CN101715557B - 计测具有核酸的微粒的方法和装置 - Google Patents

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Abstract

本发明提供能够迅速且准确地评价由具有核酸的微粒产生的污染状况的***。通过具有下述工序的微粒的计测***而完成，即，(1)使具有核酸的微粒附着在微粒附着用部件的微粒附着工序；(2)通过放电，破坏已附着的微粒的膜的膜破坏工序；(3)使上述微粒在凝胶厚度方向进行电泳，使微粒中的核酸从负极侧移到正极侧，并使核酸附着在核酸检测用部件表面的电泳工序；(4)对上述核酸检测用部件的表面进行荧光染色，计测核酸浓度的核酸计测工序。

Description

计测具有核酸的微粒的方法和装置
技术领域
本发明涉及用于掌握医院、食品厂的空气、墙面、地面、或者手术、食品制造中使用的器具·衣服因微生物产生的污染状况等的计测具有核酸的微粒的方法和装置。
背景技术
一直以来，需要调查如医院、食品厂等，特别是在卫生方面需要注意的场所的空气中、墙面和地面因微生物产生的污染状况，以及手术和食品制造中使用的器具和衣服因微生物产生的污染状况(非专利文献1)。在现有的方法中，在固定有大量培养基和细胞的膜上涂布试样溶液，微生物形成菌落，另外使病毒产生展开为膜状的细胞的缺损，对菌落数或缺损数进行计数来评价(非专利文献2)。
另一方面，由于近年来的技术开发的进步，一个分子DNA的操作和计测技术在发展，对一个分子DNA进行荧光染色，就能够明显地观察(非专利文献3)。使用该技术，来自细胞的DNA分子的取出，DNA分子向基板展开固定，再使荧光染色的限制酶附着在展开固定的DNA上，由荧光显微镜制成限制酶酶切图等都成为可能(专利文献1、非专利文献4)。
专利文献1：特开2003-200400号公报
非专利文献1：柳宇：事務所ビルにおけるバイオエアロゾルの举動とその制御方法，クリ一ンテクノロジ一 vol 17，No.5，44-47，2007
非专利文献2：石松維世：浮游微生物粒子の捕集と検出，クリ一ンテクノロジ一 vol 17，No.5，48-51，2007
非专利文献3：Morikawa K.，and Yanagida M.，J.Biochem.，89，pp.693-696，1981
非专利文献4：A.Bensimon，A.Simon，A.Chiffaudel，V.Croquette，F.Heslot，D.Bensimon，”Alignment and sensitive detection of DNA by amoving interface”，Science，Vol.265(5181)，pp2096-2098，1994
发明内容
本发明通过将可视化一分子的方法应用于检测具有核酸的颗粒，能够迅速且准确地对环境中的微生物进行计数。
现有技术中，通过由培养产生的菌落或细胞缺损，进行因环境中的微生物产生的污染状况的评价。但是，细胞的培养、和使细胞感染病毒引起细胞缺损都需要数天的时间。使用荧光色素，将细胞内的DNA染色而进行观察的方法，其细胞膜的色素透过性不高，需要10小时左右以上的染色处理时间(非专利文献2)。此时，细胞内小器官大多同时被荧光染色、成为误差的原因。另外，如果为了缩短处理时间、破坏细胞膜进行荧光染色，则核酸以外的生物体高分子也被染色、成为误差的原因。
鉴于上述情况，本发明人反复深入研究，结果完成以下的发明。
第一发明涉及的计测具有核酸的微粒的方法，其特征在于，包括下述工序：(1)使具有核酸的微粒附着在微粒附着用部件的微粒附着工序；(2)通过放电，破坏已附着的微粒的膜的膜破坏工序；(3)使上述微粒在凝胶厚度方向进行电泳，使微粒中的核酸从负极侧移到正极侧，并使核酸附着在核酸检测用部件表面的电泳工序；(4)对上述核酸检测用部件的表面进行荧光染色，计测核酸的浓度的核酸计测工序。
在本发明中，在上述微粒附着工序中，优选在电晕放电电极的光滑的电极侧表面放置上述微粒附着用部件，使在空中浮游的具有核酸的微粒附着在上述微粒附着用部件的表面。
另外，在上述膜破坏工序中，优选使用在相对电极间***有绝缘板的电极系，在上述电极的间隙***上述微粒附着用部件，向上述电极间施加交变电压，由此破坏微粒的膜。
另外，在上述核酸检测用部件中，优选核酸进行电泳的面具有正的表面电荷。
第二发明涉及的计测具有核酸的微粒的***，其特征在于，具有：使具有核酸的微粒的附着微粒附着用部件；使具有核酸的微粒附着在该微粒附着用部件的表面的微粒附着装置；膜破坏装置，通过放电，破坏附着在上述微粒附着用部件上的上述微粒的膜；核酸检测用部件，具有电荷中和剂的带和在该带的一面侧设置的凝胶；电泳装置，使附着在上述微粒附着用部件表面的核酸，通过上述核酸检测用部件的凝胶进行电泳，向上述带侧移动；和核酸检出装置，在除去上述核酸检测用部件的凝胶的状态下，检测上述带表面的核酸。
在本发明中，优选上述微粒附着装置具有设置有针电极和平板电极的电晕放电电极，在上述平板电极上载置有上述微粒附着用部件的状态下，使上述微粒附着在表面。
另外，优选上述膜破坏装置具有相对的电极、插在该电极之间的绝缘板、和用于***上述微粒附着用部件的部件安装空间，向上述电极间施加交变电压，由此破坏上述膜。
另外，优选上述核酸检测用部件的带具有正的表面电荷。
另外，优选上述核酸检测用部件兼用作上述微粒附着用部件，在使具有核酸的微粒附着在上述凝胶表面的状态下，进行微粒的膜破坏操作。
所谓核酸包括RNA或DNA中的任意一个。另外，可以是一根链或二根链中的任意一种，也包括环状或直链状中的任意一种。
所谓具有核酸的微粒，意指具有核酸的物质，例如，包括微生物(包括细菌、菌类、酵母、霉菌等)、病毒、类病毒等。
发明效果
为了调查具有核酸的细菌和病毒颗粒等微粒的浓度，必须有效地破坏细胞膜和蛋白质的包膜，取出内部所含的核酸(DNA、RNA)，只对该核酸进行荧光染色、并计数。为了从细菌和病毒中迅速取出核酸，在本发明中使用放电。特别是使用在相对电极间***有绝缘板的电极系进行放电破坏，由此可以在数分钟以内破坏细胞、取出核酸。相比于破坏细胞膜的酶反应等，能够在极短时间内进行。
另外，本发明的目的在于以短时间进行具有核酸的微粒的浓度计测。如果使用上述放电破坏，就可以将附着在微粒附着用部件上的微粒在其场所破坏。现有技术中，具有核酸的微粒一旦移到溶液中，为了进行核酸提取操作，就需要相当量的试样。因此，为了收集大量的试样，就需要长时间的微粒捕集操作，不能迅速地进行浓度计数。
另一方面，根据本发明，从在微粒附着用部件表面被破坏的细胞和病毒等扩散到表面的核酸，通过涂布在微粒附着用部件表面的表面活性剂等电荷中和剂，与组蛋白等蛋白质分离。即，为了通过放电破坏从微粒取出核酸后、与其它构成分子区别，通过凝胶电泳分离核酸。为了缩短电泳时间，需要尽量缩短泳动距离。在本发明的核酸检测用部件中，在带的表面使用具有薄凝胶层的膜，在凝胶层的厚度方向使核酸进行电泳，由此从其它生物体高分子分离。通过凝胶层电泳到带上的核酸附着在带表面。此时，因为核酸带有负电荷，所以，如果使用具有正极性表面电荷的带，就使分离的核酸确实地附着在带上、并保持。
进行电泳后，从带上剥离凝胶。接着，对附着在带上的核酸进行荧光染色。在荧光染色中，可以使用用于对YOYO和溴化乙锭、DAPI等、DNA和RNA进行荧光染色的一般色素。为了将电泳后的核酸确实地保持在表面上，希望使用具有正表面电荷的材料作为带。大多数情况下，从一个具有核酸的微粒提取的核酸数量为多个，但因为其分布范围大致成为微粒直径的数倍以内，所以通过图像处理鉴定该群，能够作为一个微粒的核酸群进行计数。
为了使微粒附着在微粒附着用部件的表面，对空气中浮游的微粒使用电晕放电。由此，可以使微粒高效地电集尘在膜表面。另外，根据需要、调节电晕放电电压或导入电晕放电场的包括微粒的空气流量，控制具有核酸的微粒的附着密度，由此能够提高微粒的计数精度。
另外，成为使微粒附着用部件和核酸检测用部件兼用的构成，如果由带和设置在该带的一面侧上的凝胶构成核酸检测用部件，一边连续供给核酸检测用部件，一边进行微粒附着工序、膜破坏工序、电泳工序和核酸计测工序，因此可以成为非常迅速进行测定的***。
附图说明
图1是用于说明本实施方式的概要的工序图。
图2是捕捉含有核酸的微粒的核酸检测用部件的侧截面图。
图3是电晕放电装置的概略图。
图4是用于破坏微粒膜的膜破坏装置的概略图。
图5是用于使核酸从凝胶表面移到带上的电泳装置的概略图。
图6是通过电晕放电、捕集具有核酸的微粒的微粒附着装置的概略图。
图7是表示通过电晕放电捕集的微粒中所含的活菌数的测定结果图表。图中的白色图形表示将培养基作为正极侧(positive)时的结果，黑色图形表示将培养基作为负极侧(negative)时的结果。
图8是表示对体内含有荧光蛋白质GFP的大肠菌进行无声放电处理时的结果的照片。通过实施放电处理，可知大肠菌的膜被破坏，细胞内所含的GFP扩散、荧光强度极大衰减。
图9是涂布在各种过滤器表面的DNA的荧光照片。
图10是模式地表示使微粒附着用部件和核酸检测用部件粘合，使DNA进行电泳时的状态的侧截面图。
图11是在电泳处理后、被转送到核酸检测用部件的带上的DNA的照片。虚线四角T表示滴加标准量DNA的区域，虚线圆S表示进行电泳的DNA的区域。另外，T和S内部的数值表示DNA量。
图12是附着在过滤器上的DNA的荧光显微镜照片图像。
图13是表示计数具有核酸的微粒的***的概要图。
符号说明
1...琼脂糖凝胶、2...具有正电荷的塑料膜、3，3’...针电极、5...放电电极、6...绝缘板、9，19...接地电极、13...培养基(平板状接地电极)、20...核酸、21...微粒、22...微粒附着用部件、23...核酸检测用部件、24...微粒附着装置、25...膜破坏装置、26...部件安装空间、27...电泳装置、28...核酸检测装置
具体实施方式
图1是表示用于说明本实施方式的概要的工序图。在该工序图中，微粒附着用部件22和核酸检测用部件23为不同的构成。具有核酸20的微粒21从图示左上侧沿着箭头方向进行工序，从右上侧至右下侧、再至左下侧的工序，计测核酸20。
首先，在左上的微粒附着工序中，使具有核酸的微粒21附着在微粒附着用部件22的表面。这样，附着了微粒21的微粒附着用部件22进入下面的膜破坏工序(图示右上)。
接着，关于破坏了膜的微粒，使用凝胶1，在其厚度方向进行电泳工序，使核酸20从负极侧移到正极侧。这样，核酸20移到核酸检测用部件23的带2的表面(图示右下)。
最后，除去核酸检测用部件23的凝胶1，对附着在带2表面的核酸进行荧光染色、计测核酸20的浓度(核酸计测工序)。
接着，说明各工序的详细情况。在图2中表示用于使微粒21进行电泳的核酸检测用部件23的侧截面图。在核酸检测用部件23中，以氨基(NH2 +)进行表面处理、使得具有正极性表面电荷的无纺布制成的塑料带2作为基板，在其表面具有以1mm左右以下的厚度涂布琼脂糖凝胶1而形成的膜。使用该凝胶1，使具有核酸的微粒21进行电泳。事先将形成该带状膜的核酸检测用部件23放入卡盘中保管，可以连续供给。例如，带的宽度可以为1mm至5mm左右。该核酸检测用部件23可以兼用作微粒附着用部件22。即，使微粒21附着在琼脂糖凝胶1的表面上后，使微粒21的膜破坏，接着进行电泳，由此使核酸20在带2的方向移动，附着在其表面上。
为了使空气中浮游的具有核酸的微粒附着在带状膜上，可以使用图3所示的电晕放电装置(微粒附着装置)24。在电晕放电装置24中设置有针状的高电压电极3和平板状接地电极9。以约5mm至10mm左右的间隔设置两个电极3、9的距离，向平板状接地电极9的表面供给微粒附着用部件22。
为了使附着在墙壁和衣服等上的具有核酸的微粒附着，使用带状的核酸检测用部件23，从卡盘拉出核酸检测用部件23，使凝胶1的表面直接接触墙壁和衣服等。或者，另外准备直径数mm左右的膜状微粒附着用部件22(或兼用作微粒附着用部件22的核酸检测用部件23)，使其与墙壁和衣服等接触，此后进行核酸提取和荧光染色等的后处理。
在图4中表示可以在膜破坏工序中使用的膜破坏装置25。膜破坏装置25具有相对的无声放电电极5、19、插在两电极间的绝缘板6、以及用于***微粒附着用部件22的部件安装空间26。两放电电极5、19制成平行平板电极，通过在电极的一侧设置绝缘板6，使部件安装空间26的空隙为2mm左右以下。上侧电极5由不锈钢筛网构成，下侧电极19是接地电极。电极5与高压交变电源4连接。另外，在绝缘板6和电极9之间夹持安装有规定厚度的隔板7。在其上施加例如30kHz、10kV左右的交变电压，发生无声放电。
使具有核酸20的微粒21附着在微粒附着用部件22上后，在部件安装空间26中***微粒附着用部件22，通过无声放电破坏微粒21的膜。
接着，在破坏附着在微粒附着用部件22表面的具有核酸20的微粒21的膜表面，加入SDS等表面活性剂，提取核酸20。此后，使用图5所示的电泳装置27，进行核酸20的电泳。在电泳装置27中设置有：加入具有导电性的水溶液(电解质液10)的容器30；以及在该容器30底面和上面设置的一对正负电极28、29。在两电极28、29之间***核酸检测用部件23，进行核酸20的电泳。以核酸检测用部件23的凝胶1侧成为负、带2侧成为正的方式，在凝胶1的厚度方向进行电泳，使核酸20从凝胶1表面电泳到带2上。电泳需要的时间通常为数分钟左右。
进行电泳后，从电泳装置27取出核酸检测用部件23，用刮刀剥取凝胶1，作成附着有核酸20的带2。此后，在加入了荧光染色液的容器中通过带2，对附着的核酸20进行荧光染色。
此后，发出荧光地向带2照射激发光，对发出荧光的核酸20进行计数。
实施例
(通过电晕放电进行具有核酸的微粒的捕集)
使用具有图6所示的电晕放电电极的微粒附着装置，捕集空气中浮游的细菌。该装置设置有电晕放电用针状高压电极3’、作为平板状接地电极(集尘电极)的培养基13和高压直流电源15。另外，符号13A是用于将培养基13接地的电极。在装置的上面侧设置有风扇12。通过该风扇12的驱动，室内的空气从上面侧导入(符号11)、从下面侧排出(符号14)。在空气通过两电极3’、13之间时，具有核酸的微粒被培养基13捕集。
图7表示使用该装置捕集微粒时的菌落数的计数结果。用风扇12向下方以每秒18升送入室内空气，在银制的针电极3’和培养基13之间发生电晕放电。使培养基13侧成为正极(positive)或负极(negative)，使电压从0kV变化到30kV，进行10分钟电晕放电后，计数将培养基13培养2天时所确认的菌落数。
其结果，(1)通过10分钟的电晕放电，无论使用正极或负极哪一种时，被捕集的菌数都增加到10倍以上(负极是22倍、正极是47倍)，和(2)相比于使用负极电晕放电时，使用正极电晕放电，能够确认提高了活菌的捕集效率。可以认为正极的电晕放电的菌落数多的情形，是因为银制的正极中大气压电晕放电能够抑制对细菌有害的臭氧发生。
(通过无声放电破坏菌)
图8表示破坏膜后的大肠菌照片。为了发出荧光，使用导入了形成来自水母的荧光蛋白质GFP的基因的大肠菌。在图4所示的具有无声放电电极5、19的膜破坏装置25中，安置涂布了该大肠菌的微粒附着用部件22，施加30kHz、25kVpp的交流电压。如果大肠菌的细胞膜被破坏，细胞内所含的GFP发生扩散，所以可以确认荧光强度大大衰减。从将用于比较的未进行无声放电处理的大肠菌与以无声放电破坏的大肠菌混合的样品的荧光照片，也可以确认通过无声放电处理，荧光强度大大衰减。通常，在大肠菌的细胞膜的破坏中使用酶反应，但因为该处理需要几小时，所以通过无声放电破坏菌具有能够在极短时间内进行的优点。
(DNA的电泳)
图9是在微粒附着用部件22的表面涂布DNA分子群时的荧光照片。如图10模式地表示，在该微粒附着用部件22中涂布DNA分子的面一侧(图示下面侧)，使核酸检测用部件23粘合，通过电泳装置27进行DNA的电泳。
图11是电泳后对核酸检测用部件23的带2进行荧光染色的结果。从由染色产生的DNA量的测定，可以确认约30至50％的DNA分子从微粒附着用部件22通过电泳移到带2上并附着。图12是附着在带2上的DNA的荧光显微镜照片。表示能够识别各个DNA分子。另外，电泳时间是几分钟左右，表示能够通过薄凝胶、取样DNA。
(计数具有核酸的微粒的***)
图13表示本实施方式的计数***的概要。在该***中，微粒附着用部件和核酸检测用部件23成为兼用的构成。核酸检测用部件23连续成带状而制造，从图示左侧向右侧以规定速度移动，由此经过微粒附着工序(A)、膜破坏工序(B)、电泳工序(C)和核酸计测工序(D)。
即，核酸检测用部件23在凝胶1向上的状态下通过电晕放电装置24。此时，在凝胶1的表面附着具有核酸的微粒21。接着，核酸检测用部件23如果通过膜破坏装置25的部件安装空间26内，通过无声放电，破坏微粒21的膜。
接着，在核酸检测用部件23通过电泳装置27时，核酸20从负极侧向正极侧进行电泳、并在凝胶1的内部移动，附着在带2的表面。
在通过电泳装置27后，核酸检测用部件23的凝胶1被剥离、只为带2后，通过发生激发光的核酸检出装置28的照射，对核酸20进行计测。
这样，根据本发明，能够在10分钟以内进行从具有核酸20的微粒21的捕集到微粒21的破坏、核酸20的提取、通过电泳向带2表面的固定、荧光染色和计数。
产业上的可利用性
通过该发明，可以在10分钟以内进行医院、食品厂的空气和墙面、地面、或在手术和食品制造中使用的器具和衣服因微生物和病毒等产生的污染状况的评价，所以可以几乎实时地进行感染危险性的掌握或防止感染所需要的处置，并可以期待卫生管理方面的应用。

Claims (5)

1.一种计测具有核酸的微粒的方法，其特征在于，包括下述工序：
(1)使具有核酸的微粒附着在微粒附着用部件的微粒附着工序；
(2)通过放电，破坏已附着的微粒的膜的膜破坏工序；
(3)使所述微粒在凝胶厚度方向进行电泳，使微粒中的核酸从负极侧移到正极侧，并使核酸附着在核酸检测用部件表面的电泳工序；和
(4)对所述核酸检测用部件的表面进行荧光染色，计测核酸的浓度的核酸计测工序，
在所述微粒附着工序中，为了进行电晕放电，在电晕放电电极的光滑的电极侧表面放置所述微粒附着用部件，由此使在空中浮游的具有核酸的微粒附着在所述微粒附着用部件的表面，
在所述膜破坏工序中，使用在相对电极间***有绝缘板的电极系，在所述电极的间隙***所述微粒附着用部件，向所述电极间施加交变电压，由此破坏微粒的膜。
2.如权利要求1所述的计测具有核酸的微粒的方法，其特征在于：在所述核酸检测用部件中，核酸进行电泳的面具有正的表面电荷。
3.一种计测具有核酸的微粒的***，其特征在于，具有：
使具有核酸的微粒附着的微粒附着用部件；
使具有核酸的微粒附着在该微粒附着用部件的表面的微粒附着装置；
膜破坏装置，通过放电，破坏附着在所述微粒附着用部件上的所述微粒的膜；
核酸检测用部件，包括具有电荷中和剂的带和在该带的一面侧设置的凝胶；
电泳装置，使附着在所述微粒附着用部件表面的核酸，通过所述核酸检测用部件的凝胶进行电泳，向所述带侧移动；和
核酸检测装置，在除去所述核酸检测用部件的凝胶的状态下，检测所述带表面的核酸，
所述微粒附着装置构成为：设置进行电晕放电的针电极和平板电极，在所述平板电极的上表面侧具有所述微粒附着用部件，使所述微粒附着在所述微粒附着用部件的表面，
所述膜破坏装置具有相对的电极、插在该电极间的绝缘板、和用于***所述微粒附着用部件的部件安装空间，向所述电极间施加交变电压，由此破坏所述膜。
4.如权利要求3所述的计测具有核酸的微粒的***，其特征在于：所述核酸检测用部件的带具有正的表面电荷。
5.如权利要求3或4所述的计测具有核酸的微粒的***，其特征在于：所述核酸检测用部件兼用作所述微粒附着用部件，在使具有核酸的微粒附着在所述凝胶表面的状态下，进行微粒的膜破坏操作。
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