CN101705236B - 干酪乳杆菌Zhang中fbpA的蛋白序列 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种干酪乳杆菌Zhang中FbpA的蛋白序列，提供了一种新的干酪乳杆菌热休克蛋白FbpA的编码核苷酸序列，该序列是干酪乳杆菌Zhang应激密切相关的基因，该序列的核苷酸序列与已公布的干酪乳杆菌BL23的核酸序列FM177140和干酪乳杆菌ATCC334的核酸序列CP000423有99％的相似性。本发明还提供了干酪乳杆菌Zhang中的FbpA基因的核酸序列，该核酸序列为SEQ ID NO：1，本发明还提供了一种分离出的干酪乳杆菌Zhang热休克蛋白FbpA的氨基酸序列，该序列的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

Description

干酪乳杆菌Zhang中fbpA的蛋白序列

【技术领域】

本发明属于基因工程领域，具体地，涉及一种蛋白编码序列，特别是一种干酪乳杆菌Zhang中FbpA的蛋白序列。

【背景技术】

人体肠道内有大约1000多种共生微生物，其遗传信息的总和叫“微生物组”，编码基因有100万个以上。如果想要保持人体自身的健康状态，必须要使肠道菌群与人之间保持相互协调、和谐一致。乳杆菌是一类发酵已糖，产生以乳酸为主要代谢产物的细菌的总称。它们作为肠道内的优势菌群之一，在宿主胃肠道上皮黏附和定植可以有效的抑制病原菌的生长和繁殖，对于维持肠道微生态平衡起到了非常重要的作用。近些年以来，对于乳杆菌黏附特性的研究中，除采用常规的生理生化手段定性检测乳杆菌黏附活性成分及其生物学特性之外，许多研究者还利用生物信息学的分析方法对黏附相关的蛋白也进行了深入细致的分析。目前，尽管这些基因中一部分成员的功能已经得到了验证，乳杆菌的黏附机制尚不清楚。随着现代分子生物学研究技术的不断发展和成熟，相关功能基因的数据库势必日臻完善，这也有助于这一机理的识别。

fbpA蛋白是二聚体糖蛋白，分子量约为450kD。通常有两种存在形式：一种游离存在于血浆中；一种以纤维状存在细胞外基质。关于fbpA蛋白的研究已有近60年的历史，特别是在致病菌中，包括肺炎链球菌和化脓性链球菌，它被证明在细胞生长、分化和黏附过程中都有着非常重要的作用，因此也被认为是病原菌中主要致病因子之一。在乳杆菌中，研究者对于fbpA蛋白在黏附过程中潜在作用也进行了卓有成效的探索。例如：在短乳杆菌中，研究者发现表层蛋白在N端有同纤连蛋白连接的区域，由96-245个氨基酸组成；在嗜酸乳杆菌中，基因突变结果也证明了fbpA在黏附过程中不可或缺的作用，缺少fbpA基因的菌株细胞黏附Caco-2的能力显著下降。虽然干酪乳杆菌也是时下研究的热点之一，但迄今为止，很少有学者针对干酪乳杆菌中编码的fbpA蛋白进行探讨。

本发明参考其它菌株fbpA基因序列，克隆测序获得干酪乳杆菌Zhang（Lactobacillus casei Zhang）中的fbpA基因序列，并对不同物种fbpA基因核酸和氨基酸序列进行相似性比较，为今后开展与干酪乳杆菌中fbpA蛋白与宿主黏附能力相关研究工作提供基础资料。

在文献“王俊国等，干酪乳杆菌Zhang对大鼠抗氧化能力的影响，营养学报2009年第31卷第1期，公开日2009年2月中公开了干酪乳杆菌Zhang菌株。

在中国专利申请CN200810175856.7，公开号CN101418270A，公开日2009年4月29日，扉页、第2页、第6页中公开了干酪乳杆菌Zhang菌株，并已经说明保藏号为CGMCC1697。

在专利申请号2006101273622，公开号CN 101144062A，公开公开日为2008年3月19日，提供了分类命名为干酪乳杆菌，菌株名称为zhang的菌株的生物材料保藏证明，保藏号为CGMCC 1697。

上述文献内容引入本文作为参考。

【发明内容】

本发明提供了一种干酪乳杆菌Zhang中热休克蛋白FbpA编码序列，该序列是干酪乳杆菌Zhang应激密切相关的基因，其核苷酸序列与已公布的干酪乳杆菌BL23的核酸序列FM177140和干酪乳杆菌ATCC334的核酸序列CP000423有99%的相似性。

具体地，本发明提供了一种干酪乳杆菌Zhang中的热休克蛋白FbpA的编码序列，该序列的核苷酸序列为SEQ ID NO:1，

本发明还提供了一种分离出的干酪乳杆菌Zhang中的FbpA蛋白，该蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

本发明还提供了SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。

本发明还提供了一种干酪乳杆菌Zhang中热休克蛋白FbpA基因的克隆和测序方法。该方法包括步骤：（1）PCR引物设计与合成；（2）干酪乳杆菌DNA的提取；（3）目的片断的PCR扩增；（4）琼脂糖凝胶电泳检测；（5）目的基因片断回收与鉴定；（6）目的基因片断的克隆与鉴定；（7）测序，其特征在于PCR引物为SEQ ID NO:3（正向）和SEQ ID NO:4（反向），其序列信息如下：

SEQ ID NO:3：5’-GCTTTTTGCTATGCCACCC-3’

SEQ ID NO:4：5’-TGACAGCGACCGTCTTTTG-3’

具体地，各个步骤的详细内容如下：

（1）PCR引物设计与合成

PCR引物对的正向引物和反向引物信息如下：

SEQ ID NO:3（正向）：5’-GCTTTTTGCTATGCCACCC-3’；

SEQ ID NO:4（反向）：5’-TGACAGCGACCGTCTTTTG-3’；

（2）干酪乳杆菌DNA的提取

总DNA的提取参照QIAGEN的细菌基因组提取试剂盒说明书进行。具体操作步骤如下：

细菌培养液5ml，10,000rpm离心1分钟，弃上清。加入适量溶菌酶溶液，使其最终浓度为20mg/ml，彻底悬浮，37℃处理30-60分钟。加入20μl蛋白酶K（20mg/ml）溶液，混匀。加220μl缓冲溶液GB，振荡15秒。70℃放置30分钟。加入220μl无水乙醇，充分振荡15秒。将溶液加入吸附柱中，12,000rpm离心30秒。加500μl去蛋白液GD，12,000rpm离心30秒，弃废液。加700μl漂洗液GW，12,000rpm离心30秒，弃废液。加500μl漂洗液GW，12,000rpm离心30秒，弃掉废液。再次12,000rpm离心2分钟，将吸附柱置于室温数分钟。将吸附柱转入干净的离心管中，加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温置2-5分钟，12,000rpm离心30秒。离心得到的溶液再次加入吸附柱中，室温放置2分钟，12,000rpm离心2分钟，即得到干酪乳杆菌Zhang基因组DNA。

（3）目的片断的PCR扩增

PCR扩增体系：0.2μl Taq聚合酶(5U/μl,Takara Tokyo,Japan),2.5μl10×PCR缓冲液(without Mg²⁺),2μl dNTP(2.5mM each),2μl MgCl₂(25mM),0.2μl正向引物(50pM),0.2μl反向引物(50pM),1μl基因组DNA和17.4μlddH₂O.

PCR扩增条件：97℃变性5min；95℃ 30s，54.5℃ 30s，72℃ 30s，如此进行35次循环；72℃延伸10min，4℃ 10min。

（4）琼脂糖凝胶电泳检测

取PCR产物5μl，同1μl上样缓冲液混合均匀，点样于琼脂糖凝胶孔中，在另一孔中加入5μl DL2000 Marker,120V/cm电压下电泳30min。电泳结束后，在凝胶成像***GDS-8000 System(UVP Biomaging Systems)上留取照片。

（5）目的基因片断回收与鉴定

片段的回收按照QIAGEN琼脂糖凝胶回收试剂盒的说明进行。具体操作步骤如下：

在紫外灯下迅速将含有目的片段条带的琼脂糖块割下，放入1.5ml的离心管中。胶块中加入3倍体积溶胶液PN，置50℃水浴放置10分钟，使琼脂糖块完全溶化。将溶化后的琼脂糖块移入吸附柱CA1或CA2中，13,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的液体。将吸附柱放入同一个收集管中，在吸附柱中加入700μl漂洗液PW，13,000rpm，离心30秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。在吸附柱中加入500μl漂洗液PW，13,000rpm离心30秒，倒掉废液。将离心吸附柱CA1或CA2放回收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温或50℃温箱数分钟，晾干。将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量65-70℃水浴预热的洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟。13,000rpm离心1分钟收集DNA溶液。

（6）目的基因片断的克隆与鉴定

（6.1）感受态细胞的制备

挑取JM109大肠杆菌原种，LB琼脂板上划线。过夜培养后挑取新鲜单菌落，接种到100ml LB培养基中，37℃摇菌培养2-3小时（160转/分钟），至OD₆₀₀达到0.4-0.5时将菌液移至灭菌预冷的100ml离心管中，冰浴10-15分钟。4,000rpm，4℃离心10分钟，回收细菌沉淀。加入20ml经过过滤除菌并经预冷的0.1MCaCl₂悬浮细菌沉淀。冰浴10-15分钟后于4,000rpm，4℃离心10分钟，回收细菌沉淀。加入4ml 0.1M CaCl₂悬浮细菌沉淀。该细胞可直接用于转化实验。加甘油至终浓度为15%-20%，混匀，每份分装成100μl于1.5ml EP管中，冻存于-70℃冰箱中。

（6.2）回收片段同T载体的连接

连接用TaKaRa pMD 18-T Vector试剂盒。

具体操作过程如下：

首先在EP管中制备下列连接反应液：

然后将上述反应液在16℃反应30分钟，产物用于转化感受态细胞。

（6.3）质粒的转化

从-70℃冰箱中取出保存的感受态细胞，冰浴助溶。将100μl感受态细胞加入10μl连接产物，冰浴30分钟后于42℃水浴热应激90秒钟，立即置入冰浴中2分钟。加入400μl液体LB培养基，37℃复活50分钟后取100μl铺于LB平板上，平板含0.1（V/V）的氨苄青霉Amp（100mg/ml）X-gal（100μg/ml）和IPTG（1mM）。最后于37℃恒温培养10-15小时。白色菌斑应含重组质粒。

（6.4）转化菌落的PCR鉴定与培养

用记号笔标记转化培养的单菌落，用灭菌的牙签蘸取白色单菌落。将牙签头放入在加有PCR反应液（不含模板）的EP管中晃动，进行PCR扩增。将PCR产物同Marker一起进行琼脂糖凝胶电泳，鉴别T载体上是否含有目的片段。得到目的片段后，用灭菌枪头挑取在平板上的与之对应的单菌落，放入40ml含0.1%（V/V）的青霉素钠（100mg/ml）LB液体培养基中，37℃过夜摇菌培养，用于质粒回收和测序。

（7）测序

经过测序得到SEQ ID NO:1所示的编码热休克蛋白FbpA的核苷酸序列。

本发明的干酪乳杆菌Zhang中的fbpA基因在乳杆菌黏附过程中有着非常重要的作用。对这个基因进行克隆和测序，这为乳酸菌益生菌株遗传改造和应用提供了基本研究材料。

【具体实施方式】

下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的保护范围。

实施例1

干酪乳杆菌Zhang中热休克蛋白FbpA编码基因的克隆和测序。

本发明测序得到的片断经过相似性比较为热休克蛋白FbpA编码基因的全序列。

1、实验方法

1.1 PCR引物设计与合成

PCR引物根据GenBank提供的相关序列（Accession No:FM177140；CP000423）采用Primer 5.0自行设计，由上海桑尼生物科技有限公司合成，该引物对的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:3（正向）和SEQ ID NO:4（反向），序列信息如下：

SEQ ID NO:3（正向）：5’-GCTTTTTGCTATGCCACCC-3’；

SEQ ID NO:4（反向）：5’-TGACAGCGACCGTCTTTTG-3’；

1.2 干酪乳杆菌DNA的提取。

总DNA的提取参照QIAGEN的细菌基因组提取试剂盒说明书进行。具体操作步骤如下：

细菌培养液5ml，10,000rpm离心1分钟，弃上清，加入适量溶菌酶溶液，使其最终浓度为20mg/ml，彻底悬浮，37℃处理50分钟，加入20μl蛋白酶K溶液（20mg/ml），混匀。加220μl缓冲溶液GB，振荡15秒。70℃放置30分钟。加入220μl无水乙醇，充分振荡15秒。将溶液加入吸附柱中，12,000rpm离心30秒。加500μl去蛋白液GD，12,000rpm离心30秒，弃废液。加700μl漂洗液GW，12,000rpm离心30秒，弃废液。加500μl漂洗液GW，12,000rpm离心30秒，弃掉废液。再次12,000rpm离心2分钟，将吸附柱置于室温数分钟。将吸附柱转入干净的离心管中，加200μl洗脱缓冲液TE，室温置4分钟，12,000rpm离心30秒。离心得到的溶液再次加入吸附柱中，室温放置2分钟，12,000rpm离心2分钟，即得到干酪乳杆菌Zhang基因组DNA。

1.3 目的片断的PCR扩增

PCR扩增体系：0.2Μl Taq聚合酶(5U/μl，Takara Tokyo，Japan)，2.5μl10×PCR缓冲液(without Mg²⁺)，2μl dNTP(2.5mM each)，2μl MgCl₂(25mM)，0.2μl正向引物（SEQ ID NO:3）(50pM)，0.2μl反向引物（SEQID NO:4）(50pM)，1μl基因组DNA和17.4μl ddH₂O.

PCR扩增条件：97℃变性5min；95℃ 30s，54.5℃ 30s，72℃ 30s，如此进行35次循环；72℃延伸10min，4℃10min。

1.4 琼脂糖凝胶电泳检测

取PCR产物5μl，同1μl上样缓冲液混合均匀，点样于琼脂糖凝胶孔中，在另一孔中加入5μl DL2000 Marker，120V/cm电压下电泳30min。电泳结束后，在凝胶成像***GDS-8000 System(UVP Biomaging Systems)上留取照片。

1.5 目的基因片断回收与鉴定

片段的回收按照QIAGEN琼脂糖凝胶回收试剂盒的说明进行。

在紫外灯下迅速将含有目的片段条带的琼脂糖块割下，放入1.5ml的离心管中。胶块中加入3倍体积溶胶液PN，置50℃水浴放置10分钟，使琼脂糖块完全溶化。将溶化后的琼脂糖块移入吸附柱CA1中，13,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的液体。将吸附柱放入同一个收集管中，在吸附柱中加入700μl漂洗液PW，13,000rpm，离心30秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。在吸附柱中加入500μl漂洗液PW，13,000rpm离心30秒，倒掉废液。将离心吸附柱CA1或CA2放回收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温或50℃温箱数分钟，晾干。将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量65-70℃水浴预热的洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟。13,000rpm离心1分钟收集DNA溶液。

1.6 目的基因片断的克隆与鉴定

1.6.1 感受态细胞的制备

挑取JM109大肠杆菌原种，LB琼脂板上划线。过夜培养后挑取新鲜单菌落，接种到100ml LB培养基中，37℃摇菌培养3小时（160转/分钟），至OD₆₀₀达到0.4-0.5时将菌液移至灭菌预冷的100ml离心管中，冰浴15分钟。4,000rpm，4℃离心10分钟，回收细菌沉淀。加入20ml经过过滤除菌并经预冷的0.1MCaCl₂悬浮细菌沉淀。冰浴15分钟后于4,000rpm，4℃离心10分钟，回收细菌沉淀。加入4ml 0.1M CaCl₂悬浮细菌沉淀。该细胞可直接用于转化实验。加甘油至终浓度为15%-20%，混匀，每份分装成100μl于1.5ml EP管中，冻存于-70℃冰箱中。

1.6.2 回收片段同T载体的连接

连接用TaKaRa pMD 18-T Vector试剂盒。操作过程如下：

首先在EP管中制备下列连接反应液：

将上述反应液在16℃反应30分钟，产物用于转化感受态细胞。

1.6.3 质粒的转化

从-70℃冰箱中取出保存的感受态细胞，冰浴助溶。将100μl感受态细胞加入10μl连接产物，冰浴30分钟后于42℃水浴热应激90秒钟，立即置入冰浴中2分钟。加入400μl液体LB培养基，37℃复活50分钟后取100μl铺于LB平板上，平板含0.1（V/V）的氨苄青霉Amp（100mg/ml）X-gal（100μg/ml）和IPTG（1mM）。最后于37℃恒温培养15小时。白色菌斑应含重组质粒。

1.6.4 转化菌落的PCR鉴定与培养

用记号笔标记转化培养的单菌落，用灭菌的牙签蘸取白色单菌落。将牙签头放入在加有PCR反应液（不含模板）的EP管中晃动，进行PCR扩增。将PCR产物同Marker一起进行琼脂糖凝胶电泳，鉴别T载体上是否含有目的片段。得到目的片段后，用灭菌枪头挑取在平板上的与之对应的单菌落，放入40ml含0.1%（V/V）的青霉素钠（100mg/ml）LB液体培养基中，37℃过夜摇菌培养，用于质粒回收和测序。

2、实验结果

经过测序得到SEQ ID NO:1所示编码FbpA基因的核苷酸序列。

3、结论

克隆测序得到的FbpA基因的全长核苷酸序列。

实施例2：干酪乳杆菌Zhang中FbpA基因的序列信息与生物信息学分析

本发明新的干酪乳杆菌FbpA全长编码区序列的长度为1704bp，详细序列见SEQ ID NO:1。根据全长CDS推导出干酪乳杆菌Zhang中FbpA的氨基酸序列，共365个氨基酸残基，详见SEQ ID NO:2，在线预测（http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html）结果显示，其分子量为64301道尔顿，等电点（pI）为9.21。

将干酪乳杆菌FbpA相关的全长核苷酸序列及其编码蛋白质用BLAST程序在GenBank的非冗余数据库中进行核苷酸和蛋白质相似性检索，结果发现它与已公布序列的干酪乳杆菌FbpA在核苷酸水平和氨基酸水平上都具有99%的相似性。与其它乳杆菌如：植物乳杆菌WCSF1（Lactobacillus plantarum WCSF1）、唾液乳杆菌UCC118（Lactobacillussalivarius UCC118）及短乳杆菌ATCC367（Lactobacillus brevis ATCC 367）等编码的FbpA基因也都有着较高的相似性（具体的相似度参见表1）。由此可见，FbpA基因在乳杆菌不同物种间有着较高的保守性。通过检索由欧洲生物信息研究所(EMI)开发的Interpro数据库，我们发现它有着FbpA蛋白典型的结构域特征，一个N端ATP功能结合区域（ATP bindingdomain）和一个C端肽结合区域（Polypeptide-binding domain）。在其它乳杆菌中FbpA已经被证明在乳杆菌应激过程中有着非常重要的作用，可以认为FbpA在干酪乳杆菌应激的过程中也具有相似的作用。

3、结论

通过上述操作，表明本发明得到了编码干酪乳杆菌Zhang中的FbpA蛋白的基因序列及其氨基酸序列。

表1：本发明得到与其它乳杆菌的编码干酪乳杆菌Zhang中的FbpA基因序列具有很高的相似度

Claims (1)

1.一种干酪乳杆菌Zhang中热休克蛋白fbpA基因的克隆和测序方法，该方法包括步骤：（1）PCR引物设计与合成；（2）干酪乳杆菌DNA的提取；（3）目的片断的PCR扩增；（4）琼脂糖凝胶电泳检测；（5）目的基因片断回收与鉴定；（6）目的基因片断的克隆与鉴定；（7）测序，其特征在于PCR引物的正向引物为SEQ ID NO:3和反向引物为SEQ ID NO:4，其序列信息如下：

SEQ ID NO:3：5’-GCTTTTTGCTATGCCACCC-3’

SEQ ID NO:4：5’-TGACAGCGACCGTCTTTTG-3’。