CN101769920A - 一种测定倍他米松的直接竞争酶联免疫测定试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属生物医药领域。公开一种测定倍他米松的直接竞争酶联免疫测定试剂盒。本发明提供倍他米松抗原合成方案，用倍他米松合成倍他米松-3-羧甲基肟，后者在碳二亚胺催化下，用N-羟基丁二酰亚胺活化，与载体蛋白结合，合成免疫原；用倍他米松与琥珀酸酐反应生成倍他米松-21-半琥珀酸酯，后者通过混合酸酐法与酶结合，合成酶标抗原。用免疫原，免疫新西兰大白兔，获得***多抗。测定时，用羊抗兔多抗(二抗)包被酶标板，二抗与倍他米松多抗结合，洗涤后加入样品或标准和酶标抗原，显色测定，就可得出结果。本发明试剂盒组成一个不均一的直接竞争酶联免疫测定***。为食品安全，药物检测中，倍他米松的检测，提供一个快速，特异，灵敏的检测方法。

Description

一种测定倍他米松的直接竞争酶联免疫测定试剂盒

技术领域 本发明属生物医药技术领域，为食品安全，药物检测试剂。具体而言，本发明利用免疫反应的高灵敏性和特异性，以及酶促反应的放大效应和易检测性，建立起来的一种检测倍他米松的酶联免疫测定试剂盒。

背景技术 倍他米松(Betamethasone，Bet)是糖皮质激素可的松类的衍生物，也是***的同分异构体.是医学临床运用最广泛的强效皮质激素之一。可的松类激素通常用来治疗过敏性和严重感染性疾病，具抗炎和抗过敏的作用。这类激素尚有刺激食欲，增加肝糖原合成，升高血糖等作用。但这类激素在食物中残留，对人有潜在的危害，故欧盟等国都禁止倍他米松，氟美松等作为牲畜的促生长剂，在畜牧业中使用。

欧盟禁用并且建立最大残留限量(maximum residulimits，MRLs)，对倍他米松为：肝脏2μg/kg；肌肉0.75μg/kg；牛奶0.3μg/L。

糖皮质激素类常用的检测方法有：薄层色谱、免疫分析法、液相色谱、气相色谱、质谱或串联质谱技术等。

薄层色谱：灵敏度低，仅可检测出微克(μg)级以上的样品。不能满足食品中残留倍他米松的检测要求。

气相色谱法(GC)：由于糖皮质激素中含有多个极性基团、不挥发、热稳定性差，因此不适于直接进行GC分析。必须对糖皮质激素结构中基团进行的衍生化处理后，包括硅烷化、酰化等，才能测定。

液相色谱法(LC)：液相色谱对糖皮质激素的检测通常用配有紫外检测器的液相色谱，包括反相色谱和正相色谱，用来检测血浆中的倍他米松。此外，也有用反相和正相色谱，同时检测多种糖皮质激素。最低检出限一般可达10ug/kg。虽然该方法的灵敏度基本可以达到兽药残留检测要求，但仅适用于部分化合物，同时不能进行定性确认。

气相色谱-质谱法(GC-MS)：在激素的残留检测确认技术中，气相色谱(GC)与质谱(MS)的串联技术是最常选用的技术。从上世纪90年代以后，绝大多数欧盟参考实验室都引入了GC-MS方法，用于监控畜禽产品中类固醇激素残留。该技术集中了气相色谱高的色谱分辨率和质谱技术的特异性、选择性。由于激素类物质的挥发性不够，因此，在选择用GC-MS分析激素类物质时，也必须进行衍生化处理。

液相色谱-质谱联用法(LC-MS)：液相色谱-质谱联用(LC-MS)，或多级联用技术(LC-MS-MS)其检测灵敏度高，能对各糖皮质激素微量残留进行检测，是目前检测食品中糖皮质激素残留确证检测的最佳方法之一。气相色谱和气相色谱-质谱技术都要求对样品进行衍生化处理，样品的前处理相对比较麻烦，而液相色谱技术对化合物的定性确认又比较困难，液相色谱-质谱技术，不需要样品衍生化，而且能够定性确认，这已经成为分析糖皮质激素的主要手段。其检测限也可过0.5ug/L。

气相色谱-质谱联用(GC-MS)，液相色谱-质谱联用(LC-MS)或多级联用技术如LC-MS-MS，其设备要求高，技术难度大，对技术人员要求高。本发明试剂盒利用酶联免疫测定原理，定量检测动物组织，血液，胆汁，尿液中的倍他米松残留，不需要昂贵的仪器投入，一般中等文化水平的人员，经过短期培训，就可掌握此检测方法。该试剂盒检测多种样品中的倍他米松，其线性范围为0.1ng/ml～20ng/ml，最低检测限可达0.1ng/ml。可满足食品中倍他米松残留的监测。

为食品中倍他米松残留，提供了一种高效，快速，特异的检测方法

发明内容 本发明提供一种快速检测倍他米松的酶联免疫试剂盒。其生产的倍他米松试剂盒，线性范围为0.1ng/ml～20ng/ml，IC₅₀为3ng/ml左右，灵敏度为0.1ng/ml。稳定期在6个月以上(4℃冰箱保存)。该发明包括免疫原的合成，动物的免疫，特异性抗体的制备，试剂盒的装配和调试，试剂盒各种参数的确定及样品的处理和测定。

倍他米松，化学名9α-氟-11β，17α，21-三羟基-16β-甲基孕甾-1，4-二烯-3，20-二酮。英文Betamethasone，缩写为Bet，分子量392.45，为小分子物质，不具有免疫原性而仅具有免疫反应性，要生产倍他米松的酶联免疫测定试剂盒，必须要制备对倍他米松有高度特异性的抗体。要获得对倍他米松有高度特异性的抗体，首要条件是要有一个能激发动物产生抗体的抗原。因此，免疫原的制备最为重要。其解决的方案是倍他米松共价连接上一个大分子物质，通常是与一种蛋白质交联。常用的有牛血清白蛋白，卵清蛋白，甲状腺球蛋白，大钥匙孔状槭血蓝蛋白等，本发明公开一种制备倍他米松免疫原的方法。首先用一羟胺化合物，羧甲基羟胺，修饰倍他米松，生成倍他米松-3-羧甲基肟，Bet-3-CMO，后者与N-羟基丁二酰亚胺相联，用二环己碳二亚胺(DCC)或水溶性碳二亚胺{1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)-碳二亚胺，EDAC；1-环己-3-(2-玛啉-4-乙基)碳二亚胺对甲基苯亚磺酸盐，CMEC}催化，使之活化，然后与载体蛋白分子中游离胺基相连，生成免疫原。或者倍他米松21位琥珀酸化后，与载体蛋白相联为免疫原(见后)。

有了免疫原，第二步就是用免疫原免疫动物，本发明是免疫1.5～2kg大小的新西兰雌性家兔，获得对倍他米松有特异性反应的多克隆抗体。本发明提供一种能产生高滴度抗体的免疫方案。

为了检测特异性抗体，建立直接竞争竞争酶联免疫测定，必须合成倍他米松与一种酶交联的抗原-酶交联物(酶标抗原)，交联的酶包括：辣-根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶等。本发明公开一种合成倍他米松与酶交联的方法，首先倍他米松在21位上琥珀酰化生成倍他米松-21-琥珀酸半酯，然后用混合酸酐法生成一个混合酸酐，再与酶交联，以制备酶标抗原。或倍他米松生成Bet-3-CMO后，与与酶相联，为酶标抗原(如上)。

在以上基础上，组装检测试剂盒。用聚苯乙烯96孔或48孔酶标板，包被二抗。(选用羊抗兔抗体，有商品供给。选用效价高，一般在1∶1000～2000，稳定性好的二抗)。

优化包被浓度，抗体浓度，酶标抗原浓度，使之达到检测要求。

本发明提供组成试剂盒相关试剂及组装流程：

(1)用选购的二抗包被酶标板。(2)孵育后洗涤去未吸附上的多余二抗。(3)用另一种蛋白封闭板上未吸附二抗的多余位点，以减少测定时的非特异性吸附。(4)提供倍他米松抗体和酶标抗原浓缩液。(5)提供抗体和酶标抗原应用稀释液。(6)提供浓缩洗涤液(7)提供倍他米松的标准液，用样品制备液配7个标准：0ng/ml，0.1ng/ml，0.5ng/ml，1.0ng/ml，5.0ng/ml，10.0ng/ml，20.0ng/ml(8)提供酶显色缓冲溶液和酶反应底物液，本试剂盒所用的酶反应底物为H₂O₂和四甲基联苯胺(TMP)，H₂O₂配于显色缓冲溶液中，四甲基联苯胺(TMP)单独配制。(8)提供酶反应终止液，终止液为2M硫酸。(9)提供样品制备液。用以配制倍他米松标准溶液和测定时样品的制备。

以上试剂均放4℃冰箱保存。

应用本试剂盒检测倍他米松的检测步骤：

(1)按照测定样品数和制作标准曲线所需孔数(每样品和标准均作二个孔)，从冰箱取出所需用的孔条，放置使温度平衡至室温(25℃)。

(2)将倍他米松抗体浓缩液用抗体稀释液按1∶100稀释后，每孔加100μl，加盖，室温放置30分钟。

(3)将浓缩洗涤液用双蒸馏水按1∶9稀释后，作为洗涤液，倒去孔中抗体液，用洗涤液洗涤3次，每孔，每次250μl，每次加洗涤液后，静置3分钟，倒掉，甩干，再进行下一次洗涤。最后一次洗涤，尽量将液体甩掉。

(4)各孔加入标准或样品，各标准和样品各加2孔，每孔加50μl。将酶标抗原浓缩液，用抗体稀释液按1∶100稀释后，每孔加50μl，另取2孔，加0标准50μl和抗体稀释液50μl作为空白孔，稍平行振荡酶标板，混匀各孔中液体。加盖，室温放置30分钟。

(5)同(3)洗涤各孔，最后甩干。

(6)各孔加显色液100μl，显色液由显色缓冲液与TMB液组成，以10∶1配制，即1000μl显色缓冲液加100μl TWB液。加入后，加盖，室温暗处避光放置15分钟。

(7)每孔加终止液50μl，混匀，于30分钟内，用酶标仪，在波长450nm下，测定其光密度。

用各孔的OD₄₅₀减去空白孔的OD₄₅₀，得各孔的实际测定值。求出二平行孔的平均值，得各标准或样品的测定值。按照下式求出各标准和样品的抑制率：

各标准或样品的抑制率％＝

(各标准或样品的测定值/0标准的测定值)×100％

用各标准浓度的对数值为X，其相应的抑制率为Y，在坐标轴上作图，得倍他米松浓度的半对数坐标标准曲线，在标准曲线上，找出样品抑制率相对应的X轴上的点，就可计算出样品中倍他米松的浓度。或利用ELISA计算的相关软件，只需输入测定值，立即就可得出结果。

本试剂盒所用的检测方法，属不均一的直接竞争酶联免疫测定方法。96孔酶标板已预先包被了二抗，加入倍他米松的特异性抗体，此抗体与二抗结合后，固定在酶标板上。然后，加入标准抗原(Bet)或含有倍他米松的样品，和酶标-倍他米松，标准或样品中倍他米松与酶标-倍他米松，共同竞争与倍他米松抗体结合，经孵育后，洗涤去未结合的酶标-倍他米松，显色测定。测定值与标准或样品中倍他米松量的对数值呈反比，以此达到定量测定倍他米松的目的。所谓不均一，则是指免疫原和酶标抗原，二者是用不同的方法合成。如此可增加反应的灵敏度。这是本试剂盒的一大特点。

图例说明：

图1载体蛋白：BSA，免疫原：倍他米松-BSA，倍他米松

   三者紫外扫描图。

图2用制备的试剂盒测定，所得的倍他米松标准曲线图。

以下具体实施实例，可进一步了解本发明。此处仅提供一种优选方法，但对本发明的内容和权利要求不构成任何限制。

实施例1主要试剂和主要仪器

1.1试剂

倍他米松(购自Sigma)，羧甲基羟胺(Sigma)，吡啶；N-羟基丁二酰亚胺(NHS)；N，N-二甲基甲酰胺(DMF)；四氢呋喃；二环己碳二亚胺(DCC)；三正丁胺，氯甲酸异丁酯(均购自国药上海化学试剂公司)，牛血清白蛋白(BSA)；卵清蛋白(OVA)；四甲基联苯胺(TMP)；(购自华美生物工程公司，进口分装产品)。辣根过氧化物酶R.Z＞3(上海丽珠东风生物技术有限公司).羊抗兔多抗(上海康成生物科技公司购得).Sephadex G-25(Sigma)，其余均为分析纯试剂.

1.2主要仪器：

精密分析天平(北京赛多利斯仪器***有限公司，Sartorius，BS124s，d＝0.0001g)；带扫描PC紫外-可见分光光度计(上海欣茂仪器有限公司)；高速台式离心机(上海安亭实验仪器厂)；酶标仪，P型可调移液器一套(热电上海公司)；SZ-97自动三重水纯水蒸馏(上海本波仪器有限公司)以及其他实验室常用仪器.

实施例2倍他米松免疫原和酶标抗原的合成

2.1倍他米松-3-羧甲基肟，Bet-3-CMO，的合成

称取Bet 118mg(0.3mmmol)溶于2ml无水吡啶，搅拌下，加入45mg(0.45mmol)羧甲基羟胺，室温搅拌24小时，最后，减压抽干吡啶，得黄色油状物。加2ml乙酸乙酯溶解，用蒸馏水洗三次，用分离出有机相，无水硫酸钠干燥。加热减压去乙酸乙酯近干，加3ml***，置冰箱，得白色沉淀。此为倍他米松-3-羧甲基肟，得约53mg。取少量，溶解于0.1ml DMF，用TLC鉴定。薄层层析中，Bet-3-CMO的Rf为0.2左右，接近原点。Bet则离开原点，随层析液前移.Rf约为0.85

2.2免疫原的制备：倍他米松-牛血清白蛋白的合成

取上制备的倍他米松-3-羧甲基肟40mg，溶于DMF液2.5ml，加入25mgDCC(约0.23mmol)，4℃搅拌下，加入NHS 18mg(约0.15mmol)，避光4℃搅拌过夜.次日，离心去沉淀.取上清为活化的Bet-CMO.

称取300mg牛血清白蛋白，加7ml pH8～9的蒸馏水和5ml DMF溶解，4℃搅拌下，加入上活化的Bet-CMO 1.8ml.4℃搅拌过夜.次日，取出用0.01M PBS(pH7.5)透析3日.每天换2次透析液.透析后，定蛋白浓度，并用uv扫描鉴定，计算交联率.其交联率一般在12～18左右.此为倍他米松-牛血清白蛋白(Bet-BSA)，作为免疫原。图1为牛血清白蛋白，倍他米松-BSA和倍他米松紫外扫描图。

2.3酶标抗原的合成：倍他米松-辣根过氧化物酶的合成

倍他米松-21-琥珀酸半酯的合成：：称取40mg倍他米松(0.1mml)和15mg琥珀酸酐(0.15mmol)，加入4mL无水吡啶，混合物在65℃下加热搅拌12h，将反应物转入pH 2～3(用盐酸调)的冰水中.置冰箱过夜.次日，白色沉淀析出，离心去上清，沉淀用去离子水洗数次，离心，沉淀置干燥箱干燥，得倍他米松-21-琥珀酸半酯。

称20mg倍他米松-21-琥珀酸半酯，加四氢呋喃1ml溶解，4℃搅拌下，加入20μl三正丁胺，10μl氯甲酸异丁酯，4℃搅拌1小时，生合成混合酸酐.为倍他米松-21-琥珀酸半酯的活化形式.

称取HRP 10mg加500μl pH 8～9的蒸馏水和500μl DMF溶解，4℃搅拌下，加入上合成的混合酸酐液200μl.4℃搅拌过夜.次日，取出用0.01MPBS(pH7.5)透析3日.每天换2次透析液.透析后，过Sephadex G 25柱，收集有色峰.为Bet-HRP.

实施例3倍他米松多克隆抗体的生产

用3只新西兰长耳雌兔，每只免4次.首次用Bet-BSA配成1mg/ml浓度，取3ml，加3ml弗氏完全佐剂，充分乳化后.每只兔用2ml(即1mg免疫原)背部，多点皮下注射为首次免疫.以后分别在第21天，51天，91天再免疫3次.第21天，51天，用3ml 1mg/ml浓度的免疫原，加3ml弗氏不完全佐剂乳化，每只兔用1ml，于臀部肌肉二侧注射.第51天免疫后10天，采血检查抗体产生情况.第91天，免疫原用0.9％氯化钠液配成0.5mg/ml溶液，每只免从耳静脉注射1ml免疫原.此次后，第10天，就可从兔耳静脉或心脏收获血液.收集血液让其自然凝结.离心收集血清，此为抗Bet的抗血清.

按照此免疫方案，一般都能收获高滴度的抗血清.

用二抗包被酶标板，利用合成的Bet-HRP，测定抗血清效价.下为测定结果：

稀释倍数	1∶4000	1∶8000	1∶16000	1∶32000	1∶64000	1∶128000	1∶236000	1∶472000
									抗血清0D450	3.380	3.084	2.815	2.323	1.93	1.087	0.620	0.413
阴性血
									清0D450	0.153	0.118	0.062	0.033	0.022	0.015	0.002	0.001

可见，生产抗血清效价达40万.用则可按1∶25000～1∶50000稀释用.

实施例4优化试剂盒组成，确定各试剂最终浓度

用方阵法确定包被二抗，Bet多抗，Bet-HRP三者的最佳浓度。

4.1包被酶标板：二抗配成2mg/ml浓度，用0.01M碳酸盐缓冲溶液(pH 9.6)按1∶1000(1000μl缓冲液加1μl二抗)稀释后，每孔加100μl，加盖，放入4℃冰箱过夜。次日用洗涤液洗3次，最后一次甩干后，每孔加200μl封闭液，封闭液为含2％卵清蛋白的0.01M碳酸盐缓冲溶液(PH9.6)。加入后，加盖，放入4℃冰箱过夜。次日用洗涤液洗3次，最后一次甩干后，将酶标板放入37℃烘箱30分钟，烘干。取出后用铝箔真空包装。

4.2配抗体浓缩液：以制备Bet-多抗，1∶2500稀释(用抗体保存液)。测定时用抗体稀释液按1∶100稀释应用。

4.3配Bet-HRP浓缩液：合成的Bet-HRP，用酶保存液，按1∶10稀释。测定时用抗体稀释液按1∶100稀释应用。

4.4配浓缩洗涤液：0.5M PBS液(pH7.2)+0.5％体积的Tween-20为洗涤液。用时用蒸馏水或去离子水按1∶9稀释用。

4.5配抗体稀释液：为0.1M PBS(pH 7.2)加0.1％明胶。

4.6配样品配制液：为0.1MPBS(pH 7.2)加0.1％水杨酸钠加0.05％吐温-20。

4.7配制Bet标准：用样品配制液配。共配制7个标准：0ng/ml，0.1ng/ml，0.5ng/ml，1.0ng/ml，5.0ng/ml，10.0ng/ml，20.0ng/ml。

4.8配制显色液：显色液由二部份组成，一是“显色缓冲液”，另一是“TMB”液。显色缓冲液：Na₂HPO₄ 1.84g+柠檬酸0.47g+H₂O 100ml+30％H₂O₂ 50μl，TMB液：用95％的乙醇或用二甲亚砜配成1mg/ml浓度。

4.9配终止液：2M硫酸。浓硫酸按1∶8用水稀释则可。

4.10试剂盒组成：

(1)已包被二抗的96孔或48孔酶标板(真空铝箔包装)

(2)倍他米松(Bet)标准(共7个)：0ng/ml，0.1ng/ml，0.5ng/ml，1.0ng/ml，5.0ng/ml，10.0ng/ml，20.0ng/ml

(3)Bet抗体浓缩液(用时按1∶100稀释应用)

(4)Bet-HRP浓缩液(用时按1∶100稀释应用)

(5)抗体稀释液

(6)显色缓冲液

(7)TMB液

(8)终止液。

(9)10X洗涤液

(10)样品制备液。

实施5样品处理和测定

5.1测定样品的处理：

尿样：2ml新鲜尿液加2ml 0.1M醋酸盐缓冲溶液(pH4.8)，加40μl蜗牛酶液，6ml蒸馏水，37℃保温4小时。酶解。然后，沸水浴加热5分钟。离心，取上清1ml加4ml预先用水平衡的三氯甲烷，旋转混合抽提10分钟。离心，取下有机相2ml，N₂气吹干，残渣加200μl样品制备液，旋转混合。室温平衡30分钟，作样品测定液。

脂肪，肾脂肪样品：10g肾脂肪，在微波炉中加热熔化(低火360W，2～3分钟)。取1g于玻璃匀浆器中，加5.0ml三氯甲烷，旋转混合，抽提5分钟。离心，取下层1ml三氯甲烷液，通风橱中，用N2吹干，加200μl样品制备液，旋转混合，抽提15分钟，为测定样品液。

肌肉，香肠：10g加10ml含0.1％水杨酸钠的0.15M，氯化钠液，匀浆，取1/10体积，加5ml三氯甲烷，旋转混合，抽提5分钟。离心，取下层三氯烷1ml，用N2吹干，加200μl样品制备液，旋转混合抽提15分钟，为测定样品液。

饲料：10g加10ml含0.1％水杨酸钠的0.15M氯化钠液，匀浆，取1/10体积，加5ml三氯甲烷，旋转混合，抽提5分钟。离心取下层三氯甲烷1ml，用N2吹干，加200μl样品制备液，旋转混合抽提15分钟，为测定样品液。

饮料(包括牛奶，茶，咖啡等)：

取1ml饮料，加5ml三氯甲烷，旋转混合，抽提5分钟。离心取下层三氯甲烷1ml，用N2吹干，加200μl样品制备液，旋转混合抽提15分钟，为测定样品液。

尿样品稀释系数均为2。其余为1。

5.2样品和标准液的测定：按照说明书第6，7页所述的检测步骤，用组装好的试剂盒进行测定。测定所得标准品数椐如下：

标准

(pg/ml) 0      100        500       1000       5000      10000      20000   空白

A450    2.225  1.914      1.527     1.356      0.788     0.505      0.315   0.01

        2.187  1.954      1.538     1.331      0.812     0.576      0.308   0.01

平均值  2.206  1.934      1.5325    1.3435     0.8       0.5405     0.3115  0.01

测定值  2.196  1.924      1.5225    1.3335     0.79      0.5305     0.3015

抑制率         0.8761384  0.693306  0.6072404  0.359745  0.2415756  0.1372951

        100    87.61384   69.3306   6072404    35.9745   24.15756   13.72951

所绘的标准曲线如图2所示。IC₅₀＝1.785ng/ml

实施6试剂盒各参数的测定

试剂盒的特异性及交叉反应：

倍他米松    100％    ***  40％

氟美松      20％     孕酮      ＜2％

氢化可的松  ＜1％

用1ng/ml标准做24个孔，重复测定。计算“板内变异”CV＝4.0％

“板间变异”＜15％。“灵敏度”为0.1ng/ml。

精确度：用肝组织做添加试验，分别添加0.1ng/ml，0.5ng/ml，1ng/ml，

其回收率分别是：75％，85％，及92％

试剂盒稳定性：

标准

           0      100    500    1000   5000   10000  20000

(pg/ml)

0          2.225  1.914  1.527  1.356  0.788  0.505  0.315

37℃第1周  2.204  1.891  1.489  1.312  0.7    0.489  0.3

37℃第2周  1.982  1.681  1.318  1.044  0.587  0.405  0.257

37℃第3周  1.758  1.403  1.025  0.877  0.388  0.214  0.165

热稳定性试验，37度3周保存，相当于4度保存7.4个月。可见试剂盒的稳定期在半年以上。

Claims (7)

1.本发明公开一种测定倍他米松的直接竞争酶联免疫测定试剂盒。

其特征包括：免疫原的制备，酶标抗原的制备，抗体制备和试剂盒各组份的配制及酶标板的包被。

2.根据权利1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，合成倍他米松免疫原的方法。用倍他米松溶于无水吡啶，搅拌下，加入羧甲基羟胺，倍他米松与羧甲基羟胺的摩尔比为1∶1.5左右，室温搅拌24小时后，减压抽干吡啶，得黄色油状物。加乙酸乙酯溶解，用蒸馏水洗三次，分离出有机相。加热减压去乙酸乙酯近干，加***，置冰箱，得白色沉淀。为倍他米松-3-羧甲基肟，再与N-羟基丁二酰亚胺反应，用二环己碳二亚胺或水溶性碳二亚胺{1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)-碳二亚胺；1-环己-3-(2-玛啉-4-乙基)碳二亚胺-对甲基苯亚磺酸盐}催化，生成倍他米松-3-羧甲基肟活化物，该活化物与载体蛋白在碱性条件下，与载体蛋白上氨基相联，为倍他米松的免疫原。载体蛋白如：牛血清白蛋白，卵清蛋白，甲状腺球蛋白，大钥匙孔状槭血蓝蛋白。

3.根据权利1所述，其特征在于，合成一种酶标抗原的方法：首先合成倍他米松-21-琥珀酸半酯：倍他米松(0.1mml)和琥珀酸酐(0.15mmol)，加入无水吡啶，混合物在65℃下加热搅拌12h，将反应物转入pH 2～3(用盐酸调)的冰水中.置冰箱过夜，得白色沉淀，沉淀用去离子水洗数次，离心，干燥，得倍他米松-21-琥珀酸半酯。倍他米松-21-琥珀酸半酯，用四氢呋喃或二甲基甲酰胺为溶剂，4℃搅拌下，加入三正丁胺，氯甲酸异丁酯，生合成混合酸酐.为倍他米松-21-琥珀酸半酯的活化形式.此活化形式，在碱性条件下与酶相联，其酶可为：辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶。合成酶标抗原。

4.根椐权利1-3所述，制备的倍他米松试剂盒，其特征在于免疫原和酶标抗原用不同的合成方法。免疫原中，其载体蛋白是在倍他米松第3位上与之交联；而酶标抗原中，酶是在倍他米松第21位上与之相联，或免疫原在倍他米松21位上联接，酶标抗原在倍他米松3位上联接，如此组成一个不均一***，增加了检测的灵敏度。组成一种不均一的直接竞争酶联免疫测定试剂盒。

5.根据权利1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于标准溶液和样品的配制，是用含0.1％～0.5％水杨酸钠和0.05％～0.1％吐温-20的0.1～0.01M的磷酸盐缓冲溶液。抗体稀释液是用含0.1～0.5％明胶的0.1～0.01M磷酸盐缓冲溶液。显色液为二组份，其中，一组份为显色缓冲液，由磷酸氢二钠和柠檬酸组成，每毫升含0.2～0.5μl30％H₂O₂；另一组份为四甲基联苯胺(TMB)液。TMB液用95％乙醇或二甲亚砜配制成1mg/ml浓度。

6.根据权利1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，采用羊抗兔抗体(二抗)包被96或48孔酶标板。用2％卵清蛋白液封闭孔中未吸附二抗的部位。

7.一种用不均一性的直接竞争酶联免疫测定方法，测定各种样品中倍他米松的方法。其特征在于：

(1)样品的前处理方法。用溶剂抽提方法，大大简化了测定过程。

(2)用权利1-6所述工艺组装的试剂盒测定，检测过程为：

用包被有羊抗兔抗体的酶标板，加入倍他米松抗体，孵育后洗涤甩干，加入标准或样品溶液和酶标抗原(倍他米松-辣根过氧化物酶)，孵育后洗涤甩干，加显色剂显色，终止，测定。标准或样品中倍他米松浓度的对数值与OD₄₅₀值呈反比。以此达到定量测定倍他米松的目的。此不均一的直接竞争酶联免疫测定试剂盒，检测范围为0.1～20ng/ml，灵敏度可达0.1ng/ml，IC₅₀1～2ng/ml。