CN101712984B

CN101712984B - 鉴别香菇菌种241和241-4的分子特异性标记引物及检测方法

Info

Publication number: CN101712984B
Application number: CN2009101549231A
Authority: CN
Inventors: 李海波; ***; 付立忠; 魏海龙; 吴庆其; 贺亮; 程俊文
Original assignee: Zhejiang Academy of Forestry
Current assignee: Zhejiang Academy of Forestry
Priority date: 2009-11-30
Filing date: 2009-11-30
Publication date: 2011-12-21
Anticipated expiration: 2029-11-30
Also published as: CN101712984A

Abstract

本发明提供了一种可鉴别香菇生产菌种241和241-4的分子特异性标记引物，以及利用该引物对香菇生产菌种241和241-4进行区别和鉴定的方法。所述引物序列为：上游引物：5′-GGTTCTGCTCCTTGTGACTG-3′，下游引物：5′-TCTGCTCTTCAGATGCAAGCT-3′；本发明检测方法与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高的优点；本发明方法检测所需时间只要1～2天，而常规的拮抗试验所需要的时间至少两周时间，出菇试验则需要至少3个月的时间。

Description

鉴别香菇菌种241和241-4的分子特异性标记引物及检测方法

(一)技术领域

本发明涉及一种可区别香菇生产近缘种241和241-4的分子特异性标记引物，以及利用该引物对香菇生产菌种241和241-4进行区别和鉴定的方法。

(二)背景技术

香菇Lentinula edodes(Berk.)Pegler因其美味和具有重要的食、药用价值而倍受国内外消费者的喜爱，是我国商业化生产规模最大和世界上产量仅次于双孢蘑菇的食用菌。中国是最早栽培香菇的国家，目前香菇产量达到全世界的70％。

香菇菌种是香菇生产中最重要的生产资料，目前在中国商业化栽培使用的香菇菌种已超过100余种。不同的香菇菌种具有不同的生产性状和商业利用价值，因而菌种的快速准确鉴定对于香菇产业的发展至关重要。香菇菌种鉴定的经典方法主要是通过对香菇菌丝、菌落和子实体形态的宏观现察、生长特性、生理生化反应以及不同菌株间发生的拮抗反应等。这些方法由于易受环境因素和生理状况的影响，对形态特征上差异较小的菌株尤其是一些香菇近缘种例如241与241-4，Cr02与Cr04，申香2号、申香4号与申香6号，939-9与939-6等难以实现快速准确的鉴别。

此外，由于香菇菌种本身具有无性繁殖的遗传特性，使得在菌种市场上同种异名，异种同名、假种、劣种现象普遍存在，再加上菌种质量的退化现象，不仅极大地损害了香菇生产者和育种者的利益，也极大地影响了我国食用菌产业的持续健康发展。因此，建立起一套科学可靠、快速便捷的香菇菌种鉴定体系，不仅有利于我国香菇种质资源的发掘与利用，更好地为选育具有我国自主知识产权的优良香菇菌种服务，而且也是规范现阶段混乱的香菇菌种市场、促进香菇产业持续健康发展的迫切需要。

分子生物学技术的快速发展，特别是分子标记和基因标记技术的建立与成熟，为发展简便、快速、准确的菌株鉴定技术提供了有效手段。SCAR(特征性片段扩增区域)标记是1993年由Paran和Michelmore在RAPD基础上提出的，它基于对特异RAPD片段的测序，根据两端序列设计一对18～24碱基的引物，在较高的退火温度下进行特异扩增实现的，其专一性引物的采用排除了随机引物结合位点之间的竞争，因而它是一种十分稳定的分子标记，在应用上具有迅速、简便、低成本的特点。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种可区别香菇生产近缘种241和241-4的分子特异性标记引物，以及一种利用该引物对香菇生产菌种241和241-4进行快速辨别的方法。

本发明采用的技术方案是：

一种鉴别香菇生产菌种241和241-4的分子特异性标记引物，所述引物序列为：

上游引物：5′-GGTTCTGCTCCTTGTGACTG-3′

下游引物：5′-TCTGCTCTTCAGATGCAAGCT-3′

该引物对是采用PCR技术，经过大量筛选试验，采用RAPD标记获得香菇241和241-4菌种的差异DNA片段，将该片段克隆测序，以得到DNA序列为基础设计特异性引物。以该引物对对香菇241和241-4菌种进行PCR扩增，可从241菌种中获得1609bp大小的特异性片段。

本发明还涉及一种利用所述分子特异性标记引物对香菇生产菌种241和241-4进行快速鉴别的方法，所述方法包括：提取待测香菇菌种基因组DNA作为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现1609bp的DNA条带，则待测菌种为香菇241菌种，若电泳结果未出现1609bp的DNA条带，则待测菌种为香菇241-4菌种；所述分子特异性标记引物序列为：

上游引物5′-GGTTCTGCTCCTTGTGACTG-3′

下游引物5′-TCTGCTCTTCAGATGCAAGCT-3′

所述方法关键在于扩增引物的选择、DNA提取、PCR反应体系及反应条件确定，以及电泳检测，均可按照本领域常规方法进行。

需要说明的是，本发明分子特异性标记引物和检测方法仅适用于香菇生产近缘种241和241-4的区分，即待测菌株是限定为香菇241和241-4的范围内。香菇241-4是以段木香菇菌种241为出发菌株采集特异菌株，经拮抗、品比等试验筛选育成，其所产香菇朵型圆整、盖大、肉厚、柄短，菌肉组织致密，含水量低，非常适宜烘干，是目前干菇品质最优的品种。由于香菇241和241-4菌种形态特征差异非常小，菌种市场上将此两种菌种名称标记错误的情况时有发生，而采用本发明方法，可对菌种市场上的香菇241和241-4菌株进行快速区分和鉴定，方法简单、快捷、准确。

所述PCR扩增反应体系组成如下：

PCRBuffer 终浓度为1×

dNTPs 1mM

MgCl₂ 2.5mM

Taq DNA酶 2.5U

上、下游引物各1.25μM

模板DNA 60ng

余量为ddH₂O；

PCR反应条件如下：

94℃预变性6min后；92℃变性40s，60℃退火40s，72℃延伸2min，共30个循环；最后于72℃补平7min，终止温度为4℃。

具体的，所述方法如下：

(1)取待测香菇菌种，接种至PDA斜面，25℃培养14d，转接至PD液体培养基中，25℃下振荡培养14d，收集菌丝，以SDS-CTAB法提取待测香菇菌种基因组DNA；

(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增：

PCR反应体系每20μL组成如下：

10×PCR Buffer 2μL

10mM dNTPs 2μL

25mM MgCl₂ 2μL

5U/μL Taq DNA酶 0.5μL

25μM上、下游引物各1μL

20ng/μL模板DNA 3μL

ddH₂O补足至20μL；

PCR反应条件如下：

94℃预变性6min后；92℃变性40s，60℃退火40s，72℃延伸2min，共30个循环；最后于72℃补平7min，终止温度为4℃；

(3)取步骤(2)扩增产物5μL，与1μL 0.25％溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于1×TAE缓冲液中、5V/cm电压下电泳，电泳结束后EB染色(通常是在含0.5μg/ml EB的水溶液中染色30分钟)，于自动凝胶图像分析仪上照相，若电泳结果出现1609bp的DNA条带，则待测菌种为香菇241菌种，若电泳结果未出现1609bp的DNA条带，则待测菌种为香菇241-4菌种。

PCRBuffer终浓度为1×，是指PCRBuffer中各组分在反应体系中的浓度与1×PCR Buffer相同，通常选用体积为反应体系体积1/10的10×PCR Buffer。10×PCR Buffer成分为：100mM Tris-HCl(pH8.5)、500mMKCl、25mM MgCl₂和1.0％Triton-X-100，溶剂为ddH₂O。

本发明的有益效果主要体现在：本发明检测方法与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高的优点；本发明方法检测所需时间只要1～2天，而常规的拮抗试验所需要的时间至少两周时间，出菇试验则需要至少3个月的时间。

(四)附图说明

图1为对香菇菌种进行PCR扩增的结果；M：Marker，即DNA分子量标准；C：阴性对照；1：241；2：241-4；箭头所指为编号为1的香菇241菌种扩增出的分子量为1609bp的特殊DNA条带，而编号为2的香菇241-4菌种未扩增出该条带。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

(1)菌丝培养和基因组DNA的提取：将低温保藏的香菇菌种(香菇241和241-4生产菌种由庆元县食用菌科研中心提供)转接到PDA斜面(PDA斜面培养基：取去皮马铃薯200克，切成小块，加水1000毫升煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液加水补足至1000毫升，加葡萄糖20克，琼脂15克，溶化后分装，121℃灭菌30分钟，冷却后制成斜面)上，25℃下培养。14d后接到100ml PD液体培养基(PD液体培养基：取去皮马铃薯200克，切成小块，加水1000毫升煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液加水补足至1000毫升，加葡萄糖20克，121℃灭菌30分钟，冷却即得PD液体培养基)中，25℃下100rpm/min振荡培养14d，收集菌丝，放入-20℃冰箱保藏备用。

基因组DNA的提取采用SDS-CTAB法，并使用DNA纯化试剂盒(杭州博日科技有限公司)对提取的DNA进行纯化。纯化的基因组DNA先用1.5％的琼脂糖凝胶电泳定性检测，再用DNA/RNA紫外分光光度计(GeneQuant Pro，GE Healthcare公司)定量检测。DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用。

(2)设计特异PCR扩增引物，引物对的序列为上游引物5′-GGTTCTGCTCCTTGTGACTG-3′和下游引物5′-TCTGCTCTTCAGATGCAAGCT-3′，由上海生物工程技术有限公司合成。

(3)SCAR分子标记的PCR扩增：10×PCR Buffer 2μl，10mM dNTPs2μl，25mM MgCl₂2μl，5U/μl Taq DNA酶(杭州博日科技有限公司)0.5μl，25μM特异引物对各1μl，20ng/μl模板DNA 3μl，ddH₂O补足至20μl。扩增反应在TC-XP型扩增仪(杭州博日科技有限公司)上进行。94℃预变性6min后；92℃变性40s，60℃退火40s，72℃延伸2min，共30个循环；最后于72℃补平7min，终止温度为4℃。

(4)电泳检测：取步骤(3)PCR扩增产物5ul，与1ul 0.25％溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于1×TAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，在含0.5μg/ml EB的水溶液中染色30分钟，然后在上海培清JS-380A自动凝胶图像分析仪上照相。

按照上述方法，分别对香菇241和241-4菌种(1：241；2：241-4)进行检测，以无菌水为阴性对照，电泳结果见图1。其中编号为1的香菇241菌种扩增出了分子量为1609bp的特殊DNA条带，而编号为2的香菇241-4菌种未扩增出该条带。

SEQUENCE LISTING

<110>浙江省林业科学研究院

<120>鉴别香菇菌种241和241-4的分子特异性标记引物及检测方法

<130>

<160>2

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>1

ggttctgctc cttgtgactg 20

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>2

tctgctcttc agatgcaagc t 21

Claims

1.一种鉴别香菇生产菌种241和241-4的分子特异性标记引物，所述引物序列为：

上游引物：5′-GGTTCTGCTCCTTGTGACTG-3′

下游引物：5′-TCTGCTCTTCAGATGCAAGCT-3′。

2.一种利用权利要求1所述分子特异性标记引物对香菇生产菌种241和241-4进行快速鉴别的方法，所述方法包括：提取待测香菇菌种基因组DNA作为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现1609bp的DNA条带，则待测菌种为香菇241菌种，若电泳结果未出现1609bp的DNA条带，则待测菌种为香菇241-4菌种；所述分子特异性标记引物序列为：

上游引物5′-GGTTCTGCTCCTTGTGACTG-3′

下游引物5′-TCTGCTCTTCAGATGCAAGCT-3′。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：

所述PCR扩增反应体系组成如下：

余量为ddH₂O；

PCR反应条件如下：

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述方法如下：

(1)取待测香菇菌种，接种至PDA斜面培养基，25℃培养14d，转接至PD液体培养基中，25℃下振荡培养14d，收集菌丝，以SDS-CTAB法提取待测香菇菌种基因组DNA；

PCR反应体系每20μL组成如下：

ddH₂O补足至20μL；

PCR反应条件如下：

(3)取步骤(2)扩增产物5μL，与1μL 0.25％溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于1×TAE缓冲液中、5V/cm电压下电泳，电泳结束后EB染色，于自动凝胶图像分析仪上照相，若电泳结果出现1609bp的DNA条带，则待测菌种为香菇241菌种，若电泳结果未出现1609bp的DNA条带，则待测菌种为香菇241-4菌种。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述EB染色为在含0.5μg/ml EB的水溶液中染色30分钟。