CN101778861A - Tlr激动剂和/或1型干扰素减轻tnf-r激动剂治疗方案的毒性的用途 - Google Patents

Abstract

提供了使用TNF-R激动剂例如CD40激动剂的改良(更安全和更有效的)方法。这些方法提供了有效预防或减少毒性(肝脏毒性)量的1型干扰素和/或TLR激动剂的添加，否则TNF-R激动剂用作单一疗法(无1型干扰素和/或TLR激动剂)在某些患者中导致所述毒性。

Description

TLR激动剂和/或1型干扰素减轻TNF-R激动剂治疗方案的毒性的用途

优先权信息

本申请要求于2007年6月15日提交的临时申请序列号60/944,288的优先权利益，并且进一步要求于20033年12月30日提交的美国序列号10/748,01的优先权并且是它的部分继续申请，所述美国序列号10/748,01要求于2002年12月30日提交的美国临时序列号60/437,398的优先权，并且还要求于2007年5月3日提交的美国序列号11/743,978的优先权并且是它的部分继续申请，所述美国序列号11/743,978依次要求于2006年9月5日提交的美国临时60/842,009；于2006年6月1日提交的60/809,821和2006年5月3日提交的60/796,867的优先权。所有这些申请通过引用整体合并入本文。

发明领域

总的来说，本发明涉及减轻在施用TNF/TNF-R超家族激动剂，最特别地CD40激动剂后观察到的毒性，特别是肝脏毒性的方法，通过在包含施用TNF/TNF-R激动剂的治疗或免疫佐剂方案中进一步施用一定量的至少一种1型干扰素和/或toll样受体(TLR)激动剂，其量足以预防或减轻所述毒性，特别是肝脏毒性，所述TNF/TNF-R激动剂当用作单一疗法时引起肝脏毒性。此外，1型干扰素和/或TLR激动剂的添加允许TNF-R激动剂以更高的剂量施用，从而增强功效。这些治疗方案示例性地包括使用这些免疫激动剂和/或细胞因子免疫刺激组合用于治疗各种慢性疾病，所述疾病包括癌症、感染性疾病、自身免疫疾病、变应性和炎性疾病。

发明背景

过去10年已见证了癌症靶抗原鉴定的指数增长，用于开发人佐剂以有效针对这些靶免疫的相似步伐已落后。Toll样受体及其配体以及控制适应性免疫的受体-配体的分子鉴定已提供第一种合逻辑的、基于假设的策略，以分子调合佐剂以便引发针对癌症的保护性免疫应答。与TLRs在动员先天性免疫应答中的重要性平行，CD40及其配体是用于发展适应性免疫应答的关键激活物。

可能对抗癌症的方法中最弱的方面之一是缺乏这样的佐剂，其可以引发针对癌症相关抗原的强烈、长效免疫。过去，已依赖于看起来诱导炎症的试剂的使用。Alum(明矾)是氢氧化铝和磷酸盐的盐并且主要引发体液介导的免疫应答。这种佐剂首先在1926年采用并且在1938年FDA首次负责新药审批权时有效免受限制。Alum是唯一FDA批准的佐剂，并且是许多目前使用的疫苗如tentanus类毒素的组分。存在在癌症临床试验中已采用的许多其他佐剂(非细胞因子)，如卡介苗(BCG)、钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)、不完全弗氏佐剂(IFA)，所有这些的作用机制了解很少并且具有中度的佐剂活性。直到1999年阐明关于免疫佐剂的受体(Toll样受体)的第一项研究出现，才分子上了解免疫***的这些“非特异性”激活物如何触发先天性免疫。TLRs是在造血和非造血细胞上表达的1型膜蛋白。目前，在TLR家族中存在11个成员。这些受体的特征在于其识别由致病性生物表达的病原体相关分子模式(PAMP)的能力。一般的PAMPS包括LPS、DNA(CpG)、脂蛋白、ssRNA和糖脂。是否存在关于TLRs的真正内源配体仍有争议，尽管已报告TLR2和TLR4能够识别几种自身蛋白质(包括热休克蛋白家族的成员hsp60和hsp70)。

一般地，TLR的触发通过增强的细胞因子生产(IL12、IL18等)、趋化因子受体表达(CCR2、CCR5和CCR7)和共刺激分子表达来引发深远的免疫应答。像这样，这些受体在先天性免疫***中发挥对随后的获得性免疫应答的极性的控制。

关于CD40(CD40L、gp39)的配体CD154或CD40L是肿瘤坏死因子家族的32-39kD成员，所述家族包括TNF-α、淋巴毒素、FasL、CD30L、CD27L、4-1BBL和OX-40L。活化的CD4T细胞是负责CD154表达的占优势细胞类型。CD154在CD8+T细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞、NK细胞和DCs上的表达已得到描述。关于CD154的受体——CD40是肿瘤坏死因子受体(TNF-R)超家族的成员，所述超家族包括TNF-RI(p55)、TNF-RII(p75)、p75神经营养因子受体、fas、CD30、CD27、4-1BB和OX-40。它是组织分布最初被认为限制于B细胞、DCs(DC’s)和基底上皮细胞的50-kDa膜蛋白，然而，随后的研究已显示CD40在单核细胞/巨噬细胞、小神经胶质细胞和内皮细胞上的功能表达。

关于分离的DCs的体外研究已显示CD40触发改变细胞因子(IL12、IL15)趋化因子(IP10、MIP-1βMIP-1α和IL-8)、共刺激分子表达(CD80、CD86)和趋化因子受体的表达。所有这些效应以CD40活化DCs刺激增强的T细胞增殖和分化的能力而终结。我们自己的数据显示与TNFα和RANKL比较，CD154对早期信号传导、细胞因子产生和趋化因子产生发挥大得多的深远影响。DCs的CD40触发的一个其他关键影响是肽-MHCII周转中的改变。Lanzavecchia已使用LPS显示并且我们已使用由CD40激动剂使DCs成熟显示促进MHCII-肽复合物在DCs表面上的累积。来自我们实验室和其他的研究指出CD40看起来是在体内关于DCs的关键长寿信号。

CD40激动剂在不存在CD4⁺T细胞的情况下引发CMI的成功产生使用CD40激动剂作为用于癌症疫苗的佐剂的基本热情。经由Glennie和同事的一系列研究显示可以使用□CD40达到CD40⁺淋巴瘤的肿瘤消退，但抗CD40的剂量极高(250ug/天，第2-5天)，并且奇怪的是，免疫接种所需的肿瘤接种物极高(5×10⁷/小鼠)。然而，这些CD40⁺淋巴瘤的临床消退是令人印象深刻的。较不令人印象深刻的是关于其为CD40^-的血液***肿瘤的研究。可能关于CD40⁺淋巴瘤和白血病的成功是由于CD40激动剂对肿瘤的直接作用。对于淋巴瘤和白血病，CD40激动剂还可以增强其APC活性，并且同时增强其凋亡。然而，通过这个相同团体的随后研究的确证实CD40激动剂可以对实体瘤发挥有利的疗效。对于实体瘤，许多研究已显示CD40活化促进凋亡性死亡并且CD40表达是促成肿瘤细胞消除的肿瘤特异性T细胞应答产生中的重要因素。其他团体，如Melief和同事的团体已显示CD40激动剂单独或TLR激动剂单独可以在体内引发对表达Ad5E1A的(CD40-)肿瘤的的有效治疗(肿瘤类型未描述)。使用肾细胞癌模型，Murphy和同事已显示只有激动剂抗CD40和IL-2的组合而不是任一单独施用的试剂在大多数处理小鼠中诱导转移性肿瘤的完全消退和对后续再攻击的特异性免疫。在这时，用CD40激动剂单独的功效是无法预测的。不清楚在肿瘤上的CD40表达是否重要，肿瘤负荷是否重要，CD40单独是否足够以及CD40激动剂治疗在液体或实体瘤中的功效是否存在特征性差异。

CD40是用于诱导增强的CMI应答用于肿瘤保护目的的合理靶，然而，在文献中的数据表明它无法在广泛范围的肿瘤中应用。本领域技术人员包括本发明人已努力工作以试图开发使用抗CD40抗体作为单一疗法以增强保护性肿瘤免疫的一般方法，并且失败了。广泛测试了抗体剂量、时间测定、接种途径、肿瘤类型、不同单抗等的任何和所有参数，然而，这些努力证明是无益的，除了在B淋巴瘤和白血病模型中，如由Glennie报告的。

来自Ked1和同事的近期研究已使某些重要参数更清楚，当使用CD40激动剂时，所述参数可能影响保护性CTL的产生。使用针对SIINFYKL特异性CTL的四聚体染色和OVA转导的B16，他们显示抗CD40抗体激动剂实际上加速SIINFYKL特异性CTL的丧失。然而，如果免疫接种用携带SIINFYKL微基因的痘病毒来完成，那么使用抗CD40抗体激动剂观察到增强的CTL扩增。结论是如果这些肿瘤抗原在病毒载体中或在炎症的背景中递送，那么针对肿瘤抗原的长期免疫接种仅通过CD40激动剂得到增强。因此，在无数肿瘤模型的结果中的极大差异可能是由于与抗体CD40激动剂协作的辅炎症介质的非故意添加。

此种体内研究导致关于通过CD40激动剂活化DCs的辅信号的需求的许多近期报告。公开的研究显示CD40衔接(例如参与)单独不足以在体外和体内诱导通过DCs的IL12p70产生。通过评估关于p40和p35的mRNA，本发明人显示经由TLR(STAg，来自猪弓形体(Toxoplasmagondi)的提取物)和CD40的共衔接(例如参与)对于增强的p35mRNA表达和IL12p70产生是关键的。这项研究随后为使用人DCs的研究，在其中显示CpG DNA是用于在体外IL12p70产生与CD40信号传导的关键共刺激。总之，这些是证明CD40是驱动DC成熟的DC特定方面必需但不足够的首批研究。然而，他们未提供CD40和TLR激动的组合作用是猛烈引发CMI必需的强说服力证据。

为了增加适应性免疫应答的有效性，例如在疫苗接种方案或在微生物感染或癌症过程中，因此重要的是开发新型、更有效的但不引发不利毒性副作用的疫苗佐剂。本发明满足了这个需要并且还提供了其他优点。

发明概述

本发明涉及牵涉施用免疫佐剂的改良疗法，所述免疫佐剂包含下述的组合：(i)至少一种TNF-R激动剂，优选CD40激动剂，其包含的剂量在临床研究中用作单一疗法时在某些受试者中引发肝脏毒性，(ii)一定量的至少一种1型干扰素和/或至少一种TLR激动剂，其剂量在统计学上有效减少或消除所述TNF-R激动剂剂量作为单一疗法施用时的肝脏毒性，和(iii)任选地希望引发针对其的细胞免疫应答的抗原，例如微生物、病毒或肿瘤抗原。本发明进一步涉及此种疗法和组合物用于在其中用作免疫佐剂和用于治疗病状的用途，在所述病状中希望增强T细胞免疫但没有肝脏毒性的不希望有的引发。

包含TLR激动剂和CD40激动剂或和任选地抗原的协同佐剂的使用公开于2003年12月30日提交的美国序列号10/748,010中，所述申请通过引用整体合并入本文。这个先前申请例示了各种分离的TLR激动剂化合物，及其与CD40和其他TNF-R激动剂和任选地所需抗原(希望引发针对所述抗原的T细胞免疫应答)结合的用途，及其作为免疫佐剂用于治疗病状的用途，所述病状例如癌症、感染、自身免疫疾病和其中希望抗原特异性T细胞免疫的其他病状。

本发明是它的延伸，因为它涉及1型干扰素和/或TLR激动剂可以用于减少或消除TNF-R激动剂治疗方案的毒性副作用的发现。主题治疗方案可以施用于需要此种治疗的宿主作为如下的手段：

(i)相对于用任一激动剂单独的免疫接种，产生增强的(指数级更佳的)原代和记忆CD8+T细胞应答；

(ii)诱导抗原特异性CD8+T细胞的指数扩增，和

(iii)甚至在CD4缺陷或耗尽宿主产生保护性免疫和

(iv)产生所述治疗性应答，同时引发比所述TNF-R激动剂用作单一疗法时实质上更少的肝脏毒性。

与某些先前的TNF-R激动剂治疗方案形成对比，目前方案是安全和有效的，即它不会可观地导致对肝脏的任何毒性。因此，本发明提供了作为TNF-R激动剂的增强功效，例如CD40激动剂可以以比目前治疗方案更高的剂量使用，例如高2倍至甚至10倍，但无肝脏毒性。这将增强其针对靶细胞例如受病毒感染的细胞或肿瘤细胞的功效。

本发明特别揭示了联合疗法与单一疗法在细胞和分子水平上对针对黑素瘤的抗原特异性免疫应答以及对毒性的影响。在下文实施例中包含的研究证实CD40和TLR激动剂当在佐剂平台中组合时在鼠类癌症模型中的深远效用。数据显示疫苗接种诱导极高频率的原代和记忆自身反应性CD8⁺T细胞，其浸润转移靶器官且控制肿瘤生长。联合疗法还减少在肿瘤部位处的调节T细胞(T^regs)与CD8⁺T细胞比，并且允许持久的效应CD8⁺T细胞功能。最后，由CD40单一疗法诱导的显著肝毒性经由联合疗法消除。这些研究显示CD40和TLR激动剂的联合使用提供了更大的治疗效果伴随有限的毒性，并且提供了关于构建用于在临床试验中使用的新多因子佐剂的原理。

基于下文结果，任选可以进一步包括抗原的这些免疫佐剂组合可以用于治疗在其中上文鉴定的增强细胞免疫应答是治疗上希望的任何疾病或病状，特别是感染性疾病、增生性病症例如癌症、过敏症、自身免疫病症、炎症病症和在其中增强的细胞免疫是希望的治疗后果的其他慢性疾病。本发明的优选应用特别包括感染性病症例如HIV感染和癌症的治疗。

附图详述

图1这个图包含显示通过CD40和TLR7的伴随信号传导驱动具有增强细胞裂解活性的自身抗原特异性CD8+T细胞的扩增的实验。在实验中，其中C57BL/6小鼠用100μg肿瘤相关抗原V、100μg CD40FGK45和100μg S-27609以所示组合进行静脉内免疫接种。7天后，给小鼠采血并且细胞在体外用TRP2_(180-188)进行再刺激，以评估产生IFN和转移CD107a的能力，如“方法”中所述。淋巴细胞通过正面和侧面散射进行鉴定，并且随后对所有CD8⁺事件进行门控。(A)来自疫苗接种小鼠的代表性点图。在右上角中的数目指示对于IFN和CD44(顶端行)或IFN和CD107a(底部行)阳性的CD8⁺T细胞的频率。(B)表达CD8抗原的外周血淋巴细胞的百分比。经由单尾ANOVA的P.001(C)响应肽再刺激脱颗粒的CD8⁺细胞百分比的定量。在所有情况下，呈现的数据代表至少3次独立实验。数据作为平均值加上或减去SEM(在每个组中n＝8)进行标绘。经由单尾ANOVA的P.001。

图2这个图包含显示与CD40激动剂单一疗法形成对比，CD40激动剂/TLR6激动剂疗法援救T细胞功能的实验。在图2中描述的实验中，小鼠用各100μg的V肽、CD40和S-27609以所示组合进行免疫接种。65天后评估记忆CD8⁺功能性。(A)通过从疫苗接种小鼠的脾和肺中分离的记忆CD8⁺T细胞的IFN分泌的代表性点图。点图对活CD8⁺细胞进行门控，并且数目指示对于IFN和CD44两者阳性的细胞百分比。(B)通过执行体内细胞毒性测定法评估记忆CD8⁺T细胞的细胞裂解活性。数目反映抗原特异性裂解的百分比。(C，D)在脾(C)和肺(D)中表达IFN的记忆CD8⁺细胞的相对和绝对数目的定量。通过每个细胞群体的相对百分比乘以从每种组织中分离的细胞总数目测定阳性细胞的绝对数目。(E)在实验对象组B中呈现的体内细胞毒性测定法的定量。经由单尾ANOVA的P.001。(F)在得自疫苗接种小鼠的脾或肺的IFN⁺-记忆CD8⁺T细胞上的CD127表达。同种型对照显示为填充直方图。(G)通过记忆CD8⁺T细胞的细胞因子产生。来自实验对象组F的细胞就产生TNF和IL-2的能力进行分析。数目反映还对于TNF或IL-2阳性的CD8⁺IFN⁺细胞百分比。在所有情况下，数据由至少2次独立实验中合并，在每次实验中具有4只或更多小鼠/组，并且作为平均值(±SEM)进行标绘。

图3这个图包含显示抗CD40/TLR7激动剂的治疗性干预减缓转移性黑素瘤的进展的实验。其中，C57BL/6小鼠用10⁵转移性B16.F10黑素瘤细胞进行静脉内攻击。4天后，小鼠用100μg肿瘤相关抗原V、100μg CD40 FGK45和100μg S-27609以所示组合进行疫苗接种。24天后，杀死小鼠，取出肺，并且借助于解剖显微镜计数转移性表面肿瘤结节。(A)在肿瘤攻击后24天，在小鼠肺上的肉眼可见肿瘤结节的照片。在肺下的数目反映就治疗效果监控的小鼠平均存活时间和长期存活率。数据由3-4次独立实验合并，在每次实验中具有超过8只小鼠/组。(B)肺转移灶的计数。数据由2次独立实验合并，并且呈现为平均值加上或减去SEM(在每个组中n＝16只小鼠)。数据代表超过4次分开实验，在每次组中具有至少6只小鼠。(C)在效应细胞耗尽后肺转移灶的计数。小鼠如上所述进行处理，除了在肿瘤攻击前耗尽效应细胞群体外，如“方法”中所述。数据表示为平均值加上或减去SEM(在每个组中n＝8只小鼠)，并且代表3次独立实验。

图4：这个图包含与浸润淋巴细胞的动力学分析相关的实验。在图4(A)中显示的是实验设计，并且图4(B)包含在肿瘤攻击后第10或21天时从转移靶器官中分离的淋巴细胞的代表性点图。如“方法”中所述从荷瘤肺中分离细胞，并且用肿瘤肽实施体外再刺激。图对活的、CD8⁺细胞进行门控。右上象限中的数目反映对于IFN和活化标记CD44两者阳性的CD8⁺T细胞的频率。数据代表3次独立实验，在每次实验中具有4只小鼠/组。(C，D)在肿瘤攻击后第10(C)或21(D)天时的肺浸润的定量。数据作为平均值(±SEM)进行标绘，并且代表来自2次(C，n＝8只小鼠/组)或3次(D，n＝12只小鼠/组)独立实验的合并数据，在每次实验中具有4只小鼠/组。(E)在肿瘤接种后第10或21天时从用肿瘤抗原加上CD40/TLR7*进行疫苗接种的小鼠的肺中分离的CD8⁺T细胞的效应子表型。点图首先对肝脏CD8⁺细胞进行门控，并且随后进一步对IFN⁺CD44⁺群体进行门控。数据代表至少2次独立实验，在每次实验中具有4只小鼠/组。

图5这个图包含揭示用TLR7激动逆转与CD40单一疗法相关的肝毒性的实验。图5(A，B)包含血清转氨酶的动力学分析。小鼠用PBS、100μg CD40、100μg TLR7*或两者进行静脉内处理。在之后的各个时间点上分离血清，并且如所述的测量丙氨酸转氨酶(A)或天冬氨酸转氨酶(B)的血清水平。数据代表3次独立实验，在每个时间点上具有n＝3-8只小鼠/组。(C-F)用PBS(C)、100μg CD40(D)、100μg TLR7*(E)、或100μg CD40和100μg TLR7*(F)处理48小时的肝脏的组织学分析。(G)来自如上所述处理48小时的小鼠的肝脏中的组织病理学改变的半定量评估。数据由2次独立实验合并，在每个处理组中具有n＝6只小鼠。经由曼-怀二氏(Mann-Whitney)非参数检验的P＝.026。

图6：由图6(A)和6(B)组成的这个图包含显示通过TLR激动剂或1型干扰素(α干扰素)与抗CD40抗体激动剂的共施用减轻肝脏毒性的另外实验。在实验中，其中通过测量血清肝脏酶活性生物化学评估肝细胞损伤。具体地，小鼠i.v.接受100mg抗CD40、100mgS-27609或两者。在某些情况下，小鼠还接受分级剂量的重组干扰素-α(通常，一百万国际单位/小鼠)。24-72小时后收获血清，并且送到Charles River Laboratories(Worcester，MA)用于肝脏化学特征分析。备选地，血清样品通过National Jewish Medical Center CoreLab(Denver，CO)进行分析。

发明详述

本发明提供了用于减轻或预防毒性特别是肝脏毒性的新型方法，所述毒性通过涉及施用TNF/TNF-R激动剂的某些疗法引起，例如与施用某些CD40激动剂包括CD40激动性抗体和可溶性CD40L多肽相关的肝脏毒性。已惊奇地发现如果此种治疗方案进一步包括施用足以减轻或预防毒性量的1型干扰素和/或TLR激动剂，那么此种毒性得到减轻或预防。因此，本发明减少了此种疗法的不利副作用，以及潜在增强此种疗法如更大剂量的TNF/TNF-R激动剂的功效，例如可以在其肝功能已由于疾病而妥协(如被损坏)的患者中施用CD40激动剂，而无引发不利肝反应的危险。本发明特别提供了治疗癌症、感染性疾病、自身免疫和炎症疾病的改良(更安全和更有效的)方法，使用与足以减少或预防肝毒性量的1型干扰素和/或TLR激动剂结合的TNF/TNF-R激动剂，否则在施用剂量的TNF/TNF-R激动剂时可能导致所述肝脏毒性。

就前述而言，尽管过去10年已见证了癌症靶抗原鉴定中的指数增长，但用于开发人佐剂以有效针对这些靶免疫的相似步伐已落后。Toll样受体及其配体以及控制适应性免疫的受体-配体的分子鉴定已提供第一种合逻辑的、基于假设的策略，以分子上调合佐剂以便引发针对癌症的保护性免疫应答。与TLRs在动员先天性免疫应答中的重要性平行，CD40及其配体是用于发展适应性免疫应答的关键激活物。本文的数据显示与针对CD40的激动剂使用组合的、活化特异性TLRs的定义明确的激动剂的使用引发针对限定肽的深远的细胞介导的免疫应答，所述免疫应答达到或超过用最有效的病毒载体所可见的，并且进一步减少或消除肝脏毒性。

如上文讨论的，CD40是用于诱导增强的CMI应答用于肿瘤保护目的的合理靶，然而，在文献中的数据暗示它无法在广泛范围的肿瘤中应用。本发明人的实验室已努力工作多年以试图开发使用激动性抗CD40抗体作为单一疗法以增强保护性肿瘤免疫的一般方法，并且失败了。广泛测试了抗体剂量、时间测定、接种途径、肿瘤类型、不同单抗等的任何和所有参数，然而，这些努力证明是无益的，除了在B淋巴瘤和白血病模型中，如由Glennie报告的。

CD40相关毒性。在小鼠和人中的研究已显示CD40激动剂单独的施用诱导毒性。在完整小鼠中，已显示CD40激动剂诱导肝脏毒性。在免疫缺陷小鼠和非致命性照射的小鼠中，CD40激动剂的施用诱导致死性。

如下所述，在本发明人用CD40和TLR激动剂(或IFNa)的组合施用的研究过程中，发现向用CD40激动剂处理的小鼠体内加入TLR激动剂或IFNa解决了毒性。因此，IFNa和/或TLR激动剂与CD40激动剂(或用作单一疗法时引起相似毒性的其他TNF-R激动剂)的共施用应解决在CD40激动剂和其他TNF/TNF-R激动剂的临床使用中观察到的毒性，所述CD40激动剂和其他TNF/TNF-R激动剂引发毒性副作用，特别是肝脏毒性。如由下文实施例和包含其中讨论的数据的支持性附图中显示的，那个肝脏毒性得到消除或降到最低。

因此，一般地，本发明包含涉及以这样的剂量施用至少一种TNF/TNF-R激动剂的改良(更安全的)治疗方案，所述剂量已显示在某些受试者中在必要或所需治疗剂量时引发肝脏毒性，通过进一步施用足以减少或消除由作为单一疗法施用的TNF/TNF-R激动剂引发的潜在肝脏毒性量的至少一种1型干扰素和/或至少一种TLR激动剂。

在更详细地讨论本发明前，提供了下述定义。否则，本文的技术术语应解释为它们将是相关领域中技术人员理解的。

如本文所使用的，下述术语应具有阐述的含义：

“激动剂”指与受体组合可以产生细胞应答的化合物。激动剂可以是与受体直接结合的配体。备选地，激动剂可以与受体间接组合，通过例如(a)和与受体直接结合的另一种分子形成复合物，或(b)以其他方式导致另一种化合物的修饰，从而使得其他化合物与受体直接结合。激动剂可以称为特定受体或受体家族的激动剂(例如，TLR激动剂或TNF/R激动剂)。

“抗原”指能够成为免疫应答的靶的任何物质。抗原可以是例如通过受试生物产生的细胞介导的和/或体液免疫应答的靶。备选地，当与免疫细胞接触时，抗原可以是细胞免疫应答的靶(例如，免疫细胞成熟、细胞因子产生、抗体产生等)。

“共施用”指这样施用组合的2种或更多组分，使得组合的治疗或预防效果可以大于单独施用的任一组分的治疗或预防效果。2种组分可以同时或顺次共施用。同时共施用的组分可以在一种或多种药物组合物中提供。2种或更多组分的顺次共施用包括这样的情况，其中组分这样施用，使得每种组分可以同时在治疗部位处存在。备选地，2种组分的顺次共施用可以包括这样的情况，其中至少一种组分已从治疗部位处清除，但施用组分的至少一种细胞效应(例如，细胞因子产生、特定细胞群体活化等)在治疗部位处持续直至一种或多种另外组分施用于治疗部位。因此，在特定情况下，共施用组合可以包括在化学混合物中从不彼此存在的组分。

“免疫刺激组合”指可以共施用以提供治疗和/或预防免疫刺激效果的组分的任何组合。免疫刺激组合的组分可以包括但不限于，TLR激动剂、TNF/R激动剂、1型干扰素、抗原、佐剂等。

“混合物”指包含2种或更多组分的任何混合物、水或非水溶液、悬浮液、乳剂、凝胶、乳膏等。组分可以是例如一起提供免疫刺激组合的2种免疫刺激组分。免疫刺激组分可以是一种或多种抗原、一种或多种佐剂、或两者的任何组合。例如，混合物可以包括2种佐剂，从而使得混合物形成佐剂组合。备选地，混合物可以包括佐剂组合和抗原，从而使得混合物形成疫苗。

“协同”及其变化指施用化合物的组合的活性(例如，免疫刺激活性)大于单独施用时化合物的累加活性。

“TLR”一般指任何生物物种的任何Toll样受体。这些包括TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10和TLR11。特异性TLR可以用关于起源物种(例如人、鼠类等)、特定受体(例如，TLR6、TLR7、TLR8等)或两者的另外提及进行鉴定。

“TLR激动剂”指充当TLR的激动剂的化合物。这包括TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10和TLR11激动剂或其组合。除非另有说明，提及TLR激动剂化合物可以包括以任何药学上可接受形式的化合物，包括任何同分异构体(例如，非对映异构体或对映体)、盐、溶剂化物、多形体等。特别地，如果化合物是旋光的，那么提及化合物可以包括每种化合物的对映体以及对映体的消旋混合物。此外，化合物可以鉴定为一种或多种特定TLRs的激动剂(例如，TLR7激动剂、TLR8激动剂或TLR7/8激动剂)。在某些实施方案中，TLR激动剂将包含完整病毒或微生物，其可以进行改造以表达所需抗原。在某些实施方案中，充当TLR激动剂的微生物或病毒可以进行遗传改造，以表达CD40激动剂或另一种TNF/TNF-R激动剂例如4-1BB激动剂和/或所需抗原，从而提供在单个微生物或病毒媒介物中的TNF/TNF-R激动剂例如CD40或4-1BB激动剂、TLR激动剂和任选抗原，从而促进施用于具有其中希望引发增强的抗原特异性细胞免疫应答的病状的宿主。关于特定化合物的TLR激动可以以任何合适的方式进行评估。例如，用于检测测试化合物的TLR激动的测定法例如在于2002年12月11日提交的美国临时专利申请序列号60/432,650中描述，并且适合于在此种测定法中使用的重组细胞系例如在于2002年12月11日提交的美国临时专利申请序列号60/432,651中描述，所述美国临时专利申请引入本文作为参考。

不管采用的具体测定法，如果用化合物执行测定法导致由特定TLR介导的某些生物活性的至少阈值增加，那么该化合物可以鉴定为特定TLR的激动剂。相反，如果当用于执行设计为检测由特定TLR介导的生物活性的测定法时，化合物无法引发生物活性的阈值增加，那么该化合物可以鉴定为不充当特定TLR的激动剂。除非另有说明，生物活性的增加指在相同生物活性超过在合适对照中观察到的那种的增加。测定法可以与或不与合适的对照结合结合执行。凭借经验，技术人员可以足够熟悉地开发特定测定法(例如，在特定测定条件下在合适对照中观察到的值范围)，所述测定法可能不一定需要执行对照，以在特定测定法中测定化合物的TLR激动。

用于在给定测定法中测定特定化合物是或不是特定TLR的激动剂的TLR介导的生物活性的精确阈值增加可以根据本领域已知的因素而改变，所述因素包括但不限于作为测定法的终末点观察到的生物活性、用于测量或检测测定法的终末点的方法、测定法的信噪比、测定法的精确性和相同测定法是否用于测定化合物关于多重TLRs的激动。因此，一般对于所有可能测定法阐述鉴定化合物为特定TLR的激动剂或非激动剂所需的TLR介导的生物活性的阈值增加是不实际的。然而，根据此种因素的适当考虑，本领域普通技术人员可以容易地决定合适阈值。

采用由可表达的TLR结构基因转染的HEK293细胞的测定法可以使用例如TLR介导的生物活性(例如，NF.κ.B活化)至少3倍增加的阈值，当化合物以例如约1μM-约10μM的浓度提供用于鉴定化合物为转染到细胞内的TLR的激动剂时。然而，不同阈值和/或不同浓度范围在特定环境下可能是合适的。此外，不同阈值对于不同测定法可能是合适的。

在特定实施方案中，TLR激动剂可以是TLR的天然激动剂或合成IRM化合物。IRM化合物包括具有有效的免疫调节活性包括但不限于抗病毒和抗瘤活性的化合物。特定IRMs调节细胞因子的产生和分泌。例如，特定IRM化合物诱导细胞因子的产生和分泌，所述细胞因子例如I型干扰素、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、MIP-1和/或MCP-1。作为另一个例子，特定IRM化合物可以抑制特定TH2细胞因子例如IL-4和IL-5的产生和分泌。此外，某些IRM化合物被说成抑制IL-1和TNF(美国专利号6,518,265)。

在本发明的免疫刺激组合中作为TLR激动剂有用的特定IRMs是有机小分子(例如，分子量小于约1000道尔顿，并且在某些情况下小于约500道尔顿)，与大生物分子例如蛋白质、肽等相反。特定小分子IRM化合物公开于例如美国专利号4,689,338；4,929,624；4,988,815；5,037,986；5,175,296；5,238,944；5,266,575；5,268,376；5,346,905；5,352,784；5,367,076；5,389,640；5,395,937；5,446,153；5,482,936；5,693,811；5,741,908；5,756,747；5,939,090；6,039,969；6,083,505；6,110,929；6,194,425；6,245,776；6,331,539；6,376,669；6,451,810；6,525,064；6,545,016；6,545,017；6,558,951；和6,573,273；欧洲专利0 394026；美国专利公开号2002/0055517；以及国际专利公开号WO01/74343；WO 02/46188；WO 02/46189；WO 02/46190；WO 02/46191；WO 02/46192；WO 02/46193；WO 02/46749 WO 02/102377；WO 03/020889；WO 03/043572和WO 03/045391中。

小分子IRMs的另外例子包括特定嘌呤衍生物(例如，美国专利号6,376,501和6,028,076中描述的那些)、特定咪唑并喹啉酰胺衍生物(例如，美国专利号6,069,149中描述的那些)、特定苯并咪唑衍生物(例如，美国专利号6,387,938中描述的那些)、和与含5成员氮的杂环融合的4-氨基嘧啶的特定衍生物(例如美国专利号6,376,501；6,028,076和6,329,381；以及WO 02/085905中描述的腺嘌呤衍生物)。

其他IRMs包括大生物分子，例如寡核苷酸序列。某些IRM寡核苷酸序列包含胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)，并且例如在美国专利号6,194,388；6,207,646；6,239,116；6,339,068；和6,406,705中描述。某些含CpG寡核苷酸可以包括合成免疫调节结构基序，例如美国专利号6,426,334和6,476,000中描述的那些。其他I RM核苷酸序列缺乏CpG，并且在例如国际专利公开号WO 00/75304中描述。

适合于在本发明的免疫刺激组合中用作TLR激动剂的小分子量IRM化合物包括具有与含5成员氮的杂环融合的2-氨基吡啶的化合物。此种化合物包括例如咪唑并喹啉胺，包括但不限于取代咪唑并喹啉胺，例如氨基烷基取代的咪唑并喹啉胺、酰胺取代的咪唑并喹啉胺、氨磺酰取代的咪唑并喹啉胺、尿素取代的咪唑并喹啉胺、芳基醚取代的咪唑并喹啉胺、杂环醚取代的咪唑并喹啉胺、氨基醚取代的咪唑并喹啉胺、亚磺酰氨基醚取代的咪唑并喹啉胺、尿素取代的咪唑并喹醚、和硫醚取代的咪唑并喹啉胺；四氢咪唑并喹啉胺，包括但不限于酰胺取代的四氢咪唑并喹啉胺、氨磺酰取代的四氢咪唑并喹啉胺、尿素取代的四氢咪唑并喹啉胺、芳基醚取代的四氢咪唑并喹啉胺、杂环醚取代的四氢咪唑并喹啉胺、氨基醚取代的四氢咪唑并喹啉胺、亚磺酰氨基醚取代的四氢咪唑并喹啉胺、尿素取代的四氢咪唑并喹醚、和硫醚取代的四氢咪唑并喹啉胺；咪唑并吡啶胺包括但不限于酰胺取代的咪唑并吡啶胺、氨磺酰取代的咪唑并吡啶胺、尿素取代的咪唑并吡啶胺；芳基醚取代的咪唑并吡啶胺、杂环醚取代的咪唑并吡啶胺、氨基醚取代的咪唑并吡啶胺、亚磺酰氨基醚取代的咪唑并吡啶胺、尿素取代的咪唑并吡啶醚、和硫醚取代的咪唑并吡啶胺；1，2-桥接的咪唑并喹啉胺；6，7-融合的环烷基咪唑并吡啶胺；咪唑并萘啶胺；四氢咪唑并萘啶胺；噁唑并喹啉胺；噻唑并喹啉胺；噁唑并吡啶胺；噻唑并吡啶胺；噁唑并萘啶胺；和噻唑并萘啶胺。

在特定实施方案中，TLR激动剂可以是咪唑并萘啶胺、四氢咪唑并萘啶胺、噁唑并喹啉胺、噻唑并喹啉胺、噁唑并吡啶胺、噻唑并吡啶胺、噁唑并萘啶胺、或噻唑并萘啶胺。

在特定实施方案中，TLR激动剂可以是氨磺酰取代的咪唑并喹啉胺。在备选实施方案中，TLR激动剂可以是尿素取代的咪唑并喹啉醚。在另一个备选实施方案中，TLR激动剂可以是氨基烷基取代的咪唑并喹啉胺。

在一个具体实施方案中，TLR激动剂是4-氨基-α，α，2-三甲基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙醇。在一个备选具体实施方案中，TLR激动剂是N-(2-{2-[4-氨基-2-(2-甲氧乙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]乙氧基-}乙基)-N-甲基***啉-4-甲酰胺。在另一个备选具体实施方案中，TLR激动剂是1-(2-氨基-2-甲基丙基)-2-(乙氧甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4胺。在另一个备选具体实施方案中，TLR激动剂是N-[4-(4-氨基-2-乙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)丁基]甲基磺酰胺。在另外一个备选具体实施方案中，TLR激动剂是N-[4-(4-氨基-2-丙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)丁基]甲基磺酰胺。

在特定备选实施方案中，TLR激动剂可以是取代的咪唑并喹啉胺、四氢咪唑并喹啉胺、咪唑并吡啶胺、1，2-桥接的咪唑并喹啉胺、6，7-融合的环烷基咪唑并吡啶胺、咪唑并萘啶胺、四氢咪唑并萘啶胺、噁唑并喹啉胺、噻唑并喹啉胺、噁唑并吡啶胺、噻唑并吡啶胺、噁唑并萘啶胺、或噻唑并萘啶胺。

如本文所使用的，取代的咪唑并喹啉胺指氨基烷基取代的咪唑并喹啉胺、酰胺取代的咪唑并喹啉胺、氨磺酰取代的咪唑并喹啉胺、尿素取代的咪唑并喹啉胺、芳基醚取代的咪唑并喹啉胺、杂环醚取代的咪唑并喹啉胺、氨基醚取代的咪唑并喹啉胺、亚磺酰氨基醚取代的咪唑并喹啉胺、尿素取代的咪唑并喹醚、或硫醚取代的咪唑并喹啉胺。如本文所使用的，取代的咪唑并喹啉胺特别且明确地排除1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-氨基和4-氨基-α，α-二甲基-2-乙氧甲基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙醇。

“作为单一疗法引发肝脏毒性的治疗有效剂量的TNF-R激动剂”指这样的TNF-R激动剂剂量，其据报告引发关于免疫的治疗利益，但在临床研究中已观察到至少在某些受试者中引发肝脏毒性(在不存在1型干扰素和/或TLR激动剂的共施用的情况下)。

“TNF/R”或“TNF/TNF-R”一般指肿瘤坏死因子(TNF)超家族或肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的任何成员。TNF超家族包括例如CD40配体、OX40配体、4-1BB配体、CD27、CD30配体(CD153)、TNF-α、TNF-β、RANK配体、LT-α、LT-β、GITR配体和LIGHT。TNFR超家族包括例如，CD40、OX40、4-1BB、CD70(CD27配体)、CD30、TNFR2、RANK、LT-βR、HVEM、GITR、TROY和RELT。“TNF/R激动剂”指充当TNF超家族或TNFR超家族的成员的激动剂的化合物。除非另有说明，提及TNF/R激动剂化合物可以包括以任何药学上可接受形式的化合物，包括任何同分异构体(例如，非对映异构体或对映体)、盐、溶剂化物、多形体等。特别地，如果化合物是旋光的，那么提及化合物可以包括每种化合物的对映体以及对映体的消旋混合物。此外，化合物可以鉴定为任一超家族的特定成员的激动剂(例如，CD40激动剂)。

“TNF-R激动剂”或“TNF/TNF-R激动剂”在本文中包括TNF超家族或TNF-R超家族的任何成员的任何合适激动剂，其引发通过与至少一种TLR激动剂和/或1型干扰素结合施用此种激动剂预防或减轻的毒性例如肝脏毒性。在许多情况下，一个超家族的成员可以是另一个超家族的互补成员的激动剂。例如，CD40配体(TNF超家族的成员)可以充当CD40(TNFR超家族的成员)的激动剂，并且CD40可以充当CD40配体的激动剂。因此，合适的TNF/R激动剂包括例如CD40配体、OX40配体、4-1BB配体、CD27、CD30配体(CD153)、TNF-α、TNF-β、RANK配体、LT-α、LT-β、GITR配体、LIGHT、CD40、OX40、4-1BB、CD70(CD27配体)、CD30、TNFR2、RANK、LT-βR、HVEM、GITR、TROY和RELT。此外，合适的TNF/R激动剂包括针对TNF/R产生的特定激动性抗体(例如，各自针对小鼠CD40产生的IC10和FGK4.5)。

“TNF-R激动剂单一疗法”在本文中指涉及施用至少一种TNF-R激动剂例如CD40激动剂的治疗方案，其不包括TLR激动剂和/或1型干扰素的伴随施用。一般地此种单一疗法可以在某些受试者中引发肝脏毒性。

“治疗部位”指特定治疗部位。依赖于具体治疗，治疗部位可以是整个生物(例如，全身疗法)或生物的任何部分(例如，局部疗法)。

“1型干扰素”统指IFN-α、IFN-β、IFN-Ω等或其任何混合物或组合。在本发明中，术语“1型干扰素”包含当接近TNF-R激动剂或与TNF-R激动剂组合施用时，引发增强的CD8+免疫应答的任何1型干扰素，所述TNF-R激动剂优选CD40激动剂。这包括α干扰素、β干扰素和分类为1型干扰素的其他类型干扰素。特别地，这包括ε干扰素、ζ干扰素和τ干扰素，例如τ1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；此外，这包括其变体，例如片段、模拟不同1型干扰素例如α干扰素结构的共有干扰素、其PEG化版本、由于重组表达或诱变而具有改变的糖基化的1型干扰素等。本领域技术人员充分了解不同的1型干扰素，包括商购可得和用作治疗的那些。优选地1型干扰素将包含人1型干扰素并且最优选人α干扰素。

“疫苗”指包括抗原的药物组合物。疫苗可以包括除抗原外的组分，例如一种或多种佐剂、载体等。在某些实施方案中，TLR激动剂将包含完整病毒或微生物，其可以进行改造以表达所需抗原。在某些实施方案中，充当TLR激动剂的微生物或病毒可以进行遗传改造，以表达CD40激动剂或4-1BB激动剂和/或所需抗原，从而提供在单个微生物或病毒媒介物中的CD40或4-1BB激动剂、TLR激动剂和任选抗原，从而促进施用于具有其中希望引发增强的抗原特异性细胞免疫应答的病状的宿主。

因此，本发明提供了涉及施用TNF-R激动剂和任选地抗原的改良(更安全和更有效的)疗法包括肿瘤和感染性疾病疫苗，由此通过TNF-R激动剂与足以消除或减少不利毒性量的至少一种TLR激动剂和/或1型干扰素的共施用达到改善(减少或消除的肝脏毒性)，否则在相同剂量的TNF-R激动剂例如CD40激动剂用作单一疗法时可能导致所述不利毒性。当本发明人在本文中阐述TNF-R激动剂的剂量在特定剂量时是毒性的时，它意指这个剂量已在临床试验中观察到引发肝脏毒性，如当用作单一疗法(无TLR和/或1型干扰素)时通过某些肝脏酶(转氨酶)的增加体现的。用于在临床试验过程中测量药物的肝脏毒性的方法是众所周知的，因为这是许多潜在治疗的副作用，如果足够显著，那么这可能否定化合物的治疗用途。

这些治疗将包括其中希望引发抗原特异性免疫应答的特定病状，例如产生所述组合物的具有慢性疾病例如癌症或感染性或变应性病症的个人。

再进一步地，本发明提供了包含已发现在某些受试者中引发肝脏毒性的量的所述TNF-R激动剂(如果用作单一疗法)、足以预防或减轻所述肝脏毒性的的量至少一种1型干扰素和/或TLR激动剂、和任选地抗原(或在合适宿主优选人中提供其表达的一种或多种核酸序列)的组合物，所述组合物适合于治疗疾病，例如在其中引发增强的抗原特异性细胞免疫应答是治疗上正当的疾病。

特别地，本发明提供了改良的(更安全和更有效的)免疫治疗方法，其包括给需要此种治疗的宿主施用主题激动剂和/或细胞因子组合，以便引发增强的抗原特异性细胞免疫应答。在优选实施方案中，这些组合物或多肽缀合物或编码这些激动剂和细胞因子组合的核酸序列将施用于这样的受试者，其具有或处于发展癌症、感染性疾病特别是慢性感染性疾病例如涉及病毒、细菌或寄生虫；或自身免疫、炎症或变应性病状的危险中。例如，本发明可以用于引发针对HIV、肺癌或黑素瘤的抗原特异性细胞免疫应答。HIV是充分公认的疾病的例子，其中保护性免疫几乎必然需要针对病毒的有效且长寿的细胞免疫应答的产生。此外，肺癌和黑素瘤都是致病力强的癌症，其导致每年数千人死亡并且对于其需要改良和安全疗法。

因此，本发明为开发有效且安全的治疗作准备，例如针对HIV的疫苗和用于治疗涉及病毒、细菌、真菌或寄生虫的其他慢性感染性疾病以及增生性疾病例如癌症、自身免疫疾病、变应性病症和炎症疾病的组合物。

发明应用

本发明提供了涉及施用至少一种TNF-R激动剂例如CD40激动剂例如CD40激动性抗体或可溶性CD40L多肽、片段或包含缀合物的治疗方法，由此通过进一步施用有效量的至少一种TLR激动剂和/或1型干扰素减少或消除与此种TNF-R激动剂在所需治疗剂量下用作单一疗法有关的毒性(肝脏毒性)。(在这个背景中，“有效”意指1型干扰素或TLR激动剂消除或减少TNF-R激动剂的肝脏毒性。)TLR激动剂和/或1型干扰素和TNF/R激动剂以有效增加针对特定抗原的免疫应答的量提供(或施用，对于包含或编码这些部分的免疫刺激缀合物形式是合适的)。此外，如提及的，TNF-R激动剂例如CD40激动剂的量将一般包含这样的剂量，所述剂量作为单一疗法施用时在至少某些受试者中引发毒性(肝脏毒性)。此外，TLR激动剂和/或1型干扰素的量将是足以预防或减轻所述毒性的量，并且将在TNF-R激动剂施用之前、之时或之后施用。

例如，TLR激动剂可以以约100ng/kg-约100mg/kg的量施用。在许多实施方案中，TLR激动剂以约10μg/kg-约10mg/kg的量施用。在某些实施方案中，TLR激动剂以约1mg/kg-约5mg/kg的量施用。然而，构成有效增加针对特定抗原的免疫应答的量的TLR激动剂的具体量在某种程度上依赖于特定因素，包括但不限于待施用的具体TLR激动剂；待施用的具体抗原及其量；待施用的具体TNF/R激动剂及其量；免疫***状态(例如，抑制、妥协、刺激)；TLR激动剂、TNF/R激动剂和抗原的施用方法和次序；制剂待施用于其的物种；和所需治疗结果。因此，一般阐述构成有效量TLR激动剂的量是不实际的。然而，根据此种因素的适当考虑，本领域普通技术人员可以容易地决定合适量。

1型干扰素的量将是足以预防或减轻作为单一疗法施用时的TNF-R激动剂的毒性的量。如本文所示，如果CD40激动剂与1型干扰素或TLR激动剂结合施用，那么可以减轻例如CD40激动剂的毒性。因此，本发明提供了更有效的CD40激动剂治疗，因为CD40激动剂可以以比迄今描述更高的剂量施用。例如，如果与1型干扰素或TLR激动剂共施用，那么CD40L多肽的MTD(最大耐受剂量)可以超过0.1mg/kg/天至少1.5倍、更优选至少2-5倍、或甚至10倍或更多，从而允许以至少约0.15mg/kg/天-1.0mg/kg/天或更高的MTD量施用CD40L多肽。这将导致更有效的CD40L治疗，例如在CD40相关恶性肿瘤的治疗和本文公开的其他治疗中。此外，本发明将减少CD40激动剂抗体治疗的毒性，并且促进高于迄今提出的CD40激动性抗体剂量的施用。特别地，如上所述，已报告由Vonderheide等人，J Clin.Immunol.25(7)：876-883(2007)报告的关于激动性CD40L抗体的MTD是0.3mg/kg，并且过量的剂量导致暂时的肝脏毒性、静脉血栓栓塞、3级头痛和细胞因子释放，以及相关毒性和不利副作用例如发烧和寒战。与1型干扰素或TLR激动剂结合的CD40激动性抗体的共施用有效允许MTD抗体量大量增加例如1.5-15或甚至5-10倍，而无不良反应。因此，关于CD40激动性抗体的MTD量可以增至约0.45mg/kg-约3.0mg/kg或甚至更高。因此，本发明包括CD40激动剂与足以减少毒性作用例如肝脏毒性量的1型干扰素或TLR激动剂的共施用，否则在特定CD40激动剂剂量下将潜在导致所述肝脏毒性。

就1型干扰素而言，量可以从约1.X10.sup.3活性单位(U)到约1.×10U、更一般地从约10.sup.4U到约10.sup.8U变化。

激动性抗体或CD40L多肽的量可以从约0.00001克到约5克、更一般地从约0.001克到约1克不同。如上所述，优选的MTD将超过0.3mg/kg，并且可以为约0.45mg/kg-约3mg/kg。如果治疗方法涉及抗原的施用，那么这可以以约0.0001克-约50克、更一般地约0.1克-约10克的量施用。如所述的，这些部分可以在相同或不同制剂中施用。如果分开施用，那么部分可以以任何次序施用，一般在彼此的数小时内、更一般地在时间上基本接近。

TNF/R激动剂例如CD40激动剂可以以约100ng/kg-约100mg/kg的量施用。在特定实施方案中，TNF/R激动剂以10μg/kg-约10mg/kg的量施用。在某些实施方案中，TNF/R激动剂以约1mg/kg-约5mg/kg的量施用。然而，构成有效增加针对特定抗原的免疫应答的量的TNF/R激动剂的具体量在某种程度上依赖于特定因素，包括但不限于待施用的具体TNF/R激动剂；待施用的具体TLR激动剂及其量；待施用的具体抗原及其量；免疫***状态；TLR激动剂、TNF/R激动剂和抗原的施用方法和次序；制剂待施用于其的物种；和所需治疗结果。因此，一般阐述构成有效量TNF/R激动剂的量是不实际的。然而，根据此种因素的适当考虑，本领域普通技术人员可以容易地决定合适量。

在某些实施方案中，免疫刺激组合可以进一步包括抗原。当存在于免疫刺激组合中时，抗原可以以这样的量施用，与组合的其他组分组合，所述量有效产生针对抗原的免疫应答。例如，抗原可以以约100ng/kg-约100mg/kg的量施用。在许多实施方案中，抗原可以以约10μg/kg-约10mg/kg的量施用。在某些实施方案中，抗原可以以约1mg/kg-约5mg/kg的量施用。然而，构成有效产生免疫应答的量的抗原的具体量在某种程度上依赖于特定因素，例如待施用的具体抗原；待施用的具体TLR激动剂及其量；待施用的具体TNF/R激动剂及其量；免疫***状态；TLR激动剂、TNF/R激动剂和抗原的施用方法和次序；制剂待施用于其的物种；和所需治疗结果。因此，一般阐述构成有效量抗原的量是不实际的。然而，根据此种因素的适当考虑，本领域普通技术人员可以容易地决定合适量。

当存在时，抗原可以与免疫刺激组合的任何组分同时或顺次施用。因此，抗原可以单独或与一种或多种佐剂(包括例如，TLR激动剂、1型干扰素和/或TNF/R激动剂)混合施用。在某些实施方案中，抗原可以就一种佐剂而言同时施用(例如，在混合物中)，但就一种或多种另外佐剂而言顺次施用。

抗原和免疫刺激组合的其他组分的顺次共施用可以包括这样的情况，其中抗原和免疫刺激组合的至少一种其他组分这样施用，使得各自同时在治疗部位处存在，即使抗原和其他组分不是同时施用。抗原和免疫刺激组合的其他组分的顺次共施用还可以包括这样的情况，其中抗原或免疫刺激组合的至少一种其他组分从治疗部位处清除，但清除抗原或其他组分的至少一种细胞效应(例如，细胞因子产生、特定细胞群体活化等)在治疗部位处持续至少直至组合的一种或多种另外组分施用于治疗部位。因此，在特定情况下，本发明的免疫刺激组合可以包括从不与组合的另一种组分混合存在的一种或多种组分，这是可能的。

抗原可以是能够产生TH1免疫应答的任何材料，所述TH1免疫应答可以包括例如CD8+T细胞应答、NK T细胞应答、γ/δT细胞应答或TH1抗体应答中的一种或多种。合适的抗原包括但不限于肽；多肽；脂质；糖脂；多糖；碳水化合物；多核苷酸；朊病毒；活的或灭活的细菌、病毒或真菌；和细菌、病毒、真菌、原生动物、肿瘤衍生或生物衍生的抗原、毒素或类毒素。

此外，考虑不产生强免疫应答的特定的目前实验抗原，特别是诸如重组蛋白质、糖蛋白和肽的材料可以与本发明的佐剂组合结合使用。示例性实验亚单位抗原包括与病毒疾病相关的那些，例如腺病毒、AIDS、禽痘、巨细胞病毒、登革热、猫白血病、禽瘟、甲型肝炎、乙型肝炎、HSV-1、HSV-2、猪霍乱、A型流感、B型流感、日本脑炎、麻疹、副流感、狂犬病、呼吸道合胞病毒、轮状病毒、疣和黄热病。

在特定实施方案中，抗原可以是癌抗原或肿瘤抗原。术语癌抗原和肿瘤抗原可互换使用并且指由癌细胞区别表达的抗原。因此，癌抗原可以用于区别靶向针对癌细胞的免疫应答。癌抗原因此可以有效刺激肿瘤特异性免疫应答。特定癌抗原可以由正常细胞编码，尽管不一定由正常细胞表达。这些抗原中的某些可以表征为在正常细胞中通常沉默的(即，不表达的)，仅在分化的特定阶段时表达的那些、和暂时表达的那些(例如，胚胎和胎儿抗原)。其他癌抗原可以由突变型细胞基因编码，例如癌基因(例如，活化的ras癌基因)、抑制基因(例如，突变型p53)、或起因于内部缺失或染色体易位的融合蛋白。另外其他的癌抗原可以由病毒基因编码，例如由RNA和DNA肿瘤病毒携带的那些。

癌症或肿瘤和与此种肿瘤相关(但并非唯一地)的特异性肿瘤抗原，包括急性成淋巴细胞性白血病(etv6、aml1、亲环素b)、B细胞淋巴瘤(Ig同种型)、神经胶质瘤(E-钙粘蛋白、α-连环蛋白、β-连环蛋白、γ-连环蛋白、p120ctn)、膀胱癌(p21ras)、胆管癌(p21ras)、乳腺癌(MUC家族、HER2/neu、c-erbB-2)、***(p53、p21ras)、结肠癌(p21ras、HER2/neu、c-erbB-2、MUC家族)、结肠直肠癌(结肠直肠癌抗原(CRC)-CO17-1A/GA733、APC)、绒毛膜癌(CEA)、上皮细胞癌(亲环素b)、胃癌(HER2/neu、c-erbB-2、ga733糖蛋白)、肝细胞癌(甲胎蛋白)、霍奇金淋巴瘤(Imp-1、EBNA-1)、肺癌(CEA、MAGE-3、NY-ESO-1)、淋巴样细胞衍生的白血病(亲环素b)、黑素瘤(p5蛋白质、gp75、癌胚抗原、GM2和GD2神经节苷脂、Melan-A/MART-1、cdc27、MAGE-3、p21ras、gp100.sup.Pmel117)、骨髓瘤(MUC家族、p21ras)、非小细胞肺癌(HER2/neu、c-erbB-2)、鼻咽癌(Imp-1、EBNA-1)、卵巢癌(MUC家族、HER2/neu、c-erbB-2)、***癌(***特异性抗原(PSA)及其抗原表位PSA-1、PSA-2和PSA-3、PSMA、HER2/neu、c-erbB-2、ga733糖蛋白)、肾癌(HER2/neu、c-erbB-2)、宫颈和食道鳞状细胞癌(病毒产物例如人***瘤病毒蛋白质)、睾丸癌(NY-ESO-1)和T细胞白血病(HTLV-1表位)。

包括抗原的本发明的免疫刺激组合可以形成疫苗。此种疫苗可以包含本领域技术人员众所周知的另外药学上可接受的成分、赋形剂、载体等。

本发明的免疫刺激组合可以根据本领域技术人员众所周知的常规方法(例如，经口、皮下、经鼻、局部)施用于动物，例如哺乳动物(人和非人)、家禽等。

本发明还提供了包括给受试者施用本发明的免疫刺激组合的治疗和/或预防方法。

除非提供了特定施用顺序，否则免疫刺激组合的组分可以与抗原同时施用(一起在混合物中或分开地，例如经口或通过分开注射)或在施用免疫刺激组合的一种或多种其他组分后施用。例如，TLR激动剂或1型干扰素和TNF/R激动剂可以与彼此同时施用或就彼此而言顺次施用。此外，当抗原作为免疫刺激组合的组分存在时，它可以与组合的任何其他组分同时施用，或就组合的任何其他组分而言顺次施用。

免疫刺激组合的组分可以以任何次序同时或顺次施用。当组分同时施用时，它们可以在单个制剂或在不同制剂中施用。当作为不同制剂施用时，无论同时还是顺次，组分可以在单个部位或分开部位处施用。此外，当作为不同制剂施用时，每种制剂可以使用不同途径进行施用。合适的施用途径包括但不限于经皮或经粘膜吸收、注射(例如，皮下、腹膜内、肌内、静脉内等)、摄食、吸入等。当顺次施用时，组分施用之间的时间可以至少部分由特定因素决定，例如特定组分持续的时间长度，全身或在施用部位处；或组分的细胞效应持续的时间长度，全身或在施用部位处，即使在组分已清除后。

特定小分子IRM化合物可以诱导抗病毒细胞因子的生物合成。因此，对于包括活病毒抗原和小分子IRM化合物作为免疫刺激组合的TLR激动剂组分的特定实施方案，可能希望在施用IRM化合物前施用抗原，从而使得可以建立病毒感染。

在一个方面，本发明的方法可以包括施用包括本发明的免疫刺激组合的疫苗，以在受试者中诱导TH1免疫应答。如上所述，特定小分子IRMs单独可以用作疫苗佐剂。包括TLR激动剂(例如，小分子IRM)和TNF/R激动剂的免疫刺激组合可以提供比任一抗原单独、与TLR激动剂组合的抗原、或与TNF/R激动剂组合的抗原大得多的免疫应答。在某些情况下，与TLR激动剂或TNF/R激动剂比较，包括TLR激动剂和TNF/R激动剂的免疫刺激组合可以协同增加免疫应答。

本发明的方法还包括诱导来自免疫***的细胞的免疫应答，不管细胞是在体内还是离体。因此，本发明的免疫刺激组合可以用作治疗疫苗的组分、预防疫苗的组分、或作为在离体细胞培养中使用的免疫刺激因子。当用于引发离体免疫应答时，离体活化的免疫细胞可以再引入患者内。备选地，在细胞培养中由活化免疫细胞分泌的因子(例如，抗体、细胞因子、共刺激因子等)可以收集用于研究、预防或治疗用途。

本发明的方法还包括在体内以抗原特异性方式活化初始CD8+T细胞。响应抗原和免疫刺激组合的共施用产生的活化抗原特异性CD8+T细胞群体——无论抗原明确地是免疫刺激组合的组分或不是——可以分成2个功能上不同的亚群。抗原特异性CD8+T细胞的一个群体包括在提供细胞介导的免疫应答中主动衔接(例如参与)的效应T细胞——CD8+T细胞。抗原特异性CD8+T细胞的第二个群体包括记忆T细胞、CD8+T细胞，其自身不涉及提供免疫应答，但在与相同抗原的随后接触后可以容易地诱导以成为抗原特异性效应细胞。根据下述方法活化CD8+T细胞可以诱导抗原特异性CD8+效应T细胞的扩增、产生抗原特异性CD8+记忆T细胞、或两者。

包括抗原的免疫刺激组合可以施用于受试者。在受试者中充分温育后，CD8+T细胞将响应免疫接种而成熟为抗原特异性CD8+效应T细胞。与仅用抗原、抗原和TNF/R激动剂、或抗原和TLR激动剂免疫接种的受试者比较，更大百分比的CD8+效应T细胞在用免疫刺激组合免疫接种的受试者中将是抗原特异性的，所述免疫刺激组合包括TLR激动剂和TNF/R激动剂。一般地，免疫接种和CD8+效应T细胞的产生之间的温育时间为约4天-约12天。在特定实施方案中，CD8+效应T细胞可以在免疫接种后约5天产生。在其他实施方案中，CD8+效应T细胞可以在免疫接种后约7天产生。

如果抗原是蛋白质，那么可能不需要给受试者施用完整蛋白质。因此，包括给受试者施用本发明的免疫刺激组合的方法可以用于引发在受试者的CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)的抗原特异性应答。此种应答可以针对许多病状，包括例如肿瘤和病毒感染的细胞群体。在本发明的某些实施方案中，本发明的疫苗可以预防施用，以给受试者提供针对例如肿瘤和/或病毒感染的保护性抗原特异性细胞介导的免疫。

在一个备选实施方案中，本发明的免疫刺激组合可以用于在体内发展抗原特异性CD8+记忆T细胞。抗原特异性CD8+记忆T细胞在第二次暴露于抗原后可能能够产生二次TH1免疫应答。CD8+效应T细胞可以在再暴露于抗原后短至2小时内由再活化的CD8+记忆T细胞产生。第二次暴露于抗原可以通过免疫接种(即，加强免疫接种)或天然暴露。

本发明的免疫刺激组合可以用于治疗上处理可通过细胞介导的免疫应答治疗的病状。此种组合可以包含至少治疗有效量的TLR激动剂和治疗有效量的TNF/R激动剂。在许多实施方案中，治疗组合可以进一步包括治疗有效量的抗原。

治疗组合可以以与一种或多种药学上可接受的载体的进一步组合提供。因为TLR激动剂和/或1型干扰素、TNF/R激动剂和抗原(如果存在于组合中)可以顺次、在不同位点和/或通过不同途径共施用，所以治疗组合可以在2种或更多制剂中提供。当在2种或更多制剂中提供时，每种制剂可以包括与其余制剂中包括的一种或多种载体相似或不同的载体。备选地，TLR激动剂、和/或1型干扰素、TNF/R激动剂和抗原(如果存在于组合中)可以在单个制剂中提供，所述单个制剂可以包括单个载体或载体组合。

每种组分或组分的混合物可以以任何合适的方便剂型施用，例如片剂、锭剂、肠胃外制剂、糖浆剂、软膏剂、软膏、气溶胶制剂、皮肤贴剂、粘膜贴剂等。

治疗免疫刺激组合可以在治疗方案中作为单个治疗剂施用。备选地，本发明的治疗免疫刺激组合可以与本发明的另一种治疗组合、与一种或多种药物组合物、或与其他活性试剂例如抗病毒剂、抗生素、另外的IRM化合物等组合施用。

因为它们诱导TH1免疫应答且产生CD8+效应T细胞库的能力，所以本发明的特定免疫刺激组合可以特别用于治疗病毒疾病和肿瘤。这种免疫调节活性暗示本发明的免疫刺激组合和疫苗在治疗病状中有用，所述病状例如但不限于：

(a)病毒疾病，例如，起因于经由下述病毒感染的疾病：腺病毒属、疱疹病毒属(例如，HSV-I、HSV-II、CMV或VZV)、痘病毒属(例如，正痘病毒属例如天花或牛痘、或触染性软疣)、细小RNA病毒属(例如，鼻病毒或肠道病毒)、正粘病毒属(例如，流感病毒)、副粘病毒属(例如，副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒和呼吸道合胞病毒(RSV))、冠状病毒属(例如，SARS)、乳多空病毒属(例如，***瘤病毒，例如引起生殖器疣、寻常性疣或足底疣的那些)、嗜肝性DNA病毒属(例如，乙型肝炎病毒)、黄病毒属(例如，丙型肝炎病毒或登革病毒)、或逆转录病毒属(例如，慢病毒例如HIV)；

(b)细菌疾病，例如，起因于通过细菌感染的疾病，例如埃希氏杆菌属(Escherichia)、肠杆菌属(Enterobacter)、沙门氏菌属(Salmonella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、志贺氏菌属(Shigella)、李斯特菌属(Listeria)、气杆菌属(Aerobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链球菌属(Streptococcus)、衣原体属(Chlamydia)、支原体属(Mycoplasma)、肺炎球菌属(Pneumococcus)、奈瑟球菌属(Neisseria)、梭菌属(Clostridium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、弧菌属(Vibrio)、沙雷氏菌属(Serratia)、普罗威登斯菌属(Providencia)、色杆菌属(Chromobacterium)、布鲁氏菌属(Brucella)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、或博德特氏菌属(Bordetella)；

(c)其他感染性疾病，例如衣原体，霉菌病包括但不限于念珠菌病、曲霉菌病、组织胞浆菌病、隐球菌性脑膜炎，或寄生虫病包括但不限于疟疾、卡氏肺囊虫肺炎、利什曼病、隐孢子虫病、弓形体病、和锥虫感染；和

(d)肿瘤性疾病，例如，上皮内瘤变、宫颈发育不良、光化性角化病、基底细胞癌、鳞状细胞癌、肾细胞癌、卡波济氏肉瘤、肺癌、黑素瘤、肾细胞癌、白血病包括但不限于粒细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、和毛细胞白血病、和其他癌症(例如，上文提及的癌症)；和

(e)TH2介导的、特应性和自身免疫疾病，例如特应性皮炎或湿疹、嗜酸性粒细胞增多症、哮喘、过敏症、变应性鼻炎、全身性红斑狼疮、原发性血小板增多症、多发性硬化症、Ommen′s综合征、盘状狼疮、斑秃、瘢痕形成和其他类型疤痕的抑制，且增强伤口愈合，包括慢性伤口。

本发明的免疫刺激组合的某些实施方案还可以用作疫苗佐剂用于与任何材料结合使用，所述材料产生体液和/或细胞介导的免疫应答，例如活病毒、细菌或寄生虫抗原；灭活病毒、肿瘤衍生的、原生动物、生物衍生的、真菌、或细菌抗原、类毒素、毒素；自身抗原；多糖；蛋白质；糖蛋白；肽；细胞疫苗；DNA疫苗；重组蛋白质；糖蛋白；肽；等，用于与例如下述结合使用，例如，BCG、霍乱、瘟疫、伤寒、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、A型流感、B型流感、副流感、脊髓灰质炎、狂犬病、麻疹、腮腺炎、风疹、黄热病、破伤风、白喉、流感嗜血杆菌(Hemophilus influenza)b、肺结核、脑膜炎球菌和肺炎球菌疫苗、腺病毒、HIV、禽痘、巨细胞病毒、登革热、猫白血病、禽瘟、HSV-1和HSV-2、猪霍乱、日本脑炎、呼吸道合胞病毒、轮状病毒、***瘤病毒、黄热病和阿尔茨海默氏病。

本发明的免疫刺激组合还可以特别帮助具有妥协的免疫功能的个体。例如，IRM化合物可以用于治疗在例如移植患者、癌症患者和HIV患者中在细胞介导的免疫抑制后发生的条件性感染和肿瘤。

本发明还提供了治疗动物中的病毒感染的方法和治疗动物中的肿瘤性疾病的方法，其包括给动物施用治疗有效量的本发明的免疫刺激组合。治疗或抑制病毒感染的治疗有效量是与未经治疗的对照动物比较，将引起病毒感染的一种或多种表现中的减少的量，所述表现例如病毒损伤、病毒载量、病毒产生速率和死亡率。***性病状的组合的治疗有效量是与未经治疗的动物比较，将引起例如肿瘤大小中的减少、肿瘤病灶数目中的减少、或减缓肿瘤生长的量。

在一个具体实施方案中，本发明的免疫刺激组合可以用于抑制体内肿瘤生长。具有表达特定抗原的肿瘤细胞的受试者可以用治疗组合进行免疫接种，所述治疗组合包含TLR激动剂、TNF/R激动剂和任选地抗原。在某些实施方案中，治疗可以包括初次免疫接种和二次加强免疫接种。取自用本发明的治疗组合免疫接种的受试者的肿瘤一般小于从(a)未免疫接种的受试者、或(b)仅用抗原免疫接种的受试者收获的肿瘤。

根据本发明的治疗可以包括一次或超过一次免疫接种。当治疗包括超过一次免疫接种时，治疗可以包括以任何合适频率施用的任何合适次数的免疫接种。免疫接种在治疗方案中的次数和频率至少部分依赖于一种或多种因素，包括但不限于待治疗的病状及其阶段、受试者的免疫***状态、待施用的具体TLR激动剂或1型干扰素及其量、待施用的具体TNF/R激动剂及其量、和待施用的具体抗原(如果存在)及其量。

如所述的，在某些实施方案中，本发明的治疗组合可能不需要抗原组分。对于特定病状(例如，B细胞淋巴瘤或慢性细菌或病毒感染)，有效治疗可以使用不包括抗原的免疫刺激组合获得。此种病状可以以这种方式治疗，因为例如，病状可以提供足够量或各种病状特异性抗原，以产生能够治疗病状的细胞介导的免疫应答。

TLR激动剂和/或1型干扰素和TNF/R激动剂以有效增加针对特定抗原的免疫应答的量和以其中TNF-R激动剂作为单一疗法可以引发肝脏毒性的剂量提供(或施用，对于免疫刺激组合形式合适的)。

例如，TLR激动剂可以以约100ng/kg-约100mg/kg的量施用。在许多实施方案中，TLR激动剂以约10μg/kg-约10mg/kg的量施用。在某些实施方案中，TLR激动剂以约1mg/kg-约5mg/kg的量施用。然而，构成有效增加针对特定抗原的免疫应答的量的TLR激动剂的具体量在某种程度上依赖于特定因素，包括但不限于待施用的具体TLR激动剂；待施用的具体抗原及其量；待施用的具体TNF/R激动剂及其量；免疫***状态(例如，抑制、妥协、刺激)；TLR激动剂、TNF/R激动剂和抗原的施用方法和次序；制剂待施用于其的物种；和所需治疗结果。因此，一般阐述构成有效量TLR激动剂的量是不实际的。然而，根据此种因素的适当考虑，本领域普通技术人员可以容易地决定合适量。

此外，例如，TNF/R激动剂可以以约100ng/kg-约100mg/kg的量施用。在特定实施方案中，TNF/R激动剂以10μg/kg-约10mg/kg的量施用。在某些实施方案中，TNF/R激动剂以约1mg/kg-约5mg/kg的量施用。然而，构成有效增加针对特定抗原的免疫应答的量的TNF/R激动剂的具体量在某种程度上依赖于特定因素，包括但不限于待施用的具体TNF/R激动剂；待施用的具体TLR激动剂及其量；待施用的具体抗原及其量；免疫***状态；TLR激动剂、TNF/R激动剂和抗原的施用方法和次序；制剂待施用于其的物种；和所需治疗结果。因此，一般阐述构成有效量TNF/R激动剂的量是不实际的。然而，根据此种因素的适当考虑，本领域普通技术人员可以容易地决定合适量。

相比之下，在某些实施方案中，免疫刺激组合可以进一步包括抗原。当存在于免疫刺激组合中时，抗原可以以这样的量施用，与组合的其他组分组合，所述量有效产生针对抗原的免疫应答。例如，抗原可以以约100ng/kg-约100mg/kg的量施用。在许多实施方案中，抗原可以以约10μg/kg-约10mg/kg的量施用。在某些实施方案中，抗原可以以约1mg/kg-约5mg/kg的量施用。

然而，构成有效产生免疫应答的量的抗原的具体量在某种程度上依赖于特定因素，例如待施用的具体抗原；待施用的具体TLR激动剂及其量；待施用的具体TNF/R激动剂及其量；免疫***状态；TLR激动剂、TNF/R激动剂和抗原的施用方法和次序；制剂待施用于其的物种；和所需治疗结果。因此，一般阐述构成有效量抗原的量是不实际的。然而，根据此种因素的适当考虑，本领域普通技术人员可以容易地决定合适量。

当存在时，抗原可以与免疫刺激组合的任何组分同时或顺次施用。因此，抗原可以单独或与一种或多种佐剂(包括例如，TLR激动剂和/或1型干扰素、TNF/R激动剂、或其组合)混合施用。在某些实施方案中，抗原可以就一种佐剂而言同时施用(例如，在混合物中)，但就一种或多种另外佐剂而言顺次施用。

抗原和免疫刺激组合的其他组分的顺次共施用可以包括这样的情况，其中抗原和免疫刺激组合的至少一种其他组分这样施用，使得各自同时在治疗部位处存在，即使抗原和其他组分不是同时施用。抗原和免疫刺激组合的其他组分的顺次共施用还可以包括这样的情况，其中抗原或免疫刺激组合的至少一种其他组分从治疗部位处清除，但清除抗原或其他组分的至少一种细胞效应(例如，细胞因子产生、特定细胞群体活化等)在治疗部位处持续至少直至组合的一种或多种另外组分施用于治疗部位。因此，在特定情况下，本发明的免疫刺激组合可以包括从不与组合的另一种组分混合存在的一种或多种组分，这是可能的。

本发明还提供了包括给受试者施用本发明的免疫刺激组合的治疗和/或预防方法。

在某些实施方案中，方法和组合物可以通过包括来自感染因子的抗原用于治疗处于具有感染的危险中或具有感染的个体。感染指可归于在宿主中存在的外来生物或因子的疾病或病状，所述生物或试剂在宿主内繁殖。处于具有感染的危险中的受试者是易于发展感染的受试者。此种个体可以包括例如具有已知或怀疑暴露于感染性生物或因子的受试者。处于具有感染的危险中的受试者还可以包括具有与建立针对感染性因子或生物的免疫应答的受损能力相关的病状的受试者，例如具有先天性或获得性免疫缺陷的受试者，经历辐射或化学疗法的受试者，具有烧伤损伤的受试者，具有跌打损伤的受试者、经历手术、或其他侵入性医学或牙科操作的受试者，或相似地免疫妥协的个体。

可以用本发明的疫苗组合物治疗或预防的感染包括细菌、病毒、真菌和寄生虫的。还包括的其他较不常见类型的感染是立克次氏体、支原体以及引起绵羊疯痒病、牛海绵状脑病(BSE)和朊病毒病(例如库鲁病和克-雅二氏(Creutzfeldt-Jacob)病)的因子。感染人的细菌、病毒、真菌和寄生虫的例子是众所周知的。感染可以是急性、亚急性、慢性或潜伏的，并且它可以是局限性或全身性的。此外，感染在感染性生物的因子在宿主中的生命周期的至少一个阶段过程中可以占优势地是细胞内或细胞外的。

主题疫苗和方法可以针对其使用的细菌感染包括革兰氏阴性和革兰氏阳性菌。革兰氏阳性菌的例子包括但不限于巴斯德菌属物种(Pasteurella spp.)、葡萄球菌属物种和链球菌属物种。革兰氏阴性菌的例子包括但不限于大肠埃希杆菌(Escherichia coli)、假单胞菌属物种和沙门氏菌属物种。感染性细菌的具体例子包括但不限于Heliobacter pyloris、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)、分枝杆菌属物种(例如，结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、鸟分枝杆菌(M.avium)、M.intracellilare、堪萨斯分枝杆菌(M.kansaii)、戈登分枝杆菌(M.gordonae))、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)、单核细胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogeners)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、(A族链球菌)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B族链球菌)、链球菌属(草绿色族)、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、牛链球菌(streptococcus bovis)、链球菌属(aenorobic.spp)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、病原性弯曲杆菌属物种、肠球菌属物种(Enterococcus spp.)、流感嗜血杆菌、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、白喉杆菌(Corynebacterium diptheriae)、棒状杆菌属物种、Erysipelothrix rhusiopathie、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、多杀性巴斯德菌(Pasteurella multocida)、拟杆菌属物种(Bacteroides spp.)、具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)、念珠状链杆菌(Streptobacillus moniliformis)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)、细弱密螺旋体(Treponemapertenue)、钩端螺旋体属(Leptospira)、立克次氏体属(Rickettsia)和衣氏放线菌(Actinomyces israelii)。

在人中引起感染的病毒的例子包括但不限于，逆转录病毒科(Retroviridae)(例如，人缺陷病毒，例如HIV-1(也称为HTLV-III)、HIV-II、LAC或IDLV-III/LAV或HIV-III和其他分离物例如HIV-LP、细小RNA病毒科(Picornaviridae)(例如，脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎、肠道病毒、人柯萨奇病毒、鼻病毒、埃可病毒)、(Calciviridae)(例如，引起胃肠炎的毒株)、披膜病毒科(Togaviridae)(例如，马脑炎病毒、风疹病毒)、黄病毒科(Flaviviridae)(例如，登革病毒、脑炎病毒、黄热病病毒)、冠状病毒科(Coronaviridae)(例如，冠状病毒)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)(例如，vesicularstomata viruses、狂犬病病毒)、纤丝病毒科(Filoviridae)(例如，埃博拉病毒)、副粘液病毒科(Paramyxoviridae)(例如，副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如，流感病毒)、布尼亚病毒科(Bungaviridae)(例如，哈坦病毒、bunga病毒、phleoboviruses和内罗病毒)、沙粒病毒科(Arena viridae)(出血热病毒)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)(例如，呼肠孤病毒、环状病毒、轮状病毒)、双股双节RNA病毒科(Bimaviridae)、嗜肝病毒科(Hepadnaviridae)(乙型肝炎病毒)、细小病毒科(Parvoviridae)(细小病毒)、乳多空病毒科(Papovaviridae)(***瘤病毒、多瘤病毒)、腺病毒科(Adenoviridae)(腺病毒)、疱疹病毒科(Herpeviridae)(例如，单纯疱疹病毒(HSV)I和II、水痘带状疱疹病毒、痘病毒)和虹膜病毒科(Iridoviridae)(例如，非洲猪瘟病毒)和无类别的病毒(例如，海绵状脑病的病原体、丁型肝炎的因子、非甲型非乙型肝炎的因子(1类肠传播的；2类肠胃外传播的例如丙型肝炎)；诺瓦克病毒和相关病毒和星状病毒)。

真菌的例子包括曲霉菌属物种(Aspergillus spp.)、粗球孢子菌(Coccidoides immitis)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、白色念珠菌(Candida albicans)和其他念珠菌属物种(Candida spp.)、Blastomyces dermatidis、荚膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、诺卡氏属物种(Nocardia spp.)和Pneumocytis carinii。

寄生虫包括但不限于血液感染和/或组织寄生虫，例如焦虫(Babesia microti)、(Babesi divergans)、溶组织内阿米巴(Entomoeba histolytica)、Giarda lamblia、热带利什曼原虫(Leishmania tropica)、利什曼原虫属物种(Leishmania spp.)、巴西利什曼原虫(Leishmania braziliensis)、Leishmania donovdni、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、三日疟原虫(Plasmodiummalariae)、卵形疟原虫(Plasmodium ovale)、间日疟原虫(Plasmodiumvivax)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、冈比亚锥虫(Trypanosomagambiense)和罗德西亚锥虫(Trypanosoma rhodesiense)(非洲昏睡病)、克鲁斯锥虫(Trypanosoma cruzi)(Chagus′病)和刚地弓形虫、扁形动物和蛔虫。

如所述的，本发明进一步包含主题治疗方案和组合物在治疗增生性疾病例如癌症中的用途。癌症是不受控制的细胞生长的病状，所述细胞干扰身体器官和***的正常功能。具有癌症的受试者是在受试者的体内存在具有可客观测量的癌细胞的受试者。处于发展癌症的危险中的受试者是易于发展癌症的受试者，例如基于家族史、遗传素质、受试者暴露于辐射或其他引起癌症的试剂。从其最初位置转移且在重要器官中播种的癌症可以通过受累器官的功能衰退最终导致受试者的死亡。造血***癌症例如白血病能够竞争出(out-compete)受试者中的正常造血区室，从而导致造血失败(以贫血、血小板减少症和嗜中性白血球减少症的形式)，最终引起死亡。

转移是与原发性肿瘤位置不同的癌细胞区域，起因于癌细胞从原发性肿瘤播散到身体的其他部分。在原发性肿瘤肿块诊断时，受试者可以就转移灶的存在进行监控。通常通过磁共振成像(MRI)、计算机断层摄影(CT)、扫描、血液和血小板计数、肝功能研究、胸透和骨扫描的单独或联合使用加上特异性症状的监控检测转移。

根据本发明包含的佐剂组合和组合物可以用于治疗各种癌症或处于发展癌症的危险中的受试者，通过包括肿瘤相关抗原(TAA)或编码DNA。这是在肿瘤细胞中表达的抗原。此种癌症的例子包括乳腺、***、结肠、血液癌症例如白血病、慢性淋巴细胞性白血病等。本发明的疫苗接种方法可以用于刺激免疫应答，以通过抑制或减缓肿瘤的生长或减少肿瘤的大小来***。肿瘤相关抗原还可以是通过肿瘤细胞占优势但不是唯一地表达的抗原。

另外的癌症包括但不限于基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脑和中枢神经***(CNS)癌症、***、绒毛膜癌、结肠直肠癌、***癌、消化***癌症、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、头与颈癌、胃癌、上皮内肿瘤、肾癌、喉癌、肝癌、肺癌(小细胞、大细胞)、淋巴瘤包括霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤；黑素瘤；成神经细胞瘤；口腔癌(例如，唇、舌、口和咽)；卵巢癌；胰腺癌；成视网膜细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸***癌症；肉瘤；皮肤癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫癌；泌尿***癌症；以及其他癌症和肉瘤。

根据本发明包含的佐剂组合和组合物还可以用于治疗自身免疫疾病，例如多发性硬化症、类风湿性关节炎、1型糖尿病、牛皮癣或其他自身免疫病症。潜在地可以用本发明的疫苗和免疫佐剂治疗的其他自身免疫疾病包括克罗恩氏病和其他炎性肠病例如溃疡性结肠炎、全身性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性脑脊髓炎、重症肌无力(MG)、桥本氏甲状腺炎、古德帕斯彻氏综合征、天疱疮、格雷夫斯病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少性紫癜、具有抗胶原抗体的硬皮病、混合性***病、polypyositis、恶性贫血、特应性阿狄森氏病、自身免疫相关不育症、肾小球肾炎(例如，新月形成性肾小球肾炎、增生性肾小球肾炎)、大疱性类天疱疮、干燥综合征、牛皮癣关节炎、胰岛素抗性、自身免疫型糖尿病(1型糖尿病；胰岛素依赖性糖尿病)、自身免疫性肝炎、自身免疫性血友病、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自身免疫性肝炎、自身免疫性血友病、自身免疫性淋巴细胞增生综合征、自身免疫性uveoretinitis、和吉-巴(Guillain-Bare)综合征。近来，动脉硬化和阿尔茨海默氏病已识别为自身免疫疾病。因此，在本发明的这个实施方案中，抗原将是针对其宿主引发不希望有的免疫应答的自身抗原，所述免疫应答促成组织破坏和正常组织损害。

根据本发明包含的佐剂组合和组合物还可以用于治疗哮喘以及变应性和炎性疾病。哮喘是呼吸***病症，特征在于炎症和气道狭窄以及气道对吸入因子增加的反应性。哮喘是频繁地尽管并非唯一地与特应性或变应性症状相关。过敏症是获得的对物质(抗原)的超敏性。变应性病状包括湿疹、变应性鼻炎或伤风、花粉热、支气管哮喘、荨麻疹和食物过敏和其他特应性病状。变应原是可以在敏感受试者中诱导变应性或哮喘应答的物质。存在众多变应原包括花粉、昆虫毒液、动物皮毛、粉尘、真菌孢子和药物。

天然和植物变应原的例子包括对下述属特异的蛋白质：犬属、表皮螨属、猫属、豚草属、黑麦草属(Lotium)、柳杉属、链格孢属、桤木属、Alinus、桦木属、栎属、木犀榄属、蒿属、车前属、墙草属、小蠊属、蜜蜂属、柏属、刺柏属、侧柏属、扁柏属、Periplanet、Agopyron、黑麦属、小麦属、鸭茅属、羊茅属、豌豆属、燕麦属、绒毛草属、黄花茅属、燕麦草属、剪股草属、梯牧草属、虉草属、雀稗属、高粱属和Bromis。

应当理解根据本发明包含的佐剂组合和组合物可以与用于治疗特异性病状的其他疗法组合，所述特异性病状例如感染性疾病、癌症和自身免疫病状。例如，在癌症的情况下，本发明的方法可以与化学疗法或放射疗法组合。

在某些情况下，在佐剂中包括促进亲和纯化的部分可以是有利的。此种部分包括不干扰佐剂组合的功能的相对小分子。备选地，标签可以可通过切割去除。此种标签的例子包括多组氨酸标签、血凝素标签、麦芽糖酶结合蛋白、凝集素、谷胱甘肽-S转移酶、抗生物素蛋白等。其他合适的亲和标签包括FLAG、绿色荧光蛋白(GFP)、myc等。

主题佐剂组合可以与生理学上可接受的载体例如生理盐水一起施用。组合物还可以包括另一种载体或赋形剂例如缓冲剂，例如柠檬酸盐、磷酸盐、乙酸盐和碳酸氢盐，氨基酸，尿素，醇，抗坏血酸，磷脂，蛋白质例如血清白蛋白，乙二胺四乙酸，氯化钠或其他盐，脂质体，甘露醇，山梨糖醇，甘油等。本发明的佐剂可以根据相应施用途径以各种方法进行配制。例如，液体制剂可以制备用于摄食或注射、凝胶或可以制备用于摄食、吸入或局部应用的操作。用于制备此种制剂的方法是众所周知的，并且可以例如在″Remington′sPharmaceutical Sciences，″第18版，Mack Publishing Company，Easton Pa中发现。

本发明还包含基于DNA的疫苗。可能编码所需抗原和/或CD40佐剂的这些DNAs可以作为裸露DNAs施用，或可以包含在表达载体例如充当TLR激动剂的重组病毒中。此外，主题核酸序列可以在移植物的移植前引入移植物的细胞内。这个DNA优选将进行人源化，以促进在人受试者中的表达。

主题佐剂组合可以进一步包括“标记”或“报道物”。标记或报道分子的例子包括β内酰胺酶、氯霉素乙酰转移酶、腺苷脱氨酶、氨基糖苷磷酸转移酶、二氢叶酸还原酶、潮霉素B-磷酸转移酶、胸苷激酶、lacZ和黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶等。

主题佐剂可以通过包含一种或多种载体的细胞进行表达，所述载体能够指导抗原或TNF-R激动剂和/或1型干扰素或TLR激动剂的表达，例如用载体转导的细胞。例如，可以使用杆状病毒载体。可以使用的其他载体包括基于T7的载体用于在细菌、酵母表达载体、哺乳动物表达载体、病毒表达载体等。病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、腺相关载体、疱疹病毒、猴病毒40和牛***瘤病毒载体。此外，可以利用细菌和酵母表达载体。

本领域技术人员可以容易地选择合适组分用于特定表达***，包括适合于所需细胞或生物的表达载体、启动子、可选标记等。各种表达***的选择和使用可以例如在Ausubel等人，″Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley and Sons，New York，N.Y.(1993)；和Pouwels等人，Cloning Vectors：A Laboratory Manual″：，1985Suppl.1987)中发现。还提供的是包含且表达主题DNA构建体的真核细胞。

在细胞移植物的情况下，细胞可以通过植入操作或用导管介导的注射操作通过血管壁进行施用。在某些情况下，细胞可以通过释放到脉管***内进行施用，从其中细胞随后通过血流进行分配和/或移动到***组织内。

在CD40激动剂作为TNF-R激动剂的情况下，此种激动剂将优选包含特异性结合CD40的激动性抗CD40抗体或其片段，优选鼠类或人CD40、或CD40L蛋白质、衍生物、多聚体例如三聚CD40L或4-1BB配体缀合物。如本文所使用的，术语“抗体”以其最广泛含义使用，以包括多克隆和单克隆抗体，及其抗原结合片段。这包括Fab、F(ab′)2、Fd和Fv片段。

本发明目前进一步基于下述实施例进行描述。

实施例

材料与方法

小鼠和肿瘤细胞系

雄性6-8周大的C57BL/6小鼠得自National Cancer Institute(Bethesda，MD)，并且维持在无病原体条件下。所有实验得到Institutional Animal Care and Use Committee of DartmouthCollege批准。B16.F10黑素瘤细胞是来自Mary Jo Turk(Dartmouth-Hitchcock Medical Center，Lebanon，NH)的友情赠与，并且维持在完全培养基(包含10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、2mM谷氨酰胺和50μM 2-巯基乙醇的RPMI 1640)中。

细胞系、抗体和试剂

针对CD8(53-6.7)、CD4(GK1.5)、CD44(IM7)、CD127(A7R34)、CD122(5H4)、IL-2(JES6-5H4)、IFN(XMG1.2)、FoxP3(FJK-16s)、Granzyme B(16G6)的小鼠单克隆抗体(mAbs)，和同种型对照大鼠IgG2a购自eBioscience(San Diego，CA)，因为都是布雷菲德菌素A和莫能星。抗CD107a(1D4B)购自BD Pharmingen(San Jose，CA)。抗TNF(MP6-XT22)购自Invitrogen(Carlsbad，CA)。重组人IL-2购自Peprotech(Rocky Hill，NJ)。抗CD40(FGK45)购自BioExpress(Lebanon，NH)。内毒素含量小于1EU/mg，如通过定量生色鲎阿米巴样细胞溶解物试剂盒(QCL 1000；Cambrex，East Rutherford，NJ)。TLR7激动剂S-27609是来自3M Pharmaceuticals(St Paul，MN)的礼物，并且先前已得到描述。 ⁸ 由杂交瘤产生抗CD4(GK1.5)、抗CD8(2.43)和抗NK1.1(PK136)，并且使用标准方法纯化生物反应器上清液。H2K^b-限制的I类肽Ova_(257-264)(SIINFEKL)和TRP2_(180-188)(SVYDFFVWL)以及经修饰的TRP2表位V(SIYDFFVWL)购自Pepceuticals(Nottingham，United Kingdom)，并且超过90％纯。肽以5mg/mL溶解于DMSO中，并且随后在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释用于免疫接种。

细胞制备

在疫苗接种后的各个时间，取出组织用于分析。使脾均质化成单细胞悬浮液，并且经由眶后采血或心脏穿刺将外周血收集到肝素管内。红血细胞用ACK Lysing Buffer(BioSource，Rockville，MD)进行裂解。为了从转移靶器官中分离淋巴细胞，取出肺并且用包含417.5μg/mL Liberase CI(Roche，Indianapolis，IN)和200μg/mL DNA酶I(Roche)的RPMI注射，切碎并且在经过细胞过滤器前于37℃温育30分钟。细胞进行洗涤并且重悬浮于80％Percoll中，用40％Percoll覆盖，并且在400g下离心25分钟。收集位于80％/40％界面处的细胞，洗涤并且通过Guava(Guava Technologies，Hayward，CA)进行计数。

肿瘤攻击和疫苗接种

小鼠用10⁵B16.F10黑素瘤肿瘤细胞进行静脉内注射，以建立肺转移灶。4天后，新生或荷瘤小鼠用100μg V肽、100μg抗CD40和100μg TLR7激动剂S-27609以所示各种组合进行静脉内疫苗接种。约20天后收集肺，并且借助于解剖显微镜计数转移灶。备选地，经过接下来90天就存活监控小鼠。

细胞子集的体内耗尽

通过腹膜内施用250μg抗CD4(GK1.5)、抗CD8(2.43)和抗NK1.1(PK136)来完成淋巴细胞子集的耗尽。在实验开始前4天和其后每周递送抗体。通过流式细胞术证实耗尽，并且导致相关细胞类型的超过95％减少。

流式细胞术

使单细胞悬浮液与用FITC、PE、PerCP、PC5或APC标记的抗体一起温育。如在“细胞系、抗体和试剂”下列出的抗体来自eBioscience、BD Pharmingen和Invitrogen。在经修饰的Becton Dickinson FACSCAN运行的CellQuest软件(BD Bioscience)上执行4色分析。

细胞内细胞因子染色和脱颗粒测定法

使来自肺、脾或外周血(外周血淋巴细胞[PBLs])的细胞与1μg/mL Ova_(257-264)和TRP2_(180-188)肽加上10U/mL IL-2和3μg/mL布雷菲德菌素A一起在完全培养基中于37℃温育5-18小时。在固定和使得可渗透前，细胞用PerCp或PC5标记的抗CD8和FITC标记的抗CD44抗体进行染色，随后用PE或APC标记的抗IFN(XMG1.2)、PE标记的抗TNF(MP6-XT22)、PE标记的抗IL-2(JES6-5H4)、FITC标记的抗CD127(A7R34)、或PE标记的抗颗粒酶B(16G6)染色。通过扣除用无关肽对照观察到的本底计算IFN⁺细胞百分比。对于脱颗粒测定法，细胞如上所述进行处理，但在最初5-18小时温育期过程中包括莫能星和2.5μg/mL FITC标记的抗CD107a(1D4B)。

体内细胞毒性测定法

如先前所述执行体内细胞裂解活性。(8)简言之，初始同基因脾细胞用0.5μM或5μM羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE；Molecular Probes，Eugene，OR)于37℃区别标记10分钟，洗涤，并且随后分别与20μg/mL无关Ova_(257-264)(SIINFEKL)或抗原特异性TRP2_(180-188)肽一起脉冲1小时。标记和脉冲的细胞随后以1∶1比混合，并且静脉内注射约10⁷细胞。1天后，杀死小鼠，并且通过流式细胞术分析脾细胞。通过首先测定关于每只小鼠的SIINFEKL标记的靶数目与TRP2标记的靶数目比计算特异性裂解，并且随后如下计数抗原特异性裂解百分比：特异性裂解％＝(1-[初生小鼠中的CFSE^lo/CFSE^hi比÷免疫接种小鼠中的CFSE^lo/CFSE^hi比])x100。

血清转氨酶和组织学分析

通过测量血清肝脏酶活性生物化学评估肝细胞损害。特别地，小鼠静脉内接受100μg抗CD40、100μg S-27609或两者或作为对照的PBS。24-72小时后收获血清，并且通过在National Jewish MedicalCenter Core Lab(Denver，CO)的标准临床分析测定丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平。对于组织学分析，来自如上所述处理的小鼠的肝在缓冲***中固定，在石蜡中包埋，切片，并且在编码前用苏木精和伊红(H&E)染色，并且以不知情方式在0-4量表上评分。数字得分如下指定：肝：0指示正常肝，未注意到损伤或肝细胞损害；1，罕见的门静脉和实质浸润但无坏死；2，中等实质或门静脉浸润但无坏死；3，频繁和/或大门静脉或实质浸润伴随偶然分离的凝固性坏死岛；和4，广泛炎症区域伴随桥接凝固性坏死。经由Olympus·BX41显微镜(Center Valley，PA)使用与OlympusDP11数码相机附着的20x/0.05非油物镜和10x目镜获取H&E图像，并且用XnView for Windows，版本1.82.2(Reims，France)进行编辑。

统计分析

[00162]数据表示为平均值加上或减去SEM，并且除非另有说明，组间差异通过单尾ANOVA和Tukey分析进行分析。在肿瘤存活实验的情况下，使用时序比较测定统计关联性。在任意量表上评分肝炎程度，并且使用曼-怀二氏检验分析所得到的非参数数据。小于.05的概率(P)值视为统计上显著的。

实施例1

使用CD40/TLR7激动剂和肿瘤特异性肽引发高频率的肿瘤特异性、效应CD8⁺T细胞。

本发明人先前证实CD40和TLR激动剂的共施用协同增强针对外来抗原的抗原特异性CD8⁺T细胞扩增。(8)在本文中我们进一步显示可以诱导针对自身抗原的类似高频率的CD8⁺T细胞。近来，H2K^b限制的黑素瘤排斥自身抗原TRP2_(180-188)经修饰的肽变体，称为V(SIYDFFVWL)，显示引发高亲和力TRP2特异性CD8⁺T细胞。(17)我们推论用V加上激动性CD40抗体(CD40)和TLR7激动剂(TLR7*)的免疫接种将放大后续的CD8⁺应答，并且产生增加的效应细胞功能。如图1B中可见，CD40增加免疫接种小鼠的外周血中的CD8⁺T细胞的相对数目，与抗原、TLR7激动剂或两者的添加无关(与单独的V比较，关于V/CD40、V/CD40/TLR7*、和CD40/TLR7*的P.001)。尽管CD40增加多克隆CD8⁺应答，但它无法产生TRP2特异性CD8⁺T细胞的大量群体(图1A，C)。仅肿瘤抗原、CD40和TLR7激动剂的组合导致TRP2特异性T细胞的协同扩增。为了测量细胞裂解潜力，评估这些细胞脱颗粒的能力，这可以通过在细胞表面上CD107a(溶酶体相关膜蛋白质-1)的保留进行测量。(18)CD107a的细胞表面表达与细胞裂解活性直接相关。(19，20)在CD40或TLR7激动剂单独组中的仅约4％和约2％CD8⁺细胞分别表达CD107a。然而，通过这个测量用CD40和TLR7激动剂引发的超过30％CD8⁺细胞表达细胞裂解活性(与单独的V比较，P.001)。组合处理还导致体内细胞毒性测定法中肽脉冲靶的增加裂解(数据未显示)。总之，这些数据证实CD40和TLR7激动剂的组合诱导高频率和高总数目的具有细胞裂解功能的自身反应性CD8⁺T细胞。

实施例2

通过CD40和TLR7的伴随信号传导驱动具有增强细胞裂解功能的自身抗原特异性CD8⁺T细胞的扩增。

C57BL/6小鼠用100μg肿瘤相关抗原V、100μg CD40 FGK45和100μg S-27609以所示组合进行静脉内免疫接种。7天后，给小鼠采血并且细胞在体外用TRP2_(180-188)进行再刺激，以评估产生IFN和转移CD107a的能力，如“方法”中所述。淋巴细胞通过正面和侧面散射进行鉴定，并且随后对所有CD8⁺事件进行门控。(A)来自疫苗接种小鼠的代表性点图。在右上角中的数目指示对于IFN和CD44(顶端行)或IFN和CD107a(底部行)阳性的CD8⁺T细胞的频率。(B)表达CD8抗原的外周血淋巴细胞的百分比。经由单尾ANOVA的P.001(C)响应肽再刺激脱颗粒的CD8⁺细胞百分比的定量。在所有情况下，呈现的数据代表至少3次独立实验。数据作为平均值加上或减去SEM(在每个组中n＝8)进行标绘。经由单尾ANOVA的P.001。

实施例3

CD40/TLR7*疫苗接种引发有效的CD8⁺T细胞记忆

假定CD40和TLR激动剂的共施用将取消基于激动性CD40的单一疗法的有害作用，以产生长期记忆。为了测定与肿瘤抗原结合的CD40和TLR7激动剂的伴随递送是否引发CD8⁺T细胞记忆的产生，给小鼠接种疫苗，并且在60+天后分析效应子功能。用V和CD40的免疫接种引发在肺中具有有限细胞裂解潜力的最低限度的、持续CD8⁺效应子群体(图2A，B，D)。TLR7单一疗法无法诱导持续抗原特异性CD8⁺T细胞的显著库。相比之下，用肿瘤抗原、CD40和TLR7激动剂的疫苗接种引发脾和肺的效应细胞群体(图2A，C，D)。更重要的是，与CD40或TLR7*单一疗法不同，当实施体内细胞毒性测定法时，用这种方案疫苗接种的小鼠有效裂解肽脉冲的靶(图2B，E；P.001，与V或V/CD40比较)。此外，IFN染色的平均荧光强度增加超过由单独的CD40处理可见的(脾：185±30对310±22，P＝.0041；肺：152±6对253±25，P＝.0028)，证实由CD40/TLR7*引发的CD8⁺T细胞在产生效应细胞因子方面更有效。最后，仅CD40/TLR7*加上肿瘤抗原可以诱导自身免疫白癜风，在约36％疫苗接种的小鼠中可见的应答(数据未显示)。为了确保TRP2特异性记忆T细胞群体的鉴定，就CD127(IL-7R)的表达检查CD8⁺T细胞，显示为在效应细胞分化成记忆细胞后选择性再表达的标记。(21)。事实上，从脾和肺中分离的TRP2特异性CD8⁺T细胞表达CD127(图2F)。细胞不仅表达CD127，它们还是完全功能的，能够产生TNF和IL-2。在肺和脾中发现的IFN⁺细胞中，超过70％分泌TNF同时超过20％分泌IL-2(图2G)。此外，因为这些细胞的部分获得分泌IL-2和表达CD127的能力，所以这指示这种疫苗接种方案产生效应子和关键记忆表型的记忆细胞。(22)

实施例4

与CD40单一疗法形成对比，CD40/TLR7*疗法援救CD8⁺记忆T细胞功能。

小鼠用各100μg的V肽、CD40和S-27609以所示组合进行免疫接种。65天后评估记忆CD8⁺功能性。(A)通过从疫苗接种小鼠的脾和肺中分离的记忆CD8⁺T细胞的IFN分泌的代表性点图。点图对活CD8⁺细胞进行门控，并且数目指示对于IFN和CD44阳性的细胞百分比。(B)通过执行体内细胞毒性测定法评估记忆CD8⁺T细胞的细胞裂解活性。数目反映抗原特异性裂解的百分比。(C，D)在脾(C)和肺(D)中表达IFN的记忆CD8⁺细胞的相对和绝对数目的定量。通过每个细胞群体的相对百分比乘以从每种组织中分离的细胞总数目测定阳性细胞的绝对数目。(E)在实验对象组B中呈现的体内细胞毒性测定法的定量。经由单尾ANOVA的P.001。(F)在得自疫苗接种小鼠的脾或肺的IFN⁺-记忆CD8⁺T细胞上的CD127表达。同种型对照显示为填充直方图。(G)通过记忆CD8⁺T细胞的细胞因子产生。来自实验对象组F的细胞就产生TNF和IL-2的能力进行分析。数目反映还对于TNF或IL-2阳性的CD8⁺IFN⁺细胞百分比。在所有情况下，数据由至少2次独立实验中合并，在每次实验中具有4只或更多小鼠/组，并且作为平均值(±SEM)进行标绘。

实施例5

与转移性黑素瘤的对照中的单一疗法比较CD40/TLR7*免疫疗法的极佳疗效。

比较了不同疫苗接种策略改变转移性黑素瘤的进展的能力。小鼠用10⁵转移性B16.F10黑素瘤细胞进行静脉内接种，并且4天后开始处理。疫苗接种后24天，杀死小鼠，并且计数表面肺转移灶。用肿瘤抗原或肿瘤抗原加上TLR7激动剂的处理在控制肿瘤进展方面无效(图3A，B)。用肿瘤抗原加上CD40的免疫接种减少肿瘤结节的数目(P.001对单独的V)。然而，给这种疫苗添加TLR7激动剂导致转移灶数目中超过单独的CD40的3倍减少(图3B；P.01对V/CD40)。此外，通过CD40/TLR7*提供的保护依赖于抗原，因为H2K^b肽，V的去除取消处理的效应(图3A，B)。这个保护对于TLR7激动剂不是独特的，因为用TLR3和TLR9激动剂观察到相等功效(数据未显示)。此外，改变疫苗接种途径并未显著改变处理结果(图S1，在Blood网站上可获得；参见在线文章顶部上的Supplemental Materials链接)。因为CD40/TLR7*疫苗接种减少肺转移灶的数目，所以询问联合免疫疗法是否将提供针对转移性疾病的长期保护。用肿瘤抗原、肿瘤抗原加上TLR7激动剂、或不含肿瘤抗原的CD40/TLR7激动剂疫苗接种的所有小鼠死于肺衰竭(图3A)。平均存活时间分别是29、30和30天。CD40单一疗法使存活时间显著增加超过具有35天的中值存活时间的单独肿瘤抗原(P.001)，并且导致超过90天的3％小鼠存活。然而，肿瘤抗原加上CD40/TLR7*的组合使存活极大地改善超过单独的CD40(P.001)。中值存活时间从35增至47天，在90天后其中20％小鼠活着(还参见图S2中的Kaplan-Meier图)。为了测定哪个细胞子集在这个疫苗接种方案下介导转移性黑素瘤的排斥，在肿瘤攻击前使小鼠耗尽CD8⁺、CD4⁺和NK1.1⁺细胞。CD8⁺细胞的耗尽取消疫苗接种的保护效应(图3C；与无需耗尽的疫苗接种比较P＝.001)。CD4⁺和NK1.1⁺细胞在肿瘤保护中起部分作用，因为它们的耗尽导致略微更快，尽管不是显著的肿瘤进展(图3C)。这些数据指示在抗原的存在下，与联合免疫疗法的疫苗接种导致能够介导抗肿瘤应答的CD8⁺T细胞依赖性免疫应答大于用基于CD40或TLR的单一疗法可见的。

实施例6

本发明的CD40/TLR7*治疗减缓转移性黑素瘤的进展。

C57BL/6小鼠用10⁵转移性B16.F10黑素瘤细胞进行静脉内攻击。4天后，小鼠用100μg肿瘤相关抗原V、100μg CD40FGK45和100μg S-27609以所示组合进行疫苗接种。24天后，杀死小鼠，取出肺，并且借助于解剖显微镜计数转移性表面肿瘤结节。(A)在肿瘤攻击后24天，在小鼠肺上的肉眼可见肿瘤结节的照片。在肺下的数目反映就治疗效果监控的小鼠平均存活时间和长期存活率。数据由3-4次独立实验合并，在每次实验中具有超过8只小鼠/组。(B)肺转移灶的计数。数据由2次独立实验合并，并且呈现为平均值加上或减去SEM(在每个组中n＝16只小鼠)。数据代表超过4次分开实验，在每次组中具有至少6只小鼠。(C)在效应细胞耗尽后肺转移灶的计数。小鼠如上所述进行处理，除了在肿瘤攻击前耗尽效应细胞群体外，如“方法”中所述。数据表示为平均值加上或减去SEM(在每个组中n＝8只小鼠)，并且代表3次独立实验。

实施例7

在CD40/TLR7*免疫疗法后的肺浸润增强伴随细胞裂解潜力

为了获得CD40/TLR7*免疫疗法为何介导更佳的抗肿瘤免疫的了解，在肿瘤攻击后10和21天后执行肺浸润的动力学分析(图4A)。在离体下肽再刺激后对从荷瘤肺中分离的淋巴细胞实施细胞内细胞因子染色。仅肿瘤抗原加上CD40或CD40/TLR7*疫苗接种引发肿瘤特异性CD8⁺T细胞以转移到转移靶器官内(图4B)。V/CD40/TLR7*疫苗接种的小鼠的流式细胞术分析揭示，经过CD40单一疗法在第10天时肿瘤特异性CD8⁺T细胞的相对百分比中的5倍增加和在第21天时的3倍增加。在绝对范围上，CD40驱动多克隆T细胞移动到疫苗接种小鼠的肺内，与TLR刺激无关，但这个应答伴随时间减弱(图4C，D)。相比之下，抗原特异性细胞仍升高，而CD40/TLR7*在2个时间点上诱导更大的绝对应答(在2个时间点上在V/CD40/TLR7*和V/CD40之间的P.001)。此外，由CD40/TLR7*疫苗接种产生的细胞显示细胞裂解潜力，如通过脱颗粒和颗粒酶B表达测量的(图4E)。

实施例8

肺浸润淋巴细胞的动力学分析。

这个实施例涉及图4中的实验。在图4(A)中显示的是实验设计，并且图4(B)包含在肿瘤攻击后第10或21天时从转移靶器官中分离的淋巴细胞的代表性点图。如“方法”中所述从荷瘤肺中分离细胞，并且用肿瘤肽实施体外再刺激。图对活的、CD8⁺细胞进行门控。右上象限中的数目反映对于IFN和活化标记CD44阳性的CD8⁺T细胞的频率。数据代表3次独立实验，在每次实验中具有4只小鼠/组。(C，D)在肿瘤攻击后第10(C)或21(D)天时的肺浸润的定量。数据作为平均值(±SEM)进行标绘，并且代表来自2次(C，n＝8只小鼠/组)或3次(D，n＝12只小鼠/组)独立实验的合并数据，在每次实验中具有4只小鼠/组。(E)在肿瘤接种后第10或21天时从用肿瘤抗原加上CD40/TLR7*进行疫苗接种的小鼠的肺中分离的CD8⁺T细胞的效应子表型。点图首先对肝脏CD8⁺细胞进行门控，并且随后进一步对IFN⁺CD44⁺群体进行门控。数据代表至少2次独立实验，在每次实验中具有4只小鼠/组。

实施例9

疫苗效果必须超过调节T细胞的效应，并且CD8⁺/FoxP3⁺细胞比已用于评估引发强度。(23)在第10天时，联合疗法导致抗原特异性CD8⁺T细胞与FoxP3⁺细胞的绝对数目中的10倍增加，而CD40单一疗法导致3倍增加(图4C)。已显示FoxP3^-″src＝″/math/rarr.gif′border＝0 FoxP3⁺T转化中的优化减少需要用CD40和TLR激动剂使DCs成熟。这些数据支持其中联合免疫疗法介导增加的抗肿瘤免疫的一种方法是通过扩增CD8⁺T细胞数目和效应子功能同时减少免疫抑制效应的假设。

实施例10

CD40诱导的肝细胞损伤通过TLR7激动剂的共施用得到减少。

使用CD40单一疗法的显著剂量限制性安全关注之一是肝脏毒性。使用CD40激动剂的几项人(24)和动物(24)^{\1″B25″\1″B26″}(27)研究报告升高水平的循环肝细胞酶ALT和AST，指示肝脏损害。为了检查用单一疗法与联合疗法比较肝细胞损害的严重度，测量在疫苗接种后小鼠中的ALT和AST血浆水平(图5A，B)。2种转氨酶在用CD40处理的小鼠中显著升高，在处理后48小时时达到顶点。TLR7*对酶水平无影响。与CD40单一疗法形成对比，CD40/TLR7*处理完全取消用单独的CD40可见的毒性。肝脏的肉眼评估揭示大量坏死区域，仅在用CD40处理的小鼠中观察到的发现(数据未显示)。组织学分析证实肝细胞损害的严重度(图5C-F)。在用PBS处理的小鼠中可见正常肝结构(图5C)。从用CD40处理的小鼠中分离的肝脏显示广泛桥接的凝固性坏死(图5D)，而TLR7*处理导致微量炎症无任何可观察的凝固性坏死(图5E)。来自接受CD40/TLR7*的小鼠的肝脏具有某些炎症病灶，但很少或无凝固性坏死(图5F)。组织学损害的程度随后在半定量列表上进行评分(图5G)。数据揭示TLR7*显著减少与CD40单一疗法相关的肝脏毒性(P＝.026)。尽管TLR7*减弱CD40诱导的毒性的原因不明，但已显示毒性中的这个逆转是TLR7依赖性的，因为当用CD40或CD40/TLR7*处理时，MyD88KO和TLR7KO小鼠都具有相似的ALT和AST酶水平(数据未显示)。最后，虽然关于CD40/TLR7*联合疗法在逆转毒性中的分子和细胞机制仍不明了，并且需要进一步研究，但它不仅提供更佳的治疗后果还使不利副作用降到最低。

实施例11

与CD40单一疗法相关的肝毒性由TLR7激动剂逆转。

这个实施例涉及图5中的实验。图5(A，B)包含血清转氨酶的动力学分析。小鼠用PBS、100μg CD40、100μg TLR7*或两者进行静脉内处理。在之后的各个时间点上分离血清，并且如所述的测量丙氨酸转氨酶(A)或天冬氨酸转氨酶(B)的血清水平。数据代表3次独立实验，在每个时间点上具有n＝3-8只小鼠/组。(C-F)用PBS(C)、100μg CD40(D)、100μg TLR7*(E)、或100μg CD40和100μg TLR7*(F)处理48小时的肝脏的组织学分析。(G)来自如上所述处理48小时的小鼠的肝脏中的组织病理学改变的半定量评估。数据由2次独立实验合并，在每个处理组中具有n＝6只小鼠。经由曼-怀二氏非参数检验的P＝.026。

实施例12

通过TLR激动剂或IFNa与CD40激动剂的共施用取消肝脏毒性

这个实施例涉及图6和7中的实验。其中通过测量血清肝脏酶活性生物化学评估肝细胞损伤。具体地，小鼠i.v.接受100mg抗CD40、100mg S-27609或两者。在某些情况下，小鼠还接受分级剂量的重组干扰素-α(通常，一百万国际单位/小鼠)。24-72小时后收获血清，并且送到Charles River Laboratories(Worcester，MA)用于肝脏化学特征分析。备选地，血清样品通过National Jewish MedicalCenter ore Lab(Denver，CO)进行分析。

结论

尽管过去10年已见证了癌症靶抗原鉴定中的指数增长，但用于开发人佐剂以有效针对这些靶免疫的相似步伐已落后。Toll样受体及其配体以及控制适应性免疫的受体-配体的分子鉴定已提供第一种合逻辑的、基于假设的策略，以分子调合佐剂以便引发针对癌症的保护性免疫应答。与TLRs在动员先天性免疫应答中的重要性平行，CD40及其配体是用于发展适应性免疫应答的关键激活物。我们的数据显示与关于CD40的激动剂使用组合的、活化特异性TLRs的定义明确的激动剂的使用引发针对限定肽的深远的细胞介导的免疫应答，所述免疫应答达到或超过用最有效的病毒载体可见的。基于这些观察，已使用这个CD40/TLR平台，并且已显示它在黑素瘤治疗中可以是治疗上有效的。假设这2种激动剂影响作为靶的树突状细胞(DC)，并且诱导独特地使DC有能力驱动深远的CMI应答的功能特征。尽管我们并未完全了解为何这些DCs在诱导CMI中如此有效，但我们显示用TLR*和□CD40触发的DCs的分子标记不同于在体内用单独的任一试剂触发的DCs。

可能对抗癌症的方法中最弱的方面之一是缺乏这样的佐剂，其可以引发针对癌症相关抗原的强烈、长效免疫。过去，已依赖于看起来诱导炎症的试剂的使用。Alum是氢氧化铝和磷酸盐的盐并且主要引发体液介导的免疫应答。这种佐剂首先在1926年采用并且在1938年FDA首次负责新药审批权时有效免受限制。Alum是唯一FDA批准的佐剂，并且是许多目前使用的疫苗如tentanus类毒素的组分。存在在癌症临床试验中已采用的许多其他佐剂(非细胞因子)，如卡介苗(BCG)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、不完全弗氏佐剂(IFA)，所有这些的作用机制了解很少并且具有适度的佐剂活性。直到1999年阐明关于免疫佐剂的受体(Toll样受体)的第一项研究出现，才分子了解免疫***的这些“非特异性”激活物如何触发先天性免疫。

TLRs是在造血和非造血细胞上表达的1型膜蛋白。目前，在TLR家族中存在11个成员。这些受体的特征在于其识别由致病性生物表达的病原体相关分子模式(PAMP)的能力。一般的PAMPS包括LPS、DNA(CpG)、脂蛋白、ssRNA和糖脂，如下表1中描述的。是否存在关于TLRs的真正内源配体仍有争议，尽管已报告TLR2和TLR4能够识别几种自身蛋白质包括热休克蛋白家族的成员hsp60和hsp70。

一般地，TLR的触发通过增强的细胞因子生产(IL12、IL18等)、趋化因子受体表达(CCR2、CCR5和CCR7)和共刺激分子表达来引发深远的免疫应答。像这样，这些受体在先天性免疫***中发挥对随后的获得性免疫应答的极性的控制。

关于CD40(CD40L、gp39)的配体CD154是肿瘤坏死因子家族的32-39kD成员，所述家族包括TNF-α、淋巴毒素、FasL、CD30L、CD27L、4-1BBL和OX-40L。活化CD4T细胞是负责CD154表达的占优势细胞类型。CD154在CD8⁺T细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞、NK细胞和DCs上的表达已得到描述。关于CD154的受体——CD40是肿瘤坏死因子受体(TNF-R)超家族的成员，所述超家族包括TNF-RI(p55)、TNF-RII(p75)、p75神经营养因子受体、fas、CD30、CD27、4-1BB和OX-40。它是组织分布最初被认为限制于B细胞、DCs(DC’s)和基底上皮细胞的50-kDa膜蛋白，然而，随后的研究已显示CD40在单核细胞/巨噬细胞、小神经胶质细胞和内皮细胞上的功能表达。

关于分离的DCs的体外研究已显示CD40触发改变细胞因子(IL12、IL15)趋化因子(IP10、MIP-1αMIP-1β和IL-8)、共刺激分子表达(CD80、CD86)和趋化因子受体的表达。所有这些效应以CD40活化DCs刺激增强的T细胞增殖和分化的能力而终结。我们自己的数据显示与TNF□和RANKL比较，CD154对早期信号传导、细胞因子产生和趋化因子产生发挥大得多的深远影响。DCs的CD40触发的一个其他关键影响是肽-MHCII周转中的改变。Lanzavecchia已使用LPS显示并且我们已使用sCD154由CD40激动剂使DCs成熟显示促进MHCII-肽复合物在DCs表面上的累积。来自我们实验室和其他的研究指出CD40看起来是在体内关于DCs的关键长寿信号。已假定DC长寿对于CD4⁺T细胞应答延长的克隆扩增是必需的。我们感觉CD40信号传导对DC长寿的影响是当TLR和CD40激动剂组合使用中观察到的协同作用的关键特征，并且将在下文讨论。概括来说，不存在CD40激动剂在体外和体内诱导DCs中的深远生物改变的怀疑。然而，假定这些改变并不持久、无效且不足以“许可”DC真正触发有效的CMI应答。

CD40激动剂在不存在CD4⁺T细胞的情况下引发CMI的成功产生使用CD40激动剂作为用于癌症疫苗的佐剂的基本热情。经由Glennie和同事的一系列研究显示可以使用□CD40达到CD40⁺淋巴瘤的肿瘤消退，但抗CD40的剂量极高(250ug/天，第2-5天)，并且奇怪的是，免疫接种所需的肿瘤接种物极高(5×10⁷/小鼠)。然而，这些CD40⁺淋巴瘤的临床消退是令人印象深刻的。较不令人印象深刻的是关于其为CD40^-的血液***肿瘤的研究。可能关于CD40⁺淋巴瘤和白血病的成功是由于CD40激动剂对肿瘤的直接作用。对于淋巴瘤和白血病，□CD40还可以增强其APC活性，并且同时增强其凋亡。然而，通过这个相同团体的随后研究的确证实CD40激动剂可以对实体瘤发挥有利的疗效。对于实体瘤，许多研究已显示CD40活化促进凋亡性死亡并且CD40表达是促成肿瘤细胞消除的肿瘤特异性T细胞应答产生中的重要因素。其他团体，如Melief和同事的团体已显示CD40激动剂单独或TLR激动剂单独可以在体内引发对表达(CD40-)肿瘤的Ad5E1A的有效治疗(肿瘤类型未描述)。使用肾细胞癌模型，Mur phy和同事已显示只有激动性□CD40和IL-2的组合而不是任一单独施用的试剂在大多数处理小鼠中诱导转移性肿瘤的完全消退和对后续再攻击的特异性免疫。在这时，用CD40激动剂单独的功效是无法预测的。不清楚在肿瘤上的CD40表达是否重要，肿瘤负荷是否重要，CD40单独是否足够以及□CD40治疗在液体或实体瘤中的功效是否存在特征性差异。我们将讨论当与TLR激动剂一起使用时，CD40激动剂将诱导高水平的肿瘤特异性免疫，并且避免用□CD40单一疗法在不同肿瘤模型中可见的特性。

CD40是用于诱导增强的CMI应答用于肿瘤保护目的的合理靶，然而，在文献中的数据暗示它无法在广泛范围的肿瘤中应用。我的实验室已努力工作多年以试图开发使用□CD40作为单一疗法以增强保护性肿瘤免疫的一般方法，并且失败了。广泛测试了抗体剂量、时间测定、接种途径、肿瘤类型、不同单抗等的任何和所有参数，然而，这些努力证明是无益的，除了在B淋巴瘤和白血病模型中，如由Glennie报告的。来自Kedl和同事的近期研究已使某些重要参数更清楚，当使用CD40激动剂时，所述参数可能影响保护性CTL的产生。使用针对SIINFYKL特异性CTL的四聚体染色和OVA转导的B16，他们显示□CD40激动剂实际上加速SIINFYKL特异性CTL的丧失。然而，如果免疫接种用携带SIINFYKL微基因的痘病毒来完成，那么使用□CD40激动剂观察到增强的CTL扩增。结论是如果这些肿瘤抗原在病毒载体中或在炎症的背景中递送，那么针对肿瘤抗原的长期免疫接种仅通过CD40激动剂得到增强。因此，在无数肿瘤模型的结果中的极大差异可能是由于与□CD40激动剂协作的辅炎症介质的非故意添加。

此种体内研究导致关于通过CD40激动剂活化DCs的辅信号的需求的许多近期报告。公开的研究以及待在初步数据部分中呈现的那些，显示CD40衔接(例如参与)单独不足以在体外和体内诱导通过DCs的IL12p70产生。通过评估关于p40和p35的mRNA，本发明人显示经由TLR(STAg，来自猪弓形体的提取物)和CD40的共衔接(例如参与)对于增强的p35mRNA表达和IL12p70产生是关键的。这项研究随后为使用人DCs的研究，在其中显示CpG DNA是用于在体外IL12p70产生与CD40信号传导的关键共刺激(51)。总之，这些是证明CD40是驱动DC成熟的DC特定方面必需但不足够的首批研究。然而，他们未提供CD40和TLR激动的组合作用是猛烈引发CMI必需的强说服力证据。

CD40和TLR激动之间的协同问题通过定量TLR或CD40衔接(例如参与)或TLR/CD40衔接(例如参与)对OVA特异性四聚体⁺细胞在体内扩增的影响直接解决。我们已显示□CD40、TLR7激动剂(S27609)和OVA(蛋白质或肽)的施用可以诱导OVA特异性CD8⁺T细胞的产生(参见初步数据部分中的例子)。到第6天时，抗原特异性T细胞可以代表整个CD8⁺T细胞群体的超过25％。测试的所有TLR激动剂与抗CD40协作并且诱导有效的抗原特异性CTL活性。这些发现支持先天性和获得性免疫的联合触发使诱导有效的效应T细胞的能力达到最大的假设，并且设定关于使用这种技术作为在癌症免疫疗法中的疫苗平台的阶段。

在小鼠和人中的研究已显示CD40激动剂单独的施用诱导毒性。在完整小鼠中，已显示CD40激动剂诱导肝脏毒性。在免疫缺陷小鼠和非致命性照射的小鼠中，CD40激动剂的施用诱导致死性。在我们用□CD40和TLR激动剂(或IFNa)的组合施用的研究过程中，发现TLR激动剂或IFNa在体内加入用□CD40处理的小鼠解决了毒性。因此，IFNa或TLR激动剂与CD40激动剂的共施用应解决在CD40激动剂的临床使用中观察到的毒性。

此外，关于先天性和适应性免疫的分子触发器的鉴定将改革关于疫苗的佐剂平台。然而，在不存在另一个的情况下一个免疫途径的分离活化可能是毒性、无效的，并且在某些情况下对长期、保护性免疫的发展是有害的。更有效的分子改造的疫苗将可能包括触发多个免疫途径的试剂的组合。(28，29)我们的研究证实与任一单元佐剂比较，组合中的CD40和TLR激动剂引发(1)高频率的自身反应性、效应CD8⁺T细胞，(2)有效的、肿瘤特异性CD8⁺记忆，(3)有效浸润转移靶器官且发挥效应子功能的CD8⁺T细胞，(4)优良的治疗效果，(5)在肿瘤部位处增强的CD8⁺T细胞与FoxP3⁺T细胞比，和(6)减少的肝毒性。

加强的肿瘤特异性CD8⁺T细胞的频率已成为关于许多人临床试验的主要终末点(13)，并且被认为是保护性抗肿瘤免疫的出现中的必要组分。由CD40/TLR激动剂和抗原的组合施用引发肿瘤特异性CD8⁺T细胞的频率比用几乎任何其他佐剂或基于细胞的疫苗平台例如抗原脉冲的DCs观察到的那种高1个数量级。(30)^\1″B31″-(32)尽管关于这种惊人应答的细胞和分子基础并未完全了解，但我们已公开CD70在DCs上的表达对于CD8⁺T细胞扩增是关键的。(9)CD70在CD8^-DCs上的加强表达仅在CD40和TLR激动剂都共施用时诱导。通过CD70/CD27后续增加的信号传导可以说明在疫苗接种后可见的优良记忆应答。(33)我们的数据暗示当经由CD40和TLR在体内触发时，CD8^-DCs获得交叉呈递可溶性抗原的能力，并且这非常可能促成抗原特异性CD8⁺T细胞的极高频率。总之，我们目前的假设是CD40/TLR7*增加抗原加工和交叉呈递的效率，从而促进增强的CD8⁺T细胞引发和记忆。本文呈现的数据使用肽抗原，并且像这样，绕过交叉呈递途径。然而，有趣的是推测CD40/TLR激动可能促进在肽疫苗接种后表位扩展至备选肿瘤抗原。

抗CD40作为单元佐剂已显示终止体液(34)和细胞介导的免疫(16)应答。尽管CD40单一疗法可能提供最低限度的短期免疫增强，但研究已显示它缩短了CD8⁺T细胞记忆的产生。(14)有趣的是，甚至对于体液记忆，CD40激动剂的使用使长期记忆和长寿浆细胞的产生异常终止。(17)在通过Murphy和同事的近期研究中(Berner等人(14))，CD40单一疗法导致IFN依赖性肿瘤特异性CD4⁺T细胞的凋亡，且不能设定针对肿瘤攻击的保护性记忆应答。许多CD40单克隆抗体已进入临床。(2，4，35)^{\1″B36″\1″B37″}(38)其中仅一个(2)已报告是强激动剂，类似于在本文以及大量其他鼠类研究中使用的例如抗鼠类CD40。(39，40)在那个1期研究中，发现各自具有IV期黑素瘤的4个患者在研究结束时再分期后具有部分应答。尽管作出关于激动性CD40单一疗法(2)作为疫苗平台的任何结论性阐述可能过早，但在小鼠中的临床前研究暗示当与先天性免疫的激活物组合时，它作为疫苗将更有效。即使不是用于临床功效，CD40单一疗法的毒性可能由其他免疫激活物的添加得到改善。其中激动性CD40单一疗法可能合适的一种指示是在B细胞淋巴瘤中，其中在小鼠中，高剂量单一疗法已显示极其有效(40，41)。

动物模型中的研究揭示作为单元佐剂，TLR激动剂可以引发强的、炎症应答并且增强广泛范围的特异性免疫应答。(42)用TLR激动剂的临床研究结果已混合(43)咪喹莫特，FDA批准的局部应用的TLR7激动剂，已证明在基底细胞癌极其有效。此外，使用TLR4激动剂的2种改善的成人乙型肝炎病毒(HBV)疫苗已得到批准。然而，在2007年6月，Pfizer延缓了关于TLR9激动剂在非小细胞肺癌中的临床计划，由于缺乏当与各种化学治疗剂组合时在2和3期试验中的临床功效。(44)我们的数据强烈暗示至少在癌症适应症中，适应性免疫的激活物将极大增加TLR激动剂的治疗潜力。

用TNFR激动剂和TLR激动剂的单臂试验已显示在很大程度上是安全的并且诱导炎症应答是令人鼓舞的。基于使用TLR激动剂、TNFR激动剂和其他免疫激活物的混合物在小鼠中新出现的临床前研究，预期这些混合物将极大改善在临床试验中的功效，并且同时减少毒性。增强频率的原代效应T细胞、潜在的长期免疫记忆、和减少的调节T细胞功能是对于成功的治疗干预可能需要达到的某些标志终末点。这个和其他研究(45)的发现提供用于产生多因子疫苗以达到在人中的癌症疫苗试验中的最大功效的合理策略。

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应当理解，不实质影响本发明的各实施方式的活性的修饰是在本文所提供的本发明的定义之内的。

本文所引用的各种杂志、专利以及其他出版物的所指包括技术状况，并以全文的方式纳入本文。

Claims (27)

1.改善的治疗方案，其中所述被改善的治疗方案涉及以作为单一疗法施用时在某些受试者中引发肝脏毒性的剂量施用至少一种TNF-R激动剂，其中所述改善包含进一步施用足以使所述肝脏毒性消除或减少基于肝脏酶水平测定的至少50％的量的至少一种1型干扰素和/或TLR激动剂，。

2.权利要求1的方案，其中所述TNF-R激动剂是CD40激动剂。

3.权利要求2的方案，其中所述CD40激动剂是具有CD40激动性活性的激动性抗体或片段或单体或多聚CD40L多肽或变体或片段或缀合物。

4.权利要求1的方案，其中所述TLR激动剂是选自TLR1、TLR2、TLR 3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11和TLR12的TLR的激动剂。

5.权利要求1的方案，其中所述TLR激动剂是酵母或细菌原生质球、胞质体、膜或亚细胞颗粒。

6.权利要求1的方案，其中所述TNF-R激动剂是CD40激动剂，其以作为单一疗法引发肝脏毒性的量的至少2倍的剂量施用。

7.权利要求1的方案，其中所述TNF-R激动剂是CD40激动剂，其以作为单一疗法引发肝脏毒性的量的至少5倍的剂量施用。

8.权利要求1的方案，其中所述TNF-R激动剂是CD40激动剂，其以作为单一疗法引发肝脏毒性的量的至少10倍的剂量施用。

9.权利要求1的方案，其进一步包括施用将引发针对其的免疫应答的抗原。

10.权利要求9的方案，其中所述抗原是病毒、细菌、真菌或寄生虫抗原。

11.权利要求9的方案，其中所述抗原是人抗原。

12.权利要求11的方案，其中所述人抗原是癌抗原、自身抗原或其表达关联或牵涉慢性人疾病的其他人抗原。

13.权利要求10的方案，其中所述病毒抗原对选自下述的病毒特异：HIV、疱疹、***瘤病毒、埃博拉、细小RNA、肠道病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、禽流感病毒、狂犬病病毒、VSV、登革病毒、肝炎病毒、鼻病毒、黄热病病毒、bunga病毒、多瘤病毒、冠状病毒、风疹病毒、埃可病毒、痘病毒、水泡带状疱疹、非洲猪瘟病毒、流感病毒和副流感病毒。

14.权利要求10的方案，其中所述细菌抗原得自选自下述的细菌：沙门菌属、埃希氏杆菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属、弧菌属、弯曲杆菌属、Heliobacter、欧文氏菌属、疏螺旋体属、暗杆菌属(Pelobacter)、梭菌属、沙雷氏菌属、Xanothomonas、耶尔森菌属、Burkholdia、李斯特菌属、志贺氏菌属、巴斯德菌属、肠杆菌属、棒状杆菌属和链球菌属。

15.权利要求10的方案，其中所述寄生虫抗原得自选自下述的寄生虫：巴贝虫属、Entomoeba、利什曼原虫属、疟原虫属、锥虫属、弓形虫属、Giarda、扁形动物和蛔虫。

16.权利要求10的方案，其中所述真菌抗原得自选自下述的真菌：曲霉菌属、Coccidoides、隐球菌属、念珠菌属、诺卡氏菌属、肺囊虫属和衣原体属。

17.权利要求9的方案，其中所述抗原是由选自下述的人癌症表达的癌抗原：***癌、胰腺癌、脑癌、肺癌(小或大细胞)、骨癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、睾丸癌、皮肤癌、淋巴瘤、白血病、结肠癌、甲状腺癌、***、头与颈癌、肉瘤、神经胶质癌和胆囊癌。

18.权利要求9的方案，其中所述抗原是其表达与自身免疫疾病相关的自身抗原。

19.权利要求1的方案，其引发抗原特异性细胞免疫应答。

20.权利要求19的方案，其中所述施用导致下述至少一种：

(i)相对于仅编码CD40激动剂或TLR激动剂或1型干扰素的DNA的施用，增强的原发和记忆CD8+T细胞应答；

(ii)诱导抗原特异性CD8+T细胞的指数扩增；和

(iii)在CD4缺陷宿主中产生与正常(非CD4缺陷)宿主可比较的保护性免疫应答。

21.权利要求1的方案，其用于治疗选自癌症、过敏症、炎性疾病、感染性疾病和自身免疫疾病的疾病。

22.权利要求21的方案，其中所述感染性疾病由病毒、细菌、真菌或寄生虫引起，并且所述TLR激动剂包含病毒、细菌、真菌或寄生虫，或其引起疾病的片段或部分，或改造为表达其抗原的病毒或微生物。

23.权利要求22的方案，其中所述病毒是HIV。

24.权利要求1的方案，其用于治疗黑素瘤。

25.权利要求1的方案，其用于治疗肺癌。

26.权利要求1的方案，其用于治疗淋巴瘤或白血病。

27.权利要求27的方案，其中所述淋巴瘤或白血病是B细胞淋巴瘤或CLL。

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