CN101744948A - 一种油茶蒲提取物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种油茶蒲提取物及其制备方法和用途。以提取物总量计，所述提取物中含有5-70w/w％总黄酮(以芦丁计)；所述油茶蒲是山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia L)木本植物油茶的果实的果壳。
Description
技术领域
本发明涉及植物提取物领域。更具体地涉及从油茶果实的果壳中提取的有效部位及其制备方法和用途。
背景技术
油茶(Camellia oleifera Abel)是山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia)木本植物，是我国特有的油料树种，主要分布在我国的江西、湖南、浙江、广西、广东、福建、贵州等地。油茶按花的颜色不同可分为白花油茶、红花油茶和黄花油茶，种植最广的为白花茶油，其中以普通油茶分布最广。山茶油含有丰富的不饱和脂肪酸，有很高的营养价值，被誉为东方的橄榄油。目前中国油茶种植面积正逐年增加，油茶籽的产量也在逐步增长。
油茶蒲又称茶包，为油茶果的外壳，约占油茶果总重量的2/3，是油茶生产的废弃物，每年产量约有170多万吨。在油茶产区，油茶蒲或作为燃料或被丢弃，利用率极低[中国油脂，1996，21(4)：39-42]。有关油茶蒲的研究，有文献报道利用油茶蒲生产碳酸钾和焦磷酸钾，对它的深入研究利用未见报道。可见对油茶蒲的开发和利用对振兴油茶产业，增加油茶的附加值，实现油茶副产物的综合利用，具有深远的意义。
脂肪酸合酶(Fatty Acid Synthase，FAS)，是催化乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A合成内源性长链脂肪酸的关键酶，研究表明它是治疗肥胖和癌症的潜在靶点，关于它的研究越来越引起人们的关注，它的抑制剂因其潜在的减肥与抗癌功效更成为研究中的热点。浅蓝菌素(Cerulenin)是最早被发现的FAS抑制剂，但是它化学结构不稳定，有一定毒性，严重限制了其应用范围，Kuhajda等模拟浅蓝菌素的抑制机制，合成及筛选出了化学结构较为稳定的FAS抑制剂C75。随着人们对天然产物的青睐，人们越来越希望从天然产物中寻找高效脂肪酸合酶抑制剂。
本领域迫切需要提供更多的来源于天然植物的活性物质，如高效FAS抑制剂，尤其是来自于目前被大量丢弃的天然原料的活性物质。
发明内容
本发明旨在提供一种油茶蒲提取物。
本发明的第二个目的是提供所述油茶蒲提取物的制备方法。
本发明的第三个目的是提供所述油茶蒲提取物的用途。
本发明的第四个目的是提供一种含有所述油茶蒲提取物的组合物。
在本发明的第一方面，提供了一种油茶蒲提取物，以提取物总量计，所述提取物中含有5-70w/w％总黄酮(以芦丁计)；所述油茶蒲是山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia L)木本植物油茶的果实的果壳。
在另一优选例中，所述油茶蒲提取物在285nm和236nm处有两个紫外吸收峰。
在另一优选例中，所述的提取物是经醇-水溶剂提取的物质，所述的醇选自甲醇或乙醇；更佳地，所述的提取物是经醇浓度为0-100v/v％的醇-水溶剂提取的物质，所述的醇选自甲醇或乙醇。
在另一优选例中，所述的油茶蒲提取物通过如下步骤获得：
(1)将油茶蒲和醇-水溶剂混合，用选自下述的一种或多种方式提取得到油茶蒲提取物；浸提、热回流提取、逆流提取、超声波提取、或微波辐射提取。
在另一优选例中，所述的浸提条件为：提取温度为20-100℃，提取时间0.1-5小时，料液比W/V：1∶3-30；所述的微波辐射提取的条件为：微波辐射功率为100-6000W，辐射时间为20秒-5小时(更佳地，2min-1h)，料液比为1∶3-1∶30(W/V)；所述的超声波提取的条件为：料液比1∶3-1∶30(W/V)，超声波功率50-5000W，超声波作用时间12-180分钟。
在另一优选例中，在步骤(1)后还包括下述步骤：
(2)分离纯化；所述的分离纯化选自柱层析、或膜分离。
在本发明的第二方面，提供了一种如上所述的油茶蒲提取物的制备方法，所述的方法包括步骤：
(1)将油茶蒲和醇-水溶剂混合，用选自下述的一种或多种方式提取得到油茶蒲提取物；浸提、热回流提取、逆流提取、超声波提取、或微波辐射提取。
在另一优选例中，所述醇-水溶剂中醇的浓度为0-100v/v％；所述的浸提条件为：提取温度为20-100℃，提取时间0.1-5小时，料液比W/V：1∶3-30；所述的微波辐射提取的条件为：微波辐射功率为100-6000W，辐射时间为20秒-5小时(更佳地，为2min-1h)，料液比为1∶3-1∶30(W/V)；所述的超声波提取的条件为：料液比1∶3-1∶30(W/V)，超声波功率50-5000W，超声波作用时间12-180分钟。
在另一优选例中，在步骤(1)后还包括下述步骤：
(2)分离纯化；所述的分离纯化选自柱层析、或膜分离。
在另一优选例中，所述的膜分离的条件为：采用卷式超滤膜***，操作压力为0.4-1.2Mpa，操作温度20-60℃。
在另一优选例中，所述的柱层析填料选自聚酰胺、硅胶、大孔树脂、纤维素、琼脂糖凝胶或葡聚糖凝胶。
在本发明的第三方面，提供了一种如上所述的油茶蒲提取物在制备抑制脂肪酸合酶、减少脂肪或抗氧化的组合物中的应用。
在另一优选例中，所述的油茶蒲提取物还具有抗菌、抗炎、抗辐射、脱敏、消除疲劳、缓解精神压力、增强免疫功能、保护心脑血管、抗肿瘤预防癌症、美白、和/或促进头发生长的功能。
在另一优选例中，所述的组合物是功能性食品配料、膳食补充剂、天然药物原料或化妆品功能成分。
在本发明的第四方面，提供了一种组合物，以组合物总重量计，它含有重量百分比为1-99％的如上所述的油茶蒲提取物和药学上或食品学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的组合物为饮料、酒类、胶囊、软胶囊、粉剂、片剂、颗粒剂、口服液、喷雾剂及霜剂、乳剂、水剂和膏体。
在另一优选例中，所述的组合物为胶囊、粉剂、片剂、颗粒剂、口服液、喷雾剂、霜剂、乳剂、水剂、或浸膏。
在另一优选例中，所述的组合物是功能性食品配料、膳食补充剂、天然药物原料或化妆品功能成分。
据此，本发明提供了来源于天然植物的活性物质，尤其是来自于目前被大量丢弃的天然原料(如油茶蒲)的活性物质。
附图说明
图1是实施例7中所获得的油茶蒲提取物XI的紫外图谱，在200-400nm的波长范围内进行扫描，紫外光谱图显示，在285nm、236nm处有两个明显的紫外吸收峰。
图2是实施例7中所很多的油茶蒲提取物的液相图谱；其中
A是油茶蒲50％乙醇提取物IV的液相图谱；B是油茶蒲提取物XIII的液相图谱。
图3油茶蒲提取物液相图谱特征性物质紫外扫描图谱；其中
A是油茶蒲液相图谱里出峰时间为10.9min的特征性物质；B是油茶蒲液相图谱里出峰时间为11.9min的特征性物质
图4显示了油茶蒲提取物对脂肪酸合酶的不可逆抑制作用
具体实施方式
发明人通过对油茶生产的废弃物-油茶蒲的深入研究，发现其中的水溶性有效部位具有良好的减肥功效和抗氧化作用，该有效部位中的黄酮是重要的活性成分，该有效部位在200-400nm的波长范围内进行扫描显示，285nm、236nm处有两个明显的紫外吸收峰。在此基础上完成了本发明。
油茶蒲提取物
本发明提供的油茶蒲提取物是从山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia L)木本植物油茶的果实的果壳——油茶蒲中得到的混合物。可用于本发明的油茶包括：白花油茶、红花油茶和黄花油茶，更佳地为白花油茶，如普通油茶(Camellia oleifera Abel)、攸县油茶(Camellia yuhsienensis Hu)、小叶油茶(Camellia miocar pa Hu)。
本发明提供的油茶蒲提取物是油茶蒲的水溶性有效部位，其中含有多酚、黄酮；以油茶蒲干基计有效部位含量为1-30w/w％，黄酮在有效部位的含量以芦丁计为5-70w/w％。
本发明提供的油茶蒲提取物是经醇浓度为0-100v/v％的醇-水溶剂提取的物质，所述的醇选自甲醇或乙醇。所述的提取方式选自浸提、热回流提取、逆流提取、超声波提取、和/或微波辐射提取。
本发明提供的油茶蒲提取物，在285nm和236nm处有两个紫外吸收峰。当采用下述条件的高效液相色谱测定本发明提供的油茶蒲提取物时，保留时间分别为4.2分钟，7.8分钟，10.9分钟，11.9分钟的峰的面积总和是所有峰面积之和的40-80％：
固定相：反相色谱柱(优选C18)；
流动相：乙腈和0.5-2v/v％醋酸水溶液的混合溶液；
流速：1mL/min。
较佳地，所述的高效液相色谱测定是梯度洗脱：在0-60分钟时间内乙腈和0.5-2v/v％醋酸水溶液的体积比从1∶9变化到1∶2。
本发明提供的油茶蒲提取物的形态没有特别的限定，例如可以是粉末状、膏状、或是液体状(包括糊状)。
油茶蒲提取物的制备方法
本发明提供的油茶蒲提取物可以通过下述方法制备获得：
(1)将油茶蒲和醇-水溶剂混合，用选自下述的一种或多种方式提取得到油茶蒲提取物；浸提、热回流提取、逆流提取、超声波提取、或微波辐射提取。
本发明采用的油茶蒲原料可以进行预处理，也可以不经预处理。优选的原料是5-50目的碎片，含水量在10w/w％以下。
本发明提供的油茶蒲提取物是通过醇-水溶剂提取得到。所述的醇-水溶液是体积百分比为0-100％的醇溶液，可以使用本领域常用的醇类，如乙醇和甲醇，优选乙醇。所述的提取方法是热回流提取、逆流提取、微波辅助提取、超声波辅助提取，或其组合。
在本发明的一个实施例中，浸提条件为：提取温度为20-100℃，提取时间0.1-5小时，料液比W/V：1∶3-30。
在本发明的-个实施例中，微波辅助提取的工艺参数为：微波辐射功率100-6000W，辐射时间为20秒-5小时，料液比为1∶3-30(W/V)；较佳地，微波辐射功率为200-4000W(更佳地为500-4000W)，辐射时间为20秒-1小时(更佳地为20秒-15分钟)，料液比为1∶5-20(W/V)。
在本发明的一个实施例中，超声波辅助提取料液比1∶3-30(W/V)，超声波功率50-5000W，超声波作用时间12-180分钟；较佳地，超声波辅助提取料液比1∶5-30(W/V)或1∶3-1∶20(W/V)，超声波功率200-2000W，超声波作用时间18-60分钟或20-120分钟。
在本发明的一个实施例中，热回流辅助提取料液比1∶3-30(W/V)，温度60-100℃，提取时间0.3-5小时；更佳地，热回流辅助提取料液比1∶3-30(W/V)，80-100℃。
在另一优选例中，在步骤(1)后还可以辅以其他高效分离手段进一步纯化。可以使用本领域常规的方法进行进一步地分离纯化，其中优选膜分离或柱层析。
在本发明的一个实施例中，所述的膜分离的条件为：采用卷式超滤膜***，操作压力为0.3-2Mpa(较佳地为0.4-1.2Mpa)，操作温度10-70℃(较佳地为20-50℃)。
在本发明的一个实施例中，所述的柱层析填料选自聚酰胺、硅胶、或大孔树脂。
油茶蒲提取物的用途
本发明提供的油茶蒲提取物具有抑制脂肪酸合酶、减少脂肪、和抗氧化的作用。
本发明提供的油茶蒲提取物可有效地抗自由基、抗氧化、抗菌、抗炎、抗辐射、脱敏、消除疲劳、缓解精神压力、增强免疫功能、调节脂质代谢、减肥、保护心脑血管、抗肿瘤预防癌症、美白、促进头发生长。因此，本发明也提供了通过给需要的受试者施加有效量的所述油茶蒲提取物来预防、改善或治疗所述疾病的方法。
当施用时，所用的油茶蒲提取物有效剂量可随施用的模式和待治疗的疾病的严重程度而变化。具体情况根据受试者的个体情况来决定，或者在熟练一是或营养师可以判断的范围内。
如本文所用，术语“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人或/或动物所接受的量。
含有油茶蒲提取物的组合物
本发明提供一种组合物，以所述组合物总重量计，它含有重量百分比为1-99％的本发明提供的油茶蒲提取物和药学上或食品学上可接受的载体。
在本发明中，各种组合物可以按本领域熟知的方法配制，可以将油茶蒲提取物与药学上或食品学上可接受的载体混合配制。药学上或食品学上可接受的载体的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和***反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。所述的有药学上或食品学上可接受的载体中还可以包含甘草提取物等天然提取物、维生素和微量元素等营养强化剂及膳食纤维、糊精。
“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋型剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的，可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、润湿剂或乳化剂、矫味剂、pH缓冲物质等。
在本发明的另一优选方式中，所述的食品学上可接受的载体或赋形剂可含有：填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、矫味剂、包覆材料、膳食制品、或缓释剂。
对于本发明所述的组合物的剂型没有特别的限制，可以是任何适用于哺乳服用的剂型；优选的，所述的剂型可选自胶囊、软胶囊、粉剂、片剂、颗粒剂、口服液、喷雾剂、霜剂、乳剂、水剂或膏体等。
本发明的组合物包括药物组合物、食品组合物、保健品组合物、食品配料组合物、膳食补充剂组合物、天然药物原料组合物、或化妆品功能成分组合物；也可以是保健饮料、酒类等。只要它们含有或基本上由茶蒲提取物组成即可。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
本发明的主要优点在于：
1、建立了有效的提取工艺，可确定油茶蒲提取物及相关制剂的标准化；
2、可保证达到药品有效、安全、稳定的三个基本要求；
3、充分利用了以前被丢弃的油茶蒲，减少了资源浪费，有利于环境保护；
4、提供了山茶资源的利用度，提高了经济效益，有利于农民的增收。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
硝酸铝-亚硝酸钠比色法
标准曲线的绘制：准确称取以五氧化二磷为干燥剂减压干燥(60℃，0.09Mpa)至恒重的芦丁标准品，用60％乙醇溶解，定容至250mL，摇匀，得标准应用液，放置低温暗箱内，及时检测。分别吸取标准应用液1.0mL，2.0mL，3.0mL，4.0mL，5.0mL，6.0mL于25mL容量瓶中，分别用60％乙醇添至10mL，加入5％NaNO2溶液1.0mL，摇匀，放置6min，再加入10％Al(NO3)3溶液1.0mL，6min后加入4％NaOH溶液10mL，混匀，再用30％的乙醇定容至刻度，摇匀，放置15min后在波长510nm处测定吸光度A，得芦丁含量y(mg/mL)与吸光度A间的回归方程。
样品中黄酮含量的测定：取待测液1mL于25mL容量瓶中，测定方法同标准品，测定其在510nm处的吸光度A，由回归方程计算黄酮含量。
提取物黄酮含量(％)＝(黄酮类化合物质量/提取物质量)×100％
福林酚比色法
标准曲线的制作：精确称取没食子酸标准品25mg，用水溶解并定容至250mL，得0.1mg/mL的对照品标准溶液。精密吸取对照样品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于10mL容量瓶中，再加入1mL福林酚显色剂，摇匀后再加入2mL质量分数15％碳酸钠溶液，定容至10mL，室温下反应2h后测定A760，绘制标准曲线。
样品中多酚含量的测定：移取待测定提取液0.5mL于25mL容量瓶中，然后移取稀释后的提取液0.5mL于10mL容量瓶中，依次加入1mL福林酚显色剂及2mL质量分数15％碳酸钠溶液并定容，按上述标准曲线测定方法测定吸光值，并根据标准曲线计算总酚的没食子酸当量。
提取物中多酚的含量(％)＝(粗提物中多酚含量/粗提物质量)×100％
高效液相色谱测定
Waters 2695高效液相分离单元，Water s 2996二极管阵列检测器；色谱柱：Luna C18(200×4.6mm 100A 5μ)；流动相：乙腈/1％醋酸；流速：1mL/min；进样量：20μL；洗脱梯度如下：
| 时间(min) | 0 | 5 | 15 | 20 |
| 1％醋酸(％) | 90 | 20 | 30 | 10 |
| 乙腈(％) | 10 | 80 | 70 | 90 |
脂肪酸合酶活性测定方法
全反应测定：测活体系为100mmol/L KH2PO4-K2HPO4缓冲液，pH 7；含有1mmoL/L EDTA；3μmol/L AcCoA；10μmol/L MalCoA；35μmol/L NADPH，37℃恒温，加入10μg FAS启动反应，用北京普析通用TU-1810紫外-可见分光光度计连续监测340nm光吸收变化。反应总体积为2ml。最初2分钟吸收值的变化为直线代表该反应的初速度。
快结合(可逆)抑制的测定：被测萃取液样品加到测活***中，再加FAS启动反应，测定酶的活性为Ai，以萃取溶剂代替萃取液样品的测活结果为Ao。Ai/Ao为剩余活性，此值越低抑制能力越强。此抑制通常为可逆抑制。
半抑制浓度的测定：在不同的萃取液加量下测定对FAS的快结合抑制，以剩余活性对每毫升测活溶液含萃取物的干重(μg/ml)作图。由剩余活性随抑制剂量增加而降低的曲线上可估出活性被抑制一半时的抑制浓度即为半抑制浓度(IC50)。此参数值越小抑制能力越强。
慢结合(不可逆)抑制的速度常数测定：抑制剂加到FAS溶液中，混匀后25℃放置，在不同的时间间隔取混合溶液测定酶活性At，只加同样量的萃取溶剂时的测活作为对照Ao。At/Ao为该时刻的剩余活性(Remaining Activity，R.A.)。
实施例1
用水超声辅助提取油茶蒲提取物I
(1)取油茶蒲，粉碎后过50目筛，置于容器中，加入10倍重量的水，60℃超声波提取20分钟；
(2)将上述提取液4000转/分钟的条件下离心10分钟，取上清液，定容，以备使用；
(3)取提取液，60℃烘干后，计算油茶蒲提取物I得率为11.9％(w/w)。
采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法测定每100克干茶蒲中总黄酮含量为3.05克，油茶蒲提取物I中总黄酮含量为25.6％(以芦丁计)。
采用福林酚比色法测定总酚得率为2.31％，油茶蒲提取物I中总酚含量为19.4％(以没食子酸计)。
实施例2
用50％乙醇超声辅助提取油茶蒲提取物II
(1)取油茶蒲，粉碎后过50目筛，置于容器中，加入10倍重量的50％乙醇溶液，30℃超声波提取30分钟；
(2)将上述提取液4000转/分钟的条件下离心10分钟，取上清液，浓缩，喷雾干燥，得油茶蒲提取物II。
采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法测定油茶蒲提取物中黄酮含量为28.5％(以芦丁计)。
采用福林酚比色法测定油茶蒲提取物中总酚含量为21.4％(以没食子酸计)。
实施例3
40％乙醇微波辅助提取油茶蒲提取物III
(1)取油茶蒲，粉碎后过50目筛，置于容器中，加入10倍重量的40％乙醇溶液，700W微波辅助提取2分钟；
(2)将上述提取液真空减压抽滤，取上清液，得油茶蒲提取物III。
采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法测定油茶蒲提取物中黄酮含量为29.8％(以芦丁计)。
采用福林酚比色法测定油茶蒲提取物中总酚含量为22.0％(以没食子酸计)。
实施例4
用50％乙醇热回流提取油茶蒲提取物IV
(1)取油茶蒲，粉碎后过50目筛，置于容器中，加入10倍重量的50％乙醇溶液，100℃热回流辅助提取2小时；
(2)将上述提取液真空减压抽滤10分钟，取上清液，浓缩，喷雾干燥得油茶蒲提取物IV。
采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法测定油茶蒲提取物中黄酮含量为29.6％(以芦丁计)。
采用福林酚比色法测定油茶蒲提取物中总酚含量为22.4％(以没食子酸计)。
实施例5
用100％甲醇超声波辅助提取的油茶蒲提取物XVII
(1)取油茶蒲，粉碎后过50目筛，置于容器中，加入10倍重量的100％甲醇溶液，30℃超声波辅助提取30分钟；
(2)将上述提取液真空减压抽滤10分钟，取上清液，浓缩，喷雾干燥得油茶蒲提取物XVII。
采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法测定油茶蒲提取物中黄酮含量为29.4％(以芦丁计)。
采用福林酚比色法测定油茶蒲提取物中总酚含量为23.1％(以没食子酸计)。
实施例6
大孔树脂精制的油茶蒲提取物V
(1)取油茶蒲50％乙醇提取物IV，溶于水；
(2)取净品级的D101大孔树脂(购自杭州德佳科学仪器有限公司)，装柱；
(3)上样后，分别以水、20％乙醇、40％乙醇、80％乙醇、100％乙醇洗脱两个柱体积，分别收集后浓缩干燥得油茶蒲提取物V。
采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法测定各洗脱组分的黄酮含量(表1)。其中40％乙醇洗脱部分的黄酮含量最高，达到54.94％，水洗脱部分的黄酮含量最低，为1.74％。
表1 D101精制后各组分的黄酮含量
| 组分 | 黄酮含量(％) |
| D101水洗脱部分 | 1.73 |
| D101 20％乙醇洗脱部分 | 34.32 |
| D101 40％乙醇洗脱部分 | 54.94 |
| D101 80％乙醇洗脱部分 | 27.81 |
| D101 100％乙醇洗脱部分 | 10.17 |
实施例7
油茶蒲不同浓度乙醇水溶液提取物对脂肪酸合酶的可逆抑制作用
(1)取油茶蒲，粉碎后过50目筛，置于容器中，加入10倍重量的水溶液，30℃超声波提取30分钟；
(2)将上述提取液4000转/分钟的条件下离心10分钟，取上清液，真空浓缩干燥，得油茶蒲提取物VI。
将上述方法中的水溶液分别以不同浓度的乙醇-水溶剂(如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％)代替，再用同样的方法制备得到油茶蒲提取物VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI。
脂肪酸合酶活性采用乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A、NADPH为底物的标准测活方法测定，计算提取物对该酶的半抑制浓度。结果如表2所示：
表2 不同溶剂的提取物对脂肪酸合酶的半抑制浓度
| 油茶蒲提取物 | 乙醇-水溶剂 | 脂肪酸合酶IC50(μg/mL) | 黄酮含量(％) |
| VI | 水 | 1.72 | 23.4 |
| VII | 10％乙醇 | 1.39 | 25.5 |
| VIII | 20％乙醇 | 1.33 | 26.0 |
| IX | 30％乙醇 | 1.17 | 27.1 |
| X | 40％乙醇 | 0.96 | 27.9 |
| XI | 50％乙醇 | 0.96 | 28.7 |
| XII | 60％乙醇 | 1.00 | 31.5 |
| XIII | 70％乙醇 | 1.57 | 32.2 |
| XIV | 80％乙醇 | 1.68 | 24.2 |
| XV | 90％乙醇 | 3.96 | 19.6 |
| XVI | 100％乙醇 | 3.28 | 19.7 |
结果表明，随着提取溶剂中乙醇浓度的增加，提取物对脂肪酸合酶的抑制作用先增强后降低，40-50％乙醇提取物的抑制作用最强；随着乙醇浓度的增加，提取物中的黄酮含量也呈现先增加后降低，其中70％乙醇提取物的黄酮含量最高。
油茶蒲提取物中的黄酮含量与其对脂肪酸合酶的抑制作用呈现一定的相关性，抑制活性最强的物质主要为极性较大部位，因此乙醇浓度升高到一定程度后，不利于这部分物质的提取而使提取物对脂肪酸合酶的抑制作用减弱。
实施例8
油茶蒲提取物对脂肪合酶的不可逆抑制作用
(1)取油茶蒲提取物VI，配制成一定浓度的溶液；
(2)将一定量的油茶蒲提取物VI溶液与酶保温后，在不同的时间从保温体系中取酶与提取物的混合物，加入底物乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A、NADPH测定酶的剩余活性。样品与酶液进行保温，混合保温体系中的样品浓度为0.025mg/ml经过135分钟后，酶活只剩下不到30％，见图4。
结果表明，油茶蒲提取物VI对脂肪酸合酶存在很强的不可逆抑制作用。
实施例9
油茶蒲提取物对小鼠的减肥降脂作用
(1)取油茶蒲提取物VI，配成一定浓度的溶液；
(2)ICR小鼠在实验环境下喂普通饲料7d，称体重，随机分成5组：正常对照组、模型组、阳性对照组(奥利司他50mg/kg)、高剂量组(油茶蒲提取物VI 300mg/kg)、低剂量组(油茶蒲提取物VI 150mg/kg)。正常对照组动物从实验开始至结束用普通饲料喂养，其余各组动物均喂营养饲料(蛋黄粉10％+猪油10％+普通饲料8％)。正常对照组、模型组每天灌胃给予等量蒸馏水，其余各组按上述剂量每天灌胃给予各试验物；
(3)每周记录体重1次；6周后，各组小鼠禁食12h，称重，眼眶采血，分离血清，随即颈椎脱臼处死，快速取肝脏(称重后保存于液氮罐中)，分离睾丸、肾脏周围脂肪，称重。
具体试验结果如表3、表4、表5、表6所示。
表3 小鼠体重变化表
| 正常对照组 | 模型组 | 阳性对照组 | 高剂量组 | 低剂量组 | |
| 体重增加率(％) | 56.29 | 67.51 | 54.53 | 39.28 | 52.71 |
表4 小鼠血脂变化表
| 正常对照组 | 模型组 | 阳性对照组 | 高剂量组 | 低剂量组 | |
| TC(mmol/L) | 2.81±0.25 | 4.75±0.73 | 4.14±0.41 | 4.37±0.70 | 4.03±0.52 |
| TG(mmol/L) | 1.13±0.33 | 1.50±0.25 | 1.00±0.19 | 0.69±0.11 | 0.93±0.18 |
表5 小鼠肾周及睾丸周围脂肪重量
| 正常对照组 | 模型组 | 阳性对照组 | 高剂量组 | 低剂量组 | |
| 肾脏周围脂肪湿重(g) | 0.09±0.04 | 0.32±0.12 | 0.18±0.08 | 0.14±0.05 | 0.247±0.07 |
| 睾丸周围脂肪湿重(g) | 0.48±0.16 | 1.07±0.36 | 0.63±0.19 | 0.56±0.15 | 0.850±0.39 |
表6 小鼠血液瘦素水平
| 正常对照组 | 模型组 | 阳性对照组 | 高剂量组 | 低剂量组 | |
| 瘦素(ng/mL) | 0.135±0.020 | 0.431±0.048 | 0.314±0.019 | 0.307±0.036 | 0.183±0.037 |
结果表明，油茶蒲提取物能显著减轻小鼠体重，使小鼠睾丸、肾脏周围脂肪量明显减少，同时具有显著地调节血脂作用。
实施例10
油茶蒲提取物的抗氧化作用
对油茶蒲提取物的清除自由基(ABTS+、DPPH·)能力进行了测定。
(1)对ABTS自由基的清除作用
ABTS工作液的配制：先配制7mmol/L ABTS(购自美国Sigma公司)储备液和140mmol/L过硫酸钾(K2S2O8)溶液，然后取5mL 7mmol/L ABTS储备液和88μL 140mmol/L过硫酸钾溶液混合后得ABTS+·储备液，再将该储备液在室温条件下避光储备12-16h，最后将生成的ABTS+·储备液用无水乙醇稀释，使其在30℃、734nm波长下的吸光度为0.70±0.02，即得到ABTS+·自由基工作液。
Trolox标准曲线的制作：准确称取Trol ox标准品(购自美国Si gma公司)10mg，用甲醇溶解定容至10ml，分别吸取0、60、120、180、240、300、420μL的标准液用甲醇稀释至1mL。在试管中加入3.0mL的ABTS+·自由基工作液，分别加入30μL不同浓度的标准溶液，混合，30℃静置6min，在734nm波长下读取吸光值(Abs)，以Trolox的浓度对自由基的清除率做标准曲线。
提取物清除ABTS自由基的能力的测定：在试管中加入3.0mL的ABTS+·自由基工作液，再加入30μL的1mg/mL的待测样品，混合，30℃静置6min，在734nm波长下读取吸光值(Abs)，并在Trolox标准曲线上获得待测样品相应的Trolox当量浓度，定义为TEAC值。TEAC值越大表明抗氧化物质抗氧化活性越强。
结果见表7。
表7 茶蒲提取物抗清除ABTS自由基能力
| 样品 | TEAC(mg/L) |
| 茶蒲水提物VI | 582.8 |
| 油茶蒲50％乙醇提取物XI | 783.8 |
| 油茶蒲70％乙醇提取物XIII | 716.8 |
| 维生素C | 2000.2 |
结果表明，油茶蒲提取物有很强的清除ABTS自由基的能力，其中，提取物XI较VI、XIII有更强的清除ABTS自由基的能力，1mg/mL的提取物XI的TEAC当量为783.8mg/L，但是较维生素C的清除ABTS自由基的能力弱。
(2)对DPPH自由基的清除作用
采用DPPH分析法测定油茶蒲提取物的清除自由基能力。
该分析方法的原理是：DPPH自由基是一种稳定的以氮为中心的自由基，在515nm波长处有最大吸收，其甲醇溶液呈紫色，且其浓度与吸光度呈线性关系。当在DPPH甲醇溶液中加入自由基清除剂后，自由基清除剂可以与DPPH自由基结合或发生替代，使DPPH自由基数量减少，直至达到稳定。
具体分析方法如下：
取待测液2mL及2×10-4mol/L DPPH溶液2mL加入同一具塞试管中摇匀，在室温下密闭静置30min，用试剂空白作参比，于517nm波长下测定吸光度，根据下列公式计算每种待测样品对DPPH自由基的清除率：
清除率(％)＝[1-(Asample-Asampleblank)/Acontrol]×100％
其中：Asample为加提取液后DPPH溶液的吸光度；
Asample blank为提取液的吸光度；
Acontrol为未加提取液时DPPH溶液的吸光度。
以待测样品浓度为横坐标，以清除率值为纵坐标绘制待测样品清除DPPH自由基的曲线。根据曲线的线性回归方程，计算得到DPPH自由基清除率为50％时的待测样品浓度，定义为半抑制浓度(IC50)。根据IC50判断待测样品清除DPPH自由基的能力，IC50越小表示其清除自由基能力越强。
结果见表8。
表8 茶蒲提取物抗清除DPPH自由基能力
结果表明，油茶蒲提取物XIII较XVI的清除DPPH自由基能力强，这可能与其黄酮含量相关。
实施例11
组合物实施例
将油茶蒲提取物配入化妆品的防晒基质中，按照下面的配方和方法配制化妆品。
表9 防晒化妆品配料表
制备方法：将A液和B液分别加热至72-82℃，连续搅拌直至各种成分全部溶解，边搅拌边将A液加入B液，继续搅拌直至所形成的乳剂冷却至室温(15-30℃)，最后得到100g防晒标准品。
实施例12
含油茶蒲提取物的化妆品组合物抗紫外辐射的作用
将实施例11获得的化妆品通过测定其防晒系数(sun protect factor，SPF)评价茶蒲提取物抗紫外辐射的性能。
利用胶带法测定样品的防晒系数。
①将3M胶带剪成1.1cm×4.5cm大小，粘贴在石英比色皿透光侧表面上。
②接通电源，预热分光光度计，选定多波长测量，测量参数分两次分别设定为T％和Abs设定紫外线波长分别为290nm-400nm，波长间隔为5nm。
③将贴有胶带的石英比色皿置于样品光路和参比光路中，调整仪器零点。
④称量9.9mg待测样品，将样品均匀涂在石英比色皿3M胶带上。
⑤将制备好的样品比色皿置与37℃的干燥箱里，干燥15分钟。
⑥将待测样品比色皿置与样品光路中，取另一贴有胶带的石英池置于参比光路中，分别测定UVB区设定波长紫外线吸光度值和透射率，取各测定数值的算术均值。
⑦依次测定5个平行样品，计算均值，在算均值的算术均数及为该样品的吸光度值和透射率。
⑧利用下列公式计算样品的SPF值。
其中：E(λ)：北纬40度，太阳顶角20度，夏天中午阳光不同波长的辐射强度。
I(λ)：为不同波长光的红斑效应系数。
T(λ)：为不同波长样品的透射率。
结果空白组的SPF值为8.72±2.19，样品组的SPF值为17.13±3.38(SPF≥15为超级防晒)，所以茶蒲水提物VI具有较强的抗紫外辐射性能。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种油茶蒲提取物，其特征在于，以提取物总量计，所述提取物中含有5-70w/w％总黄酮(以芦丁计)；所述油茶蒲是山茶科(Theaceae)山茶属(CamelliaL)木本植物油茶的果实的果壳。
2.如权利要求1所述的油茶蒲提取物，其特征在于，在285nm和236nm处有两个紫外吸收峰。
3.如权利要求1所述的油茶蒲提取物，其特征在于，所述的提取物是经醇-水溶剂提取的物质，所述的醇选自甲醇或乙醇；优选所述的提取物是经醇浓度为0-100v/v％的醇-水溶剂提取的物质，所述的醇选自甲醇或乙醇。
4.如权利要求1所述的油茶蒲提取物，其特征在于，所述的提取物通过如下步骤获得：
(1)将油茶蒲和醇-水溶剂混合，用选自下述的一种或多种方式提取得到油茶蒲提取物；浸提、热回流提取、逆流提取、超声波提取、或微波辐射提取。
5.一种如权利要求1-4任一所述的油茶蒲提取物的制备方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：
(1)将油茶蒲和醇-水溶剂混合，用选自下述的一种或多种方式提取得到油茶蒲提取物；浸提、热回流提取、逆流提取、超声波提取、或微波辐射提取。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述醇-水溶剂中醇的浓度为0-100v/v％；所述的浸提条件为：提取温度为20-100℃，提取时间0.1-5小时，料液比W/V：1∶3-30；所述的微波辐射提取的条件为：微波辐射功率为100-6000W，辐射时间为20秒-5小时(优选2min-1h)，料液比为1∶3-1∶30(W/V)；所述的超声波提取的条件为：料液比1∶3-1∶30(W/V)，超声波功率50-5000W，超声波作用时间12-180分钟。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)后还包括下述步骤：
(2)分离纯化；所述的分离纯化选自柱层析、或膜分离。
8.一种如权利要求1-4任一所述的油茶蒲提取物在制备抑制脂肪酸合酶、减少脂肪或抗氧化的组合物中的应用。
9.一种组合物，其特征在于，以组合物总重量计，它含有重量百分比为1-99％的如权利要求1-4任一所述的油茶蒲提取物和药学上或食品学上可接受的载体。
10.如权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述的组合物为饮料、酒类、胶囊、软胶囊、粉剂、片剂、颗粒剂、口服液、喷雾剂及霜剂、乳剂、水剂和膏体。
Priority Applications (1)
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