CN101768622B - 一种评价鹿茸药效的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种评价鹿茸药效的方法，该方法以胃肠道中双歧杆菌为有益菌代表、葡萄球菌为有害菌代表，通过获取能全面反映作用过程、具有整体表达特征的热谱曲线等综合信息，客观量化地评价鹿茸醇提液的不同萃取部位对胃肠道微生物生长代谢的影响，筛选鹿茸促菌作用最强的活性部位，同时考察该活性部位的抑菌作用；本发明操作方法简单，易于检测的规范化、自动化。

Description

一种评价鹿茸药效的方法

技术领域

本发明涉及一种评价鹿茸药效的方法，具体为评价鹿茸对胃肠道特征菌群生长代谢影响的方法。

背景技术

鹿茸为鹿科动物梅花鹿Cervus nippon Temminck或马鹿Cervuselaphus Linnaeus的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，具有促生长代谢、壮肾阳、强筋骨等功效。随着研究的深入，人们从鹿茸不同活性部位中提取分离出越来越多的化学成分，有关鹿茸药理作用的研究报道也较多，但鹿茸调节补益的真正药效物质基础尚不清楚，严重影响其推广应用。因此，客观且灵敏地对鹿茸药效进行表征，对于鹿茸的质量标准控制及临床有效用药具有重要意义。

鹿茸中含有大量的生物活性物质，例如鹿茸的醇提物对四氯化碳和乙醇中毒所引起的小鼠和大鼠肝和血浆中丙二醛含量升高有明显抑制作用，而正丁醇提取物和***提取物等为抑制单胺氧化酶的主要有效成分。现代药理认为中药调节代谢的药效之一是源于中药中含有调节胃肠道有益菌的活性部位或化学成分。

传统研究方法如细胞免疫反应检测法、免疫组织化学法、血流动力学、红细胞凝集法等已用于鹿茸活性部位的评价，但这些方法往往存在评价指标单一、整体信息易缺失、受干扰因素多、操作复杂等局限，难以全面表征机体受药物干预过程中的特征信息，无法获得实时的动态数据。

微量热法(Microcalorimetry)作为一种简便、可量化的测定热变化的方法广泛地应用于物理、化学和生命科学等领域。该方法主要是通过获得动态的生物热动力学参数和热谱曲线(P-t曲线)的特征信息来表达微生物、细胞、组织和器官等生物体在生长代谢过程中的微量热变化(吸热或放热)规律，具有实时、灵敏、高通量和指纹特性等技术优势。

在细菌的生长、繁殖、衰亡过程中，伴随代谢、有热量释放，释放的热量随生长期的变化关系被称为生物热活性谱(又称“热谱曲线”或“生物效应谱”)。

在既定的条件下，细菌的生长符合微生物生长曲线模型。生长曲线分为四个期，即延滞期(lag phase)、指数生长期(log phase)、稳定期(stationary phase)和衰亡期(decline phase)。指数生长期细菌的生长曲线符合微生物指数生长数学模型。

P_t＝P₀exp(kt)或InP_t＝lnP₀+kt    (1)

式中，P₀为基线起点的细菌产热功率，P_t为t时刻的细菌产热速率，k为生长速率常数。同时还可提取最大产热功率(P_max)、达峰时间(t_p)、产热量(Q)等热谱曲线的特征参数。

肠道中的菌群大致可分为有益菌、有害菌和利害均备菌，各种菌群互相制约、互相协调，共同维持肠道的微生态平衡，从而维护机体的健康。其中有益菌主要包括双歧杆菌(Bifidobacterium)(占80％～90％)和乳杆菌(Lactobacillus)等，双歧杆菌是肠道的微生物种群中的优势种群并与宿主终生伴随，对整体种群起决定作用。一旦失去了优势种群，则微生态平衡失调。作为双歧杆菌重要组成之一的青春双歧杆菌(Bifi1dobacterium adolescentis)直接或间接影响着人和动物的生理变化和免疫功能，在机体内的有无或多寡是衡量健康状况的指标之一。有害菌主要包括绿脓杆菌(Pseudomonas)、霍乱菌(Cholera)、葡萄球菌(Staphylococcus)等，其中金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是一种广泛存在的病原微生物，是交叉感染的主要病原菌和重要传染源。

发明内容

本发明的目的是提供一种评价鹿茸药效的方法，该方法包括如下步骤：

(1)取鹿茸的***、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇的萃取部位干膏，溶于无菌水中，制成浓度为100-1200μg·mL^-1的各供试品溶液；

(2)在恒温37℃、厌氧、无菌条件下，将双歧杆菌接种到TPY培养基中形成双歧杆菌的悬浮液，其浓度为0.5～5×10⁶个细胞/mL；

(3)取所述双歧杆菌的悬浮液，分别与29～39倍量的鹿茸各萃取部位的不同浓度供试品溶液在安瓿瓶中混合，密封，置于微量量热仪中检测，记录热谱曲线；

(4)分析热谱曲线中各参数随鹿茸各萃取部位的不同浓度的变化关系，根据结果评价鹿茸各萃取部位对胃肠道有益菌的特征菌群生长代谢的影响。

上述方法在步骤(4)之后还可以进一步包括如下步骤：

(5)根据所述热谱曲线的生长速率常数k，得到促进双歧杆菌生长的有效率E的最大值，依据该最大值确定促菌活性最强的部位，取该活性部位的干膏，加入无菌水溶解，制成浓度为100-1200μg·mL^-1的活性部位的供试品溶液；

(6)在恒温37℃、无菌条件下，将葡萄球菌接种到蛋白胨培养基中形成葡萄球菌的悬浮液，其浓度为0.5～5×10⁶个细胞/mL；

(7)取所述葡萄球菌的悬浮液，与29～39倍量的所述活性部位不同浓度的供试品溶液在安瓿瓶中混合，密封，置于微量量热仪中检测，记录热谱曲线；

(8)分析热谱曲线中各参数随所述活性部位的不同浓度的变化关系，根据结果评价鹿茸所述活性部位对胃肠道有害菌的特征菌群生长代谢影响。

其中，所述双歧杆菌为青春双歧杆菌；

所述葡萄球菌为金黄色葡萄球菌；

步骤(1)所述各萃取部位溶液的系列浓度为100μg·mL^-1、200μg·mL^-1、400μg·mL^-1、600μg·mL^-1、800μg·mL^-1、1200μg·mL^-1；

步骤(2)所述双歧杆菌的悬浮液的浓度优选1.5×10⁶个细胞/mL；

步骤(5)所述活性部位溶液的系列浓度为100μg·mL^-1、200μg·mL^-1、400μg·mL^-1、600μg·mL^-1、800μg·mL^-1、1200μg·mL^-1；

步骤(6)所述葡萄球菌的悬浮液的浓度优选1.5×10⁶个细胞/mL；

所述干膏的制备步骤如下：

(1)取鹿茸粉末8～12g，加6～10倍量50～80％乙醇回流提取2-3次，每次1-2小时，合并药液，浓缩成相对密度为0.9g/ml的浸膏；

(2)用***、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇对所述浸膏分别分级萃取，每种溶剂萃取2～3次，每次20ml，分别合并各萃取液，得到***部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位，将各萃取部位减压干燥得干膏。

本发明建立了灵敏表征鹿茸中具有补益活性的4种萃取部位对胃肠道特征菌群生长代谢影响的评价方法。该方法着眼于捕获微生物生长代谢过程中能量变化的特征，采用微量热法研究鹿茸中4种萃取部位的不同浓度对胃肠道主要有益菌(青春双歧杆菌)生长代谢的影响，以生长速率常数(k)、最大产热功率(P_max)、达峰时间(t_p)和有效率(E)等生物热动力学特征参数为指标，对其促菌活性进行客观、量化的评价，筛选鹿茸各萃取部位中促菌活性最强的部位；进一步考察该活性部位对病原微生物(金黄色葡萄球菌)生长抑制的作用规律，客观且灵敏地对鹿茸药效部位进行评价，为名贵补益中药鹿茸及其他化学成分复杂中药的研究提供了新的研究思路、方法和试验基础。

本发明以肠道中两种主要的有益菌(双歧杆菌)和有害菌(葡萄球菌)为代表，通过获取能全面反映作用过程、具有整体表达特征的热谱曲线等综合信息，客观量化地评价鹿茸醇提液的不同萃取部位对胃肠道微生物生长代谢的影响，筛选鹿茸促菌作用最强的活性部位，同时考察该活性部位的抑菌作用；本发明操作方法简单，易于检测的规范化、自动化。

本发明的特点在于：

(1)建立了灵敏表征鹿茸中具有补益活性的4种萃取部位对胃肠道特征菌群生长代谢影响的评价方法；

(2)该方法在密封独立的环境中进行，干扰小，能够真实动态全面反映鹿茸活性部位与细菌的相互作用，客观评价鹿茸的药效；

(3)所选生物模型之肠道有益菌(青春双歧杆菌)能够真实表征鹿茸补益的功效，从而来筛选鹿茸提取物中促菌作用最强的活性部位；

(4)所选生物模型之肠道有害菌(金黄色葡萄球菌)能够真实表征鹿茸药效的毒副作用，从而为其安全性提供参考依据；

(5)该方法优化了测定条件，有利于准确测定；

(6)评价的参数全面，客观并且能够量化，自动化操作简单，有利于检测方法的规范化。

(7)建立了综合评价鹿茸药效的方法。

附图说明

图1为鹿茸醇提液的各萃取部位对青春双歧杆菌生长代谢影响的热谱曲线，其中(a)为正丁醇部位、(b)为***部位、(c)为氯仿部位、(d)为乙酸乙酯部位(37℃，TPY培养基)；

图2为鹿茸醇提液的正丁醇萃取部位对金黄色葡萄球菌生长代谢影响的热谱曲线(37℃，蛋白胨培养基)；

图3为鹿茸醇提液正丁醇萃取部位作用于两种肠道特征菌群的生长速率(k)比较分析图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

1.仪器

TAMIII多通道微量量热仪(Thermometric AB，瑞典)，配以TAMAssistant数据采集和分析软件，实验时***控温于37℃；YXQ LS-B全自动立式电热蒸汽灭菌器(上海降拓仪器设备有限公司)，BS210S型电子天平(Sartorious，北京赛多利斯仪器***有限公司)。

2.试剂

菌株：青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis，AS.1.2190)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，CCTCC AB 910393)由中国药品生物制品检定所中国典型培养物保藏中心提供。

3.TPY培养基：胰酶解酪朊10g，植质蛋白胨5g，酵母提取物2.5g，CaCl₂0.15g，葡萄糖5g，FeCl₃0.005g，K₂HPO₄2g，吐温801mL，MgCl₂·6H₂O 0.5g，半胱氨酸-HCl 0.5g，ZnSO₄·7H₂O 0.25g，琼脂15g，溶于1L蒸馏水中，用1mol/L HCl溶液调节pH至6.8后分装，121℃高压蒸汽灭菌15min，4℃贮存备用。

4.蛋白胨培养基：蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl 5g，溶于1L蒸馏水中，用1mol/L NaOH溶液调节pH至7.2后分装，121℃高压蒸气灭菌30min，4℃贮存备用。

5.梅花鹿茸(批号20080119)购于北京同仁堂吉林人参有限责任公司。

6.所有试剂均为分析纯。

实施例1鹿茸醇提液各萃取部位对胃肠道有益菌生长代谢的影响

1.供试品溶液的配制

取梅花鹿茸粉末12g，加10倍量80％乙醇回流提取3次，每次1小时，合并药液，浓缩成相对密度为0.9g/ml的浸膏；采用***溶剂萃取法，用***、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇对所述浸膏分级萃取，每种溶剂萃取3次，每次20ml，分别合并各萃取液，得到***部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位，将各萃取部位减压干燥得干膏；分别取各萃取部位干膏0.2g，加入适量无菌水溶解，配制成浓度分别为100μg·mL^-1、200μg·mL^-1、400μg·mL^-1、600μg·mL^-1、800μg·mL^-1、1200μg·mL^-1的各萃取部位溶液，用0.45μm的滤膜过滤除菌，得到鹿茸各萃取部位的供试品溶液。

2.测定方法

在恒温37℃、厌氧、无菌条件下，将1×10⁶个青春双歧杆菌接种到TPY培养基中形成青春双歧杆菌的悬浮液，其浓度为1.5×10⁶个细胞/mL；取青春双歧杆菌的悬浮液0.05ml，分别与鹿茸各萃取部位的不同浓度供试品溶液1.95ml混合于安瓿瓶中，密封；在微量量热仪中用安瓿提升器将安瓿放入测量筒上半部的预热位置，将试样预热20分钟，然后将试样降落到测量杯(测量筒和测量杯均位于测量通道内，测量筒是上半部分，当样品进入仪器时，先要在上半部分预热，之后降落到底部测量杯部位)中进行检测，记录热谱曲线；当曲线重新返回基线时，实验结束。各萃取部位作用下青春双歧杆菌的生长代谢热谱曲线见图1。

3.结果

3.1青春双岐杆菌生长速率常数k的测定

将图1中鹿茸各萃取部位的指数生长期的P_t、t值代入式(1)中，用计算机进行线性拟合得到细菌指数生长期生长速率常数k，结果见表1。

表1鹿茸各萃取部位作用下青春双岐杆菌生长代谢的生物热动力学参数测定结果

3.2有效率E的测定

由于细菌指数生长期的养分和氧气供应量有限，细菌在该期繁殖生长十分迅速，热谱曲线呈指数上升，此期细菌的形态、染色性、生理活性等对外界药物等因素的作用都比较敏感，考察生物学各方面指标多选用该期。由表1可知，青春双岐杆菌的生长状况与其指数生长期的生长速率常数(k)的相关性显著，并且k与浓度的量效关系及其重现性、稳定性均较好，即k能很好地表征药物对细菌生长状态的影响及其生长规律，因此本发明选择k作为评价指标进行有效率E的计算。

E＝(k_t-k₀)/k₀×100％            (2)

式中k_t为鹿茸各萃取部位作用下的指数生长期最大生长速率常数，k₀为空白样品指数生长期的生长速率常数。鹿茸各萃取部位作用下青春双岐杆菌生长的有效率见表2。

表2鹿茸各萃取部位对青春双岐杆菌生长速率常数和有效率的影响

*r：相关系数

3.3鹿茸醇提液的各萃取部位促进胃肠道有益菌生长的测定结果分析

将鹿茸醇提液各萃取部位促进青春双歧杆菌生长的有效率进行比较，可以看出，相比于空白对照组，青春双岐杆菌在鹿茸醇提液各萃取部位作用下的k均增大，表明醇提液各萃取部位均有促进青春双岐杆菌生长的作用。各萃取部位E的大小顺序均为：正丁醇部位＞***部位＞氯仿部位＞乙酸乙酯部位。以上结果表明，4个萃取部位的促菌作用强弱顺序为：正丁醇部位＞***部位＞氯仿部位＞乙酸乙酯部位。结合图1的热谱曲线，可以发现图1(a)曲线的整体走行趋势最好、规律性最强，最能体现萃取部位的促菌特性。以上结果说明，鹿茸醇提液正丁醇萃取部位所含的有效成分和活性物质更多更完全，药效更强，作用更持久，更能反应鹿茸的促菌作用特点。因此，可以选择正丁醇萃取部位对鹿茸的抑菌作用进行评价。

实施例2鹿茸醇提液正丁醇萃取部位对胃肠道有害菌生长代谢的影响

1.测定方法

在恒温37℃、无菌条件下，将1×10⁶个金黄色葡萄球菌接种到蛋白胨培养基中形成金黄色葡萄球菌的悬浮液，其浓度为1.5×10⁶个细胞/mL；取金黄色葡萄球菌的悬浮液0.05ml，与实施例1中制备的鹿茸正丁醇萃取部位不同浓度的供试品溶液1.95ml在安瓿瓶中混合，密封，用安瓿提升器将安瓿放入测量筒上半部的预热位置，将试样预热20分钟，，然后将试样降落到测量杯中进行检测，记录热谱曲线；当曲线重新返回基线时，实验结束。正丁醇萃取部位作用下金黄色葡萄球菌生长代谢的热谱曲线见图2。

2.鹿茸醇提液正丁醇萃取部位对金黄色葡萄球菌生长代谢测定结果

将鹿茸醇提液正丁醇萃取部位的指数生长期的P_t、t值代入式(1)中，用计算机进行线性拟合得到细菌指数生长期生长速率常数k，结果见表3。

表3鹿茸醇提液正丁醇萃取部位作用下金黄色葡萄球菌生长代谢的生物热动力学参数测定结果

3.鹿茸醇提液正丁醇萃取部位对胃肠道有害菌生长代谢的测定结果分析

将金黄色葡萄球菌空白组的热谱曲线与不同浓度正丁醇萃取部位作用下的热谱曲线进行比较(见图2)可以看出，当浓度c＜200μg·mL^-1时，供试品溶液对细菌生长代谢影响不明显，随着浓度的增加，停滞期延长，达峰时间t后移，生长速率常数k、最大产热功率P随之降低，峰形变得平缓，其整体代谢时间延长。表明鹿茸正丁醇萃取部位对金黄色葡萄球菌的生长代谢有不同程度的抑制作用，其抑制程度随浓度的增大而增强。通过筛选得指数生长期的P和生长速率常数k能较全面地代表细菌的热谱信息，且两参数与相应浓度之间呈现良好的线性关系：k＝862.76-0.3359c，r＝0.9903。这些参数均可作为评价正丁醇萃取部位对金黄色葡萄球菌生长抑制作用强弱的客观指标。

结论

鹿茸醇提液中4种萃取部位均对青春双歧杆菌生长代谢有促进作用，其生物热动力学过程可借助热谱曲线及其特征参数进行客观地表征。一方面，鹿茸不同活性部位促进青春双歧杆菌生长代谢的强度按正丁醇部位、***部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位顺序依次减弱；另一方面，乙醇部位、乙酸乙酯部位和氯仿部位对有益菌(青春双岐杆菌)的作用强度差异较正丁醇部位的小，即选择性不强，同时作为活性最强的正丁醇部位在一定浓度范围内能有效抑制有害菌(金黄色葡萄球菌)的生长。这也是该部位活性最强、药效最好的原因之一。

另外，将能最大程度表征正丁醇萃取部位对两种肠道特征菌群(青春双岐杆菌、金黄色葡萄球菌)生长代谢的热力学参数k进行对比分析(见图3)可知，随着正丁醇萃取部位浓度的增加，青春双岐杆菌的生长速率常数k逐渐增加，说明该部位具有促进有益菌(青春双岐杆菌)生长的作用；而且在较大浓度时，正丁醇萃取部位还会对有害菌(金黄色葡萄球菌)产生抑制作用。因此，临床常用的调节代谢功能、抗衰老的鹿茸在规定的用量及服用时间间隔的条件下，可直接促进有益菌的正常生长代谢，待有益菌的数量和活力恢复到正常状态时，亦可抑制腐败菌或致病菌的生长，维持肠道微生态平衡。

本发明以鹿茸作为模型药，根据生物热力学的理论和方法，采用微量热法研究鹿茸不同化学萃取部位对肠道特征菌群代谢的影响。结果表明，鹿茸不同活性部位促进青春双歧杆菌生长代谢强弱顺序为：正丁醇部位＞***部位＞氯仿部位＞乙酸乙酯部位。活性最强的正丁醇萃取部位对金黄色葡萄球菌抑制影响的研究表明，正丁醇萃取部位的浓度大于200μg·mL^-1时，对金黄色葡萄球菌生长具有抑制作用。此外，t_p随供试品溶液浓度的增加而相应地延长；k、P和E均随浓度的增加而相应地减小。微量热法具有灵敏准确、实时、重现性好等特点，可用于名贵药材一一鹿茸的活性部位的筛选，也为药效物质的研究提供了一个新的研究思路和方法。

Claims (7)

1.一种评价鹿茸药效的方法，包括如下步骤：

(1)取鹿茸的***、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇的萃取部位干膏，溶于无菌水中，制成浓度为100μg·mL^-1、200μg·mL^-1、400μg·mL^-1、600μg·mL^-1、800μg·mL^-1、1200μg·mL^-1的各供试品溶液；

(2)在恒温37℃、厌氧、无菌条件下，将双歧杆菌接种到TPY培养基中形成双歧杆菌的悬浮液，其浓度为0.5～5×10⁶个细胞/mL；

(3)取所述双歧杆菌的悬浮液，分别与29～39倍量的鹿茸各萃取部位的不同浓度供试品溶液在安瓿瓶中混合，密封，置于微量量热仪中检测，记录热谱曲线；

(4)分析热谱曲线中各参数随鹿茸各萃取部位的不同浓度的变化关系，根据结果评价鹿茸各萃取部位对双歧杆菌生长代谢的影响。

2.根据权利要求1所述的评价鹿茸药效的方法，其特征在于，在步骤(4)之后进一步包括如下步骤：

(5)根据所述热谱曲线的生长速率常数k，得到促进双歧杆菌生长的有效率E的最大值，依据该最大值确定促菌活性最强的部位，取该活性部位的干膏，加入无菌水溶解，制成浓度为100μg·mL^-1、200μg·mL^-1、400μg·mL^-1、600μg·mL^-1、800μg·mL^-1、1200μg·mL^-1的活性部位的供试品溶液；所述E＝(k_t-k₀)/k₀×100％，式中k_t为鹿茸各萃取部位作用下的指数生长期最大生长速率常数，k₀为空白样品指数生长期的生长速率常数；

(6)在恒温37℃、无菌条件下，将葡萄球菌接种到蛋白胨培养基中形成葡萄球菌的悬浮液，其浓度为0.5～5×10⁶个细胞/mL；

(7)取所述葡萄球菌的悬浮液，与29～39倍量的所述活性部位不同浓度的供试品溶液在安瓿瓶中混合，密封，置于微量量热仪中检测，记录热谱曲线；

(8)分析热谱曲线中各参数随所述活性部位的不同浓度的变化 关系，根据结果评价鹿茸所述活性部位对葡萄球菌生长代谢影响。

3.根据权利要求1所述的评价鹿茸药效的方法，其特征在于，所述双歧杆菌为青春双歧杆菌。

4.根据权利要求2所述的评价鹿茸药效的方法，其特征在于，所述葡萄球菌为金黄色葡萄球菌。

5.根据权利要求1或3所述的评价鹿茸药效的方法，其特征在于，步骤(2)所述双歧杆菌的悬浮液的浓度为1.5×10⁶个细胞/mL。

6.根据权利要求2或4所述的评价鹿茸药效的方法，其特征在于，步骤(6)所述葡萄球菌的悬浮液的浓度为1.5×10⁶个细胞/mL。

7.根据权利要求1所述的评价鹿茸药效的方法，其特征在于，所述干膏的制备步骤如下：

(1)取鹿茸粉末8～12g，加6～10倍量50～80％乙醇回流提取2-3次，每次1-2小时，合并药液，浓缩成浸膏；

(2)用***、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇对所述浸膏分别分级萃取，每种溶剂萃取2～3次，每次20ml，分别合并各萃取液，得到***部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位，将各萃取部位减压干燥得干膏。 

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