CN101775439A

CN101775439A - 一种辅助筛选不同千粒重小麦的方法及其专用标记

Info

Publication number: CN101775439A
Application number: CN 201010033991
Authority: CN
Inventors: 宿振起; 郝晨阳; 王兰芬; 董玉琛; 张学勇
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2010-01-12
Filing date: 2010-01-12
Publication date: 2010-07-14
Anticipated expiration: 2030-01-12
Also published as: CN101775439B

Abstract

本发明公开了一种辅助筛选不同千粒重小麦的方法及其专用标记。本发明公布的方法是检测待测小麦基因组DNA中序列2所示核苷酸自5′末端第2708位脱氧核糖核苷酸是A还是G，确定待测小麦的基因型是AA还是GG；所述AA基因型为序列2所示核苷酸自5′末端第2708位脱氧核糖核苷酸为A的纯合体；所述GG基因型为序列2所示核苷酸自5′末端第2708位脱氧核糖核苷酸为G的纯合体；AA基因型为小麦的优异等位变异，其千粒重和/或粒宽高于GG基因型小麦。本标记重复性好、成本低，在提高小麦千粒重(粒宽)的分子标记辅助选择和分子设计育种中具有较好的应用前景。

Description

一种辅助筛选不同千粒重小麦的方法及其专用标记

技术领域

本发明涉及一种辅助筛选不同千粒重小麦的方法及其专用标记。

背景技术

小麦是我国主要的粮食作物之一，其产量的高低直接影响人们的生活水平和国家粮食安全。随着人口的增长、耕地面积减少和粮食生产成本的不断提高，高产育种将是我国小麦育种的永恒主题。然而，目前我国小麦高产育种正处于爬坡阶段。利用先进的分子生物学技术挖掘、利用与小麦产量直接相关的功能基因，为小麦分子标记辅助育种和转基因育种贮备并提供基因资源，对提高我国小麦育种水平、加速育种进程、大幅提高小麦产量具有重要意义。

小麦产量主要由亩穗数、穗粒数和千粒重构成，在产量三要素中穗粒数与亩穗数成一定的负相关，即亩穗数多则穗粒数相对较少，反之亦然，而千粒重则相对独立。因此，小麦千粒重的提高必将是今后我国小麦单产提升的主要途径之一(胡延吉，赵檀方.小麦高产育种中粒重作用的研究.作物学报，1995，21：671-678；许为钢，胡琳，吴兆苏，盖钧镒.关中地区小麦品种产量与产量结构遗传改良的研究.作物学报，2000，26：352-358)。千粒重主要由粒长、粒宽和粒厚等因素构成，是一个典型的数量性状，受多基因控制(Ammiraju J S S，Dholakia B B，SantraD K，et al.Identification of inter simple sequence repeat(ISSR)markersassociated with seed size in wheat.Theor Appl Genet，2001，102：726-732；Groos C，Robert N，Bervas E，Charmet G.Genetic analysis of grainprotein-content，grain yield and thousand-kernel weight in bread wheat.Theor Appl Genet，2003，106：1032-1040；Huang X Q，

H，Ganal M W，

M S.Advanced backcross QTL analysis for the identification of quantitativetrait loci alleles from wild relatives of wheat(Triticum aestivum L.).TheorAppl Genet，2003，106：1379-1389；Kumar N，Kulwal P，Gaur A，Tyagi A，KhuranaJ，Khurana P，Balyan H，Gupta P.QTL analysis for grain weight in commonwheat.Euphytica，2006，151：135-144)。千粒重的三个构成要素与千粒重均呈正相关关系，且它们之间无负相关。因此，可以通过提高千粒重的任一构成要素来达到提高小麦千粒重的目的。研究结果表明，在小麦千粒重的构成因素中，粒宽对千粒重的关联度和贡献率最高(Sun X Y，Wu K，Zhao Y.QTL analysis of kernelshape and weight using recombinant inbred lines in wheat[J].Euphytica，2008，165：615-624；盖红梅.我国小麦主要品种的选择牵连效用分析[博士学位论文].北京：中国农业科学院博士学位论文，2007)。虽然在小麦中通过连锁作图的方法已经定位了若干与小麦粒重相关的QTLs(Li S S，Jia J Z，Wei X Y，ZhangX C，Chen H M，Sun H Y，et al.An intervarietal genetic map and QTL analysisfor yield traits in wheat.Mol Breed，2007，20：167-178；Kumar K，KulwalP L，Balyan H S，Gupta P K.QTL mapping for yield and yield contributingtraits in two mapping populations of bread wheat.Mol Breed，2007，19：167-177)，但由于小麦基因组庞大、研究困难，目前仍无相关基因克隆的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种辅助筛选不同千粒重小麦的方法及其专用标记。

本发明提供的辅助筛选不同千粒重小麦和/或不同粒宽小麦的方法，是如下(a)或(b)：

(a)检测待测小麦的基因组DNA中序列2所示核苷酸自5′末端第2708位脱氧核糖核苷酸是A还是G，AA基因型(优异等位变异)小麦的千粒重和/或粒宽在统计学上大于GG基因型小麦；所述AA基因型为序列2所示核苷酸自5′末端第2708位脱氧核糖核苷酸为A的纯合体；所述GG基因型为序列2所示核苷酸自5′末端第2708位脱氧核糖核苷酸为G的纯合体；

(b)检测待测小麦的基因组DNA中序列7所示核苷酸自5′末端第254位脱氧核糖核苷酸是A还是G，AA基因型小麦的千粒重和/或粒宽在统计学上大于GG基因型小麦；所述AA基因型为序列7所示核苷酸自5′末端第254位脱氧核糖核苷酸为A的纯合体；所述GG基因型为序列2所示核苷酸自5′末端第254位脱氧核糖核苷酸为G的纯合体。

序列7所示核苷酸即为序列2所示核苷酸白5’末端第2455-2872位核苷酸。

所述方法可包括基因组DNA提取、PCR扩增和酶切。

所述方法具体包括如下步骤：

(1)提取待测小麦的基因组DNA；

(2)以步骤(1)的基因组DNA为模板，用引物对甲进行PCR扩增；所述引物对甲是序列表的序列3所示核苷酸和序列表的序列4所示核苷酸组成的引物对；

(3)以步骤(2)的PCR产物为模板，用引物对乙进行PCR扩增；所述引物对乙是序列表的序列5所示核苷酸和序列表的序列6所示核苷酸组成的引物对；

(4)用限制性内切酶Taq I酶切步骤(3)的PCR产物；如果得到167bp的酶切产物，待测小麦为AA基因型；如果得到218bp的酶切产物，待测小麦为GG基因型。

所述步骤(2)中：PCR扩增所用的聚合酶具体可为pfu酶；PCR反应程序具体可为：94℃4min；94℃45sec、64℃45sec、72℃3min30sec，32个循环；72℃10min。

所述步骤(3)中：PCR扩增所用的聚合酶具体可为Taq酶；PCR反应程序具体可为：94℃4min；94℃45sec、55℃45sec、72℃50sec，32个循环；72℃10min。

所述步骤(4)中，酶切条件具体可为：65℃、1h。

可用琼脂糖凝胶电泳检测所述酶切的酶切产物，如2.0％(质量百分含量)琼脂糖凝胶电泳。

本发明还保护辅助筛选不同千粒重小麦和/或不同粒宽小麦的专用引物，由引物对甲和引物对乙组成；所述引物对甲是序列表的序列3所示核苷酸和序列表的序列4所示核苷酸组成的引物对；所述引物对乙是序列表的序列5所示核苷酸和序列表的序列6所示核苷酸组成的引物对。

所述专用引物在制备辅助筛选不同千粒重小麦和/或不同粒宽小麦的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明同时保护一种辅助筛选不同千粒重小麦和/或不同粒宽小麦的试剂盒，包括所述专用引物。

所述方法、所述专用引物、所述试剂盒均可应用于小麦育种中，具体可将AA基因型的小麦用于育种。所述AA基因型小麦的千粒重和/或粒宽在统计学上大于GG基因型小麦，具体可为差异达极显著水平(P＜0.01)。

本发明公开了如下内容：小麦千粒重候选基因TaGW2-A1 cDNA编码序列，并该基因定位于小麦6A染色体上；通过该基因获得了TaGW2-A1编码区上游约3.3kb的启动子区序列，预测了核心启动子功能元件的位置；发现不同粒重(粒宽)材料间TaGW2-A1基因-593(起始密码子上游)处存在单核苷酸多态性(SNP)位点，构成两个不同基因型，该基因型与籽粒宽窄呈较好的对应关系；根据TaGW2-A1基因上游启动子区单核苷酸位点(-593处，G/A)的差异开发了SNP标记，命名为SNP593；应用开发的SNP593标记扫描我国255份小麦微核心种质，结合全部材料的籽粒性状数据，利用标记/性状关联分析发现，SNP593-A等位变异与小麦高粒重接近显著相关(P＜0.0528)、与粒宽极显著相关(P＜0.004)。该SNP为共显性标记，重复性好、成本低，在提高小麦千粒重(粒宽)的分子标记辅助选择和分子设计育种中具有较好的应用前景。

附图说明

图1为中国春小麦种子cDNA GW2的扩增；1-4：PCR扩增产物；M：Marker。

图2为主要禾本科植物GW2编码区序列同源性比较(DNAMAN软件)；除TaGW2-A1外其他序列均来自于NCBI数据库。

图3为TaGW2-A1上游启动子区序列扩增；1-3：PCR扩增产物；M：Marker。

图4为TaGW2-A1核心启动子原件示意图。

图5为不同粒宽材料启动子区单核苷酸多态性(SNP)位点。

图6为TaGW2-A1 SNP593标记的染色体定位；NT6A6B、NT6A6D、NT6B6A、NT6D6B分别代表小麦6A，6A，6B，6D染色体的缺失；H₂O和中国春(CS)分别代表阴性和阳性对照。

图7为SNP标记二次PCR扩增结果；M：Marker；1：白芒麦；2：三月黄；3：红冬麦；4：兰考906；5：徐州22；6：莱州953。

图8为大粒与小粒品种SNP标记琼脂糖凝胶检测；M：Marker；1、2：白芒麦；3、4：三月黄；5、6：红冬麦；7、8：兰考906；9、10：徐州22；11、12：莱州953。

图9为不同年代育成品种的千粒重、粒宽以及SNP593-A频率的变化趋势分析；A：千粒重；B：粒宽；C等位变异SNP593_A分布。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例中的小麦品种均获自中国作物种质信息网，表1和表2中的编号为网内编号。网址：http://www.cgris.net/zhongzhidinggou/index.php。

实施例1、特异引物对(分子标记)的发现

实验材料见表1。

表1实施例1中所用的小麦材料

小麦品种	编号	原始来源
			中国春	ZM005452	四川地方品种
白芒麦	ZM000215	河北冀县(农家品种)
			三月黄	ZM002685	来源不详(农家品种)
红冬麦	ZM005188	新疆塔城(农家品种)
			兰考906	ZM025358	河南兰考县品种展示中心
徐州22	ZM022308	江苏省徐州市农科院
			莱州953	ZM022727	山东莱州市农科所

一、TaGW2-A1 cDNA及其启动子区核苷酸序列的获得

1、TaGW2-A1 cDNA的克隆

以水稻GW2序列为目标，在小麦的EST数据库中BLAST同源序列，比对上的小麦EST序列进行电子拼接，以电子拼接序列为模板设计引物。以中国春小麦种子cDNA为模板，用特异性引物对(cDNA扩增引物)进行PCR扩增，得到1.2kb左右的目标片段(扩增产物电泳图见图1)。经测序验证，扩增产物长度为1275bp，定名为TaGW2-A1(核苷酸序列见序列表的序列1)。TaGW2-A1与NCBI上公布的水稻、大麦、短柄草、玉米和高粱的基因存在较高的同源性(同源性比较见图2)。因此可明确，在小麦中获得的cDNA克隆为水稻GW2的同源基因。

cDNA扩增引物：GW2F：5′-ATGGGGAACAGAATAGGAGGGAGGA-3′；

GW2R：5′-TTACAACCATGCCAACCCTTGCGTG-3′。

PCR聚合酶：TRANSGENE的Pfu酶。

PCR反应程序：94℃4min；94℃45sec、60℃30sec、72℃2min，32个循环；72℃10min。

2、中国春小麦BAC文库的筛选

中国春BAC混合池保存的菌种混匀后取5ul接种到LB培养基中，摇床转速220rpm、37℃培养过夜。碱裂解法提取质粒DNA，根据TaGW2-A1基因序列引物进行扩增，对阳性混合池进行如下筛选：

1)将阳性BAC混合池的保存菌液稀释之后，涂布在LB固体培养基表面，37℃过夜培养，然后挑取5倍于混合池中克隆数的单克隆接种于384孔板中，37℃培养过夜，培养基冷冻保存；

2)用每块384孔板中的所有单克隆制备成混合池，接种于LB培养基中培养过夜，碱裂解法提取质粒DNA，PCR检测；

3)对步骤2)中呈阳性的混合池进行阳性单克隆筛选。将384孔板中16个横行(A-P)和24个纵列(1-24)中的克隆分别混合，共得到40个更小的克隆混合池。分别以其菌液为模板，用等位特异性PCR引物扩增，检测是否含有阳性克隆。含有阳性克隆的横行和纵列的交叉点就是可能的阳性单克隆；对384孔板中相应位置的单克隆用PCR引物加以验证。

3、BAC单克隆质粒的提取

利用Qiagen Large-Construct Kit(德国)提取BAC质粒DNA，操作参考试剂盒说明。

4、BAC单克隆质粒的末端测序

采用ABI3730分析仪(Applied Biosystems)进行测序。根据已知序列设计测序引物，逐步向起始密码子上游序列进行测序。测序BAC质粒模板浓度≥300ng。测序完成后利用Seqman软件进行序列拼接、整合(TaGW2-A1编码区上游3kb的序列如序列表的序列2所示)。TaGW2-A1上游启动子区序列扩增结果见图3。TaGW2-A1核心启动子原件示意图见图4。

二、品种间TaGW2-A1启动子区SNP位点的发掘

选择下列小麦品种作为标记发掘材料：地方小(窄)粒品种(千粒重＜35g，粒宽≤3.0mm)：白芒麦、三月黄、红冬麦；育成大(宽)粒品种(千粒重＞45g，粒宽＞3.3mm)：兰考906、徐州22、莱州953。

1、SNP位点的发现

根据步骤一获得的启动子末端序列设计引物(启动子区扩增引物，下游引物包含ATG下游387bp的序列)。分别提取上述小麦品种的基因组DNA作为模板，用启动子区扩增引物进行PCR扩增。

启动子区扩增引物：F595：5′-GTTTTCCTGGGCTGGCACAATCA-3′；

R1781：5′-GCGGCACTCTACGGCAGAACAAAT-3′。

PCR聚合酶：TRANSGENE的pfu酶。

PCR反应程序：94℃4min；94℃45sec、64℃45sec、72℃3min30sec，32个循环；72℃10min。

片段扩增后利用Bioteke公司的DNA回收试剂盒进行回收，回收片段利用TranGen公司的P-easy Blunt Kit进行连接转化。采用碱裂解法提取连接转化的单克隆阳性载体，应用ABI3730分析仪进行测序。利用DNAStar中的Seqman进行序列拼接，MegAlign进行序列比对。序列比对发现：不同材料间在小麦A基因组的编码区上游-593处有一个SNP位点(SNP593标记)(见图5)，小(窄)粒品种为(-593G)，大(宽)粒品种为(-593A)，大粒品种(TCGA)与小粒品种(TCGG)相比，具有一个Taq I内切酶位点。根据此差异进行SNP标记的开发。

2、染色体定位

根据SNP所在区域的核苷酸序列设计特异引物(定位引物)，并应用小麦缺-四体进行SNP标记的染色体定位，将其定位于小麦的6A染色体上(见图6)。

定位引物：LocAF3：5′-CGTTACCTCTGGTTTGGGTGTCGTG-3′；

LocAR3：5′-CACCTCTCGAAAATCTTCCCAATTA-3′。

PCR酶：TRANSGENE公司的pfu酶。

PCR反应程序：94℃4min；94℃45sec、60℃45sec、72℃1min30sec，32个循环；72℃10min。

3、SNP标记的开发

特异性引物对(分子标记)的设计原则：1)小麦A、B、D三个基因组在SNP位点区相似性较高不能在此附近设计一个引物扩增出A基因组特异的序列；2)TaqI内切酶只识别4个碱基，在序列中的酶切位点较多；3)内切酶对PCR产物要求较高，PCR产物中应尽可能减少非特异扩增及引物二聚体的出现。

采用如下流程进行SNP标记的开发：

1)分别提取六种小麦材料幼苗叶片的基因组DNA作为模板，用SNP标记一次PCR引物扩增含有SNP位点的DNA片段。

SNP标记一次PCR引物：LocAF3：5′-CGTTACCTCTGGTTTGGGTGTCGTG-3′；

LocAR3：5′-CACCTCTCGAAAATCTTCCCAATTA-3′。

PCR聚合酶：TRANSGENE的pfu酶。

一次PCR的目的是扩增小麦A基因组，以避免其它基因组的相似序列的干扰。

2)将一次PCR产物稀释100倍后，取1ul作为二次PCR的模板，SNP标记二次PCR引物进行扩增。

SNP标记二次PCR引物：TAQ1F403：5′-GAGAAAGGGCTGGTGCTATGGA-3′；

TAQ1R820：5′-GTAACGCTTGATAAACATAGGTAAT-3′。

PCR聚合酶：Fermentas的Taq酶。

PCR反应程序：94℃4min；94℃45sec、55℃45sec、72℃50sec，32个循环；72℃10min。

扩增产物(二次PCR产物)的电泳图见图7。

3)取二次PCR产物用Taq I内切酶(Fermentas公司)在65℃下完全酶切1h。

4)将酶切产物在2.0％琼脂糖上进行酶切片段的检测，见图8。三个小粒品种(GG，SNP593)，都得到了218bp的条带；而三个大粒品种(AA，SNP593)，都得到了167bp的条带。

实施例2、TaGW2-A1基因SNP593的功能验证

分别将255份小麦材料进行如下操作：

1、提取基因组DNA。

2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，用引物对甲进行PCR扩增。

引物对甲：LocAF3：5′-CGTTACCTCTGGTTTGGGTGTCGTG-3′；

LocAR3：5′-CACCTCTCGAAAATCTTCCCAATTA-3′。

PCR聚合酶：TRANSGENE的pfu酶。

3、以步骤2的PCR产物为模板，用引物对乙进行PCR扩增。

引物对乙：TAQ1F403：5′-GAGAAAGGGCTGGTGCTATGGA-3′；

TAQ1R820：5′-GTAACGCTTGATAAACATAGGTAAT-3′。

PCR聚合酶：Fermentas的Taq酶。

4、用Taq I内切酶(Fermentas公司)65℃下将步骤3的PCR产物酶切1h。

5、将酶切产物在2.0％琼脂糖上进行酶切片段的检测。具有218bp的条带的样本的基因型为GG(SNP593)，具有167bp的条带的样本的基因型为AA(SNP593)。

分别检测各个小麦品种的千粒重和粒宽。其中千粒重为3次测量的平均结果，粒宽为20粒的平均宽度。将步骤3的PCR产物进行测序验证，测序结果与酶切检测结果一致。

小麦样本及检测结果见表2。

表2实施例2中所用的小麦材料及检测结果

将小麦样本的基因型和千粒重性状、粒宽性状进行关联分析，结果见表3。

表3关联分析结果

基因型	材料数	千粒重(g)	粒宽(mm)
基因型	材料数	千粒重(g)	粒宽(mm)	GG	130	35.08±6.34	3.14±0.18
AA	125	36.69±6.93	3.21±0.23	GG	130	35.08±6.34	3.14±0.18
AA	125	36.69±6.93	3.21±0.23	P值		0.0528	0.004

结合千粒重、粒宽表型数据进行关联分析发现：AA基因型平均千粒重为36.69g，GG基因型平均千粒重为35.08g，差异接近显著水平；AA基因型平均粒宽为3.21mm，GG基因型平均粒宽为3.14mm，差异达极显著水平(P＜0.01)。

实施例3、不同年代育成品种的千粒重、粒宽以及SNP593-A频率的变化趋势分析

对微核心种质中不同年代育成品种的千粒重、粒宽以及SNP593-A频率的变化趋势进行分析发现(见图9)：随着年代的推移，我国小麦育成品种的千粒重和粒宽均呈增大的趋势(图9A、B)，SNP593-A等位变异在不同年代品种中的出现频率也逐渐增加，与千粒重和粒宽变化趋势一致(图9C)，这表明现代育种对该变异进行了很强的选择作用，而该变异与粒重、粒宽显著相关。因此，该标记可作为提高小麦粒重(粒宽)进行小麦高产分子标记辅助育种的功能标记。

序列表

<110>中国农业科学院作物科学所

<120>一种辅助筛选不同千粒重小麦的方法及其专用标记

<130>CGGNARY102021

<160>7

<210>1

<211>1275

<212>DNA

<213>中国春小麦(Triticum aestivum L)

<400>1

atggggaaca gaataggagg gaggaggaag gccggggtgg aggagcggta cacgaggccg 60

caggggctgt acgagcacag ggatatcgac cagaagaagc tacgcaagtt gatcctcgag 120

gccaagctcg cgccctgcta cccgggggct gacgacgccg cggggggtga cctggaggag 180

tgccccatct gcttcctgta ctacccaagc cttaaccgat caaaatgttg ctcgaaaggg 240

atatgtacag agtgctttct tcaaatgaaa ccaactcata ctgctcgacc tacacaatgc 300

ccattctgca aaacccccaa ctatgctgtg gagtatcgtg gtgtaaagac aaaggaggaa 360

aggagcatag agcaatttga agaacagaaa gtcattgaag cacagatgag ggtgcggcag 420

caagcacttc aagacgaaga ggataagatg aaaagaaaac agagtaggtg ctcttctagc 480

agaacaatcg ctccaacaac agaagtggag tatcgagata tttgcagcac atcctattca 540

gtgccatcgt accaatgtac ccagcaagaa actgaatgtt gttcgtctga gccttcatgt 600

tctgctcagg ctaacatgcg gtctttccat tctaggcata ctcgtgatga taacatagac 660

atgaacatag aggacatgat ggttatggaa gcgatttggc gttcaattca ggagcaagga 720

agtataggaa atccttcttg tgggagcttt atgccttttg agcaaccaac gcgtgagagg 780

caggcattcg ttgcagctcc tcctctagaa atgccccatc ctggtggatt ttcttgtgct 840

gttgctgcta tggctgagca ccagccatca agcatggatt tctcttacat gactggtagt 900

agtgcgttcc cagtctttga catgttccgc cgaccgtgca acattgctgg tggaagcatg 960

ggtgctgcgg aaagttcacc agatagctgg agcgggatag cgccaagttg cagcagaagg 1020

gaagtggtaa gagaggaagg agagtgctca accgaccact tgtcagaggg tgcagaggcc 1080

gggacaagct atgccggctc ggacattgtg gtggatgcgg ggacaatgct accgttgcct 1140

tttgctgaca attacagtat ggttgcaagc catttccgtc ctgagagcat cgaagaacaa 1200

atgatgtatt ccatggctgt ttctttagca gaagctcatg gtagaacgca cacgcaaggg 1260

ttggcatggt tgtaa 1275

<210>2

<211>3303

<212>DNA

<213>中国春小麦(Triticum aestivum L)

<400>2

tcttgggggg gggggtcgta ccgctctata caggataatt cctagatgtg agcacgagat 60

gaacttgggg gcagaccaac tcgaaatttt agaccaaatc gaaggggaaa ataaaatccg 120

aggccaggga atgccaaggg aggtggatcc actttccaag cactagatcc acatatcaaa 180

atcagcaaaa actcacaaac aacaaaatgc aagaaatttt ggggggctct tttcatggat 240

tttttttgaa atttagaaga aaattcgaac taaaggctag aacatggggg ggggggtagg 300

gctccaaatt cgtgtcaacg tggctcatga taccaagatg atataaggca cgggccaaag 360

tgccctgatt tgtcccaatg ttcacgaaat tggaggtgga ttcgaggagg aacacgaagg 420

gaaaacatgg agaaatcaaa gggggaaaca ctctattgga caagattcac tcccggcact 480

cctcaaatca caagcaatac aagaggcgca tcaagatcca agaacaacaa gggaaataaa 540

gatacaaggt agttcatcca aatatctagg agagatggct cttgatgatt cacttgggga 600

atccttctcc acatgtggag gtcttgcatc cactagggat cttctccata ggaggccttg 660

cactccaatg gagtcttctc tctcacaaga ggaatcccac aaagggagat acatgagcta 720

agctctatga tatgagttct aatcttagct aaccctagaa atgaggtggg gaaagagtat 780

atatagtcct agccaggaag gggtaagtga ggggcagaat gggaaagata gaaggccact 840

tggccaactc tacgtgcaga cagaccggtt gtaccggttg tactataact atcgggtggt 900

accggtcttg taccgctcga ttacagtaaa gtgtccaagc gaagcagtag tggaccggtt 960

gtaccggtgg accggttgtt gaccggtagt ggactagttg taccagtttt cctgggctgg 1020

cacaatcatc ttcttccttc tcttccatgc ttccctcccg gatggtgtag ttgtactctt 1080

gtgtttggac tcctcgtcat ccataaagct atgacaatac ctatatatgc atacaagagg 1140

agtgtcaagt agtataccat cctcgaaggg gtcaagtgaa cacgtgtaaa tgagatgagt 1200

cacctttatg tacgtgaagt agatgttgca tgtgtcactt gccaaacgaa ctcttgacat 1260

ggtgatgtct gtaggatgct ccacatcaca aacacattag tcccttaacc catttgtctt 1320

caatactcca aaaccactta ggggcactag atgcacttac atttatacct ggaattttgc 1380

ttgcaaagta acatatggta tctacctatc ttgctcatcc ccttgatgca ccactctgtt 1440

agcgatactt cctagagtgt ttatctagtt cctctagcaa tggtaagtta agaagaactt 1500

aagaactcct tcaattgtac gatcaaaatg ttggtgtcat ttgtaaagcc cttggacccc 1560

caagttctga caagccttca ttaggaaatt gctttttgaa gcatgtagga gcaacaaagg 1620

gggttctttt cgtaccttag atggatcatt ctgagccttc ttgaagagct aggcgccgaa 1680

gctcccggcg attggcgatt gatccccgcc ggcatctgga tcttgctgtt tcagcaacca 1740

agactagatc cagttcagta caaagaatgg aagaacaaaa aaacatgaca tgattcgatc 1800

cttgcgctga ttttcttacc cgtcgaggat gtgggtgtgg tcacatggac aatgctgccg 1860

atgtccccga caacccgcat gtttcctcct accttctgct tccatgtcgg gcccgcggca 1920

catgcacatc atgaacgaga aacacgagta aaagcactac atgaacccct tatgaacgat 1980

ttagcaatga acacaaaatt ctagtattta gacatgagaa tgccttgtac agaatttaaa 2040

agtcatgaaa aacgttacct ctggtttggg tgtcgtgcaa ataaaacaga gataataaat 2100

tccttatagc caatgtggtg aacatagcaa attgattccc ccgggtttga ttccatgtgc 2160

tctagccaaa atagatcaaa tcagcaagat atcttatgct atgaatggtg atagtggtcg 2220

ctcatgttca tctcgactgc cgaaatcatg tgcccttagc ggacgttgta ctcctcggca 2280

gtggccacta tcaacgagcg gcggcagcca aggcgaaggg atccatgcag atcgtgagca 2340

accgtccatg cgtggctgcg gcagaccgga gcacgagtag gaggcggcag attccaccat 2400

ggaaggccga ggagtggcaa gggtagaggt ggatgcagga gggagggggg gggggagaaa 2460

gggctggtgc tatggaccgc gggaggggag gacgtgccag tgacgaggga agcgaagggc 2520

ggagcggcag gaggcctgtc gggtcgatga gatcccgtac agcagctcgc aacaaaccct 2580

agctcgcgcg agaagagaga ggggatgttc ggatcaaaga gaggacgaga gaaaaccggc 2640

gtggtaagaa aaatcgataa ggaaagaaca tcgtatgagt ggagaagggt gagacgaaaa 2700

taaatcgaac gaaaataatc ataaagtgaa agctaccaag tccttcttta aaagtagaga 2760

tcacatattc gcttagagga aagatgaagg ggtaggtgat gcgcccgcgg tgatgcactc 2820

atcatgtcgc ttcccattta cgaaagcatt acctatgttt atcaagcgtt acatgggata 2880

ggggatatac acaaacatgt tcctaaatta attaaaaaaa acatgtttct aaattgtgac 2940

acagatcgat ggtccagaat ctacgtgtca caaaactaat tgggaagatt ttcgagaggt 3000

gtatctcttg cagcgcagcg ggccagcggc agagaagccg aagcctagtg agctgtgttg 3060

tcgtcgagtg tcgcgtgcgc cttctctttt gctttgcctc cctgttctcc caccccgagg 3120

ggaaatgcat ttttaaaaac agggtaatcc cacctcgcct cggcgctccc caagccccgc 3180

agcatcgcgt acgagtgcgt ataccgtatg tatctacagt gaggcggcgc ggggcaaggg 3240

tttcgtctcc ggcggcggcg acggcggcgg cggcggcgga ggaggctaga tctgggaggg 3300

atg 3303

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

cgttacctct ggtttgggtg tcgtg 25

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

cacctctcga aaatcttccc aatta 25

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

gagaaagggc tggtgctatg ga 22

<210>6

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

gtaacgcttg ataaacatag gtaat 25

<210>7

<211>418

<212>DNA

<213>中国春小麦(Triticum aestivum L)

<400>7

gagaaagggc tggtgctatg gaccgcggga ggggaggacg tgccagtgac gagggaagcg 60

aagggcggag cggcaggagg cctgtcgggt cgatgagatc ccgtacagca gctcgcaaca 120

aaccctagct cgcgcgagaa gagagagggg atgttcggat caaagagagg acgagagaaa 180

accggcgtgg taagaaaaat cgataaggaa agaacatcgt atgagtggag aagggtgaga 240

cgaaaataaa tcgaacgaaa ataatcataa agtgaaagct accaagtcct tctttaaaag 300

tagagatcac atattcgctt agaggaaaga tgaaggggta ggtgatgcgc ccgcggtgat 360

gcactcatca tgtcgcttcc catttacgaa agcattacct atgtttatca agcgttac 418

Claims

1.一种辅助筛选不同千粒重小麦和/或不同粒宽小麦的方法，是如下(a)或(b)：

(a)检测待测小麦的基因组DNA中序列2所示核苷酸自5′末端第2708位脱氧核糖核苷酸是A还是G，AA基因型小麦的千粒重和/或粒宽在统计学上大于GG基因型小麦；所述AA基因型为序列2所示核苷酸自5′末端第2708位脱氧核糖核苷酸为A的纯合体；所述GG基因型为序列2所示核苷酸自5′末端第2708位脱氧核糖核苷酸为G的纯合体；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括基因组DNA提取、PCR扩增和酶切。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

(1)提取待测小麦的基因组DNA；

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：

所述步骤(2)中：PCR扩增所用的聚合酶为pfu酶；PCR反应程序为：94℃4min；94℃45sec、64℃45sec、72℃3min30sec，32个循环；72℃10min。

5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中：PCR扩增所用的聚合酶为Taq酶；PCR反应程序为：94℃4min；94℃45sec、55℃45sec、72℃50sec，32个循环；72℃10min。

6.如权利要求3至5中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)中，酶切条件为：65℃、1h；用琼脂糖凝胶电泳检测所述酶切的酶切产物。

7.辅助筛选不同千粒重小麦和/或不同粒宽小麦的专用引物，由引物对甲和引物对乙组成；所述引物对甲是序列表的序列3所示核苷酸和序列表的序列4所示核苷酸组成的引物对；所述引物对乙是序列表的序列5所示核苷酸和序列表的序列6所示核苷酸组成的引物对。

8.权利要求7所述专用引物在制备辅助筛选不同千粒重小麦和/或不同粒宽小麦的试剂盒中的应用。

9.一种辅助筛选不同千粒重小麦和/或不同粒宽小麦的试剂盒，包括权利要求7所述专用引物。

10.权利要求1至6中任一所述方法、权利要求7所述专用引物、权利要求9所述试剂盒在小麦育种中的应用。