CN101717789B - 一种高效产红色素培养基的制备方法 - Google Patents
一种高效产红色素培养基的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于粘质沙雷氏菌产生红色素的培养基，是以胰蛋白胨为氮源的培养基。它以胰蛋白胨、甘油和水为培养基的组分配制而成。该培养基不仅具有安全性和蛋白用量少的特点，而且促进粘质沙雷氏菌快速产生大量红色素，适用于现代生物工程中细菌次生代谢产物发酵、实验室培养基和开发天然色素等领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于粘质沙雷氏菌产生色素的培养基，特别涉及一种以胰蛋白胨作为唯一氮源的培养基的制备方法。
背景技术
很多天然色素具有安全可靠，没有毒副作用，色调自然，接近天然物质，很多品种均具有生理活性等优点，如β-胡萝卜素是自然界中最普遍存在也是最稳定的天然色素，是抗氧化剂，具有解毒作用，在抗癌、预防心血管疾病及白内障上有显著功能，并防止老化和衰老引起的多种退化性疾病，另外，在促进动物生育与成长方面也有较好功效，因此开发天然色素是国际上研究的重点。近年来利用微生物资源发酵生产天然色素为人们开辟了广阔的领域，但远不能满足工业需要，因此从自然资源中筛选产色素尤其是具有药用价值的微生物具有广阔的前景。
从昆明冶炼厂废水中筛选得到一株产红色素的短杆菌，由生理生化实验和16S rDNA的序列分析表明该短杆菌为粘质沙雷氏菌，以此菌株为出发菌株，对其产色素的发酵条件进行了研究。粘质沙雷氏菌，又称灵杆菌，为细菌中最小者，周身鞭毛，能运动，无荚膜，无芽孢，约半数菌株能产生红色的灵菌红素(prodigiosins)。灵菌红素是一类天然红色素，具有一定的免疫活性，如抑制真菌、细菌和霉菌等，也有一定的抗肿瘤作用，因此有很大的药用价值。
发明内容
本发明旨在于提供一种安全、蛋白用量少、成本低且促进粘质沙雷氏菌(Serratia sp.)KMR-3菌株快速产生大量红色素的液体培养基。
实现本发明目的技术方案是一种液体培养基，它以胰蛋白胨和水为培养基的组分配制而成。
进一步的技术方案，一种用于粘质沙雷氏菌KMR-3菌株发酵产生红色素用液体培养基的制备方法，是以胰蛋白胨和水为培养基的组分，以LB液体培养基作为起始培养基，其特征在于：该培养基是以胰蛋白胨为唯一氮源，且培养基的成分中含有甘油，发酵温度为15℃～28℃，pH值为4～10。
所述的培养基中胰蛋白胨的含量为5g/L，甘油的含量为1％。
所述发酵温度为28℃，发酵时间为36h，LB液体培养基的pH值为6.0。
所述培养基中含有甘油，用于提高次生代谢产物即红色素的含量。
本发明利用从昆明冶炼厂周围废水中分离到的一株产红色素的粘质沙雷氏菌(Serratia sp.)KMR-3菌株，其保藏号为：CGMCC No.2636。通过优化培养基的发酵条件及培养基成分，利用以胰蛋白胨作为唯一氮源的培养基获得了高产量的红色素。
本发明涉及的粘质沙雷氏菌(Serratia sp.)KMR-3菌株已经于2008年8月26日在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”(中国北京)保藏，保藏号为：CGMCC No.2636，并已于2008年申报发明专利。
本发明的具体技术步骤如下：LB(Luria-Bertani)培养基是微生物学实验中最常用的培养基，用于培养大肠杆菌等细菌分为液态或加入琼脂制成的固态培养基。以LB液体培养基作为粘质沙雷氏菌(Serratia sp.)KMR-3菌株发酵生产红色素的起始培养基，发酵温度为25℃，pH值为6.0，通过优化LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L)不同成分来提高该菌株次生代谢产物红色素的产量。初步优化实验内容为：LB液体培养基，不含胰蛋白胨的改良LB液体培养基，不含酵母膏的改良LB液体培养基，不含NaCl的改良LB液体培养基；通过测定发酵液离心上清OD535值来评价色素产量，表明不含酵母膏和不同NaCl的改良液体培养基均可在一定程度上提高色素产量(图1)。根据初步优化的结果选用只含不同浓度胰蛋白胨的培养基进行发酵，表明5g/L胰蛋白胨的效果较好(图2)，然后向培养基中加入1％的甘油用于进一步提高色素的产量，发现效果最好(图2)，因此，最终确定高产色素的培养基成分为：5g/L胰蛋白胨和1％的甘油。
粘质沙雷氏菌，又称灵杆菌，为细菌中最小者，约半数菌株能产生红色的灵菌红素(prodigiosins)。灵菌红素是一类天然红色素，具有抗细菌、真菌、疟疾和霉菌、免疫抑制和抗肿瘤等作用，而且微生物发酵生产的灵菌红素还是比较理想的天然色素，可大量用于食品工业，因此该色素具有很好的应用前景。随着现代生物技术的迅速发展和对灵菌红素的深入研究，灵菌红素的产生和作用机制将会被更加清晰地认识，大量制备，并应用于免疫治疗以造福于人类。
附图说明
下面结合附图，用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。
图1本发明不同培养时间不同培养基组分KMR-3菌株产色素量；
图2本发明不同培养时间不同培养基组分KMR-3菌株产色素量。
具体实施方式
实施例1：
沙雷氏菌属(Serratia sp.)KMR-3菌株生理生化特征：
从昆明冶炼厂周围废水中分离到的一株对铜离子具有高抗性的沙雷氏菌属(Serratia sp.)KMR-3菌株。该沙雷氏菌属(Serratia sp.)KMR-3菌株已经于2008年8月26日在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”(中国北京)保藏，保藏号为：CGMCC No.2636。
KMR-3菌株生理生化特征：KMR-3菌株生长温度和pH值测定，涂布10ml新鲜培养的KMR-3菌液于LB固体平板上，分别置4℃、15℃、28℃、37℃和42℃培养，观察细菌生长状况及温度对色素产生的影响。接种10ml新鲜培养的KMR-3菌液于不同pH(1～14)的5mL LB液体培养基中，28℃，150rpm，培养24h，观察菌体生长pH范围。结果表明：KMR-3菌株能在4℃、15℃、28℃、37℃培养条件下生长，在42℃不生长；15℃～28℃培养产生红色色素，但37℃培养不产生色素，而把培养温度从37℃降低到28℃培养又可产生红色色素，这与沙雷氏菌的特征很相近。KMR-3菌株能在pH4～10范围的LB液体培养基中生长，且均产生红色色素，其中在pH6.0附近生长最快，初步认定为该菌的最适生长pH。
根据已知的资料，沙雷氏菌属中有3个种可以产生红色色素-灵杆菌素，分别为粘质沙雷氏菌、深红沙雷氏菌和普城沙雷氏菌。通过进一步的生理生化特征将其鉴定为粘质沙雷氏菌：KMR-3菌株能以葡萄糖、山梨醇、侧金盏花醇、丙二酸盐和西蒙氏枸橼酸盐作为唯一碳源生长，不能以乳糖和卫矛醇作为唯一碳源生长，不能利用尿素，不能产生H2S，赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶和苯丙氨酸脱氨酶反应为阳性。
实施例2：
培养基成分的优化：
改良的LB液体培养基的初步优化：以LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L)作为起始培养基，发酵温度为25℃，pH值为6.0。初步优化实验内容为：LB液体培养基，不含胰蛋白胨的改良LB液体培养基，不含酵母膏的改良LB液体培养基，不含NaCl的改良LB液体培养基，分别于0，6，12，24，36，48，60，72和90h对发酵液取样，通过离心取上清测定OD535值初步评估色素产量(图1)。结果表明：发酵12h时，不含NaCl的改良LB液体培养基产色素能力较强，OD535值为0.032；而发酵至48h时不含酵母膏的改良LB液体培养基产色素能力最强，OD535值为0.135。因此采用不含酵母膏和NaCl的改良液体培养基即只含不同浓度胰蛋白胨的培养基进行发酵优化实验。
不同浓度胰蛋白胨培养基的优化：以只含胰蛋白胨(5g/L，10g/L和15g/L)的液体培养基进行发酵，培养温度为25℃，pH值为6.0。分别于0，6，12，24，36，48，60和72h对发酵液取样，通过离心取上清测定OD535值初步评估色素产量(图2)。结果表明：发酵36h时，起始培养基(LB)的OD535值为0.266，而含5g/L胰蛋白胨的液体培养基，OD535值为0.557，产色素能力提高2倍，但10g/L和15g/L胰蛋白胨的液体培养基产色素能力低于起始培养基。根据资料报道，甘油具有提高色素产量的效果，因此采用加入甘油的方法进一步优化培养基以提高色素产量。
胰蛋白胨和甘油培养基的优化：以5g/L胰蛋白胨和1％甘油的液体培养基进行发酵，培养温度为25℃，pH值为6.0。分别于0，6，12，24，36，48，60和72h对发酵液取样，通过离心取上清测定OD535值评估色素产量(图2)。结果表明：发酵36h时，该培养基产色素能力远远高于只含胰蛋白胨(5g/L，10g/L和15g/L)的液体培养基，OD535值为3.565，而起始的LB液体培养基发酵：发酵36h时OD535值仅为0.266，因此优化的5g/L胰蛋白胨和1％甘油的液体培养基产色素能力是起始培养基的13.4倍。
Claims (2)
1.一种用于粘质沙雷氏菌KMR-3菌株(Serratia sp.KMR-3)发酵产生红色素用液体培养基，培养基是以胰蛋白胨和水为培养基的组分，其特征在于：该培养基是以胰蛋白胨为唯一氮源，且培养基的成分中含有甘油，发酵温度为15℃～28℃，pH值为4～10；
所述的培养基中胰蛋白胨的含量为5g/L，甘油的含量为1％。
2.根据权利要求1所述的一种用于粘质沙雷氏菌KMR-3菌株发酵产生红色素用液体培养基，其特征在于：所述该培养基发酵温度为28℃，发酵时间为36h，培养基的pH值为6.0。
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2009
- 2009-12-14 CN CN2009102183523A patent/CN101717789B/zh not_active Expired - Fee Related
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