CN101747226A - N-乙二酸一酰氨基酸衍生物与n-乙二酸一酰二肽衍生物及其在制备促醒药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及N-乙二酸一酰氨基酸衍生物和N-乙二酸一酰二肽衍生物,以及它们在制备促醒药物中的应用。本发明的衍生物如式I-IV所示,具有降低脑电波δ和σ指数,增加θ指数的作用,可应用于制备促醒药物中。
Description
技术领域
本发明属于药物领域,涉及N-乙二酸一酰氨基酸衍生物和N-乙二酸一酰二肽衍生物,以及它们在制备促醒药物中的应用。
背景技术
本研究组曾经从人参水提取液中首次分离鉴定出一个非蛋白氨基酸:β-N-乙二酸一酰-L-α,β-二氨基丙酸(β-N-oxalo-L-α,β-diaminopropionic acid,缩写符号为β-ODAP)及其异构体α-N-乙二酸一酰-L-α,β-二氨基丙酸(α-N-oxalo-L-α,β-diamino propionic acid,缩写符号为α-ODAP)[龙义成,北京大学博士后研究报告,1991],并发现两种异构体在酸、碱或加热条件下可以相互转化[(1)Long,Y.-C.;Ye,F.-N.;Ye,Y.-H.;Xing,Q.-Y.Chin.Chem.Lett.1992,3,517-520.(2)Long,Y.-C.;Ye,Y.-H.;Xing,Q.-Y.Int.J.Peptide Protein Res.1996,47,42-46.]。1964年,S.L.N.Rao从山黧豆(Lathyrus sativus)中曾分离鉴定了β-ODAP[S.L.N.Rao,P.R.Sarma,Biochemistry,1964,3(3),432],发现它具有强烈的神经兴奋毒性,并认为它可能是食用山黧豆引起中毒的化学物质。我们的研究表明,β-ODAP既具有神经兴奋活性,也具有促醒作用。低剂量的该化合物能使脑电图中的δ(Delta)睡眠波消失。但是,β-ODAP不能作为药物使用,因为存在以下问题:①该化合物毒性较大[刘绪川,张国伟,李雅茹,王蔡香,梁兆年,中国农业科学,1989,22(5),86],对小白鼠腹腔注射LD50为748.86mg/kg,雏鸡腹腔注射LD50为694.93mg/kg;②β-ODAP本身不够稳定,易转化为无活性的α-ODAP。③化学合成有一定的难度,α,β-L-二氨基丙酸分子中含有手性碳,需要立体选择性的合成L-构型,另外,分子中有两个氨基,要进行区域选择性的乙二酸一酰化反应也是合成的一个难点。为此,我们设计合成了一系列氨基酸和二肽的乙二酸一酰基衍生物,从中筛选得到了毒性低,活性强,具有新药开发前景的化合物。
发明内容
本发明的目的在于提供具有毒性低、活性强、有望在制备促醒药物中应用的氨基酸和二肽的乙二酸一酰基衍生物。
本发明提供一种N-乙二酸一酰氨基酸衍生物,其化学结构如式I所示
其中,AA1为氨基酸残基,所述的氨基酸为甘氨酸(Gly)、L-丙氨酸(Ala)、L-精氨酸(Arg)、L-天冬酰胺(Asn)、L-天冬氨酸(Asp)、L-半胱氨酸(Cys)、L-谷氨酰胺(Gln)、L-谷氨酸(Glu)、L-组氨酸(His)、L-异亮氨酸(Ile)、L-亮氨酸(Leu)、L-赖氨酸(Lys)、L-蛋氨酸(Met)、L-苯丙氨酸(Phe)、L-脯氨酸(Pro)、L-丝氨酸(Ser)、L-苏氨酸(Thr)、L-色氨酸(Trp)、L-酪氨酸(Tyr)、L-缬氨酸(Val)、D,L-丙氨酸或β-丙氨酸;
R1为H、C1~C6烷烃基、环烃基、苯基或苄基。
优选地,R1为H。
优选地,本发明所述的N-乙二酸一酰氨基酸衍生物为N-乙二酸一酰-D,L-丙氨酸、N-乙二酸一酰-L-丙氨酸、N-乙二酸一酰-β-丙氨酸、N-乙二酸一酰-L-蛋氨酸、或N-乙二酸一酰-L-苯丙氨酸。
本发明提供一种N-乙二酸一酰二肽衍生物,其化学结构如式II所示
其中,AA2、AA3为氨基酸残基,所述的氨基酸为甘氨酸(Gly)、L-丙氨酸(Ala)、L-精氨酸(Arg)、L-天冬酰胺(Asn)、L-天冬氨酸(Asp)、L-半胱氨酸(Cys)、L-谷氨酰胺(Gln)、L-谷氨酸(Glu)、L-组氨酸(His)、L-异亮氨酸(Ile)、L-亮氨酸(Leu)、L-赖氨酸(Lys)、L-蛋氨酸(Met)、L-苯丙氨酸(Phe)、L-脯氨酸(Pro)、L-丝氨酸(Ser)、L-苏氨酸(Thr)、L-色氨酸(Trp)、L-酪氨酸(Tyr)、或L-缬氨酸(Val);
R2为H、C1~C6烷烃基、环烃基、苯基或苄基。
优选地,R2为H、甲基或乙基。
优选地,本发明所述的N-乙二酸一酰二肽衍生物为N-乙二酸一酰甘氨酰甘氨酸乙酯、N-乙二酸一酰-甘氨酰甘氨酸异丙酯、N-乙二酸一酰甘氨酰甘氨酸叔丁酯、N-乙二酸一酰-L-赖氨酰甘氨酸甲酯、N-乙二酸一酰-L-苯丙氨酰甘氨酸甲酯、N-乙二酸一酰-L-亮氨酰甘氨酸甲酯、N-乙二酸一酰-L-天冬氨酰甘氨酸甲酯、N-乙二酸一酰甘氨酰-L-亮氨酸甲酯、N-乙二酸一酰甘氨酰-L-丙氨酸叔丁酯、N-乙二酸一酰甘氨酰-L-苏氨酸甲酯或N-乙二酸一酰甘氨酰-L-色氨酸甲酯。
本发明提供一种N-乙二酸一酰二肽衍生物,其化学结构如式III所示
其中,AA4为氨基酸残基,所述的氨基酸为甘氨酸(Gly)、L-丙氨酸(Ala)、L-精氨酸(Arg)、L-天冬酰胺(Asn)、L-天冬氨酸(Asp)、L-半胱氨酸(Cys)、L-谷氨酰胺(Gln)、L-谷氨酸(Glu)、L-组氨酸(His)、L-异亮氨酸(Ile)、L-亮氨酸(Leu)、L-赖氨酸(Lys)、L-蛋氨酸(Met)、L-苯丙氨酸(Phe)、L-脯氨酸(Pro)、L-丝氨酸(Ser)、L-苏氨酸(Thr)、L-色氨酸(Trp)、L-酪氨酸(Tyr)、或L-缬氨酸(Val);
R3为H、C1~C6烷烃基、环烃基、苯基或苄基。
优选地,R3为甲基或乙基。
优选地,本发明所述的N-乙二酸一酰二肽衍生物为N-乙二酸一酰甘氨酰甘氨酸乙酯、N-乙二酸一酰甘氨酰甘氨酸异丙酯、N-乙二酸一酰甘氨酰甘氨酸叔丁酯、N-乙二酸一酰-L-赖氨酰甘氨酸甲酯、N-乙二酸一酰-L-苯丙氨酰甘氨酸甲酯、N-乙二酸一酰-L-亮氨酰甘氨酸甲酯、或N-乙二酸一酰-L-天冬氨酰甘氨酸甲酯。
本发明提供一种N-乙二酸一酰二肽衍生物,其化学结构如式IV所示
其中,AA5为氨基酸残基,所述的氨基酸为甘氨酸(Gly)、L-丙氨酸(Ala)、L-精氨酸(Arg)、L-天冬酰胺(Asn)、L-天冬氨酸(Asp)、L-半胱氨酸(Cys)、L-谷氨酰胺(Gln)、L-谷氨酸(Glu)、L-组氨酸(His)、L-异亮氨酸(Ile)、L-亮氨酸(Leu)、L-赖氨酸(Lys)、L-蛋氨酸(Met)、L-苯丙氨酸(Phe)、L-脯氨酸(Pro)、L-丝氨酸(Ser)、L-苏氨酸(Thr)、L-色氨酸(Trp)、L-酪氨酸(Tyr)、或L-缬氨酸(Val);
R4为H、C1~C6烷烃基、环烃基、苯基或苄基。
优选地,R4为甲基。
优选地,本发明所述的N-乙二酸一酰二肽衍生物为N-乙二酸一酰甘氨酰-L-亮氨酸甲酯、N-乙二酸一酰甘氨酰-L-丙氨酸叔丁酯、N-乙二酸一酰甘氨酰-L-苏氨酸甲酯或N-乙二酸一酰甘氨酰-L-色氨酸甲酯。
经实验测定,本发明的N-乙二酸一酰氨基酸衍生物和N-乙二酸一酰二肽衍生物具有降低脑电波δ和σ指数,增加θ指数的作用,可应用于制备促醒药物。
本发明所述的N-乙二酸一酰氨基酸与二肽衍生物的合成均通过将相应的氨基酸(或寡肽)的酯衍生物先与乙二酸单酯单酰氯(例如,乙二酸单苄酯单酰氯或乙二酸单乙酯单酰氯)反应,生成乙二酸单酯保护的氨基酸(或寡肽)的酯衍生物;然后,脱除此衍生物的保护基,得到式I,式II,式III与式IV的目标产物。
在上述的制备过程中,大多数保护的乙二酰氨基酸和小肽衍生物容易纯化。反应的中间体-乙二酸单酯保护的氨基酸(或寡肽)的酯衍生物具有酯溶性,可用乙酸乙酯提取,然后用水洗或酸洗,碱洗除去未反应的原料,从而得到纯化的产物。
在上述制备过程中,优选以乙二酸单苄酯单酰氯与氨基酸(或寡肽)的酯衍生物反应,在得到酯保护的乙二酰氨基酸酯后,可以分两步除去两端的酯基,如先用催化氢化除去苄酯得到单酸单酯的产物再皂化得到目标产物,或者用皂化一步除去所有的酯直接得到游离酸的产物,这样可以简化目标产物的合成。
具体实施方式
实施例1乙二酸单乙酯单酰氯的制备
将143g(0.98mol)乙二酸二乙酯与100g(1.02mol)乙酸钾、100mL水混合,在水浴上搅拌加热,反应2.5h后溶液变清,继续反应1.5h,有固体生成,停止反应,减压浓缩使体积约为100mL,加入***600mL,乙醇200mL,摇匀后放置。滤出乙二酸单酯单钾盐,用***洗涤,过滤,干燥,得138g。称取乙二酸单酯单钾盐50g,放入500mL三口瓶中,加入无水***200mL,冰浴冷却下滴加重蒸的SOCl2 80g,加完后自然升至室温,用油浴加热回流约13h,滤去不溶物,滤渣用***洗涤,滤液经干燥后进行精馏,收集125-130℃的馏分,得产物24.5g,产率56%。
实施例2乙二酸单苄酯单酰氯的制备
安装一带有HCl吸收装置的三口反应瓶,在其中将12.7g(0.1mol,8.6mL)乙二酰氯溶于60mL无水***中,室温向其中逐滴加入8.65g(0.08mol,8.3mL)的苄醇,反应体系温度有所上升,保持于20-25℃,加完后室温搅拌,用TLC检测(硅胶板,***展开)至苄醇点消失,减压蒸去***及过量的乙二酰氯,剩余物为黄色或更深颜色,用油泵进行减压蒸馏,收集73-75℃/0.3mmHg馏分,得无色刺激性气味的液体,重13.6g,86%。EI-MS m/z:198M+。
实施例3N-乙二酸一酰-D,L-丙氨酸(N-Oxalo-D,L-AlaOH)的制备
N-D,L-乙氧基乙二酰丙氨酸甲酯:D,L-丙氨酸甲酯盐酸盐10.0g(72mmol)悬浮于280mL二氯甲烷中,滴加三乙胺10mL,冰浴冷却至0℃后,同时滴加9.8g(72mmol)乙二酸单乙酯单酰氯在10mL二氯甲烷中的溶液与10mL的三乙胺。控制温度0~5℃,滴完后,继续反应2h。蒸去二氯甲烷,得大量白色晶体,用无水***提取,滤去不溶的三乙胺盐酸盐。蒸去***,得黄色油状物,用油泵进行减压蒸馏,收集114~115℃/0.45mmHg的馏分,得到无色粘稠状液体,重10.2g,产率70%。
N-乙二酸一酰-D,L-丙氨酸:
制法1:N-D,L-乙氧基乙二酰丙氨酸甲酯2.1g(10.3mmol)加12mL水溶解,冰浴下加入冷的2N NaOH 20mL,冰浴下搅拌1h,TLC检测(硅胶板,CHCl3∶CH3OH=9∶1展开)至无原料点。将其通过一个处理好的H+型强酸阳离子交换柱,用蒸馏水洗脱,收集酸性部分,得140mL,冷却干燥得油状物,进一步用EtOAc∶CCl4=1∶3溶液重结晶,得针状晶体。m.p.约50℃,不敏锐。研碎后,放入五氧化二磷真空干燥器中干燥三天,得白色晶体1.2g,m.p.128-130℃,产率72%。
制法2:配制浓度约为2N的盐酸和氢氧化钠溶液。用移液管取25.00mL氢氧化钠溶液,加入2滴酚酞指示剂,用上面配制的盐酸滴定至粉红色刚好褪去,用去盐酸24.30mL,计算得此HCl与NaOH溶液的相对浓度分别为1.000∶0.972。N-D,L-乙氧基乙二酰丙氨酸甲酯4.3g(21.2mmol),加20mL水溶解,冰浴冷却下,以移液管加入上述2N NaOH 40.00mL中,冰浴下搅拌1h,TLC检测(同上)至无原料点后,用滴定管向反应液中加入2N HCl 38.88mL,此时溶液pH=1,冷冻干燥,得白色发粘固体,用乙酸乙酯提取,过滤,不溶物(NaCl)用乙酸乙酯洗涤三次后弃去,滤液干燥后减压蒸去溶剂,浓缩至10mL,向其中逐滴加入20mLCCl4,溶液变浑,放入冰箱过夜,有晶体析出,将晶体滤出研碎,放入五氧化二磷真空干燥器中干燥三天,得白色晶体3.1g,m.p.128-130℃,产率91%,元素分析(C5H7NO5)计算值(%)C 37.26,H 4.38,N 8.69实测值C 37.01,H 4.25,N 8.32。
实施例4N-乙二酸一酰-L-丙氨酸(N-Oxalo-L-AlaOH)的制备
N-乙二酸一酰-L-丙氨酸的制备同实施例3,其最终产物用乙酸乙酯-四氯化碳重结晶,m.p.50-53℃,产率60%。FAB-MS m/z:162[M+H]+;1H-NMR(DMSO):δppm 1.35(3H,d,-CH3),4.26(1H,m,-CH),8.95(1H,s,NH);[α]D 20+22.6(C=1,EtOH);元素分析(C5H7NO5·H2O):计算值%C 33.52,H 5.06,N 7.81,实测值C 33.95,H 4.64,N 7.93。
实施例5N-乙二酸一酰甘氨酰甘氨酸乙酯(N-Oxalo-Gly-Gly-OEt)的制备
苄氧基乙二酰甘氨酰甘氨酸乙酯:甘氨酰甘氨酸乙酯盐酸盐3.93g(20mmol)悬浮于120mL CH2Cl2中,加入2.76mL(20mmol)三乙胺,冰浴冷却下滴加3.96g(20mmol)乙二酸单苄酯单酰氯在10mL CH2Cl2中的溶液,同时滴加2.76mL的三乙胺,控制反应温度为0-5℃,反应2h,升至室温反应3h。减压蒸出CH2Cl2,得白色固体,用乙酸乙酯提取(120mL),过滤,不溶物用60mL乙酸乙酯分三次洗涤后弃去,滤液合并,用100mL水洗涤两次,酯层用无水硫酸钠干燥过夜,过滤,蒸去乙酸乙酯,得浅黄色固体5.8g,用乙酸乙酯(15mL)重结晶,得无色针状晶体5.2g,m.p.94-95℃,产率81%。FAB-MSm/z:323[M+H]+;1H-NMR(CD3Cl):δ(ppm)1.25(3H,t,OCH2CH3),3.93(2H,s,Gly-H),3.99(2H,s,Gly-H),4.17(2H,q,OCH2CH3),5.31(2H,s,PhCH2O),7.33-7.46(5H,m,Ph);元素分析(C15H18N2O6):计算值(%)C 55.89,H 5.63,N 8.69,测定值C55.60,H 5.56,N 8.54。
N-乙二酸一酰甘氨酰甘氨酸乙酯:上述苄氧基乙二酰甘氨酰甘氨酸乙酯1.77g(5.5mmol)溶于120mL无水乙醇中,加入1.5g 10%Pd/C,常温常压催化氢化5h,滤去Pd/C,滤液蒸干,得白色固体,用16mL无水乙醇重结晶,得到无色针状晶体1.18g,m.p.161-163℃,产率93%。FAB-MS m/z:233[M+H]+;1H-NMR(CD3Cl):δ(ppm)1.26(3H,t,OCH2CH3),3.94(2H,s,Gly-H),4.00(2H,s,Gly-H),4.19(2H,q,OCH2CH3);元素分析(C8H12N2O6):计算值(%)C 41.38,H5.21,N 12.06,测定值C 40.96,H 5.12,N 11.98。
实施例6N-乙二酸一酰-β-丙氨酸(N-Oxalo-β-AlaOH)的制备
苄氧基乙二酰-β-丙氨酸乙酯:5.18g(33.7mmol)β-丙氨酸乙酯盐酸盐溶于100mL CH2Cl2中,加入4.68mL(33.7mmol)三乙胺,冰浴冷却,向其中滴加6.7g(33.7mmol)乙二酸单苄酯单酰氯在10mL CH2Cl2中的溶液,同时滴加4.68mL三乙胺,加完后,升至室温反应4h,蒸去CH2Cl2,所得固体用100mL乙酸乙酯提取,过滤,不溶物用50mL乙酸乙酯分三次洗涤后弃去,滤液合并,用100mL水洗涤两次。TLC检测酯层中只有一个点,为产物(硅胶板,CHCl3∶CH3OH=9∶1展开,I2显色),酯层用无水硫酸钠干燥过夜,过滤蒸去乙酸乙酯,得微黄色液体,重9.4g,产率99.8%。
皂化采用酸碱中和法,同N-乙二酸一酰-D,L-丙氨酸制法2(见实施例3)。1.63g(5.5mmol)苄氧基乙二酰-β-丙氨酸乙酯,得粗品0.8g,经乙酸乙酯-四氯化碳重结晶两次,真空干燥后得乙二酸一酰-β-丙氨酸,进行如下分析。m.p.128-129℃,FAB-MS m/z:162[M+H]+;1H-NMR(D2O):δ(ppm)3.49(2H,t,CH2),2.62(2H,t,CH2);元素分析(C5H7NO5):计算值(%)C 37.27,N 8.69,H 4.37,实测值(%)C 37.03,N 8.39,H 4.30。
实施例7N-乙二酸一酰-L-蛋氨酸(N-Oxalo-L-MetOH)的制备
苄氧基乙二酰L-蛋氨酸甲酯:反应步骤同苄氧基乙二酰-β-丙氨酸乙酯的制备,经后处理除去溶剂后得淡黄色液体。FAB-MS m/z:326[M+H]+。
N-乙二酸一酰L-蛋氨酸:3.26g(10mmol)苄氧基乙二酰-L-蛋氨酸甲酯溶于20mL甲醇中,冰浴冷却加入20mL 2NNaOH溶液,冰浴反应3h,TLC检测原料点消失后(硅胶板,CHCl3∶CH3OH=9∶1展开),减压除去甲醇,再用20mL***提取两次(除去PhCH2OH)弃去,水层经过H+型阳离子交换树脂,蒸馏水洗脱,收集酸性部分,冻干,得无色粘稠液体,固化后,用乙酸乙酯-石油醚重结晶,得无色粒状晶体1.86g,产率84%。m.p.121-122℃;[α]D 23+6.6(C=1,EtOH);FAB-MS m/z:222[M+H]+;1H-NMR(D2O):δ(ppm)4.55-4.59(1H,m,Met-αH),2.49-2.62(2H,m,Met-βH),2.04-2.22(5H,m,-CH2-S-CH3);元素分析(C7H11NO5S):计算值(%)C 38.00,H 5.01,N 6.33,实测值(%)C 37.73,H 4.98,N6.19。
实施例8N-乙二酸一酰-L-苯丙氨酸(N-Oxalo-L-PheOH)的制备
苄氧基乙二酰L-苯丙氨酸甲酯:合成步骤同苄氧基乙二酰-β-丙氨酸乙酯的合成,后处理得黄色油状物。FAB-MS m/z:342[M+H]+。
N-乙二酸一酰-L-苯丙氨酸:脱保护步骤同N-乙二酸一酰-L-蛋氨酸,产物为白色固体,极易吸潮,产率72%。m.p.103-106℃,[α]D 23+56.8(C=1,EtOH),FAB-MS m/z:238[M+H]+;1H-NMR(D2O):δ(ppm)3.03-3.29(2H,m,βH),4.67-4.70(1H,m,αH),7.24-7.31(5H,m,Ar-H)。
实施例9N-乙二酸一酰-甘氨酰甘氨酸异丙酯(Oxalo-Gly-GlyOPri)的合成
在冰水浴冷却下,将5mL氯化亚砜滴加到10mL异丙醇中,搅拌,加入甘氨酰甘氨酸660mg(5mmol),30min后撤去冰水浴,反应过夜,减压浓缩,抽干后加入10mL异丙醇,反复浓缩3次,用甲醇-***重结晶,得白色晶体880mg(H-Gly-Gly-OPri盐酸盐),产率83%。
H-Gly-Gly-OPri·HCl 420mg(3mmol)加入10mL二氯甲烷中,加1.05mL二异丙基乙基胺(DIEA)(6mmol),搅拌使其溶解,30min内滴入440mg(2.2mmol)乙二酸单苄酯单酰氯的二氯甲烷溶液(15mL),常温反应3h,除去二氯甲烷,加入30mL水,用乙酸乙酯萃取3次,合并乙酸乙酯层,依次用5%柠檬酸水溶液、水、饱和碳酸氢钠水溶液洗涤,然后水洗,饱和氯化钠水溶液洗,无水硫酸镁干燥。除去乙酸乙酯,硅胶柱层析纯化后的洗脱液经浓缩得油状物,放置数日后得白色晶体520mg,产率74%。
将上述产品350mg(约1mmol)溶于25mL无水甲醇中,加入100mg 10%Pd/C,常温常压氢化12h,TLC检测原料点消失后,过滤,浓缩,抽干后得白色晶体240mg,产率92%。ESI-HRMS(C9H15N2O6[M+H]+):247.09301(计算值),247.09270(实验值)。
实施例10N-乙二酸一酰甘氨酰甘氨酸叔丁酯(Oxalo-Gly-GlyOBut)的合成
H-Gly-OBut 262mg(2mmol),Fmoc-GlyOH 594mg(2mmol),3-(二乙氧基磷酰氧基)-1,2,3-苯并三嗪-4-酮(DEPBT)600mg(2mmol)溶于10mL DMF中,加入700μL DIEA(4mmol),搅拌,常温反应4h,加入50mL水,用乙酸乙酯萃取3次,合并乙酸乙酯层,依次用5%柠檬酸水溶液、水、5%碳酸钠水溶液洗涤,水洗,饱和氯化钠水溶液洗,无水硫酸镁干燥,除去乙酸乙酯,用乙酸乙酯-石油醚重结晶,得白色晶体630mg,产率77%。
Fmoc-Gly-GlyOBut 410mg(1mmol)溶于10mL 20%哌啶/DMF中,搅拌,常温反应20min,加入50mL水,20mL乙酸乙酯萃取2次,乙酸乙酯层合并,无水硫酸镁干燥,除去乙酸乙酯,真空干燥,得浅黄色油状物。
将上述产品溶入5mL二氯甲烷中,加入350μL DIEA(2mmol),搅拌,30min内滴入220mg(1.1mmol)乙二酸单苄酯单酰氯的二氯甲烷溶液(5mL),常温反应3h,除去二氯甲烷,加入20mL水,用乙酸乙酯萃取3次,合并乙酸乙酯层,依次用5%柠檬酸水溶液、水、饱和碳酸氢钠水溶液洗涤,然后水洗、饱和氯化钠水溶液洗,无水硫酸镁干燥。除去乙酸乙酯,硅胶柱层析,浓缩得油状物,放置后得白色晶体220mg,产率60%。
上述产品溶于25mL无水甲醇中,加入100mg 10%Pd/C,常温常压氢化12h,TLC检测原料点消失后,过滤,浓缩,抽干放置数日后得白色晶体150mg,产率91%。1H-NMR(CD3OD):δ(ppm)3.99(Gly-αH,s,2H),3.85(Gly-αH,s,2H),1.47(But,s,9H);ESI-HRMS(C10H16N2O6Na[M+Na]+):283.09061(计算值),283.09043(实验值)。
实施例11~14N-乙二酸一酰-L-赖氨酰甘氨酸甲酯(Oxalo-L-Lys-GlyOMe),N-乙二酸一酰-L-苯丙氨酰甘氨酸甲酯(Oxalo-L-Phe-Gly-OMe),N-乙二酸一酰-L-亮氨酰甘氨酸甲酯(Oxalo-L-Leu-GlyOMe),N-乙二酸一酰-L-天冬氨酰甘氨酸甲酯(Oxalo-L-Asp-GlyOMe)的合成
将等摩尔的Boc-L-Lys(Z)-OH(或Boc-L-Phe-OH、或Boc-L-Leu-OH、或Boc-L-Asp(OBzl)-OH)、H-GlyOMe·HCl、DEPBT溶于DMF中(5mL/mmol),加入3倍量的DIEA,室温搅拌4h。将反应液转入分液漏斗中,加入水(10mL/mmol),用乙酸乙酯萃取(20mL/mmol)二次,合并乙酸乙酯,分别用0.1mol/L HCl、水、5%的碳酸钠溶液洗涤一次,再用水洗涤两次,酯层用无水硫酸镁干燥。旋转蒸发除去乙酸乙酯,可得到保护二肽的固体或油状物。用乙酸乙酯或石油醚进行重结晶。产率60-80%。
将上述合成的保护二肽溶于三氟乙酸(TFA)/二氯甲烷(DCM)(v/v 1∶1)混合液中(20mL/mmol),搅拌1h,旋转蒸发除去TFA和DCM,残留物用乙酸乙酯溶解(20mL/mmol),用饱和碳酸氢钠溶液洗涤二次,用硫酸镁干燥。蒸去乙酸乙酯,将残留物溶于无水DCM中(5mL/mmol),加入1.5倍量的DIEA,搅拌下滴加等量的乙二酰单苄酯单酰氯的DCM溶液,反应3h,旋转蒸发除去DCM,残留物用乙酸乙酯溶解(20mL/mmol),分别用5%的碳酸钠溶液、水、0.1mol/L HCl洗涤一次,再用水洗涤两次,酯层用无水硫酸镁干燥。旋转蒸发除去乙酸乙酯,可得到保护的乙二酰二肽衍生物。用硅胶柱层析得到纯化合物。产率为50-70%。
将保护的乙二酰二肽衍生物溶于适量的甲醇中,加入10%的Pd/C,进行常压氢化,脱除所有的苄酯和苄基,过滤除去Pd/C,蒸去甲醇,最终得到N-乙二酸一酰二肽甲酯。产率为80-90%。
N-乙二酸一酰-L-赖氨酰甘氨酸甲酯[α]D 20-2.8(C=0.6,DMF);1H-NMR(CD3OD):δ(ppm)4.43-4.49(Lys-αH,m,1H),3.88-3.99(Gly-αH,m,2H),3.72(OMe,s,3H),3.12-3.16(Lys-εH,t,1H),2.92-2.96(Lys-εH,t,1H),1.77-1.82(Lys-βH,m,2H),1.42-1.72(Lys-γ,δH,m,4H);ESI-HRMS(C11H20N3O6[M+H]+):290.13521(计算值),290.13506(实验值)。
N-乙二酸一酰-L-亮氨酰甘氨酸甲酯[α]D 20-30.9(C=0.3,DMF);1H-NMR(CD3OD):δ(ppm)4.50-4.54(Leu-αH,t,1H),3.93-3.96(Gly-αH,d,2H),3.72(OMe,s,3H),1.69-1.70(Leu-β,γH,m,3H),0.94-0.99(Leu-δH,m,6H);ESI-HRMS(C11H19N2O6[M+H]+):275.12431(计算值),275.12404(实验值)。
N-乙二酸一酰-L-苯丙氨酰甘氨酸甲酯[α]D 20-10.2(C=0.3,DMF);1H-NMR(CD3OD):δ(ppm)7.19-7.29(Phe-ArH,m,5H),4.69-4.72(Phe-αH,m,1H),3.94(Gly-αH,s,2H),3.72(OMe,s,3H),3.22-3.27(Phe-βH,m,1H),2.99-3.05(Phe-βH,m,1H);ESI-HRMS(C14H16N2O6Na[M+Na]+):331.09061(计算值),331.09052(实验值)。
N-乙二酸一酰-L-天冬氨酰甘氨酸甲酯1H-NMR(CD3OD):δ(ppm)4.31-4.32(Asp-αH,d,1H),3.89(Gly-αH,s,2H),3.72(OMe,s,3H),2.77-2.95(Asp-βH,m,2H);ESI-HRMS(C9H12N2O8Na[M+Na]+):299.04914(计算值),299.04917(实验值)。
实施例15N-乙二酸一酰甘氨酰-L-亮氨酸甲酯(Oxalo-Gly-L-LeuOMe)的合成
Boc-GlyOH(0.48g,2.74mmol),L-LeuOCH3·HCl(0.45g,2.47mmol)悬浮于10mL的DCM,冰浴搅拌下加入Et3N(0.35mL),最后加入HOBt(0.19g,1.41mmol)、DCC(0.52g,2.52mmol)。用TLC板检测反应情况,于室温搅拌过夜,反应24h后,滴加3滴冰乙酸,破坏未反应的DCC,继续搅拌0.5h后用约40mL的乙酸乙酯稀释反应液后过滤,滤液转移至分液漏斗中。依次用5%的柠檬酸溶液、水、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤。有机相用无水硫酸镁干燥,过滤,滤液用旋转蒸发仪蒸去溶剂,获得油状物和少量固体,用约10mL乙酸乙酯稀释并将其转移至50mL茄形瓶,再过滤,滤液转至25mL的茄形瓶中,旋去溶剂,出现油状物。最后用油泵抽干溶剂,获得淡黄色油状物(Boc-Gly-L-LeuOCH3),0.44g;产率为58%。
将上述油状物溶于1.0mL DCM,冰浴下加入TFA 1.0mL,搅拌1h后,旋转蒸发除去TFA和DCM,残留物加入无水***,得白色固体,0.38g,产率:84%。将此固体溶于无水DCM(5mL)中,冰浴下加入Et3N 0.13mL,搅拌下再同时滴加乙二酸单苄酯单酰氯溶液(0.24mL溶于1.0mL DCM)和Et3N(0.13mL),反应4h后,旋转蒸发除去溶剂,残留物用乙酸乙酯溶解(120mL),依次用水、5%的碳酸钠溶液洗涤,酯层用无水硫酸镁干燥。旋转蒸发除去乙酸乙酯,得到保护的乙二酰二肽衍生物。用硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯=2∶1洗脱)得产物0.25g,产率82%。1H-NMR(CDCl3):δ(ppm)7.80-7.36(m,5H,Ph),6.38(d,1H,NH),5.33(s,2H,CH2Ph),4.65(m,1H,Leu-αH),4.08(d,2H,Gly-αH),3.75(s,3H,OMe),1.65(m,2H,Leu-βH),1.56(t,1H,Leu-γH),0.95(s,6H,Leu-δH).
将此保护的乙二酰二肽衍生物溶于乙醇(20mL)中,加入10%的Pd/C(0.1g),常压氢化(12h),过滤除去Pd/C,蒸去乙醇,最终得到Oxalo-Gly-L-LeuOMe0.17g,粘稠状物,产率90%。[α]D 20-20.0(C=0.1,DMF);ESI-HRMS(C11H18N2O6Na[M+Na]+):297.10626(计算值),297.10611(实验值);1H-NMR(MeOD):δ(ppm)4.52(m,1H,Leu-αH),4.00(d,2H,Gly-αH),3.73(s,3H,OMe),1.70(m,1H,Leu-γH),1.64(m,2H,Leu-βH),0.98(d,3H,Leu-δH),0.94(d,3H,Leu-δH).
实施例16N-乙二酸一酰甘氨酰-L-丙氨酸叔丁酯(Oxalo-Gly-L-AlaOBut)的合成
Fmoc-GlyOH(0.74g,2.48mmol),L-AlaOBut·HCl(0.45g,2.48mmol)悬浮于10mL的DCM中,冰浴搅拌下加入Et3N(0.35mL),最后加入HOBt(0.19g,1.41mmol)、DCC(0.52g,2.52mmol)。用TLC板检测反应情况,于室温搅拌过夜,反应10h后,滴加3滴冰醋酸,破坏未反应的DCC,继续搅拌0.5h后用约40mL的乙酸乙酯稀释后过滤,滤液转移至的分液漏斗中。滤液依次用5%的柠檬酸溶液、水、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤。有机相用无水硫酸镁干燥,过滤,滤液用旋转蒸发仪除去溶剂,得白色固体(Fmoc-Gly-L-AlaOBut)1.0g,产率97%。
将上述固体溶于5.0mL DCM,冰浴下加入二乙胺5.0mL,搅拌3h后,旋转蒸发除去溶剂,残留物真空干燥后溶于无水DCM(10mL)中,冰浴下加入Et3N 0.36mL,搅拌下再同时滴加乙二酸单苄酯单酰氯溶液(0.40mL溶于1.0mL DCM),反应6h后,旋转蒸发除去溶剂,残留物用乙酸乙酯溶解(120mL),依次用水、5%的碳酸钠溶液、饱和食盐水洗涤,酯层用无水硫酸镁干燥。旋转蒸发除去乙酸乙酯,得到保护的乙二酰二肽衍生物。用硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯=2∶1洗脱)得白色固体0.62g,产率68%。1H-NMR(CDCl3):δ(ppm)7.74-7.36(m,5H,Ph),6.37(d,1H,NH),5.33(s,2H,CH2Ph),4.83(m,1H,Ala-αH),4.05(d,2H,Gly-αH),1.49(s,9H,tBu),1.41(d,3H,Ala-βH).
将此保护的乙二酰二肽衍生物溶于乙醇(20mL)中,加入10%的Pd/C(0.1g),常压氢化(12h),过滤除去Pd/C,蒸掉乙醇,最终得到Oxalo-Gly-L-AlaOBut0.43g,粘稠状物,产率92%。[α]D 20-27.0(C=0.4,DMF);ESI-HRMS(C11H18N2O6Na[M+Na]+):297.10626(计算值),297.10606(实验值);1H-NMR(MeOD):δ(ppm)4.31(q,1H,Ala-αH),3.99(d,2H,Gly-αH),1.48(s,9H,tBu),1.38(d,3H,Ala-βH).
实施例17N-乙二酸一酰甘氨酰-L-苏氨酸甲酯(Oxalo-Gly-L-ThrOMe)的合成
Fmoc-GlyOH(0.57g,1.92mmol),L-Thr(But)-OMe·HCl(0.43g,1.91mmol)悬浮于3.5mL的DCM中,冰浴搅拌下加入Et3N(0.27mL),最后加入HOBt(0.15g,1.11mmol)、DCC(0.40g,1.94mmol)。用TLC板检测反应情况,于室温搅拌过夜,反应15h后,滴加3滴冰醋酸,破坏未反应的DCC,继续搅拌0.5h后用约40mL的乙酸乙酯稀释后过滤,滤液转移至分液漏斗中。滤液依次用5%的柠檬酸溶液、水、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤。有机相用无水硫酸镁干燥,过滤,滤液用旋转蒸发仪除去溶剂,得白色固体。此固体用硅胶柱层析纯化,石油醚∶乙酸乙酯=2∶1洗脱,得固体(Fmoc-Gly-L-Thr(But)-OMe)0.60g,产率为:66%。
将上述固体溶于5.0mL DCM,冰浴下加入二乙胺5.0mL,搅拌3h后,旋转蒸发除去溶剂,残留物真空干燥后溶于无水DCM(5mL)中,冰浴下加入Et3N 0.21mL,搅拌下再同时滴加乙二酸单苄酯单酰氯溶液(0.25mL溶于1.0mLDCM),反应6h后,旋转蒸发除去溶剂,残留物用乙酸乙酯溶解(120mL),依次用水、5%的碳酸钠溶液、饱和食盐水洗涤,酯层用无水硫酸镁干燥。旋转蒸发除去乙酸乙酯,得到保护的乙二酰二肽衍生物。用硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯=2∶1洗脱)得粘稠状物,0.33g,产率57%。1H-NMR(CDCl3):δ(ppm)7.75-7.37(m,5H,Ph),6.41(d,1H,NH),5.33(s,2H,CH2Ph),4.51(d,1H,Thr-αH),4.26(m,1H,Thr-βH),4.15(m,2H,Gly-αH),3.74(s,3H,OMe),1.19(d,3H,Thr-γH),1.12(s,9H,tBu).
将上述化合物溶于0.5mL DCM,冰浴下分别加入苯甲醚0.1mL,TFA1.0mL,搅拌1h后,旋转蒸发除去TFA和DCM,残留物用硅胶柱层析(DCM∶MeOH=60∶1洗脱)得粘稠状物,0.2g,产率77%。将此保护的乙二酰二肽衍生物溶于乙醇(20mL)中,加入10%的Pd/C(0.1g),常压氢化(12h),过滤除去Pd/C,蒸去乙醇,最终得到Oxalo-Gly-L-ThrOMe 0.15g粘稠状物,产率100%。[α]D 20+5.1(C=0.2,DMF);ESI-HRMS(C10H16N2O7Na[M+Na]+):299.08552(计算值),299.08547(实验值);1H-NMR(MeOD):δ(ppm)4.52(d,1H,Thr-αH),4.32(m,1H,Thr-βH),4.07(s,2H,Gly-αH),3.76(s,3H,OMe),1.20(d,3H,Thr-γH).
实施例18N-乙二酸一酰甘氨酰-L-色氨酸甲酯(Oxalo-Gly-L-TrpOMe)的合成
Boc-GlyOH(0.29g,1.65mmol),L-TrpOMe·HCl(0.42g,1.65mmol)悬浮于4mL的DCM中,冰浴搅拌下加入Et3N(0.23mL),最后加入HOBt(0.11g,0.81mmol)、DCC(0.34g,1.65mmol)。用TLC板检测反应情况,于室温搅拌过夜,反应15h后,滴加3滴冰醋酸,破坏未反应的DCC,继续搅拌0.5h后用约40mL的乙酸乙酯稀释后过滤,用适量的乙酸乙酯洗涤反应瓶和固体,最后滤液转移至100mL的分液漏斗中。滤液依次用5%的柠檬酸溶液、水、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤。有机相用无水硫酸镁干燥,过滤,滤液用旋转蒸发仪除去溶剂,得白色固体(Boc-Gly-L-TrpOMe)。
将上述白色固体溶于1.6mL DCM,冰浴下分别加入苯甲醚0.1mL,TFA1.0mL,搅拌1h后,旋转蒸发除去TFA和DCM,残留物真空干燥后为一油状物。将此油状物溶于无水DCM(5mL)中,冰浴下加入Et3N 0.24mL,搅拌下再同时滴加乙二酸单苄酯单酰氯溶液(0.29mL溶于1.0mLDCM)和Et3N(0.27mL),反应4h后,旋转蒸发除去溶剂,残留物用乙酸乙酯溶解(120mL),分别用水、5%的碳酸钠溶液洗涤,酯层用无水硫酸镁干燥。旋转蒸发除去乙酸乙酯,得到保护的乙二酰二肽衍生物。用硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯=1.5∶1洗脱)得到白色固体0.37g,产率约51%(3步)。1H-NMR(CDCl3):δ(ppm)8.10-6.97(m,10H,Ar),6.42(d,1H,NH),5.31(s,2H,CH2Ph),4.93(m,1H,Trp-αH),3.91(d,2H,Gly-αH),3.72(s,3H,OMe),3.34(s,2H,Trp-βH).
将此保护的乙二酰二肽衍生物溶于乙醇(20mL)中,加入10%的Pd/C(0.1g),常压氢化(12h),过滤除去Pd/C,蒸去乙醇,最终得到Oxalo-Gly-L-TrpOMe0.26g,淡红色固体,产率90%。[α]D 20+15.5(C=0.2,DMF);ESI-HRMS(C16H18N3O6[M+H]+):348.11956(计算值),348.11982(实验值);1H-NMR(MeOD):δ(ppm)7.53-7.02(m,5H,Ar),4.77(m,1H,Trp-αH),3.95(d,2H,Gly-αH),3.68(s,3H,OMe),3.33(dd,1H,Trp-βH),3.22(dd,1H,Trp-βH).
实施例19促醒活性实验
在体重2.0-2.5千克的成年家兔(New Zealand)上,采用第三脑室注射和静脉注射两种给药途径,测定了化合物N-乙二酸一酰-L-丙氨酸(Oxalo-L-AlaOH)及N-乙二酸一酰甘氨酰甘氨酸乙酯(Oxalo-GlyGlyOEt)对脑电波δ(delta)、σ(sigma)与θ(theta)指数的影响。实验前分别在左、右运动前区,右枕和右颞等区装置急性或慢性不锈钢电极,用单极或双极引导,脑电各波的计算机分析均以运动前区为基础。侧脑室手术根据Sawyer的图谱,笫三脑室手术根据Monnier的方法在第三脑室和大脑导水管间***一根和侧脑室同一外径的导管。静脉注射用0.9%NaCl消毒注射液溶解样品或作对照。脑室注射用新鲜配制的类脑脊液(0.9%NaCl溶液加葡萄糖)溶解样品或作对照。脑室注射用自动连续注射装置和微量注射器进行(25微升/分)。全部实验用ND-82型笔描器记录脑电,用MF-5型频率自动分析装置进行积分计算,用DTR-1204型磁带记录器进行多道记录。
实验结果(见表1、2、3、4)表明上述化合物能够显著降低脑电波δ和σ指数(瞌睡),和增加θ指数(觉醒),因此具有显著的促醒活性。
表1第三脑室注射化合物对脑电波δ指数的影响
表2静脉注射化合物对脑电波δ指数的影响
表3静脉注射化合物对脑电波σ指数的影响
表4静脉注射化合物对脑电波θ指数的影响
其他的一些药理实验还表明,N-乙二酸一酰甘氨酰甘氨酸乙酯及其同系物具有以下特点:(1)不同给药途径(脑室注射,静脉注射,腹腔注射,口服)均有效,而且口服给药途径的作用时间最长。(2)N-乙二酸一酰甘氨酰甘氨酸乙酯的有效作用剂量较低。大鼠、家兔等实验动物的脑室有效作用剂量是10μg/兔,静脉有效作用剂量是100μg/kg,腹腔的有效作用剂量是150μg/kg,而口服的有效作用剂量为150μg/kg。(3)N-乙二酸一酰甘氨酰甘氨酸乙酯的毒性较小。以有效作用剂量50倍的剂量给药(小鼠,i.p.)或40倍的剂量给药(大鼠,p.o.)在持续观察的两周内,均未见急性毒性效应。因此,上述化合物可以被应用于制备促醒药物。
Claims (12)
2.根据权利要求1所述的N-乙二酸一酰氨基酸衍生物,其特征在于:所述的N-乙二酸一酰氨基酸衍生物为N-乙二酸一酰-D,L-丙氨酸、N-乙二酸一酰-L-丙氨酸、N-乙二酸一酰-β-丙氨酸、N-乙二酸一酰-L-蛋氨酸、或N-乙二酸一酰-L-苯丙氨酸。
3.权利要求1或2所述的N-乙二酸一酰氨基酸衍生物在制备促醒药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的N-乙二酸一酰二肽衍生物,其特征在于:所述的N-乙二酸一酰二肽衍生物为N-乙二酸一酰甘氨酰甘氨酸乙酯、N-乙二酸一酰甘氨酰甘氨酸异丙酯、N-乙二酸一酰甘氨酰甘氨酸叔丁酯、N-乙二酸一酰-l-赖氨酰甘氨酸甲酯、N-乙二酸一酰-L-苯丙氨酰甘氨酸甲酯、N-乙二酸一酰-L-亮氨酰甘氨酸甲酯、N-乙二酸一酰-L-天冬氨酰甘氨酸甲酯、N-乙二酸一酰甘氨酰-L-亮氨酸甲酯、N-乙二酸一酰甘氨酰-L-丙氨酸叔丁酯、N-乙二酸一酰甘氨酰-L-苏氨酸甲酯或N-乙二酸一酰甘氨酰-L-色氨酸甲酯。
6.权利要求4或5所述的N-乙二酸一酰二肽衍生物在制备促醒药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的N-乙二酸一酰二肽衍生物,其特征在于:所述的N-乙二酸一酰二肽衍生物为N-乙二酸一酰甘氨酰甘氨酸乙酯、N-乙二酸一酰甘氨酰甘氨酸异丙酯、N-乙二酸一酰甘氨酰甘氨酸叔丁酯、N-乙二酸一酰-L-赖氨酰甘氨酸甲酯、N-乙二酸一酰-L-苯丙氨酰甘氨酸甲酯、N-乙二酸一酰-L-亮氨酰甘氨酸甲酯、或N-乙二酸一酰-L-天冬氨酰甘氨酸甲酯。
9.权利要求7或8所述的N-乙二酸一酰二肽衍生物在制备促醒药物中的应用。
11.根据权利要求10所述的N-乙二酸一酰二肽衍生物,其特征在于:所述的N-乙二酸一酰二肽衍生物为N-乙二酸一酰甘氨酰-L-亮氨酸甲酯、N-乙二酸一酰甘氨酰-L-丙氨酸叔丁酯、N-乙二酸一酰-氨酰-L-苏氨酸甲酯、或N-乙二酸一酰甘氨酰-L-色氨酸甲酯。
12.权利要求10或11所述的N-乙二酸一酰二肽衍生物在制备促醒药物中的应用。
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