CN101711360A - 细胞介导的免疫应答检验及其试剂盒 - Google Patents

细胞介导的免疫应答检验及其试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供用于测定从受试者中收集的小体积未稀释的全血中的细胞介导的免疫(CMI)的方法和试剂盒。具体地，该方法用于测定在体积例如为50μl至500μl的未稀释的全血样品中的应答。这样，包括儿童、成人或老人人类受试者的受试者的毛细管取样和快速测试是便利地。

Description

细胞介导的免疫应答检验及其试剂盒
技术领域
本发明主要涉及用于诊断、监视或治疗的方法和试剂盒，其测量针对体外试剂(原文为“agent in vitro”，也可称为“体外因子”)的细胞应答性。具体地，本发明提供用于测量从受试者收集的小样品全血中的针对抗原的细胞介导的免疫(CMI)应答的***。该方法和试剂盒将在全血样品分析中找到广阔应用，所述全血样品具有包括来自婴儿和儿童或其它受试者的一系列不同体积，其中所述样品体积是受限的或其中需要小样品体积。
背景技术
本说明书中作者引用的出版物的参考书目集中在说明书的末尾。
本说明书对任何之前出版物(或从其衍生的信息)，或任何已知的事物的引用，不是并且也不应该看作是之前出版物(或从其衍生的信息)，或公知常识的已知事物形成为本说明书涉及到努力方面的承认或供认或任何形式的暗示。
免疫应答的功能在于消除入侵的病原体或毒素。在某些情况下免疫应答对有机体是非常破坏性的，并且存活依赖于免疫***从非自体区分自体的能力。例如当免疫***对自体过度应答时产生自体免疫疾病。某些免疫应答针对相对无害的非自体分子。例如哮喘和枯草热，涉及对非自体的免疫应答，其中所述免疫应答比病原因子(causativeagent)更衰弱。通常，先天的免疫***筛选出针对非病原性有机体的应答，并且有助于防止针对此类无害试剂的适应性免疫应答。
适应性免疫应答由淋巴细胞例如执行抗体应答的B淋巴细胞或执行细胞介导的应答的T淋巴细胞来执行。B淋巴细胞产生有助于使病原体和毒素失活的免疫球蛋白。T细胞直接与呈递于宿主细胞表面上的非自体分子(抗原)反应，其与提供“自体”分子指令***的主要组织相容性(MHC)分子有关。在两种情况下，产生对非自体分子的特定表位特异的细胞应答，并提供免疫应答网络和免疫效应子分子。
因此，用于诊断或监视感染或评价受试者建立(mount)针对非自体的免疫应答的能力的一种方法为确定受试者是否已经建立了针对抗原刺激的免疫应答。由于T细胞应答包括产生效应子T细胞，所述效应子T细胞能够对抗原应答或能够被刺激来通过产生免疫效应子分子对抗原应答，可以在体外测定应答于特定抗原的这些分子的产生，作为细胞介导的免疫应答的测定。然而，由于非自体抗原性分子通过抗原呈递细胞呈递至T细胞，存在复杂的和必须在体外成功地发生的细胞与分子的相互作用以产生用于检测的充分的免疫效应子分子。
用于检测细胞介导的免疫应答的大多数体外方法包括使用各种分离技术从全血中纯化外周血单核细胞。此类检验包括铬释放检验、细胞毒性检验、MHC I类四聚体检验、用于IFN-γ或其它细胞因子的检验，其中ELISPOT提供良好的实例。ELISPOT方法固定抗原呈递细胞，并且已经用于检测应答于抗原性刺激产生特定细胞因子的T细胞的数量。
如果使用全血，通常将其稀释于培养基中以稀释红细胞，这被认为降低该检验的敏感性。使用未稀释全血的管内细胞介导的免疫应答检验描述于国际公开No.WO 2004/042396，申请人为Cellestis Limited，在此将其全文引入以作参考。国际公开No.WO 2004/042396公开了使用血液收集管以用于样品与抗原和简单糖一起孵育，并且使用该试管***与其中将血液转移到24-孔微量滴定板并在24-孔微量滴定板中孵育的检验相比，显示增强的敏感性。
对于人类和牲畜动物中的全血检验而言，至少从受试者中取3毫升血液，以提供充足的材料来进行细胞介导的免疫应答检验。通常通过静脉血取样、借助于经常在真空下的用针刺入收集血管来取该量。
检测免疫效应子分子的各种方法，例如酶联免疫吸附检验(ELISA)、放射免疫检验(RIA)、或血细胞计数法可以使用小体积，然而，对于进行体外细胞介导的免疫应答检验的抗原性刺激阶段的改进***，在本领域存在需要。具体地，需要允许以小体积血液进行的全血测试的方法，例如通过外周毛细血管取样获得的那些。筛选小样品血液的能力将极大地便利儿童或其它血液可能受到限制或难于获得的受试者的取样，并且允许无需静脉采血的血液取样，其通过使用毛细血管血例如通过拇指、足跟、耳垂或其它方便位点的点刺测试(pricktest)获得的那些，并且用于测试在单次小容量抽血中(single blooddraw of low volume)的包括有丝***原和半抗原刺激物的多种或一系列抗原。
发明内容
本发明部分基于以下令人惊奇的发现：可以在来自受试者的非常小体积的全血中产生和检测细胞免疫应答，并且其不必须为静脉或动脉血。这意味着收集血液用于进行细胞介导的免疫应答的检验可以使用，例如点刺取样外周毛细血管血液来实现，其通常产生约1毫升或更少的体积。此外，该非常小的全血样品可以就它们产生免疫效应子分子的能力来测试，便于从小样品中多次测试。
在一个广泛的实施方式中，本发明提供用于在来自受试者的样品中测定细胞介导的免疫应答的方法，其中所述样品包括被试剂(agent)例如抗原刺激后分泌免疫效应子分子的细胞。在一个特定实施方式中，本发明提供用于在从受试者收集的全血样品中测定细胞介导的免疫(CMI)应答的方法，其中所述全血样品包括被抗原刺激后能够产生免疫效应子分子的免疫***的细胞，所述方法包括：(i)使来自外周毛细血管的全血样品或来自受试者动脉或静脉的低于0.5mL全血在基本上无需稀释样品下在孵育容器中与抗原一起孵育；和(ii)检测或测定免疫效应子分子或能够产生效应子分子的核酸分子的存在，所述效应子分子指示受试者建立细胞介导的应答的能力。
在另一实施方式中，该方法包括：(i)将来自外周毛细血管的全血样品或来自受试者动脉或静脉的低于0.5mL的全血收集到容器；(ii)使全血与抗原和抗凝血剂一起孵育；和(iii)检测或测定免疫效应子分子或能够产生免疫效应子分子的核酸分子的存在，所述免疫效应子分子指示受试者建立细胞介导的应答的能力。
该方法将在选择用于治疗患有例如以下疾病的受试者的合适的治疗策略中发现广泛应用：炎性疾病状况，病原性感染例如由细菌、病毒、寄生虫或真菌病原体引起的那些，自体免疫失调，免疫缺陷，过敏或癌症或发展此类疾病的倾向。
在优选的实施方式中，该方法包括收集和/或孵育毛细血管血液样品，或用毛细管取样装置从受试者收集样品。
在某些实施方式中，该方法包括：在样品的形状包括已经被优化的尺寸(dimension)的条件下将样品与试剂一起孵育。在某些实施方式中，就特定受试者或受试者群优化所述尺寸。在其它实施方式中，就特定细胞样品优化所述尺寸。在某些实施方式中，尺寸为样品的高度。在另一实施方式中，优化体积。在进一步的实施方式中，还优化外周血单核细胞(PBMC)或其它免疫细胞的浓度。所述″优化″是指与其他测试的值或范围相比所选尺寸值或范围提供最佳的细胞应答。这样，在某些实施方式中，所述样品包括使用本文公开的方法已经预选择来提供最佳细胞应答的尺寸。
如在实施例1中所列举，标准缀合物联免疫检验测定(standardconjugate-linked immunoassay testing)证明：在少至0.5mL，0.4mL，0.3mL，0.2mL和0.1mL的血液孵育总体积中产生IFN-γ。描述于实施例2至4的进一步的实验显示：孵育少至20μl和/或具有4mm样品高度的血液样品能够产生充分的免疫效应子分子以用于诊断检验。最佳结果在约6mm至约12mm或约5mm至约18mm以及中间值的样品高度下获得，而不依赖于收集或孵育的样品体积。
因此，在某些实施方式中，孵育容器适于保持样品的最佳形状，其中所述形状具有选自以下一种或两种或更多的尺寸：(i)最大圆直径低于约6mm；(ii)高度至少约4mm至6mm，最大高度约12mm至20mm；或(iii)体积低于0.5mL，任选地低于约400μl。
在另一方面，本发明提供用于在来自受试者的全血样品中测定针对试剂(agent)的细胞介导的应答的试剂盒，所述试剂盒包括：与能够刺激免疫细胞分泌免疫效应子分子的试剂分开或一起容纳的收集容器，以及进一步任选地包括使用说明书。在某些实施方式中，将该样品从收集容器转移到一个或多个用于与抗原一起孵育的容器，并且所述试剂盒包括一个或多个收集容器和一个或多个孵育容器。方便起见，收集容器包括抗凝血剂。在其它实施方式中，孵育容器包括抗原和任选的简单糖例如右旋糖。
因此，本发明提供用于测定从受试者收集的全血样品中的细胞介导的应答的试剂盒，所述试剂盒以多组分形式包括：(i)一个或多个收集和/或孵育容器，其适合容纳或孵育外周毛细血管全血样品或低于0.5mL的静脉或动脉血；(ii)一种或多种测试抗原，用于分析针对其的体外应答，以及任选的对照抗原；(iii)反应试剂(reagents)，用于测定免疫效应子分子的存在或水平的升高；(iv)任选的一套包括本文所述方法之一的说明书。
在某些实施方式中，孵育容器适于保持样品的最佳形状，其中所述形状具有选自以下一种或两种或更多的尺寸：(i)最大圆直径低于约6mm；(ii)高度至少约4mm至6mm，最大高度约12mm至20mm；或(iii)体积低于0.5mL，任选地低于约400μl。
说明书，例如可以包括收集全血和将血液在收集/孵育容器中混合以将抗凝血剂与该血液混合的说明。在其它实施方式中，说明书包括将全血样品与抗原和与任选的对照抗原或有丝***原一起孵育的说明。在其它实施方式中，说明书包括将孵育容器离心和收集血浆的说明。在某些实施方式中，说明书包括检测血浆中的免疫效应子分子的说明。
在某些实施方式中，标记收集容器以将样品高度确定为约12mm。在某些实施方式中，试剂盒包括多个标记的相同和/或不同尺寸的收集容器。在某些实施方式中，试剂盒包括毛细管取样装置。在另一实施方式中，试剂盒包括一种或多种用于诊断的测试抗原和任选的作为对照抗原的有丝***原，以用于分析针对其的体外应答。任选地，试剂盒进一步包括适于测定免疫效应子分子或其编码分子的存在或水平升高的反应试剂，包括阳性和阴性对照。在某些实施方式中，试剂盒进一步包括适于进行用于免疫效应子检测的检验的反应试剂。在一种实施方式中，所述检验为用于IFN-γ、或下游效应子分子的检验。在优选的实施方式中，反应试剂包括用于检测IFN-γ，TNF或GM-CSF的抗体缀合物。在示例性的实施方式中所述抗体缀合物检测IFN-γ。此类检验包括例如基于ELISA或ELISPOT的检验或本领域已知的类似检验。在另一实施方式中，所述检验为用于编码免疫效应子分子，例如IFN-γ的RNA的逆转录-扩增检验。此类检验中本领域是已知的，并且描述于例如Sambrook，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd Edition，CSHLP，CSH，NY，2001和Ausubel(Ed)Current Protocols inMolecular Biology，5th Edition，John Wiley&Sons，Inc，NY，2002。
在另一方面，本发明包括可以自动化或半自动化的方法、计算机程序、计算机产品、计算机以便于从受试者检验的结果的解释。
上述简述不是并且不应以任何形式看作本发明所有实施方式的穷举列举。
附图说明
图1为用于执行由存储介质编码的指令的***的图解表示。
图2为磁性存储介质的截面的图解表示。
图3为光学可读数据存储***的截面的图解表示。
具体实施方式
除非另外指出，本文所用的所用科学技术术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解相同的含义。虽然与本文所述类似或等同的任何方法或材料可用于本发明实践和测试中，但还是描述优选的方法和材料。为了本发明的目的，以下术语如下定义。
术语″约″规定前述术语数值中的一些变化或校正。其涉及数量(quantity)、体积、水平、值、百分比、尺寸、大小或量(amount)，其可以相对于列举的术语以多至35％，30％，25％，20％，15％，10％，5％，4％或3％变化。这样，术语″至少约6mm″包括4mm或5mm以及6mm和大于6mm的高度，而″约12mm″包括13mm，14mm，15mm或16mm或小于12mm的高度。此外，术语覆盖单位数值的分数部分，例如6.5mm或6.9mm等。在优选的实施方式中，变化是较小的，并且限制至数值中的10％或15％的变化。
本文使用冠词″a″和″an″(对应于中文的“一个”、  “一种”或未将其翻译)来指一个或多于一个(即至少一个)冠词的语法目标。举例而言，″一种抗原″或“一个抗原”或“抗原”是指一种抗原或多于一种抗原，″一种免疫效应子分子″或″一个免疫效应子分子″或“免疫效应子分子″是指一种或多种免疫效应子分子。
本文所用术语″抗原″包括刺激免疫应答、特别是细胞免疫应答的任何分子或试剂，并且包括反义蛋白或肽、半抗原、有丝***原、过敏原或毒素或具有此活性的任何天然发生或合成的分子或其部分。在某些实施方式中，抗原包括一种或多种全长或部分长度的多肽。在其它实施方式中，抗原包括肽或一组肽，其来自一种或多种不同全长或部分长度的多肽。在某些实施方式中，使用在体外模拟呈递至免疫***的抗原的一种或多种作用的抗原。通常，就给定群体或受试者中的最佳选择性和敏感性选择测试抗原。在一种示例性实施方式中，所述抗原为来自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的抗原。在某些实施方式中，所述抗原为结核(TB)特异性抗原。在其它实施方式中，所述抗原为衍生自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)或鸟分枝杆菌(M.avium)的纯化蛋白。在某些实施方式中，所述抗原刺激分枝杆菌蛋白例如ESAT-6(Skjot et al.，Infection and Immunity，68(1)：214-20，2000)，CFP-10和TB7(Brock et al.，Int.J.Tuberc.Lung.Dis，5(5)：462-467，2001)。有丝***原可以用作阳性对照，或来检测样品中细胞建立抗原非特异性免疫应答的能力。在其它实施方式中，所述试剂为有丝***原。在其它实施方式中，所述抗原选自自体抗原、来自病原性有机体的抗原、刺激免疫应答的金属或无机分子、或肿瘤抗原。在某些实施方式中，所述试剂(抗原)为磷脂、磷蛋白或磷脂蛋白。在另一示例性实施方式中，所述抗原来自巨细胞病毒(CMV)。在某些实施方式中，来自病原性有机体的所述抗原为细菌、病毒、寄生虫或真菌抗原或其类似物。
除非上下文需要，否则单词″包括(comprise)″，以及变体例如″包括(comprises)″和″包括(comprising)″，将被理解为暗示包含指定的整体(integer)或步骤或整体或步骤的组，但是不排除任何其它整体或步骤或整体或步骤的组。
除非另外指出，本文所述的每一实施方式加以必要的修正可用于每一个其它实施方式。
优选地，″受试者″为人类。然而，本发明涉及灵长类、牲畜动物、伴侣动物和鸟类以及非哺乳动物例如爬行动物和两栖动物。因此，该检验应用于人类、牲畜、兽医和野生动物治疗、诊断和监测。在某些实施方式中，人类受试者选自展示特定属性或状况的组。在某些实施方式中，受试者为儿童、成人或老人受试者。在某些实施方式中，受试者具有或者已经具有病原性感染、自体免疫疾病、或癌症，或正在经受癌症治疗，或有发展此类疾病的倾向，免疫缺失或经受炎症反应。一旦受试者已经被评价包括使用本方法和/或试剂盒，则他们可以被治疗，因此，还特别涉及包括诊断和治疗的方法。
因此，本发明提供本文公开的方法中的任一，其中受试者为人类，包括儿童、成人或老人受试者。在其它实施方式中，受试者为动物或鸟，例如牲畜、赛马、外来的(exotic)、迁移的动物或鸟。
如上所述，本发明的显著优点之一为便于使用未稀释的来自外周毛细血管的全血进行CMI检验。因此，在某些实施方式中，该方法包括使用毛细管取样装置从受试者中收集样品。该装置可以为适于毛细血管取样任何外周毛细血管例如拇指、手指、足跟、脚趾、耳垂等的点刺装置。在某些实施方式中，该装置包括毛细管。毛细管或其它窄或锥形容器可用于形成具有非常小样品的最佳高度的样品形状，例如约20μl至50μl与约200μl至250μl之间。在某些实施方式中，孵育容器适于保持样品的最佳形状，其中所述形状具有选自以下一种或两种或更多的尺寸：(i)最大圆直径低于约6mm；(ii)高度至少约4mm至6mm，最大高度约12mm至20mm；或(iii)体积低于0.5mL，任选地低于约400μl。在某些实施方式中，容器中的样品具有至少约6mm至最大约12mm的高度。在某些实施方式中，样品具有4mm，5mm，6mm，7mm，8mm，9mm，10mm，11mm，12mm，13mm，14mm，15mm，16mm，17mm，18mm，19mm或20mm的高度或中间的高度。在其它实施方式中，样品具有6mm，7mm，8mm，9mm，10mm，11mm或12mm的高度或中间的高度。关于样品的体积，在某些实施方式中，孵育的总样品体积为低于500μl，低于400μl，低于300μl，低于200μl，低于100μl或低于50μl。其中所述样品为毛细血管血，孵育的总样品体积选自约2000μl，1500μl，1400μl，1300μl，1200μl，1100μl，900μl，800μl，700μl，600μl，500μl，400μl，300μl，200μl，100μl，50μl或40μl或中间的体积。在某些实施方式中，将样品收集到约3-4mm直径的毛细管。
关于″免疫细胞″包括例如淋巴细胞的细胞，其包括自然杀伤(NK)细胞、T-细胞、(CD4+和/或CD8+细胞)、B细胞、巨噬细胞和单核细胞；树突细胞或任何其它能够应答于直接或间接抗原刺激而产生效应子分子的细胞。方便起见，免疫细胞为淋巴细胞，更特别是T-淋巴细胞。
因此，本发明涉及本文公开的方法，其中免疫细胞选自自然杀伤(NK)细胞、T-细胞、B细胞、巨噬细胞或单核细胞。在优选的实施方式中所述细胞为T-细胞。
免疫效应子分子可以为应答于细胞被抗原激活或刺激而产生的一系列分子中的任何一个。虽然干扰素(IFN)例如IFN-γ为特别有用的免疫效应子分子，其它包括一系列的细胞因子例如白介素(IL)，例如IL-2，IL-3 IL-4，IL-5，IL-10或IL-12；肿瘤坏死因子α(TNF-α，TNF-β)、例如在补体途径中的补体或成分的许多其它中的集落刺激因子(CSF)例如粒细胞(G)-CSF或粒细胞巨噬细胞(GM)-CSF，穿孔蛋白、防御素、组织蛋白酶抑制素(cathelicidins)、颗粒酶(granzymes)、Fas配体、CD-40配体、外毒素(exotaxins)、细胞毒素、趋化因子和单核因子。
因此，在某些实施方式中本发明提供其中免疫效应子分子为以下的方法：细胞因子、补体***的成分、穿孔蛋白、防御素、组织蛋白酶抑制素、颗粒酶、Fas配体、CD-40配体、外毒素、细胞毒素、趋化因子或单核因子。在优选的实施方式中，细胞因子为IFN-γ，TNFα或GM-CSF。
″全血″是指来自受试者的血液，其基本上尚未被稀释或分级(fractionate)，对于细胞保持血液的周围温度以接近于实际的天然血浆条件。这样，根据本发明小体积或干燥量的例如抗原、糖或抗凝血剂的添加不构成稀释，而超过血液体积的培养基的添加构成稀释。尽管未稀释的全血为优选和最方便的样品，本发明扩展到包含免疫细胞的其它样品，例如淋巴液、脑脊液、组织液(例如骨髓或胸腺液)和呼吸***液体(respiratory fluid)包括鼻和肺液。这些样品的衍生物还可以通过处理获得。例如，血沉棕黄层细胞(buffy coat cells)或外周血单核细胞或抗原呈递细胞可以通过本领域已知的方法获得。全血还可以处理以通过本领域已知的方法除去例如红细胞和/或血小板的成分。通过添加超过约40％至50％初始体积的样品，将出现实质上的稀释。
因此，在某些实施方式中，该方法包括检测效应子分子或能够产生效应子分子的核酸分子的存在。在该实施方式中，效应子分子或能够产生效应子分子的核酸分子的存在或水平的升高指示受试者建立细胞介导的应答的能力。
在示例性的实施方式中，样品的形状包括已被优化的高度。在该实施方式的一个实施例中，细胞样品包括至少6毫米(mm)至最大约12mm的高度，或任何中间高度。本领域技术人员将理解，关于使用的样品体积或样品在其中孵育的容器的形状，对于样品的优选高度的目前公开的需要允许可观的变化或选择。这样，在某些实施方式中，大体积的样品，如10毫升(mL)血液在合适尺寸的容器中孵育，以确保孵育期间样品的高度不超过约12mm。在另一标度上，可以例如在3-4mm直径的毛细管中孵育50微升(μl)的样品，以提供至少约6毫米(mm)至最大约12mm的样品高度，或任何中间高度。本发明不必限于要孵育的样品的任何特定体积或包含样品的容器的任何特定尺寸或形状。然而，在优选的方面本发明便于使用小体积的血液(包括毛细管取样体积)，因此避免静脉血液取样的需要。此外，不需要要求额外处理步骤的稀释血液，将血液以任意状态保持以用于测定免疫应答。使用来自人类供体的全血已经确定上述最佳高度。其它受试者或受试者群或亚群或细胞样品类型具有不同的特征，并且在样品孵育的最佳高度上显示某些变化。在这些组中涉及通过优化在样品孵育的最小和最大高度方面一些其它次要的变化。一旦理解本发明，此类优化在接受人(addressee)的技能内。
在某些实施方式中，其中共孵育样品和抗原的容器还为用于从受试者中收集样品的收集容器。可以使用很多不同可获得的容器中的任一个，条件是它们提供合适的样品尺寸。在实施例中描述了许多不同的管以旨在例示，但本发明绝不限于这些容器。在某些实施方式中，容器为包括真空以便于从受试者中收集血液的管。在其它实施方式中，容器为毛细管。在某些实施方式中，毛细管用于从皮肤表面通过毛细作用收集血液。在某些实施方式中，将样品从受试者收集到包含抗原的收集容器中，或随后向收集容器添加抗原。在某些实施方式中，使用毛细管取样装置例如针点刺装置取样血液，将血液收集到肝素化的收集容器，并随后转移到合适的容器以与试剂共孵育。
在某些实施方式中，样品为血液样品。通常，血液在抗凝血剂例如肝素的存在下保持，当添加血液时其可以在容器中或随后添加。任选的，简单糖例如右旋糖包含于容器中，或添加到孵育混合物。在一些优选的实施方式中，血液样品为全血样品。在某些实施方式中，将来自受试者的全血收集到包含抗原和/或抗凝血剂的容器中，在其它实施方式中，其后将抗原和/或抗凝血剂添加到血液中。
在一种实施方式中，该方法包括：使用毛细管取样装置从受试者收集血液样品，将血液导入合适的收集容器。在某些实施方式中，毛细管取样装置包括抗凝血剂和抗原。在其它实施方式中，收集容器或随后的容器(subsequent vessel)包括抗原。在其它实施方式中，收集容器包括简单糖例如右旋糖或其它保持样品细胞建立CMI应答的能力的试剂。无论通过哪种途径，该方法包括：使抗原与基本上未稀释样品的血液样品接触，在样品形状包括已对特定受试者或受试者群或样品类型优化过的高度的条件下使样品与抗原一起孵育。在另一实施方式中，该方法包括下使样品与试剂一起孵育，检测效应子分子或能够产生效应子分子的核酸分子的存在。在示例性的实施方式中，免疫效应子分子为细胞因子例如IFN-γ。
在其它实施方式中，将血液通过标准方法收集到收集容器，并转移到预定尺寸的样品(测试)容器，以确保在样品形状包括已对特定受试者或受试者群或样品类型优化过的高度的条件下使规定体积的血液与抗原一起孵育。
使用血液收集管作为收集容器和测试容器公开于国际公开No.WO 2004/042396，申请人为Cellestis Limited，在此将其全文引入以作参考。
在某些实施方式中，与抗原一起孵育的血液样品包括低于约1mL血液或高于约2mL血液的体积。在其它实施方式中，孵育期间1mL血液样品或约1mL血液样品不包括13mm的宽度。
在某些实施方式中，毛细管取样装置为点刺装置，例如但绝不限于美国专利No.4,469,110所描述的那些。
在另一实施方式中，该方法包括：评价在来自一个或多个受试者组中的血液样品中的细胞介导的免疫应答，其中评价来自每一受试者组的样品以确定来自每一受试者组的要评估的样品的最小体积。任选地，该方法包括：取样适合每一受试者或受试者组的血液的量，其中在与抗原一起孵育期间每一样品包括，包含已对特定受试者或受试者群或样品类型优化过的高度的形状。这样，例如，来自包括小样品体积(低于约1毫升)的受试者样品的分析结果可以容易地与来自包括例如几毫升血液的大样品的结果比较。这样，通过表征和控制细胞介导的应答检验中的变量，本发明增强来自检验的输出的值。
本发明还部分基于以下观察：孵育期间由孵育容器的形状确定的样品的高度，可用于调控细胞介导的免疫应答检验的敏感性。在一种实施方式中，本发明提供测定在细胞样品中的细胞介导的免疫应答的方法，所述方法包括：在其中样品的形状包括至少6毫米(mm)至约12mm的高度的条件下使样品与抗原一起孵育。在该观测特别有用的应用中，本发明提供检验来自受试者的样品的方法，其中样品体积是受限的或其中需要低样品体积。根据使用血液样品实施的本发明的一种实施方式，使用少至约20μl至约200μl的血液样品，其中孵育期间样品的形状包括在其最高点至少约6毫米(mm)的高度，至在其最高点约12mm的最大高度。
因此，一方面本发明提供在来自受试者的样品上进行细胞介导的免疫应答检验的方法，其中所述方法避免使用针(needles)，该方法包括使用毛细管取样装置收集血液，以获取小体积的血液。在另一相关方面，本发明包括实施本文所述的检验，包括使用小体积的样品例如约20μl至低于但约1mL的样品的一种或多种。在其它实施方式中，使用针对细胞检验技术的标准血液取样，并使用较大的样品体积，典型的1mL至5mL，但包括大至约10至200mL或以上的体积。在优选的实施方式中，全血的总孵育体积在约50μl至低于约500μl的范围内。
本发明提供用于测定受试者样品中细胞介导的免疫(CMI)应答的方法，包括在样品的形状包括已被优化的尺寸的条件下将样品与试剂一起孵育。在某些实施方式中，细胞样品与抗原一起孵育约4或5至约50小时。
在某些实施方式中，该方法基于测定通过免疫***的细胞应答于抗原性刺激的免疫效应子分子的产生。在其它实施方式中，免疫效应子分子为由效应子T细胞应答于抗原刺激产生的即时效应子分子(immediate effector molecules)。在其它实施方式中，测定下游效应子。例如，IFN-γ或其它即时效应子分子引起测定其产生的其它效应子分子的产生。在另一实施方式中，免疫效应子的产生通过测定能够产生免疫效应子的核酸分子的水平或存在来测定。因此，在某些实施方式中，免疫效应子可以使用配体或结合分子例如对效应子特异的抗体或通过测定编码效应子的基因的表达水平来检测。因此，本发明提供确定受试者细胞应答性的方法，而且，提供用于诊断感染性疾病、病理条件、免疫状况、免疫活性水平和T细胞对内源性或外源性抗原的应答性的标记的方法。
因此，在另一实施方式中，本发明涉及用于测定在受试者中的CMI应答的方法，所述方法包括：i)将来自受试者的流体样品收集到收集容器，其中所述样品包括被试剂刺激后产生免疫效应子分子的免疫***的细胞。在某些实施方式中，所述收集容器包括抗凝血剂，例如肝素。在其它实施方式中，所述收集容器包括试剂。在某些实施方式中，该方法进一步包括使试剂与收集容器中的样品接触。该方法进一步包括iii)  在样品的形状包括已被优化的尺寸的条件下使所述样品与抗原一起孵育。在某些实施方式中，该方法任选的包括iv)检测免疫效应子分子或能够产生这些中任一的核酸分子的存在，其中效应子分子或能够产生效应子分子的核酸分子的存在或水平的升高指示受试者建立细胞介导的应答的能力。在其它实施方式中，免疫效应子为细胞因子、细胞毒素或趋化因子。在示例性的实施方式中，免疫效应子为IFN-γ。
在某些实施方式中，通过测定在具有一系列尺寸的样品中效应子细胞功能以及选择与效应子细胞功能的最敏感测定相关的形状来优化样品的形状。在优选的实施方式中，样品的高度是变化的。在示例性的实施方式中，样品的高度从最大高度约12mm，最小高度约6mm而变化。
根据优选的实施方式，本发明提供用于测定人类受试者中的CMI应答的方法，所述方法包括：使用毛细管取样装置将来自所述人类受试者的样品收集到收集容器中。在某些实施方式中，所述样品包括被抗原、有丝***原或半抗原刺激后能够产生免疫效应子分子的免疫***的细胞。在某些实施方式中，该方法包括使所述样品与抗原一起孵育，然后测定免疫效应子分子的存在或水平的升高，其中所述免疫效应子分子的存在或水平指示所述人类受试者建立细胞介导的免疫应答的能力。
因此，在另一优选的实施方式中，本发明提供用于测定受试者中CMI应答的方法，所述方法包括将来自所述受试者的样品收集到收集容器中，其中所述样品包括被抗原刺激后能够产生IFN-γ分子的免疫***的细胞，将所述样品与抗原一起孵育，然后测定IFN-γ分子的存在或水平的升高，其中所述IFN-γ分子的存在或水平指示所述受试者建立细胞介导的免疫应答的能力。
从受试者收集的样品通常保存在血液收集容器中。尽管未稀释的全血是优选和极方便的样品，本发明扩展到包含免疫细胞的其它样品，例如淋巴液、脑脊液、组织液和呼吸***液体包括鼻和肺液。
在从受试者抽血后延长一段时间(extended periods)后，CMI***的细胞丧失建立全血中CMI应答的能力，并且抽血后24小时未干预(intervention)的应答经常是严重地降低或缺失。在本发明中人工和对专门设备需要的降低允许使用抗原的CMI刺激在护理地点(carelocation)例如医生办公室、诊所、门诊设备和兽医诊所或在农场进行。一旦抗原刺激完成，对新鲜和活性细胞的需要不再存在。IFN-γ和其他细胞因子或免疫效应子分子在血浆中是稳定的，这样，样品可以被储存或输送，而不需要与用于其它感染疾病或其他疾病诊断的标准血清样品类似的方式的特定的条件或快速时间要求。
孵育步骤可以从约4或5小时至50小时，更优选约5小时至40小时，更优选约8至24或约16至24小时，或之间的时间阶段。在某些实施方式中，任选的起始混合步骤以将抗原分布到整个样品后，进行样品孵育而无需进一步混合。
因此，本发明另一优选的实施方式涉及用于测定包括人类受试者的受试者中CMI应答的方法，所述方法包括：通过毛细管取样从所述受试者收集全血的样品，将所述全血样品与抗原一起孵育，然后测定免疫效应子分子例如IFN-γ的存在或水平的升高，其中所述免疫效应子分子的存在或水平指示所述受试者建立细胞介导的免疫应答的能力。
测定CMI的能力对于评估受试者的以下能力是重要的：应答由病原性试剂例如微生物或病毒或寄生虫引起的感染、建立例如在糖尿病中的自体免疫应答以防止癌症或其它肿瘤条件或测试对环境抗原的敏感性(过敏测试)。因此，提到“测定在受试者中的CMI应答”包括和包含感染性和自体免疫疾病的免疫诊断、免疫活性的标记和对内源性和/或外源性抗原(包括测定疫苗的效力)的T-细胞应答的检测以及用于过敏、炎性疾病和癌症的标记。
以小体积血液进行该测试的能力对于儿童和其它血液可能受限的样品而言是重要的。在纯化淋巴细胞方面任何处理步骤的不存在在小血液体积方面增加优点，这是因为来自小体积的淋巴细胞的纯化和计数有实际上的困难，如在无菌环境中添加温暖的无菌培养基和反应试剂。通过调整孵育容器或样品的相对比例(例如，形状、宽度和高度)以小体积获得最佳CMI应答的能力提供有价值的优点。术语容器(vessel)、容器(container)、隔室(compartment)可相互交换地使用，并且包括容纳任何体积的任何容器(receptacle)，例如孔、液体采样器(dip)、管、艾芬道夫(eppendorf)等。
本文涉及的自体免疫疾病还特别包括斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自体免疫爱迪生疾病多发性硬化(Autoimmune Addison′sDisease Multiple Sclerosis)、肾上腺的自体免疫疾病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性***和***、***(Behcet′s Disease)、大疱性类天疱疮、心肌病、乳糜泻皮炎(CeliacSprue-Dermatitis)、慢性疲劳症候群(CFIDS)、慢性炎症(ChronicInflam)、脱髓鞘、慢性炎症(Chronic Inflam)多神经病、变应性肉芽肿性血管炎(Churg-Strauss Syndrome)、瘢痕性类天疱疮(CicatricialPemphigoid)、肢端硬皮综合征(CREST Syndrome)、冷凝集素病、克罗恩氏病、疱疹样皮炎、盘状狼疮、特发性混合性冷球蛋白血症、纤维肌痛、肾小球肾炎、甲状腺机能亢进(Grave’s Disease)、格林-巴利综合征(Guillain-Barre)、桥本甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病胰岛素依赖型糖尿病(IgANephropathy Insulin Dependent Diabetes)(I型)、扁平苔藓、狼疮、梅尼埃尔氏病、混合性***病、多发性硬化、重症肌无力、心肌炎、寻常型天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多内分泌腺综合征、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣、雷诺氏现象、赖特尔综合症、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、干燥综合征(Sjogren′s Syndrome)、全身肌强直综合征、全身性红斑狼疮、大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞性动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎和白癜风。
通常评估在这些个体中潜在或实际的CMl应答性是重要的。
涉及的其它疾病状况包括炎性疾病状况。
本发明涉及的炎性疾病的实例包括但不限于导致在特定区域发红(redness)、肿胀、疼痛和感觉发热的那些疾病或失调，这意味着保护组织免受损伤或疾病的影响。可以使用本发明方法治疗的炎性疾病包括但不限于：痤疮、心绞痛(angina)、关节炎、吸入性肺炎、疾病、积脓症、胃肠炎、炎症、肠道流行性感冒、NEC、坏死性小肠结肠炎、***疾病、咽炎、PID、胸膜炎、嗓子发炎疼痛(raw throat)、发红(redness)、发红病(rubor)、咽喉痛、胃流感和***、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(Chronic Inflammatory DemyelinatingPolyneuropathy)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(ChronicInflammatory Demyelinating Polyradiculoneuropathy)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(Chronic Inflammatory DemyelinatingPolyneuropathy)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(Chroniclnflammatory Demyelinating Polyradieuloneuropathy)。
癌症治疗还某种程度上依赖于CMI。本文涉及的癌症包括：特征在于不受控的细胞生长(例如形成肿瘤)而这些细胞没有任何分化成特异和不同的细胞的疾病和紊乱。此类疾病和紊乱包括ABL1原癌基因、AIDS相关癌症、听神经瘤、急性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病、囊性腺样癌、肾上腺皮质癌、特发性髓样化生(Agnogenic myeloidmetaplasia)、脱发、腺泡状软组织肉瘤(Alveolar soft-part sarcoma)、***癌、血管肉瘤、再生障碍性贫血、星形细胞瘤、共济失调毛细血管扩张、基底细胞癌(皮肤)、膀胱癌、骨癌、肠癌、脑干胶质瘤、脑和CNS瘤、乳腺癌、CNS肿瘤、类癌肿瘤、子***、儿童脑瘤、儿童癌症、儿童白血病、儿童软组织肉瘤、软骨肉瘤、绒毛膜癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓系白血病、结直肠癌(Colorectal Cancers)、皮肤T细胞淋巴瘤、  隆突性皮肤纤维肉瘤(Dermatofibrosarcoma-provesselrans)、促***增生性小圆细胞肿瘤、导管癌、内分泌癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤文氏肉瘤、肝外胆管癌、眼癌、眼黑素瘤、成视网膜细胞瘤、输卵管癌(FallopianVessel cancer)、范可尼贫血、纤维肉瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠癌、胃肠类癌肿瘤、泌尿生殖器癌、生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞疾病、神经胶质瘤、妇科癌、血液恶性肿瘤、毛细胞白血病、头和颈癌、肝细胞癌、遗传性乳腺癌、组织细胞增多病、霍奇金病、人类***状病毒、***、高钙血症、下咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌、卡波西肉瘤、肾癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、喉癌、平滑肌肉瘤、白血病、利弗劳梅尼(Li-Fraumeni)综合征、唇癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴水肿、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、男性乳腺癌、肾恶性横纹肌样瘤、髓母细胞瘤、黑色素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、新陈代谢癌、口腔癌、多发性内分泌瘤病、蕈样肉芽肿病、骨髓增生异常综合征、骨髓瘤、骨髓增生性疾病、鼻癌、鼻咽癌、肾胚细胞瘤、神经母细胞瘤、神经纤维瘤病、奈梅亨断裂综合征、非黑色素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、眼癌(Ocular Cancers)、食道癌、口腔癌(Oral cavity Cancer)、口咽癌、骨肉瘤、造口卵巢癌(Ostomy OvarianCancer)、胰腺癌、鼻窦癌、甲状旁腺癌、腮腺癌、***癌、外周神经外胚层瘤、脑垂体癌、红细胞增多症、***癌、稀少癌症及相关疾病(Rare-cancers-and-associated-disorders)、肾细胞癌视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、先天性血管萎缩性皮肤异色症(Rothmund-ThomsonSyndrome)、唾液腺癌、肉瘤、神经鞘瘤、塞扎里综合征、皮肤癌、小细胞肺癌(SCLC)、小肠癌、软组织肉瘤、脊髓肿瘤、鳞状细胞癌(皮肤)、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、移行细胞癌(膀胱)、移行细胞癌(肾-骨盆-/-输尿管)、滋养细胞癌、尿道癌、泌尿***癌、膀胱上皮分化标志物(Uroplakins)、子宫肉瘤、子宫癌、***癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血病(Waldenstrom’s-Macroglobulinemia)、肾母细胞瘤(Wilms’Tumour)。
可以测试一系列抗原中的任一，例如对特定有机体、病毒、自体抗原或癌细胞特异的那些。作为选择，可以使用更常用的试剂来测试细胞介导的免疫应答的通用能力。后者的实例包括来自结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的PPD和破伤风类毒素。任何肽、多肽或蛋白质，碳水化合物、糖蛋白、磷脂、磷蛋白或磷脂蛋白或非蛋白化学试剂可用于本检验***。
如上所述，免疫效应子分子的检测可以在蛋白或核酸水平上进行。因此，提到“所述免疫效应子分子的存在或水平”包括直接或间接数据。例如，高水平的IFN-γmRNA为间接数据，显示增加的IFN-γ水平。用于评估RNA的本领域已知的检验描述于例如Sambrook，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd Edition，CSHLP，CSH，NY，2001 and Ausubel(Ed)Current Protocols in Molecular Biology，5thEdition，John Wiley&Sons，Inc，NY，2002。
免疫效应子的配体在检测和/或定量这些分子上特别有用。针对免疫效应子分子的抗体特别有用。本文涉及的用于检验的技术在本领域是已知的，并且包括，例如三明治检验、ELISA和ELISSPOT。还包括快速现场护理免疫层析装置(Rapid point of careimmunochromatographic devices)。提到“抗体”包括抗体的部分、哺乳动物源化(例如人源化)抗体、重组或合成抗体以及杂交和单链抗体。
多克隆和单克隆抗体都能够通过用免疫效应子或其抗原性片段免疫获得，任一类型可用于免疫检验。获得两种类型血清的方法在本领域是已知的。多克隆血清不太优选，但通过以下相对容易制备：用有效量的免疫效应子，或其抗原性部分注射合适的实验室动物，从该动物收集血清，通过任何已知的免疫吸附技术分离特定血清。虽然通过该方法产生的抗体实际上可用于任何类型的免疫检验，由于产品的潜在异质性它们通常不优选。
在免疫检验中单克隆抗体的使用特别优选，因为能够大量产生它们以及产品的均匀性。通过将永久细胞系和对免疫原性制剂敏感的淋巴细胞融合衍生的，用于单克隆抗体生产的杂交瘤细胞系的制备可以通过本领域技术人员已知的技术来完成。
因此，本发明的另一方面涉及用于检测来自受试者的包含免疫细胞的样品中的免疫效应子的方法，所述方法包括：在足以形成抗体-效应子复合物的条件下，将所述样品或所述样品的等分试样与对所述免疫效应子或其抗原性片段特异的抗体接触一段时间，然后检测所述复合物。
样品包括全血。该方法包括在平面或球形固体载体上的微阵列和巨阵列(macro-arrays)。
通过参考美国专利4,016,043，4,424,279和4,018,653可以看出，可以获得宽范围的免疫检验技术。
以下为一种类型检验的描述。将未标记的抗体固定在固体基质上，将要就免疫效应子(例如抗原)测试的样品与结合分子接触。孵育足以允许形成抗体-抗原复合物的合适的时间后，然后将用能够产生可检测信号的报道分子标记的针对该抗原特异的二抗加入并孵育，使经过足以形成抗体-抗原-标记的抗体的另一复合物的时间。冲洗掉任何未反应的材料，通过观察由报道分子产生的信号确定抗原的存在。结果通过简单的观察可视信号可以是定性的，或可以通过与包含已知量的抗原的对照样品比较来定量。该通用技术对于本领域技术人员是已知的，为许多变体中的任何。
在这些检验中，对瞬时免疫效应子(instant immune effector)具有特异性的一抗共价地或主动地结合到固体表面。典型地固体表面为玻璃或聚合物，最常用的聚合物为纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固体载体可为以下形式：容器、珠、球、微孔板(microplate)的盘(discs)、或适于进行免疫检验的任何其它表面。结合方法在本领域是已知的，通常由交联共价结合或物理吸附组成，在用于测试样品的制剂中洗涤聚合物-抗体复合物。然后将要测试的样品的等分试样加入固相复合物，并在合适的条件下(例如约20℃至约40℃)孵育足够的时间(例如2-120分钟或当更方便时，过夜)以允许结合存在于抗体中的任何亚单位。孵育时间后，将抗体亚单位固相洗涤和干燥，并与对抗原的部分的特异性二抗一起孵育。二抗与报道分子连接，报道分子用于指示二抗与半抗原的结合。
对于该检验有许多变体。一种特别有用的变体为所有或许多组分基本上同时地混合的同时检验(simultaneous assay)。
关于本说明书中所用的″报道分子″，是指通过其化学性质提供分析上可鉴定的信号的分子，其允许检测抗原结合的抗体。检测可以是定性或定量的。在该类型检验中最常用的报道分子为酶、荧光团或包含放射性核素的分子(即放射性同位素)和化学发光分子。合适荧光团的实例提供于表2。在酶免疫检验的情况下，酶通常借助于戊二醛或高碘酸盐缀合到二抗。然而，为了更容易地识别，存在各种不同的缀合技术，其对于本领域技术人员容易获得。其中常用的酶包括辣根过氧物酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶。当通过相应的酶水解时，与特定酶一起使用的底物通常就产生可检测的颜色变化而选择。合适酶的实例包括碱性磷酸酶和过氧化物酶。还可以使用荧光底物，其产生荧光产物而不是上述的发色底物。在所有情况下，将酶标记的抗体加入一抗-抗原复合物，使其结合，然后洗涤掉过量的反应试剂。然后将包含合适底物的溶液加至抗体-抗原-抗体的复合物。底物将与连接到二抗的酶反应，给出定性可视的信号，其可通常分光光度地被进一步定量，以给出存在于样品中的抗原的量的指示。再一次，本发明扩展到基本上同时的检验。
作为选择，荧光化合物，例如荧光素和罗丹明，可以化学地偶联到抗体上而不改变其结合能力。当通过用特定波长的光照射激活时，荧光染料-标记的抗体吸收光能，诱导分子中的可激发性状态，然后发射为用光显微镜能够可视检测的特征颜色的光。使荧光标记的抗体与一抗-抗原复合物结合。洗涤掉未结合的反应试剂之后，然后将残余的三元复合物暴露到合适波长的光下，观察到的荧光指示目的抗原的存在。免疫荧光和EIA技术在本领域非常良好的建立，对于本方法特别优选。然而，还可以使用其它报道分子，例如放射性同位素、化学发光或生物发光分子。
存在可使用的一系列其它检测***，包括胶体金，本发明包括所有此类检测***。    
本发明还涉及基因检验，例如包括RT-PCR分析或其它基于本领域已知的策略的扩增来检测编码免疫效应子的基因序列的RNA表达产物。
在一种实施方式中，PCR使用引物对进行，其一种或两种通常用相同或不同的能够给出可区分信号的报道分子标记。荧光团的使用在本发明实施中尤其有用。合适荧光团的实例可以选自表2中给出的列表。其它标记包括发光(luminescence)和磷光以及红外染料。这些染料或荧光团还可用作用于抗体的报道分子。
本发明包括分析荧光发射的任何合适方法。在这点上，本发明涉及包括但不限于以下技术：例如由Lakowicz等，Biophys.J.，72：567，1997公开的2-光子和3-光子时间分辨的荧光光谱(2-photon and3-photon time resolved fluorescence spectroscopy)，例如由Eriksson等，Biophys.J.，2：64，1993公开的荧光寿命成像以及例如由Youvan et al.，Biotechnology.3：1-18，1997公开的能量共振能量转移。
发光(Luminescence)和磷光可分别由本领域已知的合适的发光或磷光标记产生。在这点上可使用鉴定此类标记的任何光学方法。
红外辐射可由合适的红外染料产生。可用于本发明的示例性红外染料包括但不限于以下公开的那些：Lewis et al.，Dyes Pigm.，42(2)：197，1999，Tawa et al.，Mater.Res.Soc.Symp.Proc.，488[Electrical，Opticaland Magnetic Properties of Organic Solid-State Materials IV]，885-890，Daneshvar et al.，J.Immunol.Methods，226(1-2)：119-128，1999，Rapaport et al.，Appl. Phys.Lett.，74(3)：329-331，1999 and Duriget al.，J.Raman Spectrosc.，24(5)：281-285，1993。可以使用任何合适的红外光谱法来询问(interrogate)红外染料。比如，在该点上可使用例如由Rahman et al.，J.Org.Chem.，63：6196，1998描述的傅立叶变换红外光谱。
合适地，电磁波散射可由入射电磁辐射包括光和X射线的衍射、反射、偏振或折射引起。此类散射可用于定量mRNA的水平或蛋白质的水平。
在分析荧光团发射上流式细胞仪特别有用。
如本领域已知，流式细胞仪为高通量技术，其包括当悬浮于流体流时随着它们通过一道或多道激光束的路径，快速分析颗粒(例如标记的mRNA，DNA或蛋白质)的物理和化学特性。由于每一颗粒拦截激光束，使用任何合适的例如下文描述的跟踪算法，由每一细胞或颗粒发射的散射光和荧光可以被检测和记录。
现代流式细胞仪能够进行这些达100,000细胞/颗粒s-1的任务。通过使用过滤器和二向色镜的光学阵列，不同波长的荧光可以被分离并同时检测。此外，可以使用许多具有不同激发波长的激光。因此，可以使用各种荧光团以靶向或检查例如样品内不同的免疫效应子或来自多个受试者的免疫效应子。
可用于本发明方法的合适的流式细胞仪包括使用单激发激光(single excitation laser)，测定5至9个光学参数(参见表3)的那些，所述单激发激光通常为氩离子风冷激光，运行在15mW，其光谱线488nm。更先进的流式细胞仪能够使用多个激发激光，除了氩离子激光(488或514nm)之外，例如HeNe激光(633nm)或HeCd激光(325nm)。
例如，Biggs et al.，Cytometry，36：36-45，1999已经使用三个激发激光构建了11个参数的流式细胞仪，并且已经证明除了正向和侧向散射测定外使用9个可区分的荧光团以旨在免疫表型分型(即分类)颗粒。目前商业上可获得的参数的最大数量为17：正向散射、侧向散射和三个激发激光，每个具有5个荧光检测器。所有参数是否都能够充分地利用极大地依赖于消光系数、量子产率和所有荧光团之间光谱重叠的量(Malemed et al.，″Flow cytometry and sorting″，2nd Ed.，New York，Wiley-Liss，1990)。然而，将理解本发明不限于任何特定的流式细胞仪或任何特定的参数组。在这点上，本发明还涉及使用例如Fu et al.，Nature Biotechnology，17：1109-1111，1999公开的微型流式细胞仪(microfabricated flow cytometer)代替传统的流式细胞仪。
本发明的检验对于高通量筛选或对于就来自一个受试者的许多免疫效应子筛选而言可以是自动化或半自动化的。自动化通过计算机软件方便地控制。
因此本发明涉及用于评估一种或多种免疫效应子存在或不存在的计算机程序产品，所述产品包括：
(1)接收与标记的mRNA或抗体相关的报道分子的特性(identity)作为输入值的代码；
(2)将所述输入值与参考值比较，以确定报道分子的水平和/或与报道分子连接的分子的特性的代码；和
(3)储存代码的计算机可读介质
在另一实施方式中，程序产品进一步包括接受关于在试管中的样品的高度作为输入信息的代码。在某些实施方式中，所述信息鉴定包含样品的测试容器，所述样品具有超出一个或多个预定尺寸的形状。在某些实施方式中，信息可以为报告样品(或对应的测试容器)检测的信号的形式，其中样品的高度超过至少约12mm或对于不同的样品的其它校正的值。在另一实施方式中，信息可以为报告样品检测的信号形式，其中样品的高度低于约6mm或对于不同的样品的其它校正的值。
本发明另一方面扩展到用于评估一种或多种免疫效应子存在或不存在的计算机，所述计算机包括：
(1)机器可读数据存储介质，包括用机器可读数据编码的数据存储材料，其中所述机器可读数据包括鉴定与标记的mRNA或抗体相关的报道分子的输入值；
(2)工作内存(working memory)，用于处理所述机器可读数据的指令；
(3)中央处理单元，其耦合到所述工作内存和所述机器可读数据存储介质，用于处理所述机器可读数据以比较所述值来提供报道分子或它们连接的分子的特性或水平的评估；以及
(4)输出硬件，耦合到所述中央处理单元，用于接收比较的结果。
这些实施方式的方案之一在图1中显示，所述图1显示***10，包括包含中央处理单元(″CPU″)20的计算机11，工作内存22，其可为例如RAM(随机存取内存)或″磁芯″存储器(″core″memory)、大容量存储器24(例如一个或多个磁盘驱动器或CD-ROM驱动器)、一个或多个阴极射线管(″CRT″)显示终端26、一个或多个键盘28、一根或多根输入线30、以及一根或多根输出线40，所有都通过传统的双向***总线50相互连接。
输入硬件36，通过输入线30耦合到计算机11，可以以各种方式实现。例如，本发明的机器可读数据通过使用调制解调器或调制解调器32输入，所述调制解调器或调制解调器32通过电话线或专用数据线34连接。作为选择或此外，输入硬件36可以包括CD。作为选择，ROM驱动器或磁盘驱动器24与显示终端26连接，键盘28可用作输入装置。
输出硬件46，通过输出线40耦合到计算机11，类似地可以通过传统的装置实现。举例而言，输出硬件46可以包括CRT显示终端26以用于显示如本文所述的合成多核苷酸序列或合成多肽序列。输出硬件还可以包括打印机42，以便可以产生硬拷贝输出，或磁盘驱动器24以存储稍后使用的***输出。
运行时，CPU 20协调使用各种输入和输出装置36，46，协调来自大容量存储器24的数据存取以及向工作内存22存取或从工作内存22存取，并且确定数据处理步骤的顺序。许多程序可用于处理本发明的机器可读数据。示例性的程序可以使用例如以下步骤：
(1)输入鉴定与标记的mRNA或抗体相关的报道分子的输入值；
(2)评估，包括将所述输入值与参考值比较以确定报道分子的水平和/或与报道分子连接的分子的特性；和
(3)输出评估结果。
图2显示磁性数据存储介质100的截面图，其可以用机器可读数据或指令组编码，以用于评估免疫效应子的水平，其可由例如图1的***10的***执行。介质100可以为传统的软盘或硬盘，具有可以为传统的合适的基质(substrate)101，在一面或两面的可以为传统的合适的涂层102，包含其极性或取向可以磁性地改变的磁畴(magnetic domains)(不可见)。介质100还可以具有开口用于接收磁盘驱动器或其它数据存储装置24的主轴(spindle)。将介质100的涂层102的磁畴极化或取向以便以可以为传统的方式编码用于通过例如图1的***10的***执行的机器可读数据。
图3显示光学可读数据存储介质110的截面图，其也可用此类机器可读数据或指令组编码，用于设计本发明的合成分子，其可由例如图1的***10的***执行。介质110可为传统的致密光盘只读存储器(CD-ROM)或可擦写介质(rewritable medium)例如磁光盘，其光学上可读并且磁-光学上可写。介质100优选具有可以为传统的合适的基质111，和通常在基质111一侧的可以为传统的合适的涂层112。
已知，在CD-ROM的情况下，涂层112为反射性的，并且压有(impressed with)多个凹坑槽(pits)113以编码机器可读数据。凹坑槽的排列通过将激光从涂层112的表面反射来读取。保护涂层114，其优选基本上透明，设置在涂层112上部。
本发明还涉及用于根据本文所述的方法，评估受试者建立细胞介导的应答的能力的试剂盒。方便起见该试剂盒为隔室形式(compartmental form)，具有一个或多个适于接收来自受试者的样品的隔室，所述样品例如优选通过毛细管取样，例如通过点刺装置收集的全血。这样在某些实施方式中，该试剂盒包括适于毛细管取样的装置，例如刺穿或穿孔皮肤以允许从外周毛细血管流血的装置。用于接收样品的容器可以具有相同的均一尺寸，或它们可以包括多个尺寸。在某些实施方式中，用于接收样品的容器被标记或否则安排成可以评估容器中的样品的高度。容器还可以适于包含抗凝血剂，其中样品为具有或不具有简单糖例如右旋糖的全血，以维持免疫细胞的有效功能能力。
通常，试剂盒为封装有一套说明书用于销售的形式。说明书通常为用于测定受试者中CMI应答的方法的形式，所述方法包括：从所述受试者收集样品，其中所述样品包括被抗原刺激后能够产生免疫效应子分子的免疫***的细胞，在样品的形状包括已被优化的尺寸的条件下，将所述样品与抗原一起孵育，然后任选地测定免疫效应子分子的存在或水平的升高，其中所述免疫效应子分子的存在或水平指示所述受试者建立细胞介导的免疫应答的能力。
方便起见，该试剂盒进一步包括毛细管取样装置和/或孵育器。在某些实施方式中，使用约3-4mm直径的毛细管收集血液。
在某些实施方式中，样品源自其的受试者为人类受试者，例如儿童、成人或老人受试者。任何动物或鸟可为受试者。
虽然示例性的免疫效应子分子为IFN-γ，其它细胞因子例如作为补体***中容易检验地成分TNFα和GM-CSF、穿孔蛋白、防御素、组织蛋白酶抑制素、颗粒酶、Fas配体、CD-40配体、外毒素、细胞毒素、趋化因子和单核因子。在某些实施方式中测试的免疫细胞选自自然杀伤(NK)细胞、T-细胞、B细胞、巨噬细胞或单核细胞。
在某些实施方式中，试剂盒包括选择以下的抗原：自体抗原、来自病原性有机体的抗原、金属或无机抗原、或肿瘤抗原或其类似物。在某些实施方式中，抗原来自分枝杆菌属，例如但绝不限于ESAT-6，CFP-10和TB7。在其它实施方式中，测试的抗原为破伤风类毒素(TT)或来自结核分枝杆菌(M.tuberculosis)或鸟分枝杆菌(M.avium)的纯化蛋白质衍生物(PPD)。
如关于本方法所述，选择容器以在孵育步骤期间提供最佳样品形状。在某些实施方式中，孵育容器形成至少约4mm至6mm至最大高度约12mm至20mm的样品高度。在其它实施方式中，优选至少约6mm至最大约12mm的样品高度。在某些实施方式中，孵育容器形成4mm，5mm，6mm，7mm，8mm，9mm，10mm，11mm，12mm，13mm，14mm，15mm，16mm，17mm，18mm，19mm或20mm的样品高度或其间高度。在其它实施方式中，孵育容器形成6mm，7mm，8mm，9mm，10mm，11mm或12mm的样品高度或中间高度。相对于孵育容器中的样品体积，在某些实施方式中，孵育的样品具有低于500μl，低于400μl，低于300μl，低于200μl，低于100μl，或低于50μl的体积。在其它实施方式中，样品为毛细血管血液，孵育的样品具有约2000μl，1500μl，1400μl，1300μl，1200μl，1100μl，900μl，800μl，700μl，600μl，500μl，400μl，300μl，200μl，100μl，50μl或40μl的体积或中间体积。
在某些实施方式中，试剂盒包括用于检测IFN-γ的反应试剂，这些包括用于检测IFN-γ的抗体缀合物。
本发明进一步提供治疗具有病原性感染、自体免疫疾病或癌症或发展此类疾病的倾向的受试者的方法，所述方法包括：通过测定受试者中的CMI应答的方法评估所述受试者建立细胞介导的免疫应答的能力。所述方法包括任选地通过毛细管取样收集来自所述受试者的样品，其中所述样品包括被抗原刺激后能够产生免疫效应子分子的免疫***的细胞，在样品的形状包括已被优化的尺寸的条件下，在孵育容器中将所述样品与抗原一起孵育，然后测定免疫效应子分子的存在或水平的升高，其中所述免疫效应子分子的存在或水平指示所述受试者建立细胞介导的免疫应答的能力，然后选择合适的治疗策略。在某些实施方式中，样品为血液样品。在某些实施方式中，样品的形状包括至少6mm至最大约12mm的高度。在其它实施方式中，样品体积低于1mL，更优选低于0.5mL，包括0.01mL样品。在某些实施方式中，受试者为牲畜动物或人类或鸟类受试者。在进一步的实施方式中，孵育容器适于保持样品的最佳形状，其中所述形状具有选自以下一种或两种或更多的尺寸：(i)最大圆直径低于6mm；(ii)高度至少约4mm至6mm，最大高度约12mm至20mm；或(iii)体积低于0.5mL，任选地低于约400μl。
在另一方面，本发明提供用于优化体外细胞免疫应答的方法，所述方法包括：i)在孵育容器中将多个具有一系列不同高度或其它尺寸的细胞样品与试剂在体外在以下条件下一起孵育一段时间，其中所述细胞样品包括被抗原(例如抗原、半抗原或有丝***原)刺激后分泌免疫效应子分子的细胞，所述时间和条件足以使细胞分泌免疫效应子分子，和ii)测定来自各样品的免疫效应子分子的存在和水平；以及iii)鉴定提供最佳细胞应答的样品尺寸。在某些实施方式中，尺寸为孵育容器中样品的高度。在另一实施方式中，尺寸为孵育容器中样品的体积。在其它实施方式中，尺寸为孵育容器中样品的的最大圆直径。
本发明还进一步通过以下非限制性实施例描述。
实施例1
在与抗原一起孵育的小体积样品中的免疫效应子分子的检测
将来自健康供体(4个供体)的全血收集到9mL Vacuette肝素锂(Vacuette Li-heparin)管，其具有约6.6mm直径的圆柱形以及U形基底。在Vacuette微型收集管中刺激0.1，0.2，0.3，0.4和0.5mL血液的等分试样(无添加剂)。使用破伤风类毒素和植物血球凝集素-P(有丝***原)刺激血液。添加到各管的抗原体积与血液体积成比例，例如，0.1mL血液用0.01mL抗原刺激，0.4mL血液用0.04mL抗原刺激。
将在小体积血液中产生的IFN-γ应答与使用1mL血液在13/75Vacuette血液收集管(对照)中产生的应答比较。
在除去血浆以用于IFN-γ检测(QuantiFERON结核金ELISA(QuantiFERON-TB Gold ELISA))之前将血液与抗原在37℃下一起孵育16至24小时。由于未获得充分的样品，仅就0.1mL样品检验25μL血浆。
ELISA测试证明IFN-γ在少至0.1mL的血液体积中产生(参见表3)。对于应答于抗原的0.3-0.4mL血液在6.6mm直径容器内的结果与在11mm直径球形容器中各受试者的1mL对照类似。有丝***原结果较少地受体积影响，并且从0.1mL至0.5mL类似，指示较少需要随容器比例优化体积。
根据本发明，只要进行容器的预优化，通过细胞因子生产或其它效应子机制测定的最佳细胞应答可以以小体积(例如通过点刺取样可获得的那些)实现，一旦意识到可行，所述优化可以由本领域技术人员实现。
实施例2
在具有不同内部形状的容器中孵育的小体积全血中的免疫效应子分子的检测
将肝素化的血液在聚丙烯管中分配成3x5mL等分试样。将抗原，要么为人类巨细胞病毒(CMV)要么为破伤风类毒素(Tetanus)以合适的浓度添加到血液。每管充分地混合，使血液(50μl)分配到其中血液体积采取不同高度的各种容器。具体地，PCR管(锥形，高度10mm，最大直径5mm，U形基底)，微型收集器(圆柱形，直径6.5mm，U形基底)、96孔板(圆柱形，直径6.5mm，平底)、48孔板(圆柱形，直径11mm，平底)。在除去血浆(20μl)之前，将容器在37℃下孵育20小时，以用于通过QFT-ELISA的测试，所述QFT-ELISA使用标记的抗体检测IFN-γ的产生。在对照试验中，1mL血液在圆柱形容器(内径10.5mm，平底)中孵育，通过QFT-ELISA测试20μl血浆。结果示于表4，其中就无抗原(Nil)、破伤风类毒素(TT)和巨细胞病毒(CMV)显示以IU/mL为单位的IFN-γ。0.20 IU/mL的应答和之上的Nil是显著的。不同容器中血液体积的高度和最大圆直径也示于表4。在具有CMV和/或TT的受试者1，3，4和5中对于11.5mm和6mm的样品高度检测出强信号。当高度降到低于6mm至3mm，然后1.5mm时，对于CMV信号减弱。因此，15μl全血样品提供强信号，条件是该血液体积在合适的提供至少约4mm的样品高度的容器中孵育。
实施例3
在外周毛细血管血液中的免疫效应子分子的检测
通过手指点刺将(150μl)毛细血管血液收集到肝素锂微型收集管。将小体积(50μl)转移到三个PCR管。PCR管为锥形，具有圆柱形上部，从10mm逐渐变细成锥形基底。为CMV或破伤风类毒素(Tetanus)的抗原或无抗原(Nil)添加到管，将其在37℃下孵育20小时。其后，将血浆(20μl)除去并使用QFT-ELISA测试。如图5所示，阳性CMV对照受试者(TR)样品与阴性对照相比产生显著的信号，指示检测可以以少至50μl毛细血管血液的体积进行。
实施例4
少至6mm高度，多至18mm高度的免疫效应子分子的检测
不同体积的肝素化的人类血液与抗原(无抗原(Nil)，破伤风类毒素(TT)或巨细胞病毒(CMV))在提供11.5mm，18mm和6mm血液高度的三种类型容器中一起孵育。以QFT-ELISA测试血浆。结果(参见表6)再次显示少至6mm的有效性。结果还显示使用18mm锥形管的阳性结果，指示尽管最佳结果在5至18mm之间达成，但免疫效应子分子在高于18mm的样品高度下也产生。
示于图3的结果在也提供各种血液样品高度的图8中再次列表。这里可以看出，随着样品高度从16mm向上增加，产生降低的信号。表3中的有丝***原结果已经在表8中除去，因为PHA-P为非特异性刺激物，而破伤风类毒素需要细胞抗原加工和呈递。
实施例5
少至4mm和20μl全血的免疫效应子分子的检测
将不同体积(50μl，40μl，30μl，20μl和10μl)的肝素化的人类血液在分别提供6mm，5.5mm，5mm，4mm和2.5mm样品高度的小PCR管中测试。抗原为不同浓度的无抗原(N)、破伤风类毒素(TT)或巨细胞病毒(CMV)。血液在37℃下孵育20小时，除去血浆以通过QFT-ELISA用于测试。使用1mL培养物(cultures)的对照试验(表7续)使用小体积的血浆(50μl，40μl，30μl，20μl，15μl，10μl和5μl)以通过QFT-ELISA测试。示于表7的结果显示高度为4mm的低至20μl血液的阳性信号，尽管最佳结果发现于5.5和6mm。
本领域技术人员将意识到本文所述的本发明除了特别描述的那些之外，容许变体和改进。可以理解本发明包括所有此类变体和改进。本发明还包括说明书中引用或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，无论是单独的还是总的，以及任何两种或多种所述步骤或特征的任何和所有组合。
表1
合适荧光团的列表
Figure G2008800120078D00321
Figure G2008800120078D00331
1Ex：峰值激发波长(nm)
2Em：峰值发射波长(nm)
表2
可以通过流式细胞仪测定的示例性光学参数
Figure G2008800120078D00342
＊使用488nm激发激光
Figure G2008800120078D00343
带通滤波器的宽度
#长波通滤波器
Figure G2008800120078D00351
Figure G2008800120078D00361
表5
毛细血管血
  受试者     IFN-γ(IU/mL)
    Nil   CMV   Tetanus
    TR     0.22   27.07   -
    JH     0.12   -   0.4
表6
在PCR管中培养物的变化体积
应答于Nil，CMV抗原或破伤风类毒素的以IU/mL为单位的IFN-γ的结果显示
Figure G2008800120078D00381
在每一情况下检验20μl血浆
显示低至6mm高度和50μl的有效性
＊管逐渐变细到10mm高度，然后圆柱形至20mm高度。管在圆柱形截面的直径为5mm
Figure G2008800120078D00391
Figure G2008800120078D00401
参考书目
Altschul et al.，Nucl.Acids Res.，25：3389，1997.
Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology John Wiley&Sons Inc，1994-1998，Chapter 15.
Ausubel(Ed)Current Protocols in Molecular Biology，5th Edition，John Wiley&Sons，Inc，NY，2002.
Biggs et al.，Cytometry，36：36-45，1999.
Bonner et al.，Eur.J.Biochem.，46：83，1974.
Brock et al.，Int.J.Tuberc.Lung.Dis，5(5)：462-467，2001.
Daneshvar et al.，J.Immunol.Methods，226(1-2)：119-128，1999.
Durig et al.，J.Raman Spectrosc.，24(5)：281-285，1993.
Eriksson et al.，Biophys.J.，2：64，1993.
Erickson et al.，Science，249：527-533，1990.
Fu et al.，Nature Biotechnology，17：1109-1111，1999.
Hodgson，Bio/Technology，9：19-21，1991.
Kurrek，Eur.J.Biochem.，270：1628-1644，2003.
Lakowicz et al.，Biophys.J.，72：567，1997.
Lewis et al.，Dyes Pigm.，42(2)：197，1999.
Malemed et al.，“Flow cytometry and sorting”，2nd Ed.，NewYork，Wiley-Liss，1990.
Marmur et al.，J.Mol.Biol.，5：109，1962.
Rahman et al.，J.Org.Chem.，63：6196，1998.
Rapaport et al.，Appl.Phys.Lett.，74(3)：329-331，1999.
Remington’s  Pharmaceutical Sciences，18th Ed.，1990，MackPublishing，Company，Easton，PA，U.S.A.
Sambrook，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd Edition，CSHLP，CSH，NY，2001.
Skjot et al.，Infection and Immunity，68(1)：214-20，2000.
Summerton et al.，Antisense and nucleic acid Drug Development，7：187-195，1997.
Tawa et al.，Mater.Res.Soc.Symp.Proc.，488[Electrical，Opticaland Magnetic Properties of Organic Solid-State Materials IV]，885-890.
Wells，Methods Enzymol.，202：2699-2705，1991.
Youvan et al.，Biotechnology.3：1-18，1997.

Claims (55)

1.用于在从受试者收集的全血样品中测定细胞介导的免疫(CMI)应答的方法，其中所述全血样品包括被抗原刺激后能够产生免疫效应子分子的免疫***的细胞，所述方法包括：
(i)使来自外周毛细血管的全血样品或来自受试者动脉或静脉的低于0.5mL的全血在基本上无需稀释所述样品的条件下在孵育容器中与抗原一起孵育；和
(ii)检测或测定免疫效应子分子或能够产生效应子分子的核酸分子的存在或水平升高，所述效应子分子指示受试者建立细胞介导的应答的能力。
2.根据权利要求1所述的方法，其包括：
(i)将来自外周毛细血管的全血样品或来自受试者动脉或静脉的低于0.5mL的全血收集到容器。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其用于选择用于治疗具有以下症状的受试者的合适的治疗策略：炎性疾病状况，病原性感染，自体免疫失调，免疫缺陷，过敏或癌症或发展此类疾病的倾向。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中该方法包括孵育和/或收集毛细血管血液样品。
5.根据权利要求2所述的方法，其中该方法包括用毛细管取样装置从受试者收集样品。
6.根据权利要求2或3或4所述的方法，其中将来自受试者的全血收集到包含抗原和/或抗凝血剂的容器中，或其中其后将抗原和/或抗凝血剂添加到血液中。
7.根据权利要求6所述的方法，其中抗凝血剂为肝素。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述孵育步骤在简单糖，例如右旋糖的存在下进行。
9.根据权利要求1至8任一项所述的方法，其中所述受试者为人类。
10.根据权利要求1至8任一项所述的方法，其中所述受试者为动物或鸟类。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述人类为儿童、成人或老人受试者。
12.根据权利要求1至11任一项所述的方法，其中所述全血样品与抗原一起孵育约4小时至约50小时。
13.根据权利要求1或2所述的方法，其中ii)部分的所述免疫效应子分子为：细胞因子、补体***的成分、穿孔蛋白、防御素、组织蛋白酶抑制素、颗粒酶、Fas配体、CD-40配体、外毒素、细胞毒素、趋化因子或单核因子。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述细胞因子为IFN-γ，TNFα或GM-CSF。
15.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述免疫细胞选自自然杀伤(NK)细胞、T-细胞、B细胞、巨噬细胞或单核细胞。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述细胞为T-细胞。
17.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述抗原选自自体抗原、来自病原性有机体的抗原、金属或无机抗原、或肿瘤抗原或其类似物。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述病原性有机体为细菌、病毒、真菌或寄生生物。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述抗原来自分枝杆菌属(Mycobacterium)。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述抗原为选自ESAT-6，CFP-10和TB7的分枝杆菌蛋白。
21.根据权利要求17所述的方法，其中所述抗原为破伤风类毒素(TT)或来自结核分枝杆菌(M.tuberculosis)或鸟分枝杆菌(M.avium)的纯化蛋白质衍生物(PPD)。
22.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述容器中的样品具有至少约4mm至约6mm，最大高度约12mm至20mm的高度。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述容器中的样品具有至少约6mm至最大约12mm的高度。
24.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品具有4mm，5mm，6mm，7mm，8mm，9mm，10mm，11mm，12mm，13mm，14mm，15mm，16mm，17mm，18mm，19mm或20mm的高度或其间的高度。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述样品具有6mm，7mm，8mm，9mm，10mm，11mm或12mm的样品高度或中间的高度。
26.根据权利要求1至25任一项所述的方法，其中孵育的总样品体积低于500μl，低于400μl，低于300μl，低于200μl，低于100μl，或低于50μl。
27.根据权利要求1至25任一项所述的方法，其中所述样品为毛细血管血液，孵育的总体积为约2000μl，1500μl，1400μl，1300μl，1200μl，1100μl，900μl，800μl，700μl，600μl，500μl，400μl，300μl，200μl，100μl，50μl或40μl的体积或中间的体积。
28.根据权利要求1至27任一项所述的方法，其中所述样品为毛细血管血液样品。
29.根据权利要求2所述的方法，其中将所述样品收集到约3-4mm直径的毛细管。
30.根据权利要求1至29任一项所述的方法，其中所述孵育容器适于保持样品的最佳形状，并且其中所述形状具有选自以下的一种或两种或更多的尺寸：(i)最大圆直径低于约6mm；(ii)高度至少约4mm至6mm，最大高度约12mm至20mm；或(iii)体积低于0.5mL，任选地低于400μl。
31.用于测定从受试者收集的全血样品中的细胞介导的免疫(CMI)应答的试剂盒，其中所述全血样品包括被抗原刺激后产生免疫效应子分子的免疫***的细胞，所述试剂盒以多组分形式包括：(i)一个或多个收集和/或孵育容器，其适合容纳或孵育外周毛细血管全血样品或低于0.5mL的静脉或动脉全血；(ii)一种或多种测试抗原，用于分析针对其的体外应答，以及任选的对照抗原；(iii)反应试剂，用于测定免疫效应子分子的存在或水平的升高；(iv)任选的一套包括本文所公开的方法中任一的说明书。
32.根据权利要求31所述的试剂盒，其中孵育容器适于形成样品的最佳形状，其中所述形状具有选自以下的一种或两种或更多的尺寸：(i)最大圆直径低于约6mm；(ii)高度至少约4mm至6mm，最大高度约12mm至20mm；或(iii)体积低于0.5mL，任选地低于400μl。
33.根据权利要求31所述的试剂盒，其中所述说明书包括以下说明：(i)收集全血，并在收集/孵育容器中将血液混合；(ii)将全血样品与抗原和与任选的对照抗原或有丝***原一起孵育；(iii)将孵育容器离心和收集血浆；以及(iv)检测血浆中的免疫效应子分子。
34.根据权利要求31、32或33所述的试剂盒，其进一步包括毛细管取样装置。
35.根据权利要求31、32或33所述的试剂盒，其中所述受试者为人类。
36.根据权利要求31、32或33所述的试剂盒，其中所述受试者为动物或鸟类。
37.根据权利要求36所述的试剂盒，其中所述人类为儿童、成人或老人受试者。
38.根据权利要求31所述的试剂盒，其进一步包括孵育器，其中所述全血样品与抗原一起孵育约4小时至约50小时。
39.根据权利要求31所述的试剂盒，其中(iii)部分的所述免疫效应子分子为：细胞因子、补体***的成分、穿孔蛋白、防御素、组织蛋白酶抑制素、颗粒酶、Fas配体、CD-40配体、外毒素、细胞毒素、趋化因子和单核因子。
40.根据权利要求39所述的试剂盒，所述细胞因子为IFN-γ，TNFα或GM-CSF。
41.根据权利要求31所述的试剂盒，其中所述免疫细胞选自自然杀伤(NK)细胞、T-细胞、B细胞、巨噬细胞或单核细胞。
42.根据权利要求41所述的试剂盒，其中所述细胞为T-细胞。
43.根据权利要求31所述的试剂盒，其中所述抗原选自自体抗原、来自病原性有机体的抗原、金属或无机抗原、或肿瘤抗原或其类似物。
44.根据权利要求43所述的试剂盒，其中所述抗原来自分枝杆菌属(Mycobacterium)。
45.根据权利要求43所述的试剂盒，其中所述抗原为选自ESAT-6，CFP-10和TB7的分枝杆菌蛋白。
46.根据权利要求43所述的试剂盒，其中所述抗原为破伤风类毒素(TT)或来自结核分枝杆菌(M.tuberculosis)或鸟分枝杆菌(M.avium)的纯化蛋白质衍生物(PPD)。
47.根据权利要求31或32所述的试剂盒，其中所述孵育容器形成至少约4mm至6mm，最大高度约12mm至20mm的样品高度。
48.根据权利要求47所述的试剂盒，其中所述孵育容器形成至少约6mm至最大约12mm的样品高度。
49.根据权利要求31或32所述的试剂盒，其中所述孵育容器形成4mm，5mm，6mm，7mm，8mm，9mm，10mm，11mm，12mm，13mm，14mm，15mm，16mm，17mm，18mm，19mm或20mm的样品高度或其间高度。
50.根据权利要求31或32所述的试剂盒，其中所述孵育容器形成6mm，7mm，8mm，9mm，10mm，11mm或12mm的样品高度或中间高度。
51.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述孵育的样品具有低于500μl，低于400μl，低于300μl，低于200μl，低于100μl，或低于50μl的体积。
52.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述样品为毛细血管血液，孵育的样品具有约2000μl，1500μl，1400μl，1300μl，1200μl，1100μl，900μl，800μl，700μl，600μl，500μl，400μl，300μl，200μl，100μl，50μl或40μl的体积或中间体积。
53.根据权利要求31至52任一项所述的试剂盒，其中所述样品为毛细血管血液样品。
54.根据权利要求31所述的试剂盒，其中所述反应试剂包括用于检测IFN-γ的抗体缀合物。
55.根据权利要求31至54任一项所述的试剂盒，其包括约3-4mm直径的毛细管。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102608333A (zh) * 2012-03-30 2012-07-25 中国科学院微生物研究所 一种结核诊断组合物及其应用
CN108548917A (zh) * 2018-03-01 2018-09-18 广州市雷德生物科技有限公司 一种记忆性免疫细胞的检测体系及其应用
CN108593936A (zh) * 2011-06-29 2018-09-28 塞尔雷斯蒂斯有限公司 具有增强灵敏度的细胞介导免疫应答测定
CN110412179A (zh) * 2018-04-26 2019-11-05 缪荣明 一种液相色谱检测颗粒酶a的方法
CN111566484A (zh) * 2017-11-09 2020-08-21 宾夕法尼亚大学董事会 细胞外囊泡蛋白及其在癌症诊断、预测对疗法的反应和治疗中的用途

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2731854C (en) * 2008-07-25 2020-06-30 Cellestis Limited Measurement of cell-mediated immune response reactivity to detect or monitor a disease or condition
EP2367561B1 (en) 2008-11-30 2015-05-20 Immusant, Inc. Compositions and methods for treatment of celiac disease
CN102448491A (zh) 2009-04-01 2012-05-09 迈阿密大学 疫苗组合物和其使用方法
CN110542754A (zh) * 2009-05-19 2019-12-06 迈阿密大学 用于体外抗原呈递、评估疫苗功效及生物制剂和药物的免疫毒性的组合物、试剂盒和方法
CN102549425A (zh) * 2009-06-12 2012-07-04 疫苗技术公司 用于测量细胞介导的免疫应答的诊断试验所用的方法和组合物
US9459253B2 (en) * 2009-12-23 2016-10-04 Cellestis Limited Assay for measuring cell-mediated immunoresponsiveness
MX2012010720A (es) 2010-03-19 2013-01-29 Red Flag Diagnostics Gmbh Proceso in vitro para la determinacion rapida de un estdo del paciente con relacion a la infeccion con micobacterium tuberculosis.
AU2013229008B2 (en) * 2012-03-06 2018-11-08 Cellect Biotherapeutics Ltd Devices and methods for selecting apoptosis-signaling resistant cells, and uses thereof
MX2015002915A (es) * 2012-09-06 2015-07-06 Hitachi Chemical Co Ltd Metodos para estimacion de la inmunidad especifica de peptido.
HUE038527T2 (hu) 2012-12-28 2018-10-29 Cellestis Ltd Sejtek által közvetített immunválasz
CA2923822A1 (en) 2013-09-10 2015-03-19 Immusant, Inc. Dosage of a gluten peptide composition
AU2015323979A1 (en) 2014-09-29 2017-05-18 Immusant, Inc. Use of HLA genetic status to assess or select treatment of celiac disease
DE112016003948T5 (de) 2015-08-31 2018-05-09 City Of Sapporo Molekulare verfahren zum beurteilen einer urothelialen erkrankung
CN105259354B (zh) * 2015-11-13 2017-05-10 夏晶 结核T细胞释放γ‑干扰素检测试剂盒及其使用方法
US11739369B2 (en) 2020-03-23 2023-08-29 California Institute Of Technology Immune profiling using small volume blood samples
WO2021202893A1 (en) * 2020-04-03 2021-10-07 Nonigenex, Inc. Detecting adaptive immunity to coronavirus
EP4179328A2 (en) * 2020-07-10 2023-05-17 Covid Diagnostics Ltd. Compositions, methods, and systems for detecting immune response

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4018653A (en) * 1971-10-29 1977-04-19 U.S. Packaging Corporation Instrument for the detection of Neisseria gonorrhoeae without culture
US4016043A (en) * 1975-09-04 1977-04-05 Akzona Incorporated Enzymatic immunological method for the determination of antigens and antibodies
FR2508305B1 (fr) * 1981-06-25 1986-04-11 Slama Gerard Dispositif pour provoquer une petite piqure en vue de recueillir une goutte de sang
US4424279A (en) * 1982-08-12 1984-01-03 Quidel Rapid plunger immunoassay method and apparatus
ATE77488T1 (de) * 1986-03-06 1992-07-15 Commw Scient Ind Res Org In-vitro-testverfahren zum nachweis zellulaerer immunresponsen.
AU2002952548A0 (en) 2002-11-08 2002-11-21 Cellestis Limited Diagnostic assay
EP1751268B1 (en) * 2004-05-13 2015-12-09 Advanced Animal Diagnostics, Inc. Microfluidic device and leucocyte antigen mediated microfluidic assay
GB0616238D0 (en) * 2006-08-15 2006-09-27 Inst Animal Health Ltd Diagnostic Test

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108593936A (zh) * 2011-06-29 2018-09-28 塞尔雷斯蒂斯有限公司 具有增强灵敏度的细胞介导免疫应答测定
CN108593936B (zh) * 2011-06-29 2022-05-13 塞尔雷斯蒂斯有限公司 具有增强灵敏度的细胞介导免疫应答测定
CN102608333A (zh) * 2012-03-30 2012-07-25 中国科学院微生物研究所 一种结核诊断组合物及其应用
CN102608333B (zh) * 2012-03-30 2013-06-05 中国科学院微生物研究所 一种结核诊断组合物及其应用
CN111566484A (zh) * 2017-11-09 2020-08-21 宾夕法尼亚大学董事会 细胞外囊泡蛋白及其在癌症诊断、预测对疗法的反应和治疗中的用途
CN108548917A (zh) * 2018-03-01 2018-09-18 广州市雷德生物科技有限公司 一种记忆性免疫细胞的检测体系及其应用
CN110412179A (zh) * 2018-04-26 2019-11-05 缪荣明 一种液相色谱检测颗粒酶a的方法

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