CN101723907B - 一类邻二氰基苊并吡嗪化合物及其抗肿瘤应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及到抗肿瘤药应用领域中一类用于以DNA为靶向的邻二氰基苊并吡嗪化合物,该类化合物是用苊醌作原料,经溴化、环构化、芳香亲核取代反应制得的。其特点是,一端以柔性侧链的氨基直链或环状基团为供电子基团,另一端以两个氰基为吸电子基团,两端形成缺电子大平面共轭体系,其结构与理想的DNA嵌入剂相符。该类化合物对MCF-7(人乳腺癌细胞)体外试验显示出明显的抑制活性。
Description
技术领域
本发明涉及生物化工领域中苊并吡嗪类化合物的设计及其对肿瘤细胞抑制的应用。
背景技术
DNA是生物体的重要组成物质,是遗传信息的携带者和基因表达的物质基础,在生物生长、发育和繁殖等生命活动中具有十分重要的作用。而恶性肿瘤是机体在各种致瘤因素作用下,局部组织的细胞异常增生而形成的新生物。以DNA为靶点的化疗药物可以作用于肿瘤细胞DNA,从而对DNA产生损伤,触发DNA-损伤-修复机制响应,引发细胞周期阻滞或诱导细胞凋亡。
自从嵌入剂(intercalator)一词于1961年由Lennna提出以来,人们对其进行了大量的研究。它是指多环芳烃小分子物质与DNA的可逆性相互作用。这类分子体积小,处于缺电子状态,并具有一定的平面刚性,可以***到DNA两个堆积的碱基对之间。各种的DNA嵌入剂,如吡啶并咔唑类、蒽醌类、棘霉素类、吖啶类、放射菌素类、苯并咪唑[1,2-C]喹啉类等,都被用作抗肿瘤研究,并取得了一些进展。这里仅讨论萘酰亚胺和苊并杂环两类药效团。
萘酰亚胺类发色团有很好的平面性,具有优良的DNA嵌入性能,已被广泛地研究用于DNA嵌入剂,从而导致DNA光敏损伤或具有优异的抗肿瘤活性。
1973年,西班牙的Brana研究组首次报导了一系列的3-硝基萘酰亚胺类衍生物,四个3-硝基萘酰亚胺类化合物能够强烈抑制人类***Hela细胞和KB细胞的生长,并能抑制DNA和RNA的合成。QSAR研究表明,化合物的侧链中必须含有氮原子,这一点对其细胞毒性至关重要;同时,侧链上的氮原子与酰亚胺环中的氮原子间隔两个碳原子时,化合物的活性最高。
钱旭红组以苊醌为底物研究合成了一系列具有抗癌作用的苊并杂环类化合物(式A)(专利号:200410050449.5[P]),它们能够在低浓度范围内以剂量依赖的方式诱导培养的肿瘤细胞发生凋亡,并阻滞细胞周期。应用于肿瘤模型动物体内能通过诱导凋亡的方式明显抑制肿瘤生长。是一类活性很高的凋亡诱导剂和抗肿瘤化合物。
刘凤玉等合成的一系列的化合物(式B)(Bioorg.Med.Chem.,2006,14:6962),表现出较好的抗癌活性。但两者均存在收率低,有同分异构体,分离较困难,不稳定,溶解度不高,测试困难等缺点。
发明内容
本发明的目的是设计合成一类以苊并吡嗪化合物为母体的化合物,其特点是,一端以柔性侧链的氨基直链或环状基团为供电子基团,另一端以两个氰基为吸电子基团,两端形成缺电子大平面共轭体系,使其具有***的用途。经体外试验证明这些化合物对MCF-7肿瘤细胞生长表现出较强的抑制能力。
本发明具体技术方案是:一类邻二氰基苊并吡嗪化合物,具有以下的结构通式:
通式中,X为:
本发明苊并吡嗪类化合物的合成方法简单,原料易得,其合成按如下反应式进行:
反应试剂和条件:a.液溴,60-70℃,2.0h;b.二氨基马来腈,冰醋酸,回流,2.0h;c. HR,乙二醇单醚,回流,1.0h。
邻二氰基苊并吡嗪染料在抗肿瘤药方面的应用,包括化合物与DNA作用模式及体外抑制肿瘤细胞生长活性测试:
(1)目标化合物与DNA作用模式的测试:
a.紫外吸收光谱的测试:
紫外滴定实验在UV-3100分光光度计上进行,使用1cm石英吸收池,温度为25℃。首先用30mM,pH为7.5的Tris-HCl缓冲溶液对仪器进行基线校正,测量200-400nm范围内浓度为10μM的化合物的紫外吸收谱,然后往溶液中滴加小牛胸腺DNA即CT-DNA,使其与化合物的浓度比值依次为0.1∶1、0.3∶1、0.5∶1、1∶1和2∶1。每次加完DNA混合数遍,以使DNA和化合物充分接触、反应,放置10分钟后,测量、记录光谱数据。
b.荧光光谱的测试:
精确配制化合物的DMSO溶液,浓度在10-3-10-4M左右,取化合物的DMSO溶液0.1mL与30mM、pH为7.5的Tris-HCl溶液混合于10mL的容量瓶中。制备两组化合物的Tris-HCl-DMSO溶液,其中一组是加入CT-DNA的Tris-HCl溶液,另一组则是不含有DNA的相同浓度化合物的溶液,化合物的浓度保持在10-5-10-6M之间,CT-DNA的浓度为50μM,定容,室温避光放置一夜。这样得到一组样品液和一组空白对照液,测量他们的荧光发射波长、荧光强度。
通过上述测试,表明目标化合物与DNA的结合方式为嵌插结合。
(2)体外抑制肿瘤细胞生长活性测试:
用四氮唑盐(microculture tetrozolium,MTT)还原法对MCF-7(乳腺癌细胞)进行抑制试验。
四氮唑盐(MTT)还原法的具体操作是:取处于对数生长期,状态良好的MCF-7细胞,吹散成单细胞悬液,用血球计数板计数后,以2×103个/孔接种于96孔板。培养24h贴壁后,分别加入化合物,浓度梯度为0.1、1、10和100μmol/L,对照组加入0.1%的DMSO,每个浓度均设三个复孔。作用时间为24h。培养结束后,弃去培养基,每孔代之以含终浓度为0.5mg/ml MTT的培养基,37℃继续培养4.0h。弃去培养液,每孔加入100μl DMSO溶解蓝紫色甲瓒颗粒,用酶标仪在波长570nm下测定光吸收值(OD),参考波长为630nm。对照组细胞存活率设定为100%,其他处理组OD值与对照组相比较,按下列公式计算被测物对肿瘤细胞生长的抑制率
肿瘤抑制率=(对照组OD值-治疗组OD值)/对照组OD值×100%,
筛选方法:四氮唑盐(microculture tetrozolium,MTT)还原法,
细胞株:MCF-7细胞,
作用时间:24h,
对化合物的体外生长测试结果如下:
结果说明化合物4a,4b,4g,4h对MCF-7细胞生长有较好的抑制性。
具体实施方式
实施例1:5-溴苊醌(2)的合成
在500mL两口烧瓶中,加入20g(109.8mmol)苊醌和25.0mL液溴(466.8mmol),开始搅拌,油浴中控温60-70℃,使反应液回流,2h后,停止反应,加入亚硫酸氢钠水溶液,至反应液为无色。加水稀释后,减压抽滤,并多次用水洗涤打浆,至pH=7.0。滤饼在冰醋酸中重结晶四遍得5-溴苊醌,棕黄色针状晶体,收率90%。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ(ppm)8.39(d,1H),8.21(d,1H),8.15(d,1H),8.04(t,1H),7.96(d,1H).
实施例2:3-溴-苊并吡嗪-8,9二腈(3)的合成
15ml的两口烧瓶中加入200mg(0.77mmol)5-溴苊醌与110mg(1.07mmol)二氨基马来腈,而后加入10ml冰醋酸,搅拌加热回流2.0h,冷却后倒入水中,过滤,干燥后用CH2Cl2∶石油醚=3∶1(体积比)的溶液为洗脱剂在硅胶柱上进行分离提纯,得到鲜黄色3-溴-苊并吡嗪-8,9二腈192mg(0.58mmol),收率67.7%。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)8.03-8.06(t,1H),8.18-8.19(d,1H),8.34-8.35(d,1H),8.48-8.50(d,1H),8.56-8.57(d,1H).
实施例3:3-(2-二甲基)乙胺基-苊并吡嗪-8,9二腈(4a)的合成
取100mg(0.3mmol)3-溴-苊并吡嗪-8,9二腈于10ml圆底烧瓶中,加入5ml乙二醇单醚,搅拌下,加入234μl(2.0mmol)乙二醇单醚,N2保护下加热回流45min,溶液由浅黄色渐渐变为深红色,冷却后,倒入水中,抽虑,得红色固体,干燥后以二氯甲烷∶甲醇∶三乙胺=100∶2.5∶1(体积比)为洗脱剂在硅胶柱上进行分离提纯,得红色粉末状固体3-(2-二甲基)乙胺基-苊并吡嗪-8,9二腈50mg(0.15mmol),收率50.0%。
1H NMR(400MHz DMSO)δ(ppm)8.78-8.76(d,1H),8.54-8.52(d,1H),8.36(t,1H),8.31-8.29(d,1H),7.89-8.91(t,1H),6.93-6.95(d,1H),3.64-3.66(m,2H),2.84(t,2H),2.42(s,6H);HRMS(EI)m/z(M+H)+C20H16N6calcd for 340.1436,found:340.1444.
实施例4:3-(2-二乙基)乙胺基-苊并吡嗪-8,9二腈(4b)的合成
合成方法同实施例3,反应时间45min。收率40.0%,红色固体。
1H NMR(400MHz DMSO)δ(ppm)8.73-8.75(d,1H),8.54-8.55(d,1H),8.38-8.40(t,1H),8.30-8.32(d,1H),7.87-7.91(t,1H),6.91-6.93(d,1H),3.56(m,2H),2.78(t,2H),2.59(m,4H),0.99-1.02(t,6H);HRMS(EI)m/z(M+H)+C22H20N6calcd for 368.1749,found:368.1756.
实施例5:3-(吡啶-2-甲基)胺基-苊并吡嗪-8,9二腈(4c)的合成
合成方法同实施例3,反应时间1.0h。收率50.0%,橙红色固体。
1H NMR(400MHz DMSO)δ(ppm)9.17-9.20(t,1H),8.86-8.88(d,1H),8.59(d,1H),8.58(d,1H),8.24-8.26(d,1H),7.92-7.96(t,1H),7.76-7.80(t,1H),7.46-7.48(d,1H),7.30-7.33(t,1H),6.78-6.80(d,1H),4.83-3.84(d,2H);HRMS(EI)m/z(M+H)+C22H12N6calcd for 360.1123,found:360.1115.
实施例6:3-(2-苯胺基乙胺基)-苊并吡嗪-8,9二腈(4d)的合成
合成方法同实施例3,反应时间2.5h。收率50.0%,深红色固体。
1H NMR(400MHz DMSO)δ(ppm)8.79-8.81(d,1H),8.56-8.88(d,1H),8.52(t,1H),8.30-8.32(d,1H),7.88-7.92(t,1H),7.08-7.12(t,2H),6.94-6.96(d,1H),6.63-6.66(d,2H),6.54-6.57(t,1H),5.76-5.82(t,1H),3.67-3.69(m,2H),3.44-3.46(m,2H);HRMS(EI)m/z(M+H)+C24H16N6calcd for 388.1436,found:388.1445.
实施例7:3-哌啶基-苊并吡嗪-8,9二腈(4e)的合成
合成方法同实施例3,反应时间1.0h。收率70.0%,红色固体。
1H NMR(400MHz CDCl3)δ(ppm)8.52-8.54(d,1H),8.49-8.51(d,1H),8.38-8.40(d,1H),8.87-8.91(t,1H),7.36-7.38(d,1H),3.57-3.60(t,4H),2.037(m,4H),1.81-1.83(m,2H);HRMS(EI)m/z(M+H)+C21H15N5calcd for 337.1327,found:337.1303.
实施例8:3-硫吗啉基-苊并吡嗪-8,9二腈(4f)的合成
合成方法同实施例3,反应时间1.0h,收率66.0%,红色固体。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ(ppm)8.61-8.63(d,1H),8.48-8.50(d,1H),8.47-8.48(d,1H),7.98-8.00(t,1H),7.40-7.42(d,1H),3.76(t,4H),2.98(t,4H);HRMS(EI)m/z(M+H)+C20H13N5Scalcd for 355.0892,found:355.0898.
实施例9:3-吗啉基-苊并吡嗪-8,9二腈(4g)的合成
合成方法同实施例3,反应时间1.0h。收率56.0%,橙红色固体。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ(ppm)8.60-8.62(d,1H),8.55-8.56(d,1H),8.48-8.50(d,1H),7.97-7.99(t,1H),7.37-7.39(d,1H),3.94(t,4H),3.52(t,4H).IR(KBr cm-13435,2224);HRMS(EI)m/z(M+H)+C20H13N5O calcd for 339.1120,found:339.1118.
实施例10:3-N-甲基哌嗪-苊并吡嗪-8,9二腈(4h)的合成
合成方法同实施例3,反应时间1.0h,收率50.0%,红色固体。
1H NMR(400MHz,DMSO),δ(ppm)8.59-8.60(d,1H),8.49-8.51(d,1H),8.44-8.46(d,1H),7.94-7.98(t,1H),7.34-7.36(d,1H),3.55(m,4H),2.67(m,4H),2.32(s,3H);HRMS(EI)m/z(M+H)+C21H16N6calcd for 352.1436,found:332.1432.
实施例11:目标化合物与DNA作用模式的研究
a.紫外吸收光谱的测试:
紫外滴定实验在UV-3100分光光度计上进行,使用1cm石英吸收池,温度为25℃。首先用30mM,pH为7.5的Tris-HCl缓冲溶液对仪器进行基线校正,测量200-400nm范围内浓度为10μM的化合物的紫外吸收谱,然后往溶液中滴加小牛胸腺DNA即CT-DNA,使其与化合物的浓度比值依次为0.1∶1、0.3∶1、0.5∶1、1∶1和2∶1。每次加完DNA混合数遍,以使DNA和化合物充分接触、反应,放置10分钟后,测量、记录光谱数据。计算得其固有结合常数如表1所示:
表1化合物的固有结合常数
b.荧光光谱的研究:
精确配制化合物的DMSO溶液,浓度在10-3-10-4M左右,取化合物的DMSO溶液0.1mL与30mM、pH为7.5的Tris-HCl溶液混合于10mL的容量瓶中。制备两组化合物的Tris-HCl-DMSO溶液,其中一组是加入CT-DNA的Tris-HCl溶液,另一组则是不含有DNA的相同浓度化合物的溶液,化合物的浓度保持在10-5-10-6M之间,CT-DNA的浓度为50μM,定容,室温避光放置一夜。这样得到一组样品液和一组空白对照液,测量他们的荧光发射波长、荧光强度。
由光谱测试得化合物与DNA的结合方式主要是嵌插结合。
实施例12:体外抑制肿瘤细胞生长活性测定
用四氮唑盐(microculture tetrozolium,MTT)还原法对MCF-7(乳腺癌细胞)进行抑制试验。
四氮唑盐(MTT)还原法的具体操作是:取处于对数生长期,状态良好的MCF-7细胞,吹散成单细胞悬液,用血球计数板计数后,以2×103个/孔接种于96孔板。培养24h贴壁后,分别加入化合物,浓度梯度为0.1、1、10和100μmol/L,对照组加入0.1%的DMSO,每个浓度均设三个复孔。作用时间为24h。培养结束后,弃去培养基,每孔代之以含终浓度为0.5mg/ml MTT的培养基,37℃继续培养4.0h。弃去培养液,每孔加入100μl DMSO溶解蓝紫色甲瓒颗粒,用酶标仪在波长570nm下测定光吸收值(OD),参考波长为630nm。对照组细胞存活率设定为100%,其他处理组OD值与对照组相比较,按下列公式计算被测物对肿瘤细胞生长的抑制率
肿瘤抑制率=(对照组OD值-治疗组OD值)/对照组OD值×100%,
筛选方法:四氮唑盐(microculture tetrozolium,MTT)还原法,
细胞株:MCF-7细胞,
作用时间:24h,
对化合物的体外生长测试结果如下:
表2化合物对MCF-7细胞生长的抑制率%
以上化合物4a,4b,4g,4h对MCF-7细胞生长有较好的抑制性。
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