述)不改变保存的数据。

在某些实施方案中，控制器应用的第二个窗口(参见图13A-13B)也能实时显示数据，并且提供改变数据显示方式的工具。数据可以显示为每次暴露的感兴趣区域的原始图像(例如参见图12，左图)，为强度跨感兴趣区域与轴向位置放射状平均的图像曲线，或两者。每个曲线的高度(y-刻度)和相邻曲线之间的y-重叠量(从无重叠到完全重叠)可以全部通过图形用户界面实时改变。此外，曲线上的区域可以被用户选择进行简单数据分析(峰高和峰面积)，其被实时显示。该数据显示特征对于程序组内所有应用是常见的，并且是软件模块基础的实例，因为相同的类用于所有情况。

在其他实施方案中，第二个应用允许控制器应用中保存的任何运行的重放(参见例如图13B)。外观上，这与控制应用的第二窗口基本相同；然而，必须处理运行控制的按钮和域被检索保存的运行并控制其显示方式所必需的按钮和域替代。例如，通过将显示的曲线数目限制为一个并通过使一系列曲线(代表单个时间点)以200毫秒的间隔显示，保存的运行可以重新显示为影片。

而在其他实施方案中，第三个应用允许显示和比较不同运行所保存的数据的曲线(参见例如图14)。目前，从大约十次不同运行保存的文件可以被选择来显示。来自每次运行的任何单曲线(代表单个时间点)可以与来自所有其他选择的运行的单曲线一起显示。对于单独运行或对于步调一致的所有运行，时间点可以正向或反向的顺序显示。

***

本文公开的其他实施方案涉及到被设计来运行分析、收集分析数据并分析本文涵盖的分析信息的***。其他实施方案涉及评估、读取、记录和/或处理本文公开方法所提供数据的***。根据这些实施方案，可以是本文公开的***的部分的装置可以是反应室。一个示例性反应室可以包括但不限于至少两个电极(例如铂电极，阴极和阳极)(901)，每一个可操作连接到至少一个电极端子(902)。此外，每个电极位于反应室一端(例如顶部和底部)的至少一个缓冲液贮器(903)中，其中每个缓冲液贮器具有至少一个橡胶垫片(例如硅)(904)。根据可构成反应室的这些组件，反应室可以还包括一个或多个透析膜(905)(例如在反应室的顶部和底部)、至少一个石英反应通道(906)、至少一个通道托架(907)和位于至少一个缓冲液贮器与至少一个反应通道之间的至少两个电压传送通道(908)。

本文公开的其他实施方案包括一种装置，所述装置包括作为***的部分的反应室。本文涵盖的***可以包括但不限于电压源、定位成与反应室(900)相互作用的激光器(例如，连续波激光器)(1001)、从激光器发射的激光束(1002)、能够指导反应室(900)内可追踪剂-靶分子复合物的偏转激光束的光束发射的整形棱镜(例如，激光线束整形棱镜)(1003)、反应通道(906)、光发射(例如发射的荧光)(1006)、与照相机(例如，电荷耦合器件照相机)(1008)可操作连接的透镜和过滤器(1007)以及任选地从***接收数据的计算机。在某些实施方案中，***还可包括用于将样品加载入反应室的加载设备(例如自动化的加载设备)(1101)、能够从一个反应室旋转至下一个反应室的滚筒(1102)和置于滚筒周围的多个反应室(1103)。该***的一个特征是有能力使用可追踪剂和检测***测量靶分子的存在或不存在，其中靶分子的检测或浓度测量可以在一小时或更短时间、45分钟或更短时间、30分钟或更短时间、或者15分钟或更短时间内评估。

本文涵盖的其他实施方案可以包括用于记录、处理和显示从本文公开的组合物和方法获得的数据的计算机和计算机软件。在某些实施方案中，例如图12所示的实施方案中，示例性软件的截屏可以包括照相机(1008)捕获的图像。本文涵盖的软件程序的进一步实施方案可以允许选择待分析的区域，例如进行条带强度分析和/或评估靶分子复合物浓度。根据这些实施方案，预期计算机软件程序将允许评估和分析多个反应室实验和多种样品的靶分子分析。如图12所示，每次分析运行的右窗口参数(例如暴露时间、暴露间隔时间、暴露次数)可以被设置，然后数据可以被显示，允许在线分析数据。

光的轴向传递

本文涵盖的一些实施方案涉及其中激发光可以包括轴向传递至反应室并且经反应室壁进行检测的***或装置。该技术相对于光经圆柱体或器皿壁的传递的一个优点在于原始光源的完全强度可以传递贯穿圆柱体的完整长度。在某些实施方案中，如果光经圆柱体壁传递，则光可能需要散布以有效覆盖圆柱体长度，从而降低其强度。在其他实施方案中，待传递的光(例如，激光或其他相当的光)可能需要根据贯穿圆柱体平均强度分布来校准。光可以从光源直接轴向瞄准穿过圆柱体，或者光源可以通过镜子或棱镜来导向。任选地，如果光经圆柱体底部传递，则任选地，透明窗(例如蓝宝石、石英、玻璃或光学透明塑料)或等价物可能需要置于圆柱体的底部以允许光进入。在其他实施方案中，如果光经圆柱体顶部传递，则可能需要额外步骤以处理圆柱体顶部流体组分形成的弯液面的透镜效应。

示例性计算机***概述

本发明实施方案包括各种元素，其中许多可以由硬件组件执行或者可以机器可执行指令实现，所述计算机可执行指令可用于使得编有所述指令的通用或专用处理器实现所述元素(参见例如图21)。可选地，步骤可以通过硬件、软件和/或稳固件的组合来执行。因此，图20是实施方案可以利用的计算机***2000的实例。根据一个示例性方法，计算机***包括总线2001、至少一个处理器2002、至少一个通信端口2003和主存储器2004。***2000还可以包括可移动存储介质(未显示)、只读存储器2005和/或大容量储存器组件/设备2007。

处理器2002可以是任何已知的处理器，包括但不限于

或Itanium

处理器、或

或Athlon

处理器、或行处理器。通信端口2003可以用于基于调制解调器的拨号连接的任何RS-232端口、10/100以太网端口或使用铜或光纤的千兆端口。通信端口2003可以根据网络选择，所述网络例如局域网(LAN)、广域网(WAN)或计算机***2000连接的任何网络。

主存储器2004可以是随机存取存储器(RAM)或者本领域公知的任何其他动态存储设备。只读存储器2005可以是任何静态存储设备，例如用于存储静态信息(例如处理器2002的指令)的可编程只读存储器(PROM)芯片。

大容量储存器2006可用于存储信息和指令。例如，可以使用硬盘(诸如

系列的SCSI设备)、光盘、磁盘阵列(诸如RAID，诸如Adaptec系列RAID设备)或任何其他大容量存储设备。

总线2001将处理器2002与其他存储器、储存器和通信块通信偶联。根据使用的存储设备，总线2001可以是基于PCI/PCI-X或SCSI的***总线。

可移动存储介质可以是任何类型的外部硬盘、软盘、Zip驱动器、只读存储光盘(CD-ROM)、可重写光盘(CD-RW)、只读存储数字视频光盘(DVD-ROM)。显示器(未显示)可以是可操作来提供参数模型的视觉展示(例如分析的实时运行显示)并允许用户观看、改变和根据本文实施方案与参数模型互动的任何设备，包括但不限于图形网络界面和计算机监视器。

上文描述的组件意为示例一些类型的可能性。前述实例绝不应该限制本发明范围，因为它们仅是示例性实施方案。

在其他实施方案中，在样品(例如，可能具有感兴趣的靶分子)被制备并载入示例性反应室后，接收操作2101接收来自结合的可追踪剂-靶分子复合物或未结合的可追踪剂-靶分子复合物的发射数据。另一个接收操作2103接收数据并可以计算感兴趣靶分子的对照浓度的标准曲线。在一些实施方案2100中，每个接收操作可以使用所公布的方程的一个或多个来计算样品中靶分子的浓度。每个***可被配置以基于操作员输入来分析一种或多种感兴趣的靶分子。本文预期某些公开的方法和或装置可简单测量结合的可追踪剂-靶分子复合物而不是未结合的可追踪剂-靶分子复合物。

产生操作2103或2105基于接收的数据产生标准曲线或迁移率曲线。另一个产生操作2107产生感兴趣的靶分子(如果存在)的浓度曲线。本领域技术人员将容易理解如何能在产生操作2103和2105中产生标准曲线。

推导操作2107推导样品中存在的靶分子的量。一般，推导操作2107基于操作员选择的数据点或选择的发射值产生代表样品的模型数据。

免疫分析

以可靠方式测量蛋白质浓度的重要性已经导致开发了许多涉及抗体或抗体样分子的分析。Gosling(1990)深入描述了目前使用的许多免疫分析，通过引用并入本文。以下描述使用抗体作为结合剂，但在许多情况下，Fab片段或适体可以替代使用。然而，本文描述的方法和组合物不受此限制，并且在其他实施方案中，结合剂可以是例如生物受体。许多这样的受体(例如胰岛素受体、***1受体、乙酰胆碱受体、GABA受体、血管紧张素(antiotensin)受体、胰高血糖素受体、趋化因子受体、细胞因子受体、等等)是本领域公知的，并且任何此类已知受体或其配体结合片段可用于实施要求保护的方法。

检测和/或确定浓度通常如下提供：用信号部分(signal moiety)标记抗体或其它结合分子，所述信号部分例如荧光、化学发光、放射性或本领域已知的其他标签；使结合分子与靶结合；并检测或测量与结合的抗体关联的发射、放射性等的量。在大多数情况下，信号***的选择对于方法而言不是核心的。为荧光信号与抗体轭合的分子(例如FITC或若丹明)可通常被例如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶的酶替代(如果需要比色分析)或者被诸如碳酸酐酶或脲酶的酶替代(电导率分析)。然而，酶分析需要添加适当的底物。

针对将信号分子直接轭合于结合靶蛋白的抗体(一级抗体)所普遍采用的可选方法是采用与信号分子轭合的二级抗体。二级抗体是被开发以结合来自某些物种的所有抗体的抗体(并因此必然来自不同的物种)。例如，抗体可以从已经注射了兔抗体的山羊获得。如果这些二级抗体与信号分子轭合，则二级抗体与一级抗体的结合提供信号分子与一级抗体的连接而无化学轭合。该二级抗体可以用于连接信号分子与衍生自相同物种的任何一级抗体，从而为分析增加一定的模块性。

异质性免疫分析在没有规定结合发生的固相支持体类型下被描述。然而，使用的固相支持体的类型代表任何免疫分析过程的显著差异，影响不同步骤所需程序和时间并且有时影响将要使用的检测类型。例如，在其最常见形式中，夹心ELISA涉及将复合物结合至微量滴定板中孔的底表面，这实现了容易手工引入洗涤试剂并容易读取荧光或比色信号。然而，分析可能由于质量转移的限制而进行几个小时。蛋白质需要时间在主体溶液和表面停滞层(stagnant layer)之间平衡，并且通常需要多次洗涤。这些问题可以通过使用微珠作为结合表面而在一定程度上得到缓解，所述微珠使表面与主体溶液更加紧密接触并显著增加了每单位体积溶液可用于结合的表面积。然后，固相(珠上)与溶液相在洗涤过程中经过滤或离心分离。可以通过使用顺磁珠而使该过程更适于自动化，所述顺磁珠容易与溶液相磁分离。几乎所有异质性免疫分析可以被调整以利用这些不同的表面。

有两种常见类型的用于检测和/或确定样品中分子浓度的免疫分析，其在某种程度上与本文描述的方法相似。首先，就特异性而言，夹心ELISA被认为是免疫分析的金标准。该高度特异性通过要求两个单独抗体与感兴趣靶同时结合来实现，一种还用于下述方法的技术。其次是亲和探针毛细管电泳分析(APCE)。该分析由以下组成：感兴趣的靶与单一一级抗体结合，然后经毛细管电泳设备运行混合物，以分离结合抗体与未结合抗体。电泳分离允许整个分析在溶液中进行，一种也在下述方法中使用的技术。

试剂盒

本文涵盖用于进行本文方法的试剂盒。试剂盒可以包括但不限于实现所公开方法的一个或多个反应室组合物和用于产生反应室的容器。可选地，试剂盒可以除了样品外仅包括用于进行所公开的分析的试剂。

夹心ELISA

夹心酶联免疫吸附分析(ELISA)早先被开发并已被认为是蛋白质检测的金标准，表现出非常高的特异性和精确性作为其主要优点。一些缺点是检测蛋白所需时间和需要大量步骤。根据洗涤的严格性和次数以及孵育步骤的时长，Elisa通常进行2至6小时。

Elisa的第一步是使靶蛋白的一级抗体与孔底表面结合，所述表面已经被预处理以增加蛋白质结合。所述表面然后用封闭剂例如牛血清白蛋白(BSA)处理以封闭任何剩余活性位点，从而防止任何其他蛋白质结合和影响测试的特异性。孔被洗涤多次以去除游离抗体和封闭剂。

推测含有靶蛋白的样品被加入孔并孵育预定时间。理想地，仅该靶蛋白会结合至表面抗体，并且没有其他蛋白会结合至封闭表面或结合至表面抗体。进行多次洗涤以去除任何非特异性结合的蛋白质。如果有任何非特异性蛋白质确实结合了，则下一步使它们的作用最小化。

与检测分子轭合的靶蛋白的二级抗体被加入孔并允许结合。因为该抗体的特异性，其很少结合与表面或第一抗体非特异性结合的任何蛋白。进行多次洗涤以去除任何未结合的第二抗体。因为该第二抗体与检测分子轭合，该第二抗体的浓度可以被确定并与原始样品中靶蛋白的浓度相关联。

亲和探针毛细管电泳(APCE)

毛细管电泳涉及借助带正电和带负电的电极在填充有离子缓冲液的长毛细管的两端施加电压，从而导致带电分子向一个电极或另一个电极迁移。一个常见的伴随现象被称为“电渗流”。玻璃毛细管往往具有带负电的表面，其与溶液中接近表面的带正电的离子结合。这些带正电的离子向负电极(阴极)迁移，随其拖带主体溶液。该电渗流导致所有离子向阴极迁移(尽管以不同速率)，并且因为单一检测器可以分析所有离子物类，而不论它们流过时的电荷。电渗流可以通过改变毛细管壁的电特征而被消除或甚至逆转。

对于APCE，靶分子与已经轭合至检测分子(通常为荧光探针)的同源抗体一起孵育。然后将混合物注射入毛细管并施加电压，建立电渗流。游离靶、游离抗体和靶/抗体复合物将以不同速率迁移(被电渗流放大)，并可以因此通过荧光检测器检测为单独的峰(游离靶不应该产生信号)。尽管毛细管电泳比ELISA分析更快速，但可以分析的样品的小体积(由于毛细管的小尺寸)限制了该方法检测样品中极低浓度存在的蛋白质或其它靶分子的灵敏度。

用于靶分子检测和定量的增强速度的电免疫分析(EVEIA)

本文实施方案提供检测和确定样品中靶分子存在或不存在和/或浓度的快速、高灵敏度方法，该方法涉及垂直堆积的电泳。因为EVEIA技术的电泳部分发生在体积和横截面积比毛细管大得多的容器中，这些实施方案已经实现样品中低浓度存在的靶分子的检测方法。这里，电泳可以发生在流体动力学半径(横截面积除以周长再乘以2)为0.5mm或更大的管、通道或其他容器中。在一些实施方案中，示例性管内部体积为单位长度管2mm³或更大。在其他实施方案中，最小流体动力学半径可以是横截面积除以周长再乘以2，为0.5mm或更大。例如，约0.75mm的流体动力学半径提供2mm3/mm长度。对于圆管，流体动力学半径可以与半径相同。该实施方案可用于示例说明经不规则形状通道的流动。

在本文公开的其他实施方案中，基本不带电的聚合物剂可以包括以下的一种或多种：线性聚丙烯酰胺、部分交联的聚丙烯酰胺(例如，在组合物保持为流体或液体的固体凝胶形成点之下交联)葡聚糖或聚乙二醇或其他类似物质或物质组合。在其他实施方案中，基本不带电的聚合物剂在本文公开的条件下很少迁移，例如这些物质可以在施加电力100v/cm下迁移约0.1至约1.0mm/sec。在某些实施方案中，管、通道或容器内增加的密度梯度可以是1.0至1.1g/ml。在其他实施方案中，所述梯度可以包括但不限于密度1.0至1.02g/ml的样品层、密度1.002至1.05g/ml的捕获层和密度1.01至1.1g/ml的堆积层。在本文涵盖的所有实施方案中，堆积层具有比捕获层更高的密度，并且捕获层具有比样品层更高的密度。任选地，粘度也可以从顶部到底部增加，以在界面产生堆积效应。在某些实施方案中，粘度可以是1厘泊但不超过1.3。在其他实施方案中，2厘泊可以是底层粘度的最大上限值。在本文某些方面中，质荷比在公开的复合物形成时增加，导致靶分子电泳迁移率的降低。因为复合物含有非常高的质荷比，其在堆积层变得基本不动，而未结合组分迁移经过堆积层并与复合物分离。这可以提供能够短时间检测非常低的靶分子浓度的非常快速且灵敏的分析。

在一些实施方案中，本文公开方法可以由以下组成：

1.获得感兴趣靶分子的第一结合剂并使可追踪剂或可跟踪剂与靶分子的一些以不干扰感兴趣靶分子特异性结合的方式轭合(但不与其他靶分子轭合)。在某些实施方案中，第一结合剂可以是单克隆抗体、抗体片段(例如Fab)、适体或表现出与感兴趣靶特异性结合的任何其他分子或分子复合物。感兴趣的靶可以是蛋白质、肽、蛋白复合物或可溶于水溶液的任何分子。可追踪剂或可跟踪剂可以是荧光分子、放射性标记物、产生比色产物的酶、金属离子、产生可电检测产物的酶、或可容易直接或间接检测和定量的任何分子或分子复合物。

2.获得感兴趣的靶分子的第二结合剂并使捕获剂与其以不干扰感兴趣的靶的特异性结合的方式轭合。该第二结合剂可以是单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段(例如Fab)、适体或表现出与感兴趣靶特异性结合的任何其他分子或分子复合物。捕获剂可以是生物素、链霉抗生物素蛋白、单链核酸或能够高特异性和亲和力结合的任何其他分子或分子复合物。在某些实施方案中，第二结合剂是多克隆抗体，捕获剂是与中性抗生物素蛋白复合的生物素。

3.获得推测含有一定量的所述感兴趣的靶的样品，所述量希望被确定。

4.准备由导电水溶液堆积的层组成的垂直电泳室，一些层含有不带电的聚合物，这些层以从顶部到底部增加的密度或粘度布置以抑制混合。最顶层由待测量样品组成(″样品层″)。例如，顶层可以具有1g/ml的密度，这些层中每个随后层的密度增加约0.2至5％，并且进展为与样品层的密度或粘度相比密度或粘度约0.5％、或2％或10％的密度或粘度增加。样品层之下的层中的至少一个将含有与捕获剂的同源结合剂轭合的聚合物(″捕获层″)。任选地，捕获层之下的层中的至少一个将含有相对高浓度的不带电的聚合物，该聚合物用于阻碍与聚合物结合的复合物的迁移率(″堆积层″)。不带电的聚合物的浓度可以是约0.5％至20％重量/体积。

5.将所述第一结合剂、所述第二结合剂和所述感兴趣的靶一起混合并孵育以允许形成三元复合物，该三元复合物由与信号剂(signalingagent)轭合的第一结合剂组成，所述信号剂结合至感兴趣的靶，所述感兴趣的靶与第二结合剂结合，所述第二结合剂与捕获剂轭合。

6.从一电源(例如，能够产生10-1,000v/cm的电源)在含有混合物的电泳室的垂直距离两端施加电势。因此，靶分子迁移进入捕获层，其中复合物将结合与捕获剂同源物轭合的聚合物，显著降低这些复合物的迁移率。

7.持续施加电势，从而实现与聚合物结合的低迁移率复合物与所有其他分子分离，因此在时间和空间上从所有其他信号剂集中与感兴趣的靶缔合的信号剂。

8.任选地，持续施加电势，从而使所有靶分子迁移进入其中复合物的迁移率被进一步降低的堆积层，导致含有这些复合物的条带压缩，并实现与聚合物结合的低迁移率复合物与所有其他分子的进一步分离。

9.测量这些所述化合物组的一个或多个中的信号剂，从而确定所述样品中所述感兴趣的靶的量。

实施例

下述实施例被包括以说明本文提出的某些实施方案。本领域技术人员应该理解，随后实施例中公开的技术代表在本文公开的实施中作用良好的公开的技术，并因此被认为构成其实施的优选方式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应该理解，可以对公开的具体实施方案进行许多改变并依然获得类似或相似的结果而不背离本文精神和范围。

实施例1

在某些实施方案中，本文的组合物和方法涉及测量推测含有靶分子的样品中靶分子浓度的组合物和方法。例如，下文可包括下述步骤的全部或一些：

获得感兴趣的靶分子并将可追踪分子以不干扰下述结合剂特异性结合的方式轭合至所述靶分子。本文涵盖的靶分子可以是蛋白质、肽、蛋白质复合物或水溶液中可溶的任何其他分子。本文涵盖的可追踪分子可以是荧光分子、放射标记物、产生信号(例如比色产物或发光产物)的酶、产生可电检测产物的酶、或可容易直接或间接检测和定量的任何分子或分子复合物。一个示例性方法描述于示例性图1，靶分子是运铁蛋白，并且可追踪分子是荧光素。

获得能够结合靶分子的结合剂，并将捕获剂以不干扰与靶分子特异性结合的方式轭合至靶分子。在某些实施方案中，结合剂可以是抗体、抗体片段(例如Fab)、适体或能够特异性结合靶分子的任何其他分子或分子复合物。在各种实施方案中，捕获剂可以是生物素、寡核苷酸引物或表现出与同源分子稳定、高亲和力结合的任何分子。一个示例性方法可以描述于图2，结合剂是抗体，并且捕获剂是生物素-中性抗生物素蛋白复合物。

获得推测含有靶分子的样品并确定靶分子的存在和/或浓度。在一个示例性方法中，准备了垂直电泳室。根据该方法，室可以由导电水溶液的堆积的层组成。这些层中一些含有不带电的聚合物。在某些实施方案中，这些层可以布置为从顶部到底部具有增加的密度或粘度以减少层的混合。在该实施例中，最顶层由待测量样品组成(″样品层″)。样品层以下的层中至少一个层可含有与捕获剂的同源结合剂轭合的聚合物(″捕获层″)。任选地，捕获层以下的层中至少一个层将含有相对高浓度的不带电的聚合物。在某些实施方案中，不带电的聚合物可以添加至一层或多层，实现不带电的聚合物与靶分子或靶分子复合物结合，与不带电的聚合物的缔合可用于阻碍与聚合物结合的复合物的迁移率(″堆积层″)。

下述步骤代表用于制备可能含有靶分子的样品并分析样品中靶分子的存在和/或浓度的示例性方法和组合物。例如，第一步可包括将结合剂、可追踪剂-靶分子和感兴趣的靶分子(作为待分析样品的组分)一起混合并孵育以允许形成复合物。将这些组分混合可产生包括结合剂的复合物，所述结合剂与样品中可追踪剂-靶分子或未标记的靶结合。在其中结合剂是多价的情况下，结合剂可以结合至可追踪剂-靶分子或未标记的靶之一或两者。这描述于图3。

在可选实施方案中，结合剂、可追踪剂-靶分子、感兴趣的靶分子(作为待分析样品的组分)与所述捕获层的组分可以一起混合并孵育，以允许形成复合物，所述复合物由与样品中所述标记的靶或所述未标记的靶结合的所述结合剂组成，所述结合剂还经由聚合物缔合的捕获剂的同源结合剂结合至所述聚合物。

然后，可以在含有混合物的电泳室的两端施加电势以分离复合物与未结合的可追踪剂-靶分子，因此在时间和空间上集中这些不同的含有可追踪剂的化合物组。在一个实施方案中，复合物将集中在捕获层和堆积层的界面。

测量与一个或多个复合物缔合的或未结合的可追踪剂-靶分子。在某些实施方案中，样品中靶分子的存在和/或浓度可以通过应用标准竞争性分析动力学来测量。在一个实施方案中，可以进行靶分子浓度的分析确定。例如，来自其中预期复合物占优势的电泳室的一个或多个区域的总体信号可以与来自其中预期未结合可追踪剂-靶分子占优势的电泳室的区域的总体信号相比较。这样的比较可以提供信号数据的标准化，因此导致对样品中靶分子浓度的更准确确定。

实施例2：

靶和IgG-靶-捕获聚合物复合物的具体迁移率的计算

在一个示例性方法中，在之前研究中发现示例性靶蛋白(运铁蛋白)的电泳迁移率为约9×10^-5cm²/s V。根据方程3C和5并使用80千道尔顿的分子量，可以计算每个运铁蛋白分子的大约带电荷为-3。IgG具有大约150千道尔顿的分子量。

因为分子的可变区，电荷范围可以是负至略正。该实施例中使用的电荷的一个估计值为-5。在一个实施例中，线性聚丙烯酰胺(LPA)分子可以被使用并与多个生物素分子轭合。在多价中性抗生物素蛋白存在下，聚合物网络包括通过生物素-中性抗生物素蛋白-生物素键合形式交联结合的LPA分子，并且这些网络的分子量可以达到数百万道尔顿。由此形成的网络的分子量在本实施例中被认为是10⁷道尔顿。根据方程2C，迁移率与分子量的立方根成反比。

根据方程5，电泳迁移率与电荷成正比。尽管忽略诸如蛋白质和LPA之间密度差异和LPA水合状态等事实，LPA网络分子量的不确定性超过了这些其他影响，因此对于大致估计的目的而言，这些影响在本示例性方法中将不被考虑。基于游离运铁蛋白的电泳迁移率，运铁蛋白-抗体-LPA网络复合物的电泳迁移率可由以下表示：u＝(9×10^-5)((-3+-5)/(-3))(80/(80+150+10,000)^1/3＝2×10^-5cm²/sV。

未结合的运铁蛋白比运铁蛋白-抗体-LPA网络复合物移动快4至5倍。在某些实施例中，该差异可以是比这大的数量级。

在一个示例性实施方案中，使用毛细管电泳电压可以高达500V/cm。一个限制是由于热产生，热产生与施加电压的平方成正比。根据该示例性方法，通过施加100V/cm，游离分子以大约0.5cm/min向阳极(正电极)迁移，而完整复合的运铁蛋白以0.1cm/min沿相同方向移动，允许游离靶分子与那些复合的靶分子明显分离。

实施例3：

在一个示例性方法中，感兴趣的靶分子是蛋白质运铁蛋白。为了测试本文公开的某些实施方案，特异性结合人运铁蛋白的抗体被获得并轭合至多价剂生物素。然后纯化抗运铁蛋白抗体-生物素复合物。接下来，纯化的人运铁蛋白使用普遍可用的技术用荧光素共价标记，所述技术还允许抗运铁蛋白抗体(例如兔衍生抗体)的特异性结合。荧光素连接的运铁蛋白和生物素轭合的抗体与过量中性抗生物素蛋白和推测含有浓度约50pM的未标记运铁蛋白的样品混合。最终混合物具有100pM与生物素轭合的抗运铁蛋白抗体和100pM荧光素连接的运铁蛋白。该混合物在37℃下孵育5分钟。

样品/抗体/标记的靶混合物被注射进入电泳池，施加100V/cm的电势5分钟。例如，参见图6A-6D。捕获层中的荧光信号可以例如使用荧光检测器测量。任选地，捕获层外区域的荧光信号可以被测量，代表部分由于样品中存在未标记的运铁蛋白而未与抗体结合的荧光素连接的运铁蛋白。这两种信号的比较允许更准确估计样品中的靶浓度。在另一实施例中，这些步骤可以使用推测含有多种浓度的靶分子(例如100pM靶分子、200pM靶分子或无靶分子)的样品来重复。数据可以制表并绘图，如示例性图8所述利用与靶浓度成反比的信号。此外，含有未知量的靶分子(例如运铁蛋白)的样品可以按照上述方案来分析。使用该实施例，可以从已知运铁蛋白浓度分析数据构建的图(例如，图8所示″标准浓度曲线″图)外推确认运铁蛋白浓度。

实施例4：

在一个示例性方法中，来自概念验证实验的数据示于图7A-7C。如图7A-7C所示，中性抗生物素蛋白用于说明三层设计如何起作用来捕获希望的靶分子并将这些靶聚集成条带以检测。准备该分析的电泳池，由三层组成：底(″堆积″)层中是tris-乙酸缓冲液和7.5％甘油中的线性聚丙烯酰胺；中(″捕获″)层中是tris-乙酸缓冲液和4％甘油中的生物素化葡聚糖；和顶(″样品″)层中是tris-乙酸缓冲液中FITC-标记的中性抗生物素蛋白。在对照运行中，捕获层没有生物素化的葡聚糖。样品层在检测窗口外集中，在这些曲线的右侧。当向池施加电压时，中性抗生物素蛋白迁移(向左)入捕获层，其在那里结合生物素化的聚合物，显著降低其迁移率。当中性抗生物素蛋白-聚合物复合物到达堆积层时，线性聚丙烯酰胺的存在将复合的中性抗生物素蛋白的前进速度变慢，几乎到静止，聚集条带。对照运行中的游离中性抗生物素蛋白自由移动通过捕获层和堆积层。

根据本公开内容可以制成并实施本文公开和要求保护的所有组合物和/或方法和/或装置，而无需过度实验。虽然已经就优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但对于本领域技术人员明显的是可以对本文描述的组合物和/或方法和/或装置以及方法中的步骤或步骤的顺序进行改变，而不背离本发明的概念、精神和范围。更具体说，明显的是，在化学上和生理上相关的某些物质可以替代本文描述的物质，同时获得相同或类似的结果。对于本领域技术人员明显的所有这样类似的替代物和修饰被认为在所附权利要求限定的本发明精神、范围和概念内。

Claims (31)

1.一种组合物，用于分离样品中的靶分子，所述组合物包括：

从顶部到底部密度增加或粘度增加的垂直放置的两个或更多个相，其中所述两个或更多个相的一个或更多个相含有一种或更多种基本不带电的聚合物剂，其中所述基本不带电的聚合物剂能够与经所述含有所述一种或更多种基本不带电的聚合物剂的相电泳的结合剂缔合，并且其中所述基本不带电的聚合物剂能够与捕获分子缔合。

2.如权利要求1所述的组合物，其中所述结合剂能够与靶分子缔合。

3.如权利要求1所述的组合物，其中所述结合剂与靶分子缔合形成第一复合物，并且所述基本不带电的聚合物剂与所述第一复合物的结合剂缔合形成第二复合物。

4.如权利要求1所述的组合物，其中一个或更多个相在靶分子向底部迁移时逐渐降低所述靶分子的迁移率。

5.如权利要求1所述的组合物，其中一个或更多个相完全抑制靶分子或靶分子复合物的迁移率。

6.如权利要求1所述的组合物，其中所述靶分子包括蛋白质或肽。

7.如权利要求1所述的组合物，其中所述基本不带电的聚合物剂选自线性聚丙烯酰胺、部分交联聚丙烯酰胺、葡聚糖、聚乙二醇或其组合的一种或多种。

8.如权利要求1所述的组合物，其中所述相具有从顶部到底部粘度增加的梯度，并且包括样品层、捕获层和堆积层。

9.一种用于确定样品中靶分子的方法，所述方法包括：

获得可能含有靶分子的第一样品；

使所述第一样品暴露于结合剂，其中所述结合剂能够结合所述靶分子而形成靶分子-结合剂复合物；

将所述靶分子-结合剂复合物与未结合的靶分子混合而制成混合物；

将所述混合物经受垂直堆积的电泳基质，其中所述基质由从顶部到底部密度增加或粘度增加的两个或更多个相组成，并且其中所述基质的一个或更多个相具有不带电的聚合物(p)，所述不带电的聚合物(p)能够与经含有所述聚合物的相电泳的结合剂缔合；和

检测所述靶分子-结合剂复合物的存在。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述垂直堆积的电泳基质包括器皿中垂直堆积的电泳基质。

11.如权利要求9所述的方法，其中所述结合剂包括可捕获结合剂。

12.如权利要求9所述的方法，其中所述结合剂包括下述一种或多种：能够结合所述靶分子的可捕获抗体、能够结合所述靶分子的抗体的抗原结合片段、所述靶分子的生物受体、所述靶分子的生物受体的片段、多价生物素结合剂、标记的结合剂或生物素连接的不带电的聚合物。

13.如权利要求9所述的方法，其中相对于未结合的靶分子测量与结合剂缔合的靶分子。

14.如权利要求13所述的方法，其中与结合剂缔合的靶分子与未结合的靶分子电泳分离。

15.如权利要求9所述的方法，其中所述靶分子是蛋白质或肽。

16.如权利要求9所述的方法，其中所述电泳在最小流体动力学半径为0.5mm的器皿中进行，所述流体动力学半径等于横截面积除以周长再乘以2。

17.如权利要求9所述的方法，其中所述样品加载入管、通道或容器，并且所述电泳在所述管、通道或容器中从顶部到底部密度增加和/或粘度增加的梯度中进行，所述梯度包括密度或粘度增加的至少三个相。

18.如权利要求9所述的方法，其中测量与所述未结合的靶分子有关的可追踪剂被用来确定所述样品中所述靶分子的浓度。

19.如权利要求9所述的方法，其中测量可追踪剂-靶分子复合物和未结合的靶分子提供与所述靶分子的浓度成正比和成反比的信号。

20.如权利要求9所述的方法，其中可追踪剂是荧光的、发光的、化学发光的、放射性核素、金属离子或产生荧光产物、发光产物、化学发光产物或有色产物的酶。

21.一种用于检测靶分子的装置，所述装置包括：

a)流体动力学半径为至少0.5mm的垂直布置的器皿；

b)所述器皿内从1.0至1.1g/ml密度增加的梯度，所述梯度包括密度1.0至1.02g/ml的样品层、密度1.002至1.05g/ml的捕获层和密度1.01至1.1g/ml的堆积层，其中所述堆积层具有比所述捕获层更高的密度，并且所述捕获层具有比所述样品层更高的密度。

22.如权利要求21所述的装置，所述装置还包括：

i)与可追踪剂轭合的靶分子和未结合的靶分子；

ii)与捕获分子轭合的第二结合分子，其中所述靶分子、所述未结合的靶分子、第一和第二结合分子能够在所述样品层形成复合物；和

iii)在所述样品层、所述堆积层和所述捕获层的至少一层中基本不带电的聚合物，其中所述基本不带电的聚合物能够结合所述捕获分子以变成所述复合物的部分。

23.一种计算机可读介质，所述计算机可读介质具有计算机可读指令，所述计算机可读指令在被计算机执行时导致所述计算机运行包括下述的方法：

接收表示条带的发射的第一数据，其中所述条带包括样品中的可追踪剂-靶分子复合物；

接收表示未结合靶分子水平的第二数据；以及

比较所述第一数据与所述第二数据以评估所述样品中所述靶分子的存在。

24.如权利要求23所述的计算机可读介质，还包括评估所述样品中所述靶分子存在的浓度。

25.如权利要求23所述的计算机可读介质，其中比较所述第一数据与所述第二数据包括确定所述第一数据与所述第二数据的比率。

26.如权利要求23所述的计算机可读介质，其中比较包括为样品中可能感兴趣的每种靶分子产生标准曲线。

27.如权利要求26所述的计算机可读介质，其中比较还包括比较由结合的靶分子提供的直接发射强度，与未结合的靶分子浓度的反向比较。

28.如权利要求23所述的计算机可读介质，其中比较所述第一数据与所述第二数据以评估受治疗者中靶分子的存在、不存在或浓度包括：

确定来自感兴趣的靶分子的感兴趣的条带中发射开始的时间；

确定来自感兴趣的靶分子的感兴趣的条带中发射结束的时间；

确定来自感兴趣的靶分子的感兴趣的条带中发射开始的发射强度；

确定来自感兴趣的靶分子的感兴趣的条带中发射结束的发射强度；

对于每种靶分子分析上述强度和时间的范围；

评估通过分析所述靶分子的强度和时间而提供的信息，并分析所述信息；和

基于所获得的并经分析的数据提供的信息来评估受治疗者的健康、物质的存在或样品的污染。

29.如权利要求21所述的装置，所述装置还包括：

分离样品的工具，所述样品包含可追踪剂-靶分子复合物；

适于捕获来自所述可追踪剂-靶分子复合物的发射的读取器；

适于记录来自所述可追踪剂-靶分子复合物的发射的照相机；

适于接收来自所述装置的数据的计算机；和

适于分析所述计算机从所述可追踪剂-靶分子复合物接收的数据的计算机程序。

30.一种试剂盒，该试剂盒包括：

包括密度增加或粘度增加的至少三层的装置；和

与所述层的至少一个缔合的基本不带电的聚合物。

31.如权利要求31所述的试剂盒，所述试剂盒还包括感兴趣靶分子的至少一个阳性对照样品。

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