CN101798599A - hsa-miR-150的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种hsa-miR-150的用途，用于制备辅助诊断肿瘤恶性程度的产品。本发明还公开了hsa-miR-150在制备或筛选诱导肿瘤分化的药物中的用途。本发明与胃癌分化相关的hsa-miR-150，可作为辅助诊断肿瘤恶性程度的标志物，也可作为预测肿瘤病人生存率的标志物，同时还可作为胃癌或其他肿瘤的药物治疗靶标。

Description

hsa-miR-150的用途

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种与胃癌分化相关的hsa-miR-150的用途。

背景技术

胃癌是世界上高发的恶性肿瘤之一，在1990-1992年的中国恶性肿瘤死亡抽样调查显示，胃癌的死亡率接近25.2/10万人(男性32.8/10万人，女性17.0/10万人)，占1990-1992年死亡的肿瘤病人的23.2％，居各类恶性肿瘤之首。虽然近年来胃癌的死亡率有明显下降，但是依然很高，多数胃癌患者是发现了临床症状如腹部不适、隐痛、泛酸、暧气或消瘦、黑便等症状后进行胃镜和活检确诊，一经确诊，多为晚期，错过了治疗的最佳时期。

胃癌的筛查手段包括：影像学检查、胃镜加活检、血清学检测如胃蛋白酶元、CEA、CA系列抗原等。目前最有效的手段就是胃镜加活检，胃镜检查和病理学诊断均基于形态学的判断，对于操作人员的经验技术有较高的要求，这种非客观、非标准化的检测存在较大的误诊/漏诊率，而且对有不典型增生、胃癌进展期恶性程度变化等组织学特征进行的区分，目前尚难以有明确的界限。

小RNA(microRNA或miRNA)于1993年首次在秀丽线虫中发现，随后在2001年正式命名为microRNA，是一类约18-25nt的内源性非编码RNA(noncoding RNA)，miRNA结合mRNA的非编码区的3’端，在转录后水平调节基因的表达，紧密结合会降解靶标mRNA，结合不够紧密则阻止mRNA的翻译从而抑制靶基因表达。miRNA对增殖、分化、凋亡以及内环境的稳态均有重要意义，miRNA具有高度的保守性、时序性和组织特异性。

miRNA在许多肿瘤中均有差异表达，许多肿瘤有其特异性的miRNA表达谱。hsa-miR-150在成熟B细胞和T细胞特异性表达，c-Myb是hsa-miR-150的保守性靶标，hsa-miR-150调控c-Myb的表达且在一定范围内有剂量依赖效应，与c-Myb的表达水平负相关，两者之间的交互反应不仅对B细胞成熟分化、而且对胚胎发育和肿瘤发生均有重要意义。hsa-miR-150在B细胞慢性淋巴细胞白血病中高表达。

目前尚无关于hsa-miR-150与胃癌分化相关的研究报道。

发明内容

本发明要解决缺乏客观准确地诊断肿瘤恶性程度的方法的技术问题，提供一种与胃癌分化相关的hsa-miR-150的用途，可作为辅助诊断肿瘤恶性程度的标志物。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

在本发明的一个方面，提供了一种hsa-miR-150的用途，用于制备辅助诊断肿瘤恶性程度的产品。

优选的，所述辅助诊断肿瘤恶性程度的产品包括：用实时定量PCR、或miRNA芯片诊断肿瘤恶性程度的产品。

所述用实时定量PCR诊断肿瘤恶性程度的产品至少包括特异性扩增hsa-miR-150的引物。

所述用miRNA芯片诊断肿瘤恶性程度的产品包括：与hsa-miR-150特异性结合的探针。

在本发明中，所述探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。

在本发明的另一方面，还提供了一种用于辅助诊断肿瘤恶性程度的试剂盒，所述试剂盒包含特异性针对hsa-miR-150的引物或探针。

利用本发明的试剂盒，可以检测肿瘤病人hsa-miR-150的表达情况，如果hsa-miR-150的表达量显著升高，表明肿瘤分化低，恶性高，治疗效果差，如果hsa-miR-150的表达量正常，表明肿瘤分化好，恶性低，治疗效果佳。分化在肿瘤病理学中常指肿瘤细胞与其起源程序的成熟细胞(相应的正常细胞)的相似程度。在形态、功能、代谢、行为等方面，肿瘤细胞越相似于相应的正常细胞，则为高分化，否则就是低分化，肿瘤细胞的分化程度是肿瘤良恶性鉴别中的主要依据。一般地，分化高的肿瘤具有良性行为，分化低的肿瘤多有恶性表现。

在本发明的另一方面，还提供了一种hsa-miR-150的用途，用于制备诱导肿瘤分化的药物。

优选的，所述诱导肿瘤分化的药物包括：抗hsa-miR-150的反义寡核苷酸。

在本发明的另一方面，还提供了一种hsa-miR-150的用途，用于筛选诱导肿瘤分化的药物。

上述肿瘤包括胃癌、肝癌、胰腺癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、乳腺癌、睾丸癌、口腔鳞状细胞癌、或白血病肿瘤，优选为胃癌。

上述hsa-miR-150为SEQ ID NO：1所示的miRNA序列。

本发明与胃癌分化相关的hsa-miR-150，可作为辅助诊断肿瘤恶性程度的标志物，也可作为预测肿瘤病人生存率的标志物，同时还可作为胃癌或其他肿瘤的药物治疗靶标，为设计和筛选诱导肿瘤分化的药物提供新的靶点。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例1胃癌组织样本中提取的总RNA的2100峰图；

图2是本发明实施例1的hsa-miR-150在胃癌和癌旁组织中差异表达的miRNA芯片结果图；

图3是本发明实施例2的hsa-miR-150在胃癌和癌旁组织中差异表达的实时定量PCR曲线图；

图4是本发明实施例2的hsa-miR-150在胃癌和癌旁组织中差异表达的芯片与定量PCR结果比较图。

具体实施方式

下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G.塞德曼等主编，马学军，舒跃龙的译.北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。

实施例1 miRNA芯片实验检测胃癌组织中差异表达的miRNA

1.临床样品的准备

胃癌手术切除标本，留取26对胃癌及其癌旁正常组织，-80℃冻存，液氮运输。临床病理信息显示，该26个胃癌组织中，包含低分化、中分化及中低分化的胃癌组织。胃癌的诊断标准参照全国胃癌病理协作组拟定的胃粘膜活检病理诊断的统一标准。

2.总RNA的提取、质量检测和纯化

(1)冰冻切片

26对胃癌及其癌旁正常组织经过HE染色检查后，8μm连续切5～6片，经重新病检确定细胞质量后-80℃保存于1.5ml离心管中。

(2)总RNA的提取

利用mirVana miRNA提取试剂盒(Ambion)抽提总RNA，具体步骤详见mirVana miRNA提取试剂盒说明。

(3)总RNA的质量检测

用Agilent 2100 bioanalyzer分析提取的RNA，得2100峰图(见图1)，清晰的峰形和最低的背景荧光显示完整、未降解的RNA。

3.miRNA芯片实验

(1)实验过程

miRNA芯片采用Agilent Human miRNA 1.0芯片，该芯片可同时检测470个人类和64个病毒miRNA的表达。

总RNA利用miRNA标记试剂和杂交试剂盒(Agilent Technologies)进行标记，标记后的miRNA在55℃，20RPM进行芯片杂交(Agilent Technologies，G4470A)，扫描之前分别用GE清洗缓冲液1和GE清洗缓冲液2室温各洗5min，然后用Agilent芯片扫描仪扫描芯片。将扫描得到的图像利用图像分析采集软件8.1(Feature Extraction Software 8.1，AgilentTechnologies)分析得到原始数据。

(2)数据预处理和差异筛选

miRNA芯片所得到的原始数据经过均一化、背景质量检测得到miRNA表达值，利用MeV 4.5的SAM模块结合临床资料的转移分型进行分析。

(3)结果

应用SAM软件筛选在26对胃癌和癌旁组织中差异表达的miRNA(FDR＝0)，找到了hsa-miR-150(图2)，其序列为UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG(SEQ ID NO：1)。在图2中，MD表示中分化，M-PD表示中低分化，PD表示低分化，上方是样本编号，下面是表达图谱，红色表示miRNA上调(相对于癌旁)，绿色表示下调，黑色表示未变化。

实施例2 实时定量PCR检测hsa-miR-150表达的改变

(1)内参设定及引物设计、合成

内参选用U6-2，miRNA的定量PCR引物由特异性引物和通用引物构成，其中通用引物由qiagen miScript SYBR

Green PCR试剂盒自带；特异性引物序列为TCTCCCAACCCTTGTACCAG(SEQ ID NO：2)，由本公司自己合成。

(2)RNA提取和逆转录cDNA合成

RNA的提取、质量检测和纯化步骤同实施例1所述。

逆转录采用miScript逆转录试剂盒(Qiagen)，在PCR管中加入5×RT缓冲液、逆转录酶混合液、模板RNA、无Rnase酶水，轻轻混匀，置于冰上。

逆转录PCR反应程序为：37℃60分钟；再95℃5分钟。产物-20℃保存。

(3)实时定量PCR

反应采用ABI 7300定量PCR仪，试剂采用miScript SYBR Green PCR Kit(Qiagen)，逆转录产物1∶10稀释。实时定量PCR反应体系：2×SYBR Green混合液10ul，10×miScript通用引物2ul，10×成熟miRNA的引物(miScript Primer Assay)，无Rnase酶水，稀释cDNA。反应程序为：95℃ 15分钟，1个循环；再94℃ 15秒，55℃ 30秒，70℃ 34秒，进行40个循环。

反应结束，得定量PCR的曲线图(见图3)，分析该图可得本发明的hsa-miR-150在胃癌和癌旁正常样本差异表达，在图3中，横坐标为循环数，纵坐标为仪器自带软件产生的DeltaRn值(荧光量的log值)。hsa-miR-150在12对胃癌样本中表达情况的芯片与定量PCR结果比较见图4，在图4中，横坐标为样本号；MD表示中分化，M-PD表示中低分化，PD表示低分化；纵坐标为Log Ratio值，即癌(T)和癌旁(N)比值取Log值；qPCR内参miRNA为U6。由图4可知，miRNA芯片实验和实时定量PCR实验的结果都表明hsa-miR-150在低分化的胃癌样本中表达明显升高，而在中分化及中低分化的胃癌样本中表达正常。因此，可通过实时定量PCR或miRNA芯片诊断胃癌的恶性程度：设计hsa-miR-150的PCR引物或探针，检测胃癌组织中hsa-miR-150的表达量，如果hsa-miR-150的表达量显著升高，则说明胃癌的分化程度低，恶性程度高，治疗效果差，如果hsa-miR-150的表达量正常，则说明胃癌分化正常，恶性低，治疗效果好。由于有研究表明hsa-miR-150在B细胞慢性淋巴细胞白血病中也高表达，因此，也可通过实时定量PCR或miRNA芯片，检测肿瘤组织中hsa-miR-150的表达量，从而辅助诊断肿瘤的恶性程度。

实施例3 诱导肿瘤分化药物的筛选

以SEQ ID NO：1所示序列的hsa-miR-150作为靶点，设计和筛选诱导肿瘤分化的药物。具体方法如下。

用候选物质处理表达hsa-miR-150的体系，然后检测该体系中hsa-miR-150的表达水平。若候选物质可降低hsa-miR-150的表达，则表明该候选物质是能诱导肿瘤分化的潜在药物。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>上海生物芯片有限公司

 

<120>hsa-miR-150的用途

 

<160>2

 

<170>PatentIn version 3.3

 

<210>1

<211>22

<212>RNA

<213>Homo sapiens

 

<400>1

ucucccaacc cuuguaccag ug                                     22

 

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<223>引物

 

<400>2

tctcccaacc cttgtaccag                                        20

Claims (10)

1.一种hsa-miR-150的用途，其特征在于，用于制备辅助诊断肿瘤恶性程度的产品。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述辅助诊断肿瘤恶性程度的产品包括：用实时定量PCR、或miRNA芯片诊断肿瘤恶性程度的产品。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述用实时定量PCR诊断肿瘤恶性程度的产品至少包括特异性扩增hsa-miR-150的引物。

4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述用miRNA芯片诊断肿瘤恶性程度的产品包括：与hsa-miR-150特异性结合的探针。

5.一种用于辅助诊断肿瘤恶性程度的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含特异性针对hsa-miR-150的引物或探针。

6.一种hsa-miR-150的用途，其特征在于，用于制备诱导肿瘤分化的药物。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述诱导肿瘤分化的药物包括：抗hsa-miR-150的反义寡核苷酸。

8.一种hsa-miR-150的用途，其特征在于，用于筛选诱导肿瘤分化的药物。

9.根据权利要求1、6、或8所述的用途，其特征在于，所述hsa-miR-150为SEQ ID NO：1所示的miRNA序列。

10.根据权利要求1、6、或8所述的用途，其特征在于，所述肿瘤包括胃癌、肝癌、胰腺癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、乳腺癌、睾丸癌、口腔鳞状细胞癌、或白血病肿瘤。

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