CN101794348A - 引物评估方法、引物评估程序和实时聚合酶链式反应装置 - Google Patents

引物评估方法、引物评估程序和实时聚合酶链式反应装置 Download PDF

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Abstract

引物评估方法包括如下步骤：获取指示扩增量的时间变化的信号，所述扩增量是在如下时候获得的：以逐步稀释的目标核酸为单位、针对在退火阶段应该相互不同的温度条件的数量而制备的样本集被如此扩增使得在除了退火阶段之外的阶段的温度条件固定；获取指示逐步稀释的目标核酸的初始量的信号；根据所述扩增量的时间变化和所述初始量获得每个温度条件的扩增效率，并计算所述扩增效率的变化度；以及提交所述变化度、和针对所述变化度设置的用于引物的品质评估的参考值。

Description

引物评估方法、引物评估程序和实时聚合酶链式反应装置
技术领域
本发明涉及引物评估方法、引物评估程序、和实时聚合酶链式反应PCR装置，并且适用在，例如，扩增核酸的技术领域中。
背景技术
在聚合酶链式反应(PCR)中，将作为扩增主体的脱氧核糖核酸(DNA)、DNA聚合酶、和大量引物混合在一起。引物是起向DNA聚合酶提供DNA合成反应的起点作用的短核酸片段并且是在任何DNA合成反应中都必不可少。因此，引物的设计是非常重要的。
对于引物的设计，已经提出了合成和筛选应该用作候选者的多个序列以获得满足预定条件的最佳序列的方法(参考，例如，已公开日本专利第2003-210175号和已公开日本专利第2001-258576号)。
然而，在这种设计方法中，尽管将基长(base length)和GC含量或Tm值考虑为预定条件，但未考虑由反应温度的变化引起的扩增效率的变化。其原因将是因为这种方法是基于如下前提：引物应该起作用的退火阶段的温度条件被设置成大约60℃。
然而，在实际使用实时PCR装置或PCR装置扩增DNA的情况下，不可避免地存在由PCR装置的老化退化、PC装置外部温度的变化等引起的温度条件的差异。而且，近年来，响应缩小装置尺寸的需求，本受让人已经提出了便携式PCR装置。因此，可能在温度条件的差异较大的环境下使用PCR装置。
因此，甚至利用通过上述设计方法设计的引物，在PCR装置的实际使用中PCR产物(核酸)的扩增效率也随温度而变。甚至利用当前可从市场上购买到的引物，也会造成有关由温度引起核酸的扩增效率的变化的类似结果。
由温度变化引起的核酸的扩增效率的变化等效于作为扩增主体的核酸的定量值(quantitative value)的变化。因此，例如，在每隔预定时段监测某种活性物质中的核酸数量的情况下，由于在各个定量定时上的温度之间的差异，核酸的扩增效率发生了变化，因此，降低了量化核酸的比较价值。在临床实践中，这是一个特别严重的问题。因此，与温度变化无关地呈现比某个值高的扩增效率的引物是所需的。
发明内容
本发明需要提出一种使可以设计出具有某种程度上的耐温性的引物的引物评估方法、引物评估程序、和实时PCR装置。
按照本发明的一实施例，提供了包括如下步骤的引物评估方法：获取指示扩增量的时间变化的信号，所述扩增量是在如下时候获得的：以逐步稀释的目标核酸为单位、针对在退火阶段应该相互不同的温度条件的数量而制备的样本集被如此扩增使得在除了退火阶段之外的阶段的温度条件固定；获取指示逐步稀释的目标核酸的初始量的信号；根据所述扩增量的时间变化和所述初始量获得每个温度条件的扩增效率，并计算所述扩增效率的变化度；以及提交所述变化度、和针对所述变化度设置的用于引物的品质评估的参考值。
按照本发明的另一实施例，提供了使计算机执行如下步骤的引物评估程序：从能够使核酸增殖的装置或存储媒体中获取指示扩增量的时间变化的信号，所述扩增量是在如下时候获得的：以逐步稀释的目标核酸为单位、针对在退火阶段应该相互不同的温度条件的数量而制备的样本集被如此扩增使得在除了退火阶段之外的阶段的温度条件固定；获取指示逐步稀释的目标核酸的初始量的信号；根据所述扩增量的时间变化和所述初始量获得每个温度条件的扩增效率，并计算所述扩增效率的变化度；以及提交所述变化度、和针对所述变化度设置的用于引物的品质评估的参考值。
按照本发明的进一步实施例，提供了包括如下的实时PCR装置：热源器件，被分配给用作核酸的扩增反应场所的多个容器；控制部分，配置成根据为相应容器而设置的温度，单独控制所述热源器件的热量；和决定部分，配置成为以逐步稀释的目标核酸为单位，针对应该相互不同的温度条件的数量制备的样本集的每一个决定应该为所述容器而设置的退火阶段温度，在所述容器中，部署样本集之中的目标核酸。所述实时PCR装置进一步包括：初始量获取部分，配置成获取指示逐步稀释的目标核酸的初始量的信号；扩增量获取部分，配置成从被分配给所述容器的多个光接收器件获取指示扩增量的信号，所述扩增量是当这样扩增所述样本集使得在除了退火阶段之外的阶段的温度条件固定时所获得的；计算部分，配置成根据所述扩增量的时间变化和所述初始量获得每个温度条件的扩增效率，并计算所述扩增效率的变化度；以及提交部分，配置成提交所述变化度、和针对所述变化度设置的用于引物的品质评估的参考值。
按照本发明的实施例，可以检测引物的温度相关性，因为获得了扩增效率的变化度，扩增效率是当针对在退火阶段应该相互不同的温度条件的数量而制备的样本集被如此扩增使得在除了退火阶段之外的阶段的温度条件固定时所获得的。另外，可以设计出具有某种程度上的耐温性的引物，因为除了针对这个变化度设置的、用于引物的品质评估的参考值之外，提交了这个变化度。
附图说明
图1是示意性地示出实时PCR装置的配置的图形；
图2是示出校准时段的图形；
图3是示意性地示出获得扩增曲线的标准样本的布置例子的图形；
图4是示意性地示出引物评估指标提交器的配置的图形；
图5A和5B是示出实验结果(1)的图表；
图6A和6B是示出实验结果(2)的图表；
图7A和7B是示出实验结果(3)的图表；
图8A和8B是示出实验结果(4)的图表；
图9A和9B是示出实验结果(5)的图表；
图10是示出扩增效率的变化度的图表；
图11是示出引物评估指标提交处理的过程的流程图；和
图12是示意性地示出按照本发明另一实施例的实时PCR装置的配置的图形。
具体实施方式
下面将描述实现本发明的方式。该描述将按如下次序进行。
<1.实施例>
[1-1.实时PCR装置的配置]
[1-2.引物评估指标提交器的配置]
[1-3.引物评估指标提交处理的过程]
[1-4.有利效果等]
<2.其它实施例>
<1.实施例>
[1-1.实时PCR装置的配置]
在图1中，示出了实时PCR装置1的示意性配置。这种实时PCR装置1具有通过针对反应室RM，以预定间隔分层地部署多个衬底11到16而获得的结构。
反应衬底11是用作基层的衬底。在这个衬底中，高密度地形成每一个用作核酸的扩增反应场所的容器(下文也称为井)UL。对于这些井UL，放入作为扩增主体的目标核酸和扩增目标核酸所需的各种物质(引物、缓冲溶液、酶、dNTP(三磷酸脱氧核苷酸)、荧光染料等)。
例如，如果使用大小为6厘米正方形的反应衬底11，可以形成每一个具有1μL(微升)或更小的容积的大约40000个井UL。因此，即使反应室RM的尺寸缩小了，这种实时PCR装置1也可以处理相同类型或不同类型的许多目标核酸。
加热衬底12是部署成反应衬底11下面一层的衬底。对于加热衬底12的面对反应衬底11的表面，为每个井UL分配了热源器件HD。围绕这些热源器件HD部署着多个热敏器件TD。作为热源器件HD，使用例如薄膜晶体管(TFT)。作为热敏器件TD，使用例如PIN二极管。
将温度控制器20与加热衬底12上的热源器件HD和热敏器件TD连接。根据每隔预定间隔使用围绕热源器件HD的热敏器件TD感测的温度，温度控制器20单独控制每个热源器件HD的热量。
具体地说，温度控制器20对于每个扩增阶段(变性阶段、退火阶段、延伸阶段)为每个井UL设置目标温度。而且，温度控制器20将数值随目标温度而变的电流或电压供应给相应井UL的热源器件HD，从而加热各个井UL。
另外，每当每隔预定间隔使用热敏器件TD感测温度时，温度控制器20就获得热敏器件TD感测的温度与目标温度之间的差值，并且根据每个井UL的差值，改变供应给热源器件HD的电流或电压。
由于这种特征，即使扩增所需的温度条件不同，这种实时PCR装置1也可以对于每个扩增阶段高精度地调整高密度部署的每个井UL的温度。因此，这种实时PCR装置1可以降低由温度引起的扩增反应结果的错误率，并且可以提高检测精度。
加热辅助衬底13是部署成加热衬底12下面一层的衬底。这个加热辅助衬底13吸收或辐射整个反应室RM的热，从而将反应室RM保持在规定温度上。
因此，这种实时PCR装置1可以设置一短时段作为井UL的温度从当前阶段设置的温度改变(shift)到下一个阶段应该设置的温度之前的时段(温度渐变的时段)。作为加热辅助衬底13，使用例如珀尔帖(Peltier)器件。
发光衬底14是部署成反应衬底11上面一层的衬底。在发光衬底14的与反应衬底11相对的表面上，将发出诸如嵌入剂的荧光物质的激发光的光源器件LS部署成每一个对应于井UL的相应一个。作为光源器件LS，使用例如发光二极管(LED)。
激发光透射衬底15是部署成反应衬底11与发光衬底14之间的中间层的衬底。激发光透射衬底15允许从光源器件LS发出的激发光透过，而反射除激发光之外的其它光。作为这种激发光透射衬底15，使用例如分色镜。
在这个激发光透射衬底15的面对发光衬底14的表面上，在与发光衬底14上的光源器件LS的光轴相对应的位置的周围部署着接收从光源器件LS发出的激发光的散射光的光接收器件LDB。
将光量控制器30与发光衬底14上的光源器件LS和激发光透射衬底15上的光接收器件LDB连接。在这种实时PCR装置1中，下一个扩增循环不是响应一个扩增循环的结束定时马上开始的，而是如图2所示，从每个扩增循环的结束定时提供调整光源器件LS的光量的校准时段CF。在每个校准时段CF中，光量控制器30单独控制与井UL相对应的光源器件LS的光量，以便可以使每个光接收器件LDB接收的散射光量不变。
由于这种特征，甚至在不仅存在各个光源器件LS的制造偏差而且存在光源器件LS随时间而变的情况下，这种实时PCR装置1也使到达各个井UL的激发光量保持不变。因此，这种实时PCR装置1提高了检测精度，从而使激发光激发引起的荧光量可以反映每个井UL中的核酸本身的数量。
荧光透射衬底16是部署成加热衬底12与加热辅助衬底13之间的中间层的衬底。荧光透射衬底16允许激发光所激发的荧光物质的荧光透过，且反射除荧光之外的其它光。在面对加热辅助衬底13的表面上，将接收井UL中的激发引起的荧光的光接收器件LDA部署成每一个对应于井UL上的相应一个。
将核酸量计算器40与光接收器件LDA连接。核酸量计算器40逐个阶段地根据每个光接收器件LDA接收的荧光量而计算目标核酸的核酸量。而且，核酸量计算器40获取在当前和前一个校准时段中获得的散射光量。如果这些散射光量存在差异，核酸量计算器40根据这种差异，调整与引起散射光量中的这种差异的光源器件LS相联系的井UL中的核酸量。这种特征使核酸量计算器40甚至在存在光源器件LS随时间而变的情况下，也可以根据激发光量均衡目标核酸量。
除了上述配置之外，这种实时PCR装置1具有引物评估指标提交器50，引物评估指标提交器50根据在应该在退火阶段给出的温度不同的情况下荧光量的转变(扩增曲线)而提供评估引物的指标。
在使引物评估指标提交器50获取引物的评估指标的情况下，如图3所示，为了方便起见，在井UL中制备与应该使得相互不同的温度条件的数量一样多的、通过逐步稀释应该用作标准的目标核酸而获得的标准样本的集合St(下文将该集合也称为样本集)。在这些井UL中，供给诸如作为评估主体的引物的扩增所需的各种物质。
这种实时PCR装置1可以单独调整每个井UL的温度，因此，对于每个样本集St，可以使应该在退火阶段给出的温度不同。因此，这种实时PCR装置1使引物评估指标提交器50可以利用一个反应衬底11同时获取在应该在退火阶段给出的温度不同的情况下荧光量的转变(扩增曲线)。
[1-2.引物评估指标提交器的配置]
下面描述引物评估指标提交器50。在图4中，示出了引物评估指标提交器50的示意性配置。这个引物评估指标提交器50是通过将各种类型的硬件与负责控制整个引物评估指标提交器50的中央处理单元(CPU)51连接而被配置的。
具体地说，将只读存储器(ROM)52、用作CPU 51的工作存储器的随机访问存储器(RAM)53、操作单元54、存储单元55、和显示单元56与CPU51连接。在这个ROM 52中，存储用于生成引物的评估指标的数据的程序(下文中，也称为引物评估指标提交程序)。
如果在RAM 53中展开在ROM 52中存储的引物评估指标提交程序，CPU51就依照引物评估指标提交程序，起扩增控制器51A、扩增效率控制器51B、和评估值计算器51C的作用。
扩增控制器51A决定对于每个样本集St相同的温度作为在变性阶段和延伸阶段的目标温度。另外，扩增控制器51A决定对于每个样本集St不同的温度作为在退火阶段的目标温度。
作为决定目标温度的方法，可以应用，例如，通过在引物评估指标提交程序中规定的温度当中的选择来决定温度的方法，或通过从操作单元54输入来决定温度的方法。
扩增控制器51A将，例如，样本集St中的每个标准样本的初始核酸量(浓度)的输入屏幕显示在显示单元56上，并且从操作单元54中获取初始核酸量。
如果扩增控制器51A为样本集St决定各个扩增阶段的目标温度，则扩增控制器51A就指示温度控制器20设置所决定的目标温度。随后，扩增控制器51A驱动温度控制器20和光量控制器30沿着扩增循环开始扩增处理。
响应扩增控制器51A开始扩增处理，将指示扩增量(荧光量)的信号从与部署样本集St中的各个标准样本的井UL相对应的光接收器件LDA(图1)供给到扩增效率计算器51B。
扩增效率计算器51B根据从光接收器件LDA供给的扩增量(荧光量)和由扩增控制器51A计数的扩增循环的数量，检测达到某荧光强度之前重复的扩增循环的数量。
而且，扩增效率计算器51B计算对于每个样本集St的标准样本的扩增效率。具体地说，根据通过在横坐标上画出扩增控制器51A获取的样本集St中的各个标准样本的初始核酸量，和在纵坐标上画出达到某荧光强度之前重复的扩增循环的数量获得的标准曲线的斜率，计算扩增效率。
下面对标准曲线的斜率与扩增效率之间的关系作简单描述。一般说来，理论上认为模板DNA通过PCR中的一个循环扩增两倍。如果将模板DNA的初始量定义成[DNA]0，将扩增效率定义成e，和将扩增循环的数量定义成C，那么，DNA的数量通过如下方程表示：
[DNA]＝[DNA]0(1+e)c  …(1)
当扩增效率e是1时，在这个方程(1)中括号内的数字是2，因此，模板DNA通过一个循环扩增两倍。
对方程(1)的两侧取对数得出如下方程：
log[DNA]＝log[DNA]0+log(l+e)c
＝log[DNA]0+Clog(l+e)…(2)
如果将达到某荧光强度的循环定义成Ct，则获得如下方程：
Ct = log [ DNA ] t - log [ DNA ] 0 log ( 1 + e ) &CenterDot; &CenterDot; &CenterDot; ( 3 )
循环Ct被表示成log[NDA]0的函数，并且标准曲线的斜率是-1/log(1+e)。如果扩增效率是100％(e＝1)，则标准曲线的斜率是-3.32。如果扩增效率是85％(e＝0.85)，则标准曲线的斜率是-3.74。也就是说，标准曲线的斜率与扩增效率存在标准曲线的斜率越陡表明扩增效率就越低的关系。关于另一种表达，可以通过如下方程表示扩增效率e：
e＝10-1/slope-1…(4)
作为实验结果，对于每种类型的腺病毒，在图5A到9B中示出了在应该在退火阶段给出的温度不同的情况下的扩增效率。在这个实验中，逐个类型地设计引物。而且，如图5A到图9B所示，样本集St在退火阶段的目标温度被设置在55.0℃、55.9℃、56.7℃、57.8℃、59.3℃、61.0℃、62.4℃、63.5℃、64.2℃、和65.0℃上。除了引物和退火阶段的目标温度之外的其它条件都相同。
图5A到图9B表明，例如，类型3的引物呈现与温度变化无关的相等扩增效率，但是，例如，类型7的引物呈现随温度变化而变的扩增效率。
评估值计算器51C计算每个样本集St的扩增效率的变化度作为评估引物的指标。作为这种变化度，尤其可以使用，例如，标准偏差、方差、或平均偏差。
图10示出了对于每种类型在图5A到图9B中示出的各个温度上的扩增效率的变化度。从图10中可明白看出，类型3的引物具有最低温度相关性，因此可以当作有利引物。另一方面，类型7的引物具有最高温度相关性，因此可以当作不利引物。
如果评估值计算器51C计算出每个样本集St的扩增效率的变化度，则评估值计算器51C就将该变化度与针对该变化度的用于引物的品质评估的参考值(在下文中，该参考值也称为变化阈值)相比较。另外，如果作为计算主体的变化度等于或低于变化阈值，则评估值计算器51C就通过图像显示或音频告知用户该引物是有利引物、作为计算主体的变化度、和变化阈值。
相反，如果作为计算主体的变化度高于变化阈值，则评估值计算器51C就通过图像显示或音频告知用户该引物是不利引物、作为计算主体的变化度、和变化阈值。
作为图像显示的形式，可以应用，例如，在用条形图指示变化度的图表中示出指示变化阈值的线的形式。除了用条形图指示变化度的图表之外，也可以显示指示彼此不同的温度与扩增效率之间的关系的图表。
本实施例中的评估值计算器51C可以根据将引物用作评估主体的增殖反应的结果的使用目的，切换变化阈值。
具体地说，可以设置例如应该用于一般目的的第一变化阈值。另外，作为比这个参考阈值小的值，可以设置应该用于药理实验中的比较目的的第二变化阈值、和应该用于临床实践中的诊断目的的第三变化阈值。用户可以选择这些阈值当中的一个阈值。
由于这种特征，评估值计算器51C使用户即使考虑给定设计时间，也可以根据引物设计的重要度(即，增殖反应的结果的使用目的)，设计出具有某种程度上的耐温性的引物。
[1-3.引物评估指标提交处理的过程]
下面利用显示在图11中的流程图描述引物评估指标提交处理的过程。
具体地说，如果将提交引物的评估指标的指令从操作单元54发送给CPU51，那么，例如，CPU 51启动引物评估指标提交处理的过程，并转到第一步骤SP1。在这个第一步骤SP1中，对于每个样本集St，CPU 51决定样本集在退火阶段的目标温度，并转到第二步骤SP2。
在这个第二步骤SP2中，CPU 51获取样本集St中的各个标准样本的初始量(浓度)，并转到第三步骤SP3。在这个第三步骤SP3中，CPU 51在在第一步骤SP1中决定的目标温度的条件下，开始各个样本集St的扩增处理，并转到第四步骤SP4。
在这个第四步骤SP4中，CPU 51计算每个样本集St的扩增效率，并转到第五步骤SP5。在这个第五步骤SP5中，CPU 51计算各个样本集St的扩增效率的变化度，并转到第六步骤SP6。
在这个第六步骤SP6中，CPU 51允许选择变化阈值，以设置所选的变化阈值，并转到第七步骤SP7。在这个第七步骤SP7中，CPU 51根据在步骤SP5中计算的变化度和在步骤SP6中设置的变化阈值来评估引物，并转到第八步骤SP8。
在这个第八步骤SP8中，CPU 51通过图像显示或音频告知用户引物评估.的结果、作为计算主体的变化度、和变化阈值。在告知之后，CPU 51终止这个引物评估指标提交处理的过程。
这样，CPU 51依照引物评估指标提交程序进行了引物评估指标提交处理。
[1-4.有利效果等]
在上述配置中，实时PCR装置1获取指示扩增量的时间变化的信号，扩增量是在如下时候获得的：当扩增被如此执行使得对于针对应该相互不同的温度条件的数量而制备的样本集St(参见图3)的每一个，在除了退火阶段之外的阶段的温度条件固定。
而且，实时PCR装置1获取包括在样本集St中的和通过逐步稀释获得的标准样本的初始量(浓度)，并根据初始量和扩增量的时间变化获得每个温度条件的扩增效率(参见图5A到图9B)。
另外，实时PCR装置1计算针对每个温度条件获得的扩增效率的变化度(参见图10)，并提交计算的变化度、和针对该变化度设置的用于引物的品质评估的参考值(变化阈值)。
这种实时PCR装置1可以检测引物的温度相关性，因为它获得了扩增效率的变化度，该扩增效率是当扩增被执行以使得在除了退火阶段之外的阶段的温度条件固定时所获得的。除此之外，该实时PCR装置1使得可以设计出具有某种程度上的耐温性的引物，因为它与变化阈值一起提交了这个变化度。
这种实时PCR装置1含有温度控制器20(图1)，该温度控制器20根据为井UL定设置的温度，单独控制应该给予多个井UL的热量。对于这种温度控制器20，实时PCR装置1为每个样本集St决定应该为部署样本集之中的目标核酸的井UL设置的退火阶段温度。
而且，该实时PCR装置1从分配给相应井UL的光接收器件LDA(图1)获取指示扩增量的时间变化的信号，该扩增量是当扩增被执行使得在除了退火阶段之外的阶段的温度条件固定时而获得的。
因此，这种实时PCR装置1可以利用一个反应衬底11同时获取在应该在退火阶段给出的温度条件不同的情况下扩增量的时间变化(扩增曲线)。其结果是，这种实时PCR装置1可以显著提高计算扩增效率的变化度的效率。
此外，这种实时PCR装置1可以根据将引物用作评估主体的增殖反应的结果的使用目的，切换变化阈值。
因此，该实时PCR装置1可以根据诸如一般目的、药理实验中的比较目的、和临床实践中的诊断目的之类的引物设计的重要度(即，增殖反应的结果的使用目的)，严格或宽松地设置变化阈值。其结果是，这种实时PCR装置1使用户即使顾及给定设计时间，也可以根据引物设计的重要度，设计出具有某种程度上的耐温性的引物。
按照上述实施例，由于除了变化阈值之外，还提交在增殖循环的退火阶段的温度条件不同的情况下扩增效率的变化度的特性，所以可以实现使得可以设计出具有某种程度上的耐温性的引物的实时PCR装置1。
<2.其它实施例>
在上述实施例中尽管目标温度通过从在程序中规定的温度当中选择来决定或通过从操作单元54输入来决定，但在变性阶段和延伸阶段的目标温度可以是事先规定的固定值。
而且，在上述实施例中，作为获取指示在增殖循环的退火阶段的温度条件不同的情况下扩增量的时间变化的信号的获取形式，应用了使用相同反应衬底11获取信号的形式。但是，获取形式不局限于这个实施例。
例如，可以应用其中通过使用对于每个温度条件不同的反应衬底11获取信号的形式。或者，例如，可以应用其中从数据存储媒体获取信号的形式，在数据存储媒体中存储着指示在增殖循环的退火阶段的温度条件不同的情况下扩增量的时间变化的信号。
数据存储媒体的例子包括临时或永久地存储数据的诸如软盘、光盘只读存储器(CD-ROM)、和数字多功能盘(DVD)的封装媒体、以及诸如半导体存储器和磁盘的其它媒体。作为从这些数据存储媒体获取数据的方法，也可以利用诸如局域网、因特网、或数据卫星广播的有线或无线通信媒体。
另外，在上述实施例中，将所谓的透射型装置用作实时PCR装置1。然而，取而代之，例如，如图12所示(其中将相同标号赋予与图1中的那些相同的部分)，也可以应用所谓的反射型实时PCR装置100。
在这种实时PCR装置100中的反应衬底111中，含有侧壁底形成为圆形的多个井UL。而且，在反应衬底111的一个表面上这样部署光接收器件LDA，使之对应于这些井UL。从每个光源LS发出的激发光经由激发光透射衬底15引入在反应衬底111中形成的相应井UL中。在每个井UL中，由激发光激发的荧光物质的荧光被井UL的壁面反射。反射荧光入射到在反应衬底111的一个表面上形成的光接收器件LDA上。
此外，当应用这样的反射型实时PCR装置100时，可以实现与上述实施例相同的有利效果。
本发明的实施例可以用在包含基因试验的生物工业、药物制造、病人跟踪等中。
本申请包含与在2009年1月20日向日本专利局提交的日本优先权专利申请JP 2009-009984中公开的主题有关的主题，特此通过引用并入其全文内容。
虽然使用特定术语对本发明的优选实施例作了描述，但这样的描述只是例示性的，不言而喻，可以不偏离所附权利要求书的精神或范围地作出各种改变和修改。

Claims (6)

1.一种引物评估方法，包含如下步骤：
(a)获取指示扩增量的时间变化的信号，所述扩增量是在如下时候获得的：以逐步稀释的目标核酸为单位、针对在退火阶段应该相互不同的温度条件的数量而制备的样本集被如此扩增使得在除了退火阶段之外的阶段的温度条件固定；
(b)获取指示逐步稀释的目标核酸的初始量的信号；
(c)根据所述扩增量的时间变化和所述初始量获得每个温度条件的扩增效率，并计算所述扩增效率的变化度；以及
(d)提交所述变化度、和针对所述变化度设置的用于引物的品质评估的参考值。
2.按照权利要求1所述的引物评估方法，进一步包含如下步骤：
对于根据为相应容器而设置的温度，单独控制应该给予用作目标核酸的扩增反应场所的多个容器的热量的控制器，为每个样本集决定应该为所述容器而设置的退火阶段温度，在所述容器中，部署样本集中的目标核酸，其中，
在步骤(a)中，从分配给所述容器的光接收器件获取指示所述扩增量的时间变化的信号。
3.按照权利要求2所述的引物评估方法，进一步包含如下步骤：
根据将引物用作评估主体的增殖反应的结果的使用目的，切换所述参考值。
4.按照权利要求3所述的引物评估方法，其中，在步骤(d)中，
将在步骤(c)中计算的所述变化度与所述参考值相比较，和
如果所述变化度等于或低于所述参考值，则还提交指示用在所述增殖中的引物是有利引物的评估结果，而如果所述变化度高于所述参考值，则还提交指示用在所述增殖中的引物是不利引物的评估结果。
5.一种使计算机执行如下步骤的引物评估程序：
从能够使核酸增殖的装置或存储媒体中获取指示扩增量的时间变化的信号，所述扩增量是在如下时候获得的：以逐步稀释的目标核酸为单位、针对在退火阶段应该相互不同的温度条件的数量而制备的样本集被如此扩增使得在除了退火阶段之外的阶段的温度条件固定；
获取指示逐步稀释的目标核酸的初始量的信号；
根据所述扩增量的时间变化和所述初始量获得每个温度条件的扩增效率，并计算所述扩增效率的变化度；以及
提交所述变化度、和针对所述变化度设置的用于引物的品质评估的参考值。
6.一种实时聚合酶链式反应装置，包含：
热源器件，被分配给衬底中作为核酸的扩增反应场所而形成的多个容器；
控制机构，用于根据为相应容器而设置的温度，单独控制所述热源器件的热量；
决定机构，用于为以逐步稀释的目标核酸为单位，针对应该相互不同的温度条件的数量制备的样本集的每一个决定应该为所述容器而设置的退火阶段温度，在所述容器中，部署样本集之中的目标核酸；
初始量获取机构，用于获取指示逐步稀释的目标核酸的初始量的信号；
扩增量获取机构，用于从被分配给所述容器的多个光接收器件获取指示扩增量的信号，所述扩增量是当这样扩增所述样本集使得在除了退火阶段之外的阶段的温度条件固定时所获得的；
计算机构，用于根据所述扩增量的时间变化和所述初始量获得每个温度条件的扩增效率，并计算所述扩增效率的变化度；以及
提交机构，用于提交所述变化度、和针对所述变化度设置的用于引物的品质评估的参考值。
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